Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum and Candidatus Mycoplasma turicensis are the causative agents of feline mycoplasmosis, these agents are gram-negative, pleomorphic, small and that adhere to the surface of erythrocytes of the animal involved. Clinical signs of feline mycoplasmosis are manifestations of acute or chronic anemia, occurring weight loss, anorexia, depression, pale mucous membranes, weakness, joint pain, soreness and occasionally splenomegaly and jaundice, the animal may come to death in severe cases. The diagnosis is based on detection of the parasite in blood smears and also in molecular diagnostics using PCR. Aiming to determine the occurrence of Mycoplasma spp. in domestic cats in a region of Belém, Pará, and hematological changes of animals naturally infected by these parasites were collected 201 blood samples with EDTA for Count Blood Cells (CBC) analysis and extraction of DNA for performing the Polymerase Chain Reaction (PCR) as well as blood smears ear tip for detection of the parasite on the surface of erythrocyte. Found 5.47% (11/201) of positive examination of blood smears, being 1.47% (1/68) of males and 7.51% (10/133) than females. The DNA of Candidatus Mycoplasma haemominutum was found in 7.96% (16/201) where 16.17 % (11/68) were males and 3.75% (5/133) females, was detected Mycoplasma haemofelis in 1.49% (3/201) of samples totaling 2.94% (2/68) of males and 0.75% (1/133) of females. The CBC showed changes in erythrocytes, hematocrit and hemoglobin only in those animals with DNA of Mycoplasma haemofelis. / Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum e Candidatus Mycoplasma turicensis são os agentes causadores da micoplasmose felina, estes agentes são bactérias gram-negativas, pleomórficas, pequenas e que se aderem à superfície dos eritrócitos do animal acometido. Os sinais clínicos da micoplasmose felina são manifestações de anemia aguda ou crônica, ocorrendo perda de peso, anorexia, depressão, membranas mucosas pálidas, fraqueza, dores articulares, hiperestesia e, ocasionalmente esplenomegalia e icterícia, podendo o animal vir a óbito nos casos mais graves. O diagnóstico é baseado na detecção do parasita em esfregaços sanguíneos e também no diagnóstico molecular pela PCR. Objetivando determinar a ocorrência de Mycoplasma spp. em felinos domésticos da região de Belém-Pará, e as alterações hematológicas dos animais naturalmente infectados por estes parasitos, foram coletadas 201 amostras de sangue com EDTA para análise de hemograma e extração de DNA para realização de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) bem como esfregaços sanguíneos de ponta de orelha para detecção do parasita na superfície do eritrócito. Foram encontrados 5,47% (11/201) de positividade no exame de esfregaço sanguíneo, sendo 1,47% (1/68) de machos e 7,51% (10/133) de fêmeas. O DNA de Candidatus Mycoplasma haemominutum foi encontrado em 7,96% (16/201) dos animais onde 16,17% (11/68) eram machos e 3,75% (5/133) eram fêmeas, já Mycoplasma haemofelis foi detectado em 1,49% (3/201) das amostras, totalizando 2,94% (2/68) de machos e 0,75% (1/133) de fêmeas. O hemograma mostrou alterações em eritrócitos, volume globular e hemoglobina apenas nos animais em que foi detectado DNA de Mycoplasma haemofelis.

A conservação dos animais selvagens de vida livre é ameaçada pela fragmentação de habitat, caça, diminuição de presas e, em menor escala pela ocorrência de doenças infecciosas. Reconhecendo a importância das doenças para a conservação, e considerando que o crescimento da população humana no entorno de áreas protegidas propicia o aumento do contato de animais domésticos e selvagens, o presente estudo teve como objetivo pesquisar a exposição de carnívoros selvagens de vida livre e cães domésticos da região do Parque Nacional das Emas (PNE), Goiás à cinomose, parvovirose, brucelose e brucelose canina. Entre as espécies de carnívoros selvagens amostradas estão o lobo-guará, cachorro-do-mato, raposinha-do-campo, onça-parda, jaguatirica, gato-palheiro, gatomourisco, jaratataca e quati. Foram realizados os testes de soroneutralização, inibição de hemaglutinação, imunodifusão em gel ágar e PCR, para cinomose, parvovirose, brucelose canina e brucelose, respectivamente. Lobos-guará (12,7%, n=9), cachorros-do-mato (11,6%, n=7), jaguatiricas (18,2%, n=2) e cães domésticos (71,4%, n=25) foram expostos à cinomose. Todas as espécies de carnívoros selvagens amostradas, com exceção do quati, sendo 40,4% (n=65) dos indivíduos, e 37,1% (n=13) dos cães domésticos foram expostos à parvovirose. Apenas o lobo-guará (1,67%, n=2) foi exposto à brucelose canina e a raposinha-do-campo à Brucella spp. (1,47%, n=1). Este é o primeiro relato da exposição de gato-palheiro, gatomourisco e jaratataca ao parvovírus, e de lobo-guará à Brucella canis. A cinomose e a parvovirose merecem atenção no PNE pela possibilidade de envolvimento de cães domésticos na sua transmissão, embora não possa ser comprovada no presente estudo. A brucelose, no momento, parece não ser uma ameaça sanitária para as populações de carnívoros do PNE. / The conservation of free ranging wildlife is threatened by habitat fragmentation, hunting, decrease of prey and, to a lesser extent by the occurrence of infectious diseases. Recognizing the diseases importance for conservation, and considering that the increase of human population around protected areas provides increased contact with domestic and wild animals, the present study aimed to investigate the exposure of free ranging wild carnivores and domestic dogs in the region of Emas National Park (ENP), Goiás, Brazil for canine distemper virus (CDV), parvovirus, brucellosis and canine brucellosis. Among the species of wild carnivores sampled are the maned wolf, crab-eating fox, hoary fox, puma, ocelot, pampas cat, jaguarondi, skunk and coati. The tests performed for CDV, parvovirus, canine brucellosis and brucellosis tests were the serum neutralization test, hemagglutination inhibition, agar gel immunodiffusion and PCR, respectively. Maned wolves (12.7%, n = 9), crab-eating foxes (11.6%, n = 7), ocelots (18.2%, n = 2) and domestic dogs (71.4%, n = 25) were exposed to CDV. All species of wild carnivores sampled, except coatis, being 40.4% (n = 65) of individuals, and 37.1% (n = 13) of domestic dogs were exposed to parvovirus. Only maned wolves (1.67%, n = 2) were exposed to canine brucellosis and hoary fox to Brucella spp. (1.47%, n = 1). This is the first report of pampas cat, jaguarondi and skunk exposure to parvovirus, and of maned wolf to Brucella canis. CDV and parvovirus deserve attention in ENP by the possibility of involvement of domestic dogs in its transmission, although it can not be proven in this study. At the moment, brucellosis doesn\'t seem to be a sanitary threat for carnivores population at ENP.

Memoria (licenciado en ciencias jurídicas y sociales)

OBJETIVO: Estudiar el comportamiento cinético de enrofloxacino y su metabolito, ciprofloxacino, en ovejas, tras la administración por las vías intravenosa y subcutánea de una dosis de 5 mg/kg, y tras la administración en solución del polímero P407 al 25% y en solución del polímero P407 al 25% + carboximetilcelulosa al 2% por vía subcutánea a la dosis de 15 mg/kg. METODOS: La determinación de enrofloxacino y de ciprofloxacino en plasma y leche se realizó mediante HPLC con detección fluorescente, siguiendo el método descrito por Siefert y cols. (1999). El ajuste a métodos farmacocinéticos compartimentales y no compartimentales se realizó mediante el programa WinNonlin Professional® y MULTIFIT® (Proost, 1997). El criterio utilizado para determinar cuál era la ecuación que mejor describía la evolución de los datos experimentales en cada caso, fue el Criterio de Información de Akaike (AIC) (Yamaoka y cols., 1978). RESULTADOS: Tras la administración intravenosa, enrofloxacino y ciprofloxacino se distribuyen según un modelo bicompartimental abierto, al igual que para las vías extravasculares. Tras la administración intravenosa, la vida media obtenida para el enrofloxacino (t1/2λz) fue de 8,11 ± 2,22 h con un tiempo medio de residencia (MRT) de 5,41 ± 1,49 h. Los volúmenes aparentes de distribución de enrofloxacino calculados en función del área bajo la curva (Vz) y en estado estacionario (Vss) resultaron ser de 0,89 ± 0,26 L/kg y 2,01 ± 0,52 L/kg respectivamente, indicando una amplia distribución orgánica. Por lo que respecta al aclaramiento plasmático (Cl), éste alcanzó un valor de 0,16 ± 0,03 L/kg•h. Cuando se administró el enrofloxacino vía subcutánea sin polímero, vía subcutánea en solución del polímero P407 al 25% y vía subcutánea en solución del polímero P407 al 25% + carboximetilcelulosa al 2%, se obtuvieron los siguientes tiempos de vida media: 13,00 ± 2,11, 34,80 ± 8,47 y 38,66 ± 8,97 h, respectivamente, con unos valores de MRT de 7,92 ± 0,67, 20,74 ± 3,57 y 22,71 ± 2,32 h, respectivamente. La biodisponibilidad de enrofloxacino cuando se administró por vía subcutánea sin polímero, alcanzó un valor de 104,72 ± 24,45 %. Valores algo inferiores se obtuvieron cuando se administró el enrofloxacino vía subcutánea en solución del polímero P407 al 25% y en solución del polímero P407 al 25% + carboximetilcelulosa al 2%, que fueron de 82,01 ± 22,06 % y 84,01 ± 21,57 %, respectivamente. En cuanto al metabolito de ciprofloxacino, tras la adminstración intravenosa de enrofloxacino la vida media de ciprofloxacino fue de 6,83 ± 3,00 h con un valor de MRT de 6,36 ± 1,71h. Cuando se administró el enrofloxacino vía subcutánea sin polímero, vía subcutánea en solución del polímero P407 al 25% y vía subcutánea en solución del polímero P407 al 25% + carboximetilcelulosa al 2%, se registraron los siguientes tiempos de vida media para su metabolito ciprofloxacino: 10,62 ± 4,35, 7,15 ± 5,44 y 20,61 ± 6,06 h, respectivamente, con unos valores de MRT de 11,90 ± 2,05, 16,78 ± 3,77 y 21,39 ± 4,85h, respectivamente.Se determinaron las concentraciones mínimas inhibitorias de enrofloxacino y de ciprofloxacino frente a cepas de Staphylococcus aureus, a fin de determinar los índices farmacocinético-farmacodinámicos óptimos. CONCLUSIONES: De dicho estudio se puede concluir que una dosis de 15 mg/kg podría ser efectiva por vía subcutánea cuando se administre junto con polímero P407 al 25% o junto con polímero P407 al 25% + carboximetilcelulosa al 2%, en ovejas contra aislados bacterianos con CMI  0,5 µg/mL. La penetración en leche de enrofloxacino alcanzó unos ratios bajos, con unas relaciones AUCleche/AUCplasma cercanas a 0,5 en las vías subcutáneas y de 1 en la vía intravenosa. En el ciprofloxacino alcanzó unos ratios elevados, alcanzando relaciones del 10-20. / OBJECTIVE. To study the pharmacokinetics of enrofloxacin and its metabolite, ciprofloxacin, were studied following intravenous and subcutaneous administration of single doses of 5 mg/kg to healthy sheeps, and as a long-acting poloxamer 407 gel formulation and poloxamer 407 + carboxymethylcellulose. METHODS: Plasma concentrations were determined by HPLC assay with fluorescence detection following the method described by Siefert et al. (1999). The fitting to compartmental and non compartimental pharmacokinetic methods was carried out by using WinNonlin Professional® computers programmes. The Akaike´s information criterion (AIC) (Yamaoka et al., 1978) was used to select the best equation that defines plasma concentration-time data for each animal. RESULTS: The enrofloxacin plasma concentration versus time data after intravenous and extravascular administrations could best be described by a two compartment open model.The enrofloxacin terminal half-life (t½z) was 8,11hh after intravenous administration, with a mean residence time (MRT) of 5,41 h. The apparent volumes of distribution calculated by the area method (Vz) and at steady-state (Vss) were 0,89 and 2,01 L/kg, respectively, indicating a wide body distribution. Total body clearance was 0,16 L/kg•h. The ciprofloxacin terminal half-life (t½z) was 6,83 h after intravenous administration, with a mean residence time (MRT) of 6,36 h. After extravascular administrations, terminal half-lives were 13,00, 34,80 and 38,66 h for enrofloxacin administration subcutaneously without poloxamer, with long-acting poloxamer 407 gel formulation and with poloxamer 407 + carboxymethylcellulose, respectively. MRT values obtained were 4,08, 7,58 and 7,16 h respectively. Terminal half-lives were 10,62, 7,15 and 20,61 h for ciprofloxacin metabolite, after enrofloxacin extravascular administrations, subcutaneously without poloxamer, with long-acting poloxamer 407 gel formulation and with poloxamer 407 + carboxymethylcellulose respectively. MRT values obtained were 11,90, 16,78 and 21,39 h respectively. Absolute bioavailability was104,72 % after enrofloxacin subcutaneous administration. Similar values were obtained, 82, 01 % and y 84,01 %, after enrofloxacin administration subcutaneously with long-acting poloxamer 407 gel formulation and with poloxamer 407 + carboxymethylcellulose, respectively. Minimal inhibitory concentrations (MIC) assays of enrofloxacin against different strains of Staphylococcus aureus were performed in order to compute pharmacodynamic surrogate markers. CONCLUSION: It can be concluded from this study that a dosing régimen of 15 mg/kg could be effective by subcutaneous route with polymer P407 (25%) with or without carboximetylcelulose (2%) in sheep against Staphylococcus aureus isolates with MICs  0,5 µg/mL.

Esta tesis tuvo como objetivos 1) relacionar diferentes parámetros ultrasonográficos con el DG y evaluar las fluctuaciones séricas de P<SUB>4</SUB> durante la gestación en la gata doméstica; 2) evaluar el efecto farmacológico del ALI y CLO para interrumpir la gestación temprana y media en felinos; 3) estudiar los cambios ultrasonográficos durante el TRT; 4) evaluar la fertilidad postratamiento. Para cumplir con estos objetivos se realizaron tres experimentos. En el experimento uno se realizó un seguimiento ultrasonográfico y endocrinológico desde el día 21 de gestación hasta el parto. Todas las gatas llegaron al final de la gestación. Pudo visualizarse una correlación positiva entre los registros ultrasonográficos de las mediciones realizadas a los SG y fetos con los DG. Así mismo se obtuvo una correlación positiva entre la concentración sérica de P<SUB>4</SUB>, los DG y los DPP. La mayoría de los parámetros ultrasonográficos fueron explicados por la función polinómica con r<SUP>2</SUP> >0.70. En el experimento dos y tres se evaluó el efecto del ALI y CLO entre 21-22 y 35-38 días de gestación, respectivamente. El ALI resultó ser efectivo para interrumpir la gestación temprana y media sin la ocurrencia de efectos colaterales. En contraposición el CLO no resultó efectivo para interrumpir la preñez temprana y media, presentando efectos colaterales de grado leve. Los registros ultrasonográficos de las mediciones realizadas a los SG y fetos permitieron detectar cambios relacionados con interrupción temprana y media de la gestación. Se estudiaron las fluctuaciones de P4 en relación al TRT, observándose un ascenso postratamiento en las gatas ALI, y un descenso postratamiento en las gatas CLO. Todas las gatas del grupo ALI y CLO retornaron al estro y conservaron la fertilidad. En conclusión, con la determinación de ecuaciones exponenciales hemos correlacionado las mediciones ultrasonográficas y de la concentración sérica de P<SUB>4</SUB> con los DG. Por lo tanto con este estudio se obtuvieron nuevos datos para el monitoreo de la gestación en la gata desde el día 21 hasta el final de la preñez. Así mismo los protocolos utilizados para interrumpir la gestación mostraron que el CLO no resultó efectivo pero el ALI sí resultó efectivo para interrumpir la preñez en gatas que presentaban entre 21-22 y 35-38 d de gestación no afectando la fertilidad posterior.

El oocito de mamífero está rodeado por una matriz denominada zona pelúcida (ZP). Esta envoltura participa en procesos tales como la inducción de la reacción acrosómica, la unión de espermatozoides y también puede estar implicada en la especiación. Estudios recientes han demostrado que la matriz de ZP de ovocitos en varias especies se compone de cuatro glicoproteínas, denominadas ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4, en lugar de las tres descritas en el ratón, cerdo y vaca. En la gata (Felis catus), esta matriz se compone de al menos tres glicoproteínas denominadas ZP2, ZP3 y ZP4. Sin embargo, la presencia de cuatro proteínas en varios mamíferos, sugiere que necesita una reevaluación de la ZP en la gata. Además, en esta tesis, se realizaron investigaciones para determinar la expresión de una cuarta glicoproteína en la ZP de conejo (Oryctolagus cuniculis). Los objetivos de esta investigación fueron analizar la composición de proteínas de ZP gato por medio de análisis proteómico y en el conejo se amplificó ZP1 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). En la ZP aislada de ovarios y ovocitos de gato, se detectaron varios péptidos correspondientes a cuatro proteínas, teniendo una cobertura del 33,17%, 71,50%, 50,23% y 49,64% para ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4, respectivamente. Por otra parte, se confirmó por análisis molecular la expresión de los cuatro genes de ZP a partir de ARN total aislado de ovarios de gato, las ZPs de gato fueron parcialmente amplificadas por RT-PCR. En el conejo la ZP1 incluye un marco de lectura abierto de 1825 nucleótidos que codifican un polipéptido de 608 residuos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos deducida de ZP1 de conejo mostró una alta identidad con otras especies: 70% de identidad con ZP1 humana y caballo y 67% de identidad con la ZP1 de ratón y rata. A nivel proteómico, fueron detectados por espectrometría de masas péptidos correspondientes a las cuatro proteínas ZP. Además, mediante un análisis filogenético molecular de ZP1 mostró que este gen presenta una pseudogenización de por lo menos cuatro veces durante la evolución de los mamíferos. Los datos presentados en esta tesis proporcionan evidencia, por primera vez, que la ZP de conejo y la ZP de gato se compone de cuatro glicoproteínas. 2 / The mammalian oocyte is surrounded by a matrix called the zona pellucida (ZP). This envelope participates in processes such as acrosome reaction induction, sperm binding, and may be involved in speciation. Recent studies have shown that the ZP matrix of oocytes in several species is composed of four glycoproteins, designated ZP1, ZP2, ZP3 and ZP4, rather than the three described in mouse, pig and cow. In cat (Felis catus), this matrix is composed of at least three glycoproteins called ZP2, ZP3 and ZP4. However, the presence of a fourth protein in several mammals, meaning that a reevaluation of cat ZP is needed. Additionally, in this thesis, investigations were carried out to unveil a fourth glycoprotein in the rabbit (Oryctolagus cuniculis) ZP. The objectives of this research was to analyse of the protein composition of cat ZP by means of proteomic analysis and rabbit ZP1 was amplified by reverse transcribed polymerase chain reaction (RT-PCR). Using ZP from ovaries and oocytes of cat, several peptides corresponding to four proteins were detected, yielding a coverage of 33.17%, 71.50%, 50.23% and 49.64% for ZP1, ZP2, ZP3 and ZP4, respectively. Moreover, the expression of four genes was confirmed by molecular analysis. Using total RNA isolated from cat ovaries, the complementary deoxyribonucleic acids (cDNAs) encoding cat ZPs were partially amplified by RT-PCR. In the rabbit the ZP1 cDNA contains an open reading frame of 1825 nucleotides encoding a polypeptide of 608 amino acid residues. The deduced amino acid sequence of rabbit ZP1 showed high identity with other species: 70% identity with human and horse ZP1, and 67% identity with mouse and rat ZP1. At the proteomic level, peptides corresponding to the four proteins were detected by mass spectrometry. In addition, a molecular phylogenetic analysis of ZP1 showed that pseudogenization of this gene has occurred at least four times during the evolution of mammals. The data presented in this thesis provide evidence, for the first time, that the rabbit and cat ZP is composed of four glycoproteins.

Tesis por compendio de publicaciones / El objetivo principal de este trabajo fue el estudio y rentabilidad de la aplicación de la inseminación post-cervical en granja así como el estudio de la influencia de distintas poblaciones espermáticas con diferentes características en su selección en el útero de la cerda; para ello se analizaron los espermatozoides que fueron expulsados en el reflujo tras la inseminación y aquellos que llegaron a la unión útero-tubárica. Los resultados se reflejan en la publicación de cuatro artículos. En el artículo I, los resultados mostraron que la aplicación de inseminación post-cervical tiene unos rendimientos reproductivos similares o superiores que la inseminación cervical, siendo los rendimientos mayores cuando se inseminan cerdas con 2-3 o ≥6partos.Al mismo tiempo se realizó un estudio económico detallado de la aplicación de la inseminación post-cervical en granja, siendo éste sustancialmente beneficioso al aplicar dicha técnica en comparación con la inseminación tradicional. Además, se pudo observar que tanto el volumen (%) como el número de espermatozoides (%) en el reflujo eran superiores cuando se utilizaba la inseminación cervical en relación a la post-cervical. Por otro lado, la calidad espermática se encontraba reducida en aquellos espermatozoides recogidos en el reflujo comparados con la dosis seminal inicial. En el artículo II, se evaluó la influencia de diferentes niveles de motilidad espermática en la dosis de inseminación sobre el % de cerdas con reflujo, el volumen (%), concentración espermática (%) y tipo de espermatozoides (%) (basados en sus características mótiles) recolectados en el reflujo a diferentes tiempos tras la inseminación post-cervical. Los resultados mostraron que no había diferencias en el % de cerdas que presentaban reflujo independientemente de la dosis de inseminación recibida (motilidad baja, media o alta). De la misma manera no se observaron diferencias en relación al volumen (%) y número de espermatozoides (%) entre los diferentes grupos experimentales a los distintos tiempos de recogida. Sin embargo, el % de espermatozoides de media o baja motilidad recolectados en el reflujo eran mayores que si presentaban una motilidad alta. Este hecho se observó a partir de los 16 minutos tras la inseminación, indicando un proceso de expulsión de espermatozoides aleatorio en los primeros momentos tras la inseminación (0-15 min) mientras que entre los 16-60 minutos, la eliminación espermática se correspondía a un proceso selectivo descartando en mayor medida espermatozoides con una capacidad mótil disminuida. En el artículo III, se evaluó la diferencia morfométrica entre los espermatozoides recolectados en el reflujo y en los que se encontraron en la unión útero-tubárica con aquellos que conformaban la dosis seminal de inseminación. Los resultados mostraron que el reflujo está formado por poblaciones espermáticas con una determinada dimensión y forma, siendo los de un tamaño de cabeza y longitud del flagelo menor los que tienden a ser encontrados en el reflujo. Además se comprobó que ni el fluido uterino, ni la alteración de acrosomas ni la osmolaridad estaban implicados en los cambios morfométricos. Por otro lado, se observó que el lugar de deposición espermático influía en el tamaño del espermatozoide que se recolectaba en el reflujo. Además, los datos obtenidos muestran que los espermatozoides que alcanzan la unión útero-tubárica presentan la misma longitud del flagelo que aquellos presentes en la dosis inicial de inseminación. En el artículo IV, barajamos la hipótesis de que los espermatozoides con morfoanomalías podían ser descartados o modificados por el ambiente uterino tras la deposición en el tracto genital de la hembra. Los resultados mostraron un mayor % de espermatozoides con morfoanomalías en el reflujo que en la dosis seminal y prácticamente la totalidad de la población espermática que colonizaba la unión útero-tubárica presentaban una morfología normal. Por otro lado, se observó que el fluido uterino no tenía ninguna influencia en cambios morfológicos de los espermatozoides eyaculados, sin embargo, cuando el fluido uterino se incubó con espermatozoides epididimarios se produjo una drástica reducción de las morfoanomalías. En conclusión, la presente tesis doctoral muestra que la inseminación artificial post-cervical es una técnica viable para su uso en las granjas. De hecho las ventajas obtenidas tanto a nivel reproductivo como económico son claras, siendo su implementación y aplicación a nivel de campo unarealidad. Por otro lado, se ha comprobado que los eyaculados son poblaciones heterogéneas con diversas características de motilidad, morfología y morfometría, y que estas particularidades propias de cada espermatozoide, influyen en su interacción con el tracto genital de la hembra una vez que son depositados. La mayor parte de los espermatozoides son eliminados en su trayecto hacia el lugar de fecundación, y esa discriminación parece ser un proceso selectivo o debido a modificaciones de algunas de las características propias del espermatozoide que sufren en su interacción con el útero. / The main objective of this work was to study the viability of applying post-cervical insemination on the farm, as well as to the study the influence of different spermatozoa populations - with different characteristics - on the selection that takes place in the sow uterus; for this we analyzed spermatozoa which were expelled in the reflux after insemination and those which did reach the utero-tubal junction. In article I, the results showed that the use of post-cervical insemination produces a very similar or even higher reproductive yield than cervical insemination, the yield being much higher when inseminating sows with 2-3 or ≥6 births. At the same time, a detailed economic study of post-cervical insemination on the farm showed that this method produced substantially greater benefits than traditional insemination. Moreover, we were able to observe that the volume (%) as well as the number of spermatozoa (%) in the reflux was higher when using cervical insemination compared to post-cervical. On the other hand, the sperm quality was lower in those spermatozoa collected from the reflux compared to the initial insemination quality. In article II, we evaluated the influence of different levels of sperm motility in the insemination dose on the percentage of sows with reflux, the volume (%), sperm concentration (%), and type of spermatozoa (%) (based on the motility characteristics) collected from the reflux at different times after post-cervical insemination. The results showed that there were no differences in the % of sows which had reflux, regardless of the insemination dose received (low, medium or high motility). In the same way, there were no observable differences as regards the volume (%) and number of spermatozoa (%) between the different experimental groups at different times of collection. However, the % of spermatozoa of medium or low motility collected in the reflux was higher than those of higher motility. This observation was made 16 minutes after insemination, indicating the expulsion of random spermatozoa in the first moments following insemination (0-15 min), while at 16-60 minutes sperm elimination was a selective process, whereby spermatozoa with a low motility were expelled. In article III, we evaluated the morphometric differences between spermatozoa collected in the reflux and utero-tubal junction and those that formed the initial insemination dose. The results showed that the reflux was formed of sperm populations with a certain size and shape, mainly those with a small head and flagellum. It was also demonstrated that the uterine fluid, acrosome alteration and osmorality were not involved in these morphometric changes. On the other hand, we observed that the sperm deposition place was related with the size of the spermatozoa collected during reflux. Moreover, the data obtained showed that spermatozoa which reached the utero-tubal junction had the same length as those in the initial insemination dose. In article IV, we considered the hypothesis that the spermatozoa with morphoanomalies could be eliminated or modified by the uterine environment after deposition in the female genital tract. The results showed a higher % of spermatozoa with morphoanomalies in the reflux than in the seminal dose, while practically the whole spermatozoa population which colonized the utero-tubal junction had a normal morphology. Moreover, it was seen that the uterine fluid had no effect on the morphological changes that occurred in the ejaculated spermatozoa, although when the uterine fluid was incubated with epididymal spermatozoa, there was a drastic decrease in the number morphoanomalies. In conclusion, this PhD thesis shows that post cervical artificial insemination is a viable technique for use in farms, where the advantages are clear from both reproductive and economic points of view. Indeed, its implementation and application on farms is firmly established. Furthermore, we demonstrate that ejaculations are heterogeneous populations with a diverse motility, morphology and morphometry, and that these particularities - characteristics of each spermatozoon - influence any interaction with the genital tract of the female once deposited. Most spermatozoa are eliminated during their journey to the site of fecundation in what seems to be a selective process of discrimination or due to modifications in some of the characteristics of each individual spermatozoon as it interacts with the uterus.

Tesis por compendio de publicaciones / El hámster sirio (Mesocricetus auratus) es un roedor de reproducción estacional en días largos que sufre una fuerte atrofia testicular cuando es sometido a un fotoperiodo corto. La presente tesis doctoral tiene como objetivos, en primer lugar, estudiar las variaciones histomorfométricas que tienen lugar en el testículo durante la regresión testicular debida a fotoperiodo corto así como determinar la importancia que tienen los fenómenos de proliferación y apoptosis en el proceso de atrofia del epitelio seminífero durante este periodo; en segundo lugar, dilucidar si la histoquímica de lectinas “in situ” permite identificar células germinales y/o somáticas en apoptosis durante esta regresión; finalmente, determinar si existe muerte celular de células de Sertoli durante esta regresión y si se produce por apoptosis. Para ello, se utilizaron 50 hámsteres sirios macho jóvenes sometidos a un fotoperiodo de 14:10h luz-oscuridad. Cinco machos se utilizaron como grupo de control mantenidos con el fotoperiodo de 14:10 h de luz-oscuridad. Los otros animales fueron sometidos a un fotoperiodo corto de 8:16h de luz-oscuridad. A las 4, 6, 8, 10 y 12 semanas se sacrificaron nueve animales tratados más un control, se extrajeron sus testículos y se procesaron para su estudio tanto con microscopía de luz (H&E, histoquímica de lectinas y TUNEL e inmunohistoquímica de PCNA y vimentina) como con microscopía electrónica de transmisión (MET). Mediante microscopía de luz se realizaron diversos estudios semicuantitativos. Con ellos y los del tiempo de sacrificio se establecieron tres grupos de regresión: regresión media (MR), regresión fuerte (SR) y regresión total (TR). Se calcularon también los índices de proliferación y apoptosis de las diferentes células germinales y somáticas del epitelio seminífero. Además, se realizaron estudios cuantitativos utilizando un software de análisis de imagen. Mediante la MET se estudiaron los cambios en las células germinales y de Sertoli durante la apoptosis. Durante la regresión testicular debida a fotoperiodo corto se produjo, a nivel celular en el epitelio seminífero, un descenso inicial de la proliferación en espermatogonias y un aumento de la apoptosis de células germinales. Al final de la regresión, se recuperó la actividad proliferativa de espermatogonias aunque la actividad apoptótica continuó afectando principalmente a los espermatocitos. Histomorfométricamente se produjo tanto un descenso del diámetro y volumen tubular como, un acortamiento del túbulo seminífero con un descenso del volumen intersticial. Varias lectinas mostraron afinidad por residuos de glucoconjugados de células germinales en apoptosis: Gal β1,3-GalNAcα1, α-D-manosa, N-acetilgalactosamina y L-fucosa. Además, la lectina PNA mostró afinidad por células de Sertoli que se encontraban en apoptosis. La H&E y las secciones semifinas identificaron células de Sertoli con una morfología alterada siendo algunas TUNEL+ en los grupos MR y SR. Mediante MET se identificaron cambios característicos de la apoptosis en estas células. Por otra parte, durante la regresión testicular, se observaron, con microscopía de luz, espermátidas elongadas fagocitadas por células de Sertoli mayoritariamente en los grupos MR y SR. En conclusión: a) la regresión testicular en el hámster sirio conlleva, tanto un descenso del diámetro y volumen del túbulo seminífero como el acortamiento del túbulo seminífero y un descenso del volumen intersticial. Además, hay un descenso inicial en la proliferación y un incremento en la apoptosis de las células germinales. Al final de la regresión, las actividades proliferativa y apoptótica de las espermatogónias recuperan los valores anteriores a la regresión; b) el uso de la histoquímica de lectinas podría ser una herramienta muy útil para estudiar la apoptosis en el epitelio seminífero debido a la especificidad mostrada; c) hay evidencias morfológicas de la pérdida de células de Sertoli por apoptosis. También algunas espermátidas elongadas son fagocitadas y eliminadas por estas células de Sertoli. / The Syrian hamster (Mesocricetus auratus) is a long-day seasonal breeding rodent which suffers strong testicular atrophy when subjected to a short photoperiod. The present thesis has as objectives: (i) to study the histomorphometrical changes that take place in the Syrian hamster testes during testicular regression due to a short photoperiod and to determine the importance of the phenomena of proliferation and apoptosis in the process of seminiferous epithelium atrophy during this period; (ii) to determine whether “in situ" lectin histochemistry allows the identification of germ and/or somatic cells in apoptosis during this regression; and iii) to determine whether Sertoli cell death occurs during regression and whether it is produced by apoptosis. For this purpose, 50 young Syrian hamsters subjected to a 14:10 h L:D photoperiod were used. Five males were maintained with this 14:10 h L:D photoperiod and used as Control. The other forty five animals were subjected to a short photoperiod of 8:16 h L:D. At 4, 6, 8, 10 and 12 week, nine treated animals plus one control were sacrificed, and their testes were extracted and processed for study both by light microscopy (H&E, lectin and TUNEL histochemistry techniques and PCNA and vimentin immunohistochemistry) and transmission electron microscopy (TEM). Using light microscopy, several semiquantitative studies were carried out. Based on these data and the week when the animals were sacrificed, three regression groups were established: mild regression (MR), strong regression (SR) and total regression (TR). The proliferation and apoptosis indexes of the different germinal and somatic cells of the seminiferous epithelium were calculated. Furthermore, quantitative studies were made using image analysis software. Using TEM the changes suffered by the different germ and Sertoli cells during apoptosis were studied. During testicular regression due to short photoperiod, an initial decrease in spermatogonia proliferation and an increase in germ cell apoptosis were observed at cellular level in the seminiferous epithelium. At the end of regression, the spermatogonial proliferative activity was recovered although the apoptotic activity continued, mainly affecting spermatocytes. Histomorphometrically, a decrease in tubular diameter and volume, shortening of the seminiferous tubules and a decrease in the interstitial volume were observed. Several lectins showed affinity for glycoconjugate residues (Gal β1,3-GalNAcα1, α-D-mannose, N-acetylgalactosamine and L-fucose) of germ cells in apoptosis. Furthermore, the PNA lectin showed affinity for Sertoli cells undergoing apoptosis. H&E and semi-thin sections identified Sertoli cells with a degenerated morphology that were TUNEL+ in the MR and SR groups. Apoptotic changes in the nucleus and cytoplasm of these cells were identified by TEM. Moreover, during testicular regression and using light microscopy, some elongated spermatids were seen to have been phagocytosed by Sertoli cells, mainly in the MR and SR groups. In conclusion: a) testicular regression in Syrian hamster involves both a decrease in seminiferous tubular diameter and volume, and shortening of the seminiferous tubule accompanied by a decrease in interstitial volume. Furthermore, there is an initial decrease in proliferation and an increase in apoptosis involving all germ cells. At the end of regression, the proliferative and apoptotic activities of the spermatogonia recover the values observed prior to regression; b) lectin histochemistry can be considered a very useful tool for studying apoptosis in the seminiferous epithelium because of the specificity it shows; c) there is morphological evidence that some Sertoli cells are lost through apoptosis. Also, some elongated spermatids are phagocytized and eliminated by Sertoli cells.

OBJETIVOS: El propósito de este estudio fue determinar la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales (AEs) de corteza de canela, hojas de canela y de clavo y de los compuestos puros eugenol, cinamaldehído y vainillina frente a Listeria monocytogenes Scott A y Escherichia coli O157:H7 y el efecto de la vainillina sobre la termorresistencia de L. monocytogenes Scott A en leche de vaca semidescremada. METODOLOGIA: Se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración No Inhibitoria (CNI) de los antimicrobianos en Caldo Tripticasa de Soja (CTS) mediante el modelado de la curva dosis-respuesta obtenida al graficar las áreas fraccionadas frente a la concentración de antimicrobiano, a pH 6 y 7. También se determinaron las Concentraciones Parcialmente Inhibitorias (CPIs) y las Concentraciones Mínimas Bactericidas (CMBs). La actividad de las combinaciones de antimicrobianos se determinó mediante el método del tablero de ajedrez, que permitió obtener la Concentración Fraccionada Inhibitoria de las mezclas (CFI) y los isobologramas correspondientes. La actividad de los antimicrobianos y sus combinaciones se determinó también en leche pasteurizada de vaca con diferentes concentraciones de grasa (entera, semidesnatada y desnatada) a temperaturas de 7 ºC y 35 ºC. La resistencia térmica de L. monocytogenes Scott A se ensayó en leche semidescremada calentada a 55 ºC, 58 ºC, 60 ºC y 62 ºC con 900, 1400 y 1800 ppm de vainillina. Dos modelos matemáticos se usaron para ajustar los datos obtenidos: el modelo “shoulder+log-linear” de Geeraerd y el modelo Weibull. RESULTADOS Y DISCUSION: E. coli 157:H7 fue más resistente a los AEs de corteza de canela, hojas de canela y clavo que L. monocytogenes. La vainillina y el cinamaldehido mostraron una actividad antimicrobiana similar frente a los dos microorganismos. El antimicrobiano con menor CMI frente a L. monocytogenes fue el AE de corteza de canela seguido por el AE de clavo, cinamaldehído el AE de hojas de canela, el eugenol y la vainillina. La menor CMI frente a E. coli O 157:H7 la presentó el cinamaldehido, seguido por el AE de corteza de canela, el eugenol, el AE de clavo, el AE de hojas de canela y la vainillina. Los antimicrobianos con menor CMB, fueron el eugenol, los AEs de clavo y hojas de canela seguidos por el cinamaldehido, el AE de corteza de canela y la vainillina. El pH no afectó los valores de CMI ni de CMB. Todas las combinaciones de antimicrobianos ensayadas fueron aditivas para L. monocytogenes; para E. coli O157:H7 las mezclas con AE de corteza de canela fueron indiferentes y las mezclas con vainilla fueron sinérgicas. En la leche de vaca el AE de corteza de canela fue el antimicrobiano más efectivo, seguido por el AE de clavo, AE de hojas de canela y la vainillina. Los AEs de canela y clavo aumentaron su actividad antimicrobiana en las mezclas, especialmente las combinaciones de AEs con vainilla. La incubación a bajas temperaturas y el menor contenido de grasa de la leche aumentó la actividad antimicrobiana de los AEs. La incorporación de vainillina en la leche disminuyó la termorresistencia de L. monocytogenes, incrementando la tasa de muerte y disminuyendo la longitud del hombro de las curvas de destrucción térmica, efecto que fue más evidente cuando se usaron las temperaturas más bajas. CONCLUSIONES: La vainillina y los AEs de corteza de canela, hojas de canela y clavo presentan actividad antimicrobiana en leche de vaca frente a L. monocytogenes y E. coli O 157:H7. Las dosis necesarias de los antimicrobianos para producir la inhibición se reducen combinando los antimicrobianos entre sí. El uso de concentraciones sub-inhibitorias de vainillina en leche semidescremada favorece la inactivación térmica de L. monocytogenes. / OBJETIVES: The purpose of this study was to determine the antimicrobial activity of cinnamon bark, cinnamon leaves and clove essential oils (EOs) against Listeria monocytogenes Scott A and Escherichia coli O157:H7 and the effect of vainillin on the thermal resistance of L. monocytogenes Scott A in semiskim cow’s milk. METHODOLOGY: The MIC (Minimal Inhibitory Concentration) and the NIC (Non Inhibitory Concentration) of the antimicrobials was determined in Trypticase Soy Broth (TBS), modelling the dose-response curve based on the fractional area against the concentration of antimicrobial. Partially Inhibitory Concentrations (PICs) and Minimum Bactericidal Concentrations (MBCs) were also determined. The FICs (Fractional Inhibitory Concentrations) index of mixtures of antimicrobials was established by the checkerboard method and the corresponding isobolograms. The activity of the antimicrobials and their combinations was determined in pasteurised cow’s milk. The effect of storage temperatures (7 °C and 35 °C) and the effect of milk fat on the antimicrobial activity was also evaluated. Finally, the heat resistance of L. monocytogenes in pasteurized cow’s milk heated to moderate temperatures (55, 58, 60 and 62°C) with different levels of vanillin (900, 1400 and 1800 ppm) was studied. Two models were used to fit the data: the “shoulder+loglinear” model and the Weibull model. RESULTS AND DISCUSSION. The antimicrobial with the lowest MIC against L. monocytogenes was cinnamon bark EO, followed by clove EO, cinanaldehyde, cinnamon leaves EO, eugenol and vanillin. The antimicrobial with the lowest MIC against E. coli O 157H was cinamaldehyde followed by cinnamon bark EO, eugenol, clove EO, cinnamon leaves EOs and vanillin. The pH did not affect the MICs and CNIs values. The antimicrobial with the lowest MBC against L. monocytogenes was clove EO, followed by eugenol, cinnamon leaves EO, cinnamon bark EO, cinamaldehyde, and vanillin. The antimicrobial with the lowest MBC against E. coli O157:H7 was eugenol followed by clove EO, cinnamon leaves EO, cinamaldehyde, cinnamon bark EO and vanillin. Mixtures of all EOs were additive against L. monocytogenes; against E. coli O157:H7mixtures with cinnamon bark EO were indifferent and mixtures with vanillin were synergistic. The antimicrobial with the highest antimicrobial activity in semi-skim cow’s milk was cinnamon bark EO, followed by clove EO, cinnamon leaves EO and vanillin. Incubations in milk with low fat content or at low temperature increased the antimicrobial activity. Mixtures of EOs increased the antimicrobial activity of individual components and combinations with vanillin were the most effective. Thermal resistance of L. monocytogenes in milk was reduced by vanillin at all temperatures tested. Vanillin increased the death rate and reduced the shoulder length of L. monocytogenes of thermal destruction curves in milk. This effect was more evident when working at lower temperatures. CONCLUSIONS: Cinnamon bark, cinnamon leaves and clove EOs show antimicrobial activity in pasteurized cow’s milk. Antimicrobial mixtures reduce the concentration of individual components to inhibit microbial growth. Sub-inhibitory concentrations of vanillin in semiskim milk increase the thermal inactivation of L. monocytogenes .

En el período cercano a la ovulación o periovulatorio el tracto genital femenino ofrece el microentorno necesario para el transporte e interacción de los gametos, hasta culminar con una fecundación exitosa. En la especie bovina, el espermatozoide debe permanecer en el tracto femenino para obtener su capacidad fecundante; las moléculas y mecanismos que participan en dotar de esta capacidad a los espermatozoides, no están del todo esclarecidos. Por ello, es de suma importancia conocer estos mecanismos a fondo para desarrollar nuevas técnicas de reproducción asistida que mejoren la capacidad fecundante del gameto masculino. Nuestros objetivos fueron identificar los diferentes mecanismos moleculares presentes en el tracto genital femenino implicados en el proceso de maduración del espermatozoide, tras su depósito, transporte y permanencia en el periodo previo a la ovulación, así como analizar las similitudes y diferencias en la expresión del transcriptoma y proteoma del útero y oviducto bovino. Para identificar la expresión del transcriptoma y la expresión génica diferencial, utilizamos el análisis de micromatrices. Las muestras de epitelio oviductal, de tejido endometrial y de los fluidos oviductales (FOBs) y uterinos (FUBs) procedieron de seis novillas sincronizadas hormonalmente en la fase periovulatoria. Para la identificación de proteínas contenidas en FOB y FUB utilizamos las técnicas de electroforesis bidimensional, DiGE y espectrometría de masas (MS/MS). Nuestros resultados del análisis de micromatrices, indicaron que un total de 5509 genes son expresados diferencialmente en el oviducto y útero bovino en la fase periovulatoria. Así, también observamos que la expresión génica entre el oviducto y endometrio no es idéntica, si bien tienen una amplia similitud donde comparten expresión de genes que intervienen en sintetizar proteínas relacionadas con la unión, respuesta al estímulo, en los mecanismos de defensa y de protección ante el estrés oxidativo. También se comprobó la existencia de vías específicas para cada uno de los tejidos estudiados. Así, en el oviducto destacan la expresión de genes relacionados con actividad catalítica, del choque térmico y en endometrio destacan la presencia de transcritos relacionados con la adhesión focal y la modificación de la matriz extracelular. Se ha detectado la expresión de hasta 175 genes que intervienen en los procesos de secreción. Identificamos 47 proteínas por MS/MS, procedentes de geles bidimensionales-DiGE, de las cuales 29 son comunes para FOB y FUB. Estas proteínas intervienen en proceso biológicos generales como la comunicación celular, la respuesta al estrés y procesos catabólicos. Observamos que 9 de ellas fueron exclusivas del FOB destacando algunas proteínas de la familia de las anexinas implicadas en los mecanismos de unión, así como en el establecimiento del reservorio oviductal. Otras 5 proteínas fueron identificadas como únicas de FUB involucradas en actividades catalíticas y de glicolisis. / During the period upcoming to ovulation or peri-ovulatory phase, the female genital tract provides the microenvironment required for transport and interaction of gametes, culminating in a successful fertilization. In the bovine species, the sperm must remain in the female tract to obtain fertilizing capacity, the molecules and mechanisms involved in providing this capability to sperm, is not entirely clarified. It is therefore important to investigate these mechanisms thoroughly to develop new assisted reproductive techniques that improve the fertilizing capacity of the male gamete. Our aims were to identify the different molecular mechanisms present in the female genital tract involved in the maturation of sperm, after insemination, transport and permanence in the peri-ovulatory phase and analyze the similarities and differences in the expression of the transcriptome and proteome of bovine uterus and oviduct. To identify transcriptome expression and differential gene expression, we used microarray analysis. The sample of oviductal epithelium, endometrial tissue and oviductal fluids (FOBs) and uterine (FUBs) proceeded from six heifers hormonally synchronized in the peri-ovulatory phase. For the identification of protein contained in FUB and FOB bimensional electrophoresis techniques, DIGE and mass spectrometry (MS / MS) were used. Our results of the microarray analysis indicated that a total of 5509 genes were differentially expressed in the bovine oviduct and uterus in the peri-ovulatory phase. Thus, we also observed that gene expression in the oviduct and endometrium is not identical, have similarity, they share expression of genes involved in synthesizing proteins referring to binding, response to stimuli, mechanisms of defense and protection against oxidative stress. We also confirmed the existence of specific pathways for each of the tissues analyzed. In the oviduct, the expressed gene are related to catalytic activity and heat shock; however, in the endometrium there are gene expression associated with focal adhesion, and modification of the extracellular matrix. Up to 175 genes that are expressed are involved in the secretion pathways. We identified 47 proteins by MS / MS from two-dimensional gels and DiGE. A number of 29 proteins are common between FOB and FUB and are involved in general biological processes as cellular communication, stress response and catabolic processes. We identified 9 proteins that are specific for the FOB. It is important to emphasize the proteins of the annexin family. These proteins are involved in the binding mechanism and in the establishment of the sperm reservoir. Other five proteins were specific for the FUB and are involved in catalytic activities and glycolysis.