As leucemias são neoplasias que afetam o sistema hematopoiético e compreendem 2,53% dos casos de câncer relatados. Entre as leucemias, 27,95% correspondem a casos de leucemia mielóide crônica (LMC), que apresenta como marcador genético o cromossomo Philadelphia (Ph). Presente em mais de 80% dos casos, o cromossomo Ph é derivado da translocação t(9;22) (q34;q11), que origina um gene híbrido entre a região 5´ do gene bcr e 3´do gene abl. O produto deste gene é uma proteína Bcr-Abl na qual a atividade reguladora e nuclear do domínio tirosina quinase, originado da proteína Abl, torna-se constitutiva e citoplasmática. Estas mudanças na atividade tirosina quinase afetam diferentes vias de sinalização, com consequências em vários processos celulares como adesão, proliferação e apoptose. Em nível fisiológico, foi mostrado tanto in vitro quanto in vivo que as células hematopoiéticas precursoras Ph+ se diferenciam principalmente em células eritróides. Entretanto, quase 70% dos pacientes com LMC sofrem anemia, mostrando que, as células Ph+ diferenciadas em células eritróides não conseguem amadurecer até hemácias funcionais. Isto faz da LMC um bom modelo para o estudo da diferenciação de células eritróides e suas características, como os fatores que afetam a sintese de hemoglobina (Hb). A linhagem K562 é uma linhagem celular eritroleucêmica Ph+, amplamente utilizada como modelo para estudar drogas com capacidade anti-proliferativa e/ou indutoras da síntese de hemoglobina fetal. Entre estas drogas encontram-se a aclarrubicina (ACLA) e doxorrubicina (DOX) que, embora sejam análogos químicos pertencentes à família das antraciclinas, possuem mecanismos de ação diferentes e ainda não completamente esclarecidos. Neste trabalho, foram investigados vários aspectos da biologia das células K562 durante o tratamento com estas drogas. Foi observado que o tratamento com DOX produz um aumento de tamanho nas células e bloqueio do ciclo celular na fase G2/M, afetando também grandemente a viabilidade celular, com 70% de células mortas no sétimo dia de tratamento. Já durante o tratamento com ACLA a viabilidade, tamanho e ciclo celular foram menos afetados, com aproximadamente 15% de células mortas no sétimo dia de tratamento e um bloqueio transitório do ciclo na fase G1. No entanto, as duas drogas causaram um aumento significativo da síntese de hemoglobina, principalmente DOX que induziu um aumento quase duas vezes maior que o induzido por ACLA. A análise da expressão gênica realizada através da técnica de differential display mostrou várias bandas diferencialmente representadas e com diversas cinéticas de expressão, apresentando semelhanças e diferenças quando são comparados os dois tratamentos ou células tratadas e controle. Destas bandas, 26 estão sequenciadas mostrando genes envolvidos em vários processos celulares como dano do DNA, resistência a drogas, processamento do RNA e codificação de proteinas relacionadas com ferro. Das bandas sequenciadas, 7 foram validadas por RT-PCR (ndrg1, erk2, nf2l2, atp6ap1, rfc1, phf20 e zkscan) sendo observado um aumento na sua expressão durante o tratamento, com exceção de ndrg1 para o qual a expressão foi induzida em vez de aumentada e nf2l2 onde a diferença com o controle foi pequena e não permitiu validar este gene como diferencialmente expresso. Com o objetivo de procurar por mecanismos comuns entre os vários indutores da síntese de hemoglobina em células K562, estes genes foram também analisados durante o tratamento destas células com os indutores hidroxiuréia e dGTP. Além de induzirem a expressão de hemoglobina, os dois tratamentos provocaram um aumento no tamanho das células tratadas e um bloqueio no ciclo celular na fase S. Visando futuros trabalhos envolvendo os genes diferencialmente expressos, foi ainda otimizado um sistema de transferência gênica por eletroporação. Para isto foram testados varios parâmetros como campo elétrico, resistência, capacitância, meios de eletroporação, manipulação das células e uso de inibidores de DNAses. Como resultado, foi alcançado com o eletroporador padrão uma eficiência de transfecção de 81%, similar àquela alcançada pelo nucleoporator (eletroporador de última geração). As condições estabelecidas foram 750 V/cm, resistência infinita, 500 μF, meio RPMI1640, centrifugação e sulfato de zinco pós-pulso. A relação das antraciclinas e a hidroxiuréia, assim como de outros indutores da síntese de hemoglobina, com o ferro intracelular, juntamente com a diferença na expressão, durante o tratamento, de genes afetados direta ou potencialmente pela não disponibilidade de ferro intracelular, nos permitiu gerar uma hipótese para a via de sinalização que leva à síntese de hemoglobina. Nesta, sinais de falta ou não disponibilidade de ferro nas células ativariam a maquinaria celular para a captação e internalização do ferro extra-celular, simultaneamente com síntese de proteínas que utilizam o ferro para realizar as suas funções biológicas, entre elas a hemoglobina. Do mesmo modo, propomos a via de sinalização do ferro como um alvo potencialmente afetado por drogas indutoras da síntese de hemoglobina, como as antraciclinas, cujos alvos são ainda pouco conhecidos. Contudo, mais genes desta via de sinalização, bem como outros indutores, deveram ser estudados para saber se a síntese de hemoglobina pode ser induzida por drogas mais específicas e com menos efeitos colaterais que aquelas usadas atualmente para o tratamento de câncer e outras doenças.

Glioblastomas são os tumores mais agressivos do Sistema Nervoso Central (SNC). Caracterizam-se por sua alta invasibilidade, proliferação, altos índices de recorrência e morte, assim como quimio e radiorresistência. Tumores sólidos apresentam uma organização hierárquica, em que há uma pequena população de células tronco tumorais (CSCs) ou células iniciadoras de tumor (CICs). Essas células são capazes de repopular o tumor, que leva à recorrência. CSCs caracterizam-se por realizar também a mitose assimétrica, na qual parte das células continuam como CSCs e a outra parte sofre diferenciação. Essas células diferenciadas são incapazes de repopular o tumor, uma vez que perderam a sua capacidade tronco. CSCs mostraram ser relativamente resistentes as terapias anticâncer tradicionais como quimio e/ou radioterapia. Doxorrubicina (Doxo) é um agente anticâncer usado em diversos tipos de tumor e atua formando adutos no DNA e também inibindo a ação da topoisomerase II. Dependendo da concentração utilizada de Doxo, diferentes efeitos são observados; por exemplo, baixas doses (100 nM) levam à senescência celular, enquanto que altas doses (10 μM) levam à apoptose. Temozolomida (Tmz) é um anti-tumoral utilizado na terapia de diversos tumores, inclusive gliomas. Resveratrol (Rsv) é um polifenol encontrado em diversas plantas, como a uva, e possui efeitos como: neuroproteção, antiinflamatório, anti-oxidante, proteção cardíaca, entre outros. Nosso objetivo foi avaliar a influência do efeito dessas três drogas nas CSCs derivadas de glioblastoma humano. Realizou-se o ensaio de formação de esferas, um indicador da presença de CSCs, citometria de fluxo para Oct4 e Nanog e ensaio de senescência. Nossos ensaios utilizaram a linhagem U87 e dois tipos diferentes de meio de cultura. O primeiro continha DMEM Low Glucose com SFB e o segundo, um meio de cultura para células tronco (SCM), contendo DMEM F12 suplementado com FGF (fator de crescimento fibroblástico), EGF (fator de crescimento epidermal), LIF (fator inibidor de leucemia) e B27. Os tratamentos realizados utilizaram Doxo 1 e 10 nM; Tmz 5 μM e Rsv 1, 10 e 30 μM. O número de esferas formadas foi reduzido tanto em Doxo 1 quanto em 10 nM quando SFB foi utilizado. Doxo 1 não alterou o número de células Oct4 e Nanog positivas enquanto que Doxo 10 nM reduziu. Ambas as doses induziram senescência. Tmz reduziu o número de esferas formadas e também a porcentagem de células Oct4 e Nanog positivas. Usando SCM, observamos que Doxo e Tmz reduziram o número de esferas e a porcentagem de células Nanog e Oct4 positivas. Rsv 10 μM reduziu o número de esferas formadas enquanto que Rsv 30 μM reduziu o número de células positivas para CD133 e Oct4 com meio com SFB. Nossos resultados sugerem que Doxo 10 nM possui um melhor efeito nas CSCs do que Doxo 1 nM. Doxo 10 nM, além de reduzir o número de esferas, reduziu a porcentagem dos marcadores de CSCs e também induziu senescência celular na presença de SFB. Tmz e Rsv apresentaram resultados semelhantes à Doxo 10 nM. / Glioblastomas are the most aggressive tumors of the central nervous system (CNS). They are characterized by their high invasiveness, proliferation, high rates of recurrence and death, as well as chemo and radioresistance. Solid tumors have a hierarchical organization, in which there is a small tumor stem cell population (CSCs) or tumor initiator cells (CICs). These cells are able to repopulate the tumor, which leads to recurrence. CSCs are characterized by also performing asymmetric mitosis, in which the cells remain as CSCs and the other part undergoes differentiation. These differentiated cells are unable to repopulate the tumor, since they have lost their stem cell capacity. CSCs showed to be relatively resistant to traditional anti-cancer therapies such as chemo and / or radiotherapy. Doxorubicin (Doxo) is an anticancer agent used in several tumor types and acts by forming DNA adducts as well as inhibiting the action of topoisomerase II. Depending on the concentration of Doxo used, different effects was observed, for example, low doses (100 nM) lead to cellular senescence, whereas high doses (10 μM) lead to apoptosis. Temozolomide (Tmz) is an anti-tumor therapy used in many tumors, including gliomas. Resveratrol (Rsv) is a polyphenol found in various plants, such as grapes, and has effects such as neuroprotective, antiinflammatory, anti-oxidant, cardiac protection, among others. Our objective was to evaluate the effects of these three drugs on CSCs derived from human glioblastoma. We performed the sphere formation assay, an indicator of the presence of CSCs, flow cytometry for Oct4 and Nanog and senescence assay. Our experiments used the cell line U87 and two different types of culture medium. The first contained DMEM Low Glucose with FBS and the second, a culture medium for stem cells (SCM), containing DMEM F12 supplemented with FGF (fibroblastic growth factor), EGF (epidermal growth factor), LIF (leukemia inhibitor factor) and B27. The tests were performed using Doxo 1 and 10 nM, Tmz 5 μM and Rsv 10 and 30 μM. The number of spheres formed was reduced in both doses of Doxo when FBS was used. Doxo 1 nM did not alter the number of Oct4 and Nanog positive cells while Doxo 10 nM reduced. Both doses induced senescence. Tmz reduced the number of spheres formed and also the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Using SCM, we saw that Doxo and Tmz reduced the number of spheres and the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Rsv 10 μM reduced the number of spheres formed while Rsv 30 μM reduced the number of CD133 and Oct4 positive cells with medium supplemented with FBS. Our results suggest that Doxo 10 nM has a better effect in the CSCs than Doxo 1 nM. Doxo 10 nM besides reducing the number of spheres also decreased the percentage of CSCs markers, and induced cellular senescence in the presence of FBS. Tmz and Rsv had similar effects as Doxo 10 nM.

Doxorrubicina (DOX) é um agente importante na terapia antitumoral. Seu mecanismo de ação inclui inibição de topoisomerase II, formação de radicais livres e adutos de DNA. O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) atua removendo lesões que distorcem a dupla hélice do DNA, como as induzidas por UV e agentes químicos. Linhagens celulares deficientes em NER são mais sensíveis às antraciclinas. Porém, pouco se sabe sobre os processos celulares que permitem sobrevivência celular destas linhagens após o tratamento com esta classe de drogas. Neste trabalho verificou-se a resposta celular às lesões induzidas por DOX em linhagens celulares de fibroblastos humanos proficientes (MRC5) e deficientes em NER (CSB, XPA, XPC e XPD). Para esta finalidade foram realizados os ensaios de MTT, anexina-V, laranja de acridina e SA-b-galactosidase. Além disso, a dinâmica do ciclo celular e PDT (population doubling time) foram determinados após 72 horas de tratamento com DOX. Os resultados indicam que as linhagens deficientes em NER são mais sensíveis à DOX e morrem de maneira dose-dependente, principalmente por apoptose. Na análise do ciclo celular, a linhagem proficiente MRC5 e a linhagem deficiente em XPA apresentaram maior porcentagem de células na fase G2/M. No entanto, as linhagens CSB e XPD não apresentaram aumento relevante. Quando a linhagem XPD foi complementada com gene XPD funcional uma parada em G2 foi observada apenas em baixas doses de DOX. No ensaio PDT, houve um aumento do número de horas necessárias para a duplicação das células MRC5 e XPA tratadas com DOX, enquanto células CSB e XPD não mostraram uma mudança relevante no tempo necessário para a duplicação celular. Isto indica que estas células prosseguem através do ciclo celular, mesmo após o tratamento com DOX. No ensaio de SA-b-galactosidase, as linhagens MRC5, XPA e XPC entraram em senescência após tratamento com DOX, enquanto CSB e XPD não foram induzidas neste processo. Estes resultados foram confirmados por análise de Western Blot, onde as células CSB e XPD não apresentam diferença nos níveis de expressão de p21 e p16 (marcadores de senescência), em resposta ao tratamento com DOX. Em conjunto com a parada em G2/M e indução da senescência, as células MRC5 e XPA mostraram um aumento na coloração com laranja de acridina, indicando o processo de autofagia, enquanto que as células CSB e XPD não demonstraram este aumento. Um indício importante vem de estudos recentes que ligam a autofagia com o início da senescência. Assim, autofagia e senescência podem ser parte do mesmo processo fisiológico, conhecido como transição autofagia-senescência. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a autofagia e senescência tendem a ocorrer em paralelo, e que autofagia pode ser necessária para o fenótipo senescente. Além disso, pode-se inferir uma participação ativa do NER no reparo de lesões induzidas pela DOX. Assim, NER eficiente após o tratamento com DOX parece ser essencial para a sobrevivência da célula. Por outro lado, o recrutamento de fatores da via de NER (CSB e XPD) parece ser necessário para a indução de respostas celulares específicas, tais como a transição autofagia-senescência. / Doxorubicin (DOX) is an important agent in cancer therapy and its mechanism of action includes topoisomerase II-poisoning, free radicals release and DNA adducts formation.The nucleotide excision repair (NER) participates in the removal of lesions that distort the double helix of DNA induced by UV and chemicals. Cell lines deficient in NER are more sensitive to anthracyclines, however little is known about the cellular processes that permit cell survival after treatment with these drugs. In this work we verified the cellular response to DOX induced lesions in human fibroblasts cell lines proficient (MRC5) and deficient in NER (CSB, XPA, XPC and XPD). For this purpose we performed MTT, Annexin-V, Acridine orange and SA-b-galactosidase assays. In addition, the cell cycle dynamics and PDT (population doubling time) was determined after 72h DOX treatment. The results indicate that cell lines deficient in NER are more sensitive to anthracyclines and die in a dose dependent manner mainly by apoptosis. In the cell cycle analysis, a proficient MRC5 and XPA deficient cell lines showed a higher percentage of cells in G2/M phase. In contrast, CSB and XPD cells showed no relevant increase. When XPD cells were complemented with functional XPD gene a G2 arrest was observed just at low doses of DOX. In PDT assay, there was an increased number of hours required for doubling in MRC5 and XPA cells treated with DOX, whereas CSB and XPD lines did not show a relevant change in time required for cell duplication. This indicates that these cells proceed through the cell cycle even after treatment with DOX. In SA-b- galactosidase assay, MRC5, XPA and XPC lines entered in senescence after DOX treatment, while CSB and XPD do not induced in this process. These results were confirmed by Western Blot analysis where CSB and XPD cells do not exhibit difference in p21 and p16 expression levels (senescence markers) in response to treatment DOX. Along with the G2/M arrest and senescence induction, MRC5 and XPA cells showed an increase in acridine orange staining, indicating autophagy process, whereas CSB and XPD cells do not demonstrate this increase. An important clue comes from recent studies linking autophagy with the onset of senescence. Thus, autophagy and senescence may be part of the same physiological process, known as the autophagy-senescence transition. Taken together, our findings suggest that autophagy and senescence tend to occur in parallel, and that autophagy may be required for the senescent phenotype. Furthermore, we can infer an active involvement of NER in the repair of DOX-induced lesions. Thus, efficient NER following treatment with DOX seems to be essential for cell survival. On the other hand, recruitment of NER pathway factors (CSB and XPD) seems to be necessary for induction of specific cellular responses such as autophagy-senescence transition.

As leucemias são neoplasias que afetam o sistema hematopoiético e compreendem 2,53% dos casos de câncer relatados. Entre as leucemias, 27,95% correspondem a casos de leucemia mielóide crônica (LMC), que apresenta como marcador genético o cromossomo Philadelphia (Ph). Presente em mais de 80% dos casos, o cromossomo Ph é derivado da translocação t(9;22) (q34;q11), que origina um gene híbrido entre a região 5´ do gene bcr e 3´do gene abl. O produto deste gene é uma proteína Bcr-Abl na qual a atividade reguladora e nuclear do domínio tirosina quinase, originado da proteína Abl, torna-se constitutiva e citoplasmática. Estas mudanças na atividade tirosina quinase afetam diferentes vias de sinalização, com consequências em vários processos celulares como adesão, proliferação e apoptose. Em nível fisiológico, foi mostrado tanto in vitro quanto in vivo que as células hematopoiéticas precursoras Ph+ se diferenciam principalmente em células eritróides. Entretanto, quase 70% dos pacientes com LMC sofrem anemia, mostrando que, as células Ph+ diferenciadas em células eritróides não conseguem amadurecer até hemácias funcionais. Isto faz da LMC um bom modelo para o estudo da diferenciação de células eritróides e suas características, como os fatores que afetam a sintese de hemoglobina (Hb). A linhagem K562 é uma linhagem celular eritroleucêmica Ph+, amplamente utilizada como modelo para estudar drogas com capacidade anti-proliferativa e/ou indutoras da síntese de hemoglobina fetal. Entre estas drogas encontram-se a aclarrubicina (ACLA) e doxorrubicina (DOX) que, embora sejam análogos químicos pertencentes à família das antraciclinas, possuem mecanismos de ação diferentes e ainda não completamente esclarecidos. Neste trabalho, foram investigados vários aspectos da biologia das células K562 durante o tratamento com estas drogas. Foi observado que o tratamento com DOX produz um aumento de tamanho nas células e bloqueio do ciclo celular na fase G2/M, afetando também grandemente a viabilidade celular, com 70% de células mortas no sétimo dia de tratamento. Já durante o tratamento com ACLA a viabilidade, tamanho e ciclo celular foram menos afetados, com aproximadamente 15% de células mortas no sétimo dia de tratamento e um bloqueio transitório do ciclo na fase G1. No entanto, as duas drogas causaram um aumento significativo da síntese de hemoglobina, principalmente DOX que induziu um aumento quase duas vezes maior que o induzido por ACLA. A análise da expressão gênica realizada através da técnica de differential display mostrou várias bandas diferencialmente representadas e com diversas cinéticas de expressão, apresentando semelhanças e diferenças quando são comparados os dois tratamentos ou células tratadas e controle. Destas bandas, 26 estão sequenciadas mostrando genes envolvidos em vários processos celulares como dano do DNA, resistência a drogas, processamento do RNA e codificação de proteinas relacionadas com ferro. Das bandas sequenciadas, 7 foram validadas por RT-PCR (ndrg1, erk2, nf2l2, atp6ap1, rfc1, phf20 e zkscan) sendo observado um aumento na sua expressão durante o tratamento, com exceção de ndrg1 para o qual a expressão foi induzida em vez de aumentada e nf2l2 onde a diferença com o controle foi pequena e não permitiu validar este gene como diferencialmente expresso. Com o objetivo de procurar por mecanismos comuns entre os vários indutores da síntese de hemoglobina em células K562, estes genes foram também analisados durante o tratamento destas células com os indutores hidroxiuréia e dGTP. Além de induzirem a expressão de hemoglobina, os dois tratamentos provocaram um aumento no tamanho das células tratadas e um bloqueio no ciclo celular na fase S. Visando futuros trabalhos envolvendo os genes diferencialmente expressos, foi ainda otimizado um sistema de transferência gênica por eletroporação. Para isto foram testados varios parâmetros como campo elétrico, resistência, capacitância, meios de eletroporação, manipulação das células e uso de inibidores de DNAses. Como resultado, foi alcançado com o eletroporador padrão uma eficiência de transfecção de 81%, similar àquela alcançada pelo nucleoporator (eletroporador de última geração). As condições estabelecidas foram 750 V/cm, resistência infinita, 500 μF, meio RPMI1640, centrifugação e sulfato de zinco pós-pulso. A relação das antraciclinas e a hidroxiuréia, assim como de outros indutores da síntese de hemoglobina, com o ferro intracelular, juntamente com a diferença na expressão, durante o tratamento, de genes afetados direta ou potencialmente pela não disponibilidade de ferro intracelular, nos permitiu gerar uma hipótese para a via de sinalização que leva à síntese de hemoglobina. Nesta, sinais de falta ou não disponibilidade de ferro nas células ativariam a maquinaria celular para a captação e internalização do ferro extra-celular, simultaneamente com síntese de proteínas que utilizam o ferro para realizar as suas funções biológicas, entre elas a hemoglobina. Do mesmo modo, propomos a via de sinalização do ferro como um alvo potencialmente afetado por drogas indutoras da síntese de hemoglobina, como as antraciclinas, cujos alvos são ainda pouco conhecidos. Contudo, mais genes desta via de sinalização, bem como outros indutores, deveram ser estudados para saber se a síntese de hemoglobina pode ser induzida por drogas mais específicas e com menos efeitos colaterais que aquelas usadas atualmente para o tratamento de câncer e outras doenças.

Doxorrubicina (DOX) é um agente importante na terapia antitumoral. Seu mecanismo de ação inclui inibição de topoisomerase II, formação de radicais livres e adutos de DNA. O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) atua removendo lesões que distorcem a dupla hélice do DNA, como as induzidas por UV e agentes químicos. Linhagens celulares deficientes em NER são mais sensíveis às antraciclinas. Porém, pouco se sabe sobre os processos celulares que permitem sobrevivência celular destas linhagens após o tratamento com esta classe de drogas. Neste trabalho verificou-se a resposta celular às lesões induzidas por DOX em linhagens celulares de fibroblastos humanos proficientes (MRC5) e deficientes em NER (CSB, XPA, XPC e XPD). Para esta finalidade foram realizados os ensaios de MTT, anexina-V, laranja de acridina e SA-b-galactosidase. Além disso, a dinâmica do ciclo celular e PDT (population doubling time) foram determinados após 72 horas de tratamento com DOX. Os resultados indicam que as linhagens deficientes em NER são mais sensíveis à DOX e morrem de maneira dose-dependente, principalmente por apoptose. Na análise do ciclo celular, a linhagem proficiente MRC5 e a linhagem deficiente em XPA apresentaram maior porcentagem de células na fase G2/M. No entanto, as linhagens CSB e XPD não apresentaram aumento relevante. Quando a linhagem XPD foi complementada com gene XPD funcional uma parada em G2 foi observada apenas em baixas doses de DOX. No ensaio PDT, houve um aumento do número de horas necessárias para a duplicação das células MRC5 e XPA tratadas com DOX, enquanto células CSB e XPD não mostraram uma mudança relevante no tempo necessário para a duplicação celular. Isto indica que estas células prosseguem através do ciclo celular, mesmo após o tratamento com DOX. No ensaio de SA-b-galactosidase, as linhagens MRC5, XPA e XPC entraram em senescência após tratamento com DOX, enquanto CSB e XPD não foram induzidas neste processo. Estes resultados foram confirmados por análise de Western Blot, onde as células CSB e XPD não apresentam diferença nos níveis de expressão de p21 e p16 (marcadores de senescência), em resposta ao tratamento com DOX. Em conjunto com a parada em G2/M e indução da senescência, as células MRC5 e XPA mostraram um aumento na coloração com laranja de acridina, indicando o processo de autofagia, enquanto que as células CSB e XPD não demonstraram este aumento. Um indício importante vem de estudos recentes que ligam a autofagia com o início da senescência. Assim, autofagia e senescência podem ser parte do mesmo processo fisiológico, conhecido como transição autofagia-senescência. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a autofagia e senescência tendem a ocorrer em paralelo, e que autofagia pode ser necessária para o fenótipo senescente. Além disso, pode-se inferir uma participação ativa do NER no reparo de lesões induzidas pela DOX. Assim, NER eficiente após o tratamento com DOX parece ser essencial para a sobrevivência da célula. Por outro lado, o recrutamento de fatores da via de NER (CSB e XPD) parece ser necessário para a indução de respostas celulares específicas, tais como a transição autofagia-senescência. / Doxorubicin (DOX) is an important agent in cancer therapy and its mechanism of action includes topoisomerase II-poisoning, free radicals release and DNA adducts formation.The nucleotide excision repair (NER) participates in the removal of lesions that distort the double helix of DNA induced by UV and chemicals. Cell lines deficient in NER are more sensitive to anthracyclines, however little is known about the cellular processes that permit cell survival after treatment with these drugs. In this work we verified the cellular response to DOX induced lesions in human fibroblasts cell lines proficient (MRC5) and deficient in NER (CSB, XPA, XPC and XPD). For this purpose we performed MTT, Annexin-V, Acridine orange and SA-b-galactosidase assays. In addition, the cell cycle dynamics and PDT (population doubling time) was determined after 72h DOX treatment. The results indicate that cell lines deficient in NER are more sensitive to anthracyclines and die in a dose dependent manner mainly by apoptosis. In the cell cycle analysis, a proficient MRC5 and XPA deficient cell lines showed a higher percentage of cells in G2/M phase. In contrast, CSB and XPD cells showed no relevant increase. When XPD cells were complemented with functional XPD gene a G2 arrest was observed just at low doses of DOX. In PDT assay, there was an increased number of hours required for doubling in MRC5 and XPA cells treated with DOX, whereas CSB and XPD lines did not show a relevant change in time required for cell duplication. This indicates that these cells proceed through the cell cycle even after treatment with DOX. In SA-b- galactosidase assay, MRC5, XPA and XPC lines entered in senescence after DOX treatment, while CSB and XPD do not induced in this process. These results were confirmed by Western Blot analysis where CSB and XPD cells do not exhibit difference in p21 and p16 expression levels (senescence markers) in response to treatment DOX. Along with the G2/M arrest and senescence induction, MRC5 and XPA cells showed an increase in acridine orange staining, indicating autophagy process, whereas CSB and XPD cells do not demonstrate this increase. An important clue comes from recent studies linking autophagy with the onset of senescence. Thus, autophagy and senescence may be part of the same physiological process, known as the autophagy-senescence transition. Taken together, our findings suggest that autophagy and senescence tend to occur in parallel, and that autophagy may be required for the senescent phenotype. Furthermore, we can infer an active involvement of NER in the repair of DOX-induced lesions. Thus, efficient NER following treatment with DOX seems to be essential for cell survival. On the other hand, recruitment of NER pathway factors (CSB and XPD) seems to be necessary for induction of specific cellular responses such as autophagy-senescence transition.

Tese (Doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Nanociência e Nanobiotecnologia, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-11-23T15:56:42Z No. of bitstreams: 1 2017_AnaLygiadosSantosCâmara.pdf: 13092362 bytes, checksum: 8fe97c28a245124fcbc630f949de0084 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-01-15T21:46:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_AnaLygiadosSantosCâmara.pdf: 13092362 bytes, checksum: 8fe97c28a245124fcbc630f949de0084 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-15T21:46:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_AnaLygiadosSantosCâmara.pdf: 13092362 bytes, checksum: 8fe97c28a245124fcbc630f949de0084 (MD5) Previous issue date: 2018-01-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O cloridrato de doxorrubicina (DOX) é um antibiótico antineoplásico citotóxico largamente utilizado no tratamento de diversas neoplasias, incluindo tumores sólidos. Entretanto, a alta cardiotoxicidade irreversível causada limita o sucesso do tratamento, levando a um baixo índice terapêutico. Além disso, a resistência a quimioterápicos é responsável pelo insatisfatório índice terapêutico em aproximadamente 90% dos pacientes que possuem metástases. Sendo a entrega de fármacos no tecido tumoral um dos objetivos da nanotecnologia e perante a necessidade de desenvolver terapias mais eficazes, novos estudos propõem a latenciação de fármacos como uma promissora modalidade terapêutica. Os objetivos gerais do presente trabalho foram: 1) obter e caracterizar nanoemulsões contendo DOX pH-sensível; 2) avaliar a atividade anticâncer in vitro e in vivo, e 3) avaliar o perfil de biodistribuição do nanossistemas obtido. A formulação obtida consistiu de um novo sistema (NE C16- DOX), em que a nanoemulsão encapsulou a DOX conjugada a um ligante pH-sensível, inativando sua ação farmacológica fora do pH baixo. A NE C16-DOX apresentou-se responsiva a pH, diâmetro hidrodinâmico de 23,72 ± 1,28 nm, índice de polidispersão 0,082 e potencial zeta de +4,49 ± 0,26, sendo compatível para administração parenteral. Nos teste in vitro, foram utilizadas as células de adenocarcinoma mamário murino (4T1), de fibroblasto murino como célula não tumoral (NIH-3T3), de carcinoma cervical (HeLa) e células de carcinoma cervical resistentes a DOX (KB-V1). A NE C16- DOX reduziu significativamente a viabilidade das células tumorais, inclusive das células resistentes. Os testes de atividade hemolítica comprovaram a segurança da NE não induzindo hemólise eritrocitária quando testado sem e com o pró-fármaco. Os ensaios de interiorização mostraram que a NE C16-DOX é mais interiorizada do que a DOX livre em células 4T1. Os ensaios de citometria de fluxo mostraram que a NE C16-DOX induz morte celular por apoptose. Na avaliação de mecanismo de endocitose não houve redução da interiorização da DOX com nenhum dos bloqueadores de endocitose testados. Na microscopia, os resultados obtidos mostraram mudanças nos perfis de distribuição intracelular de DOX entre o fármaco livre e a NE. A análise de perfil de biodistribuição da NE C16-DOX mostrou maior acumulação no tecido tumoral em relação ao fármaco livre. Os resultados mostram a NE C16-DOX como um promissor nanossistema para o tratamento de tumores sólidos, permitindo a translação para a aplicação clínica. / Doxorubicin hydrochloride (DOX) is a cytotoxic antineoplastic antibiotic widely used in the treatment of various neoplasms, including solid tumors. However, the high irreversible cardiotoxicity caused limits the success of the treatment, leading to a low therapeutic index. In addition, resistance to chemotherapy is responsible for the unsatisfactory therapeutic index in approximately 90% of patients who have metastases. As the delivery of drugs in the tumor tissue is one of the objectives of nanotechnology and in view of the need to develop more effective therapies, new studies propose the latency of drugs as a promising therapeutic modality. The general objectives of this work were: 1) to obtain and characterize nanoemulsions containing DOX pH-sensitive; 2) to evaluate the anticancer activity in vitro and in vivo, and 3) to evaluate the biodistribution profile of the obtained nanosystems. The formulation obtained consisted of a new system (NE C16-DOX), in which the nanoemulsion encapsulated DOX conjugated to a pH-sensitive binder, inactivating its pharmacological action out of the low pH. The NE C16-DOX was responsive to pH, hydrodynamic diameter of 23.72 ± 1.28 nm, polydispersity index 0.082 and zeta potential of +4.49 ± 0.26 and compatible for parenteral administration. Murine adenocarcinoma cells (4T1), murine fibroblast as non-tumor cell (NIH-3T3), cervical carcinoma (HeLa) and DOX (KB-V1) resistant cervical carcinoma cells were used in the in vitro tests. NE C16-DOX significantly reduced the viability of tumor cells, including resistant cells. Hemolytic activity tests have shown the safety of NE not inducing erythrocyte hemolysis when tested with and without the prodrug. Internalization assays showed that NE C16-DOX is more internalized than free DOX in 4T1 cells. Flow cytometry assays showed that C16-DOX NE might induces cell death by apoptosis. In the evaluation of endocytosis mechanism there was no reduction of DOX internalization with any of the endocytosis blockers tested. In microscopy, the results obtained showed changes in the profiles of intracellular distribution of DOX between free drug and NE. The biodistribution profile analysis of NE C16-DOX showed greater accumulation in the tumor tissue in relation to the free drug. The results show the NE C16-DOX as a promising nanosystem for the treatment of solid tumors, allowing translation for clinical application.

Orientador: Ana Lúcia dos Anjos Ferreira / Resumo: Introdução: É desconhecido o papel do estresse oxidativo durante a evolução dacardiotoxicidade crônica induzida por múltiplas doses de doxorrubicina (DOX).Objetivo: Avaliar a evolução da cardiotoxicidade induzida por doxorrubicina pormeio da avaliação clínica, necropsia; análise morfológica, capacidade antioxidantetotal e lesão do DNA miocárdica. Primeiramente, foi estudado o efeito agudo deuma única dose de DOX e, posteriormente, avaliamos o efeito evolutivo de múltiplasdoses.Materiais e métodos: Utilizamos ratos Wistar machos (n=66) que foramrandomizados em 2 protocolos experimentais: 1) ratos foram sacrificados antes (-24h, n=8) e após (+24h, n=8) dose única de DOX (4mg/kg) a fim de determinar oefeito agudo da DOX; 2) ratos (n=58) receberam 4 injeções semanais de DOX(4mg/kg/semana) e foram sacrificados antes da primeira injeção (M0) e 1 semanadepois de cada administração (M1, M2, M3, M4) para determinar o efeito evolutivode cada uma das quatro doses da DOX. As avaliações realizadas foram: clínica,necropsia, estudo miocárdico morfológico (microscopia óptica), capacidadeantioxidante total (TAP, capacidade antioxidante) e lesão oxidativa do DNA (ensaiocometa).Resultados: No modelo agudo, não houve alteração no peso e nem nascaracterísticas clínicas ou de necropsia. Contudo, foi verificado aumento danecrose, desarranjo miofibrilar, diminuição da TAP e aumento da lesão oxidativado DNA após 24h da dose única de DOX (p<0,05). O estudo evolu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by Manuella Pacífico de Freitas Segredo null (manusegredo@hotmail.com) on 2017-02-10T18:26:59Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutoramento 16 dez 2016 - Manuella Segredo.pdf: 6088893 bytes, checksum: 8413963c281c359e0c9044c8b9243f10 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-02-15T16:30:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 segredo_mpf_dr_bot.pdf: 6088893 bytes, checksum: 8413963c281c359e0c9044c8b9243f10 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-15T16:30:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 segredo_mpf_dr_bot.pdf: 6088893 bytes, checksum: 8413963c281c359e0c9044c8b9243f10 (MD5) Previous issue date: 2017-01-23 / Introdução: É desconhecido o papel do estresse oxidativo durante a evolução da cardiotoxicidade crônica induzida por múltiplas doses de doxorrubicina (DOX). Objetivo: Avaliar a evolução da cardiotoxicidade induzida por doxorrubicina por meio da avaliação clínica, necropsia; análise morfológica, capacidade antioxidante total e lesão do DNA miocárdica. Primeiramente, foi estudado o efeito agudo de uma única dose de DOX e, posteriormente, avaliamos o efeito evolutivo de múltiplas doses. Materiais e métodos: Utilizamos ratos Wistar machos (n=66) que foram randomizados em 2 protocolos experimentais: 1) ratos foram sacrificados antes (- 24h, n=8) e após (+24h, n=8) dose única de DOX (4mg/kg) a fim de determinar o efeito agudo da DOX; 2) ratos (n=58) receberam 4 injeções semanais de DOX (4mg/kg/semana) e foram sacrificados antes da primeira injeção (M0) e 1 semana depois de cada administração (M1, M2, M3, M4) para determinar o efeito evolutivo de cada uma das quatro doses da DOX. As avaliações realizadas foram: clínica, necropsia, estudo miocárdico morfológico (microscopia óptica), capacidade antioxidante total (TAP, capacidade antioxidante) e lesão oxidativa do DNA (ensaio cometa). Resultados: No modelo agudo, não houve alteração no peso e nem nas características clínicas ou de necropsia. Contudo, foi verificado aumento da necrose, desarranjo miofibrilar, diminuição da TAP e aumento da lesão oxidativa do DNA após 24h da dose única de DOX (p<0,05). O estudo evolutivo mostrou prejuízo progressivo nos sinais clínicos, no peso corpóreo (R=-0,99; P=0,011) e nas alterações morfológicas miocárdicas (necrose: (R=1,00; P=0,004) de acordo com as doses de DOX. Contudo, foi observada melhora miocárdica progressiva tanto da TAP (R=0,95; P=0,049) como da lesão de DNA (SBs: R=-0,95; P=0,049). Além disso, a piora progressiva da necrose foi associada com a melhora progressiva tanto da lesão do DNA (SBs) (R=-0,97; P 0,027) como com a TAP (R=0,96; P=0,039). A Resumo 3 melhora progressiva da lesão do DNA (SBs) e da TAP também foram associadas (R=-0,98; P=0,018). A progressão da necrose foi associada à perda de peso corpóreo (R=- 0,98; P=0,024). A necropsia mostrou alterações (amolecimento cardíaco, ascite, derrame pleural, aderência entre órgãos e hidronefrose) a partir de M3. Conclusão: Dose única de DOX levou à desorganização, necrose, lesão no DNA e diminuição da TAP miocárdicos. O estudo evolutivo de múltiplas doses de DOX mostrou deterioração progressiva dos sinais clínicos, peso corpóreo e necrose de acordo com o aumento do número de doses de DOX. Contudo tal deterioração foi associada com a melhora da TAP e lesão oxidativa do DNA miocárdica. Nossos resultados sugerem que o dano oxidativo está associado apenas com a cardiotoxicidade induzida por uma única dose de DOX. É plausível que multiplas doses de DOX estejam associadas a aumento progressivo da resistência ao estresse oxidativo. / The mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity remains controversial. Wistar rats (n=66) received doxorubicin (DOX) injections intraperitoneally and were randomly assigned to two experimental protocols: 1) rats (n=16 ) were killed before and 24 h after a single dose of DOX (4 mg/Kg-body-wt) to determine the DOX acute effect; 2) rats (n=60) received 4 injections of DOX (4 mg/Kg-bodywt/ week) and were killed before the first injection (M0) and 1 week after each injection (M1, M2, M3, M4) to determine the chronological effect. Cardiac total antioxidant performance (TAP), DNA damage and morphology analyses were done at each time point. Body weight, clinical signs and necropsia changes were also registered. DOX single dose was associated with increased cardiac disarrangement, necrosis and DNA damage [strand breaks (SBs) and oxidized pyrimidines], and decreased TAP. Single dose of DOX was not associated with changes in body weight, clinical signs and necropsy.The chronological study showed an effect of a cumulative dose on body weight (R - 0.99, P 0.011), necrosis (R 1.00, P 0.004), TAP (R 0.95, P 0.049), and DNA SBs (R - 0.95, P 0.049). DNA SBs damage was negatively associated with TAP (R - 0.98, P 0.018) and necrosis (R - 0.97, P 0.027). The necropsy showed abnormalities (heart softening, ascites, pleural effusion, adhesion between organs and hydronephrosis) from M3. Our results suggest that oxidative damage is associated with acute cardiotoxicity induced by a single DOX only. Increased resistance to the oxidative stress is plausible for the multiple dose of DOX.

Orientador: Bertha Furlan Polegato / Resumo: Introdução: a doxorubicina é um quimioterápico amplamente utilizado, mas apresenta a cardiotoxicidade como mais grave efeito colateral. A lesão miocárdica se inicia imediatamente após a infusão da droga e é mediada por lesão oxidativa, aumento de apoptose e ativação de metaloproteinases. O açaí é um fruto rico em antocianinas, que apresenta elevado efeito antioxidativo e anti-inflamatório. O objetivo do estudo foi avaliar o efeito do açaí na prevenção da disfunção ventricular e a influência no estresse oxidativo, na apoptose e na atividade das metaloproteinases de matriz no modelo experimental de cardiotoxicidade aguda induzida pela doxorrubicina em ratos. Material e métodos: Foram utilizados 64 ratos Wistar machos, alocados em 4 grupos: controle (C), açaí (A), doxorrubicina (D) e açaí-doxorrubicina (DA). Os ratos receberam dieta padrão (grupos C e D) ou dieta padrão suplementada com açaí a 5% (grupos A e DA) por 4 semanas. Após esse período receberam injeção de doxorrubicina 20mg/kg (grupos D e DA) ou salina (grupos C e A). Quarenta e oito horas após a injeção, foi realizado ecocardiograma e estudo do coração isolado e em seguida foi realizada eutanásia. Foi coletado tecido cardíaco para realização de zimografia, Western blot, avaliação do estresse oxidativo e metabolismo energético, além da dosagem da concentração dos metabólitos de oxido nítrico (NO) no soro. Os resultados foram analisados por ANOVA de duas vias e foi considerada significância estatística de 5%. Result... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

A literatura médica tem acumulado evidência da associação de alterações cognitivas com a quimioterapia sistêmica para câncer. Estima-se que entre 17 a 34% dos pacientes permaneçam com alterações em longo prazo após o tratamento. A maioria dos estudos clínicos publicados sobre este tema foi realizado com pacientes portadoras de câncer de mama, porém alterações também foram encontradas em pacientes portadores de tumores de pulmão e linfomas. Os mecanismos pelos quais estas disfunções ocorrem não estão bem esclarecidos. As principais hipóteses incluem, entre outras, dano neuronal por baixas concentrações de quimioterápicos no sistema nervoso central, determinados polimorfismos genéticos que alteram propriedades de barreira hemato-encefálica e do metabolismo neuronal, dano no DNA neuronal por estresse oxidativo, alterações hormonais e desregulação de citoquinas. Modelos experimentais com animais têm sido desejados como forma de estudar os mecanismos pelos quais determinadas drogas ou suas combinações causam estas alterações. Entretanto, há poucos estudos utilizando modelos animais publicados. Neste trabalho nos propomos a investigar o efeito da doxorrubicina, uma medicação comumente utilizada na prática clínica, em um modelo experimental de memória aversiva de ratos Wistar utilizando testes de esquiva inibitória e habituação.