La dystrophie facioscapulohumérale (FSHD) est une dystrophie musculaire autosomique dominante, dégénérative et progressive. Les traitements élaborés jusqu'à présent n'ont pas réussi à améliorer le quotidien des patients FSHD. Plusieurs études se sont focalisées sur les mécanismes moléculaires de cette pathologie, néanmoins plusieurs d'entre elles sont contradictoires. La vision actuelle de la FSHD est celle d'une pathologie due à un mécanisme épigénétique complexe et les mécanismes moléculaires responsables de cette pathologie sont encore mal connus. Plusieurs analyses comparatives des profils d'expression des ARNm et des protéines de muscles de patients atteints de FSHD et de contrôles ont permis de montrer que plusieurs gènes impliqués dans le stress oxydant sont dérégulés de façon spécifique dans les muscles FSHD. Nos travaux ont permis de montrer dans la FSHD, aussi bien au niveau systémique, musculaire et cellulaire (cultures primaires musculaires) une augmentation des dommages oxydatifs qui se traduisent par une augmentation des peroxydes lipidiques et protéines oxydées, associés à une altération des défenses antioxydantes. Ce stress oxydant dans les biopsies musculaires et cultures primaires musculaires est associé à un dysfonctionnement mitochondrial. Des analyses plus fines sur l'action des espèces réactives de l'oxygène et leurs sources pourraient contribuer à une meilleure compréhension des bases physiopathologiques de la FSHD et permettre la sélection de thérapeutiques adaptées aux anomalies des patients FSHD. / Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) is an autosomal inherited muscular dystrophy. Actually no treatment led to improve the quality of life. Many studies have been focused on the molecular mechanisms of this disease, several of them were contradictory. The present view of the FSHD seems to be due to a complex epigenetic mechanism. Actually, no gene has been identified. Several comparative studies permit the identification of many genes involved in oxidative stress, deregulated in FSHD myoblasts and biopsies in comparison to healthy ones. Analysis of oxidative stress markers show that patients with FSHD present increased oxidative damage in blood as well as in biopsy muscle and muscular primary cell culture associated with altered antioxidant enzyme defenses. Oxidative stress is also associated with mitochondrial dysfunction. Complementary studies focusing in pathway of reactive oxygen species would contribute to a better understanding of pathophysiological bases of FSHD in order to establish a very helpful therapeutics for FSHD patients.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie génétique caractérisée par une dégénérescence des muscles squelettiques accompagnée d’une myotonie. Cette maladie est due à une expansion instable de triplets CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK. L’accumulation des ARNm DMPK mutés au sein de foci nucléaires conduit à la séquestration du facteur d’épissage MBNL1 et à des altérations de l’épissage alternatif de nombreux ARNm. En particulier, l’inclusion de l’exon 5 au sein du pré-ARNm de la troponine T cardiaque (hcTNT) est renforcée chez les patients DM1. Cette inclusion anormale participe aux anomalies cardiaques présentées par les patients. Les travaux de l’équipe, menés en collaboration avec l’équipe de Nicolas Sergeant à Lille, sur la régulation de l’épissage de l’ARNm hcTNT avaient établi l’existence de 8 sites MBNL1, dont 6 nouveaux, situés de part et d’autre de l’exon 5 et la présence de régions activatrices et inhibitrices de l’inclusion fixant des facteurs d’épissage dont l’identité n’était pas connue. L’un des objectifs de ma thèse était d’étudier l’importance fonctionnelle in cellulo de chacun des 8 sites MBNL1. J’ai ainsi pu montrer que chacun des 6 nouveaux sites participe à l’inhibition de l’inclusion de l’exon 5 par MBNL1. Les données obtenues nous ont amené à proposer un modèle dans lequel MBNL1 s’associe avec les triplets de sites MBNL1 situés de part et autre de l’exon 5 et entraine la formation d’une structure à longue distance via des interactions protéiques MBNL1-MBNL1. Cette structure isolerait l’exon 5 dans une boucle et limiterait la fixation du spliceosome. Par ailleurs, j’ai mis en œuvre une approche de purification de RNP formées en extrait nucléaire pour identifier d’autres facteurs régulant l’inclusion de l’exon 5. La protéine hnRNP H a ainsi pu être identifiée. Sa capacité à activer l’inclusion de l’exon 5 in cellulo et à entrer en compétition avec MBNL1 pour la régulation de l’inclusion de l’exon 5 via sa fixation sur des sites localisés dans l’exon 5 et en aval de cet exon a pu être confirmée. La seconde partie de ma thèse a porté sur l’étude de l’effet d’un stress oxydatif généré par 500 µM d’H2O2 sur le profil global d’épissage alternatif des pré-ARNm de cellules HeLa. Lors de ce travail, j’ai pu établir que la réponse des cellules HeLa au stress oxydatif implique deux phases de réponse : une phase précoce (1h-8h) caractérisée par un fort taux de mortalité associé à une forte augmentation du taux de d’entités oxygénées réactives (ROS) intracellulaire et une phase tardive (16h-24h) corrélée à une diminution du taux de ROS intracellulaires et une surexpression des ARN satellite III. Sur la base de ces données, une analyse globale du transcriptome par emploi de puces à exons (Affymetrix) a été réalisée à partir d’ARN totaux isolés 1h, 2h, 4h et 24h après le début du stress. Nous avons ainsi identifié des modulations d’expression et d’épissage spécifiques de chacune des deux phases. L’analyse des données par des outils bio-informatiques a permis de mettre en évidence des fonctions cellulaires bien définies qui sont plus particulièrement affectées lors d’un stress oxydant. Enfin, pour comprendre l’origine des variations d’épissage observées lors d’un stress oxydant, j’ai entrepris d’analyser les effets de ce stress sur le niveau d’expression et la localisation cellulaire des composants du spliceosome ou des facteurs qui s’associent pour réguler son activité / Myotonic distrophy of type 1 (DM1) is a genetic disease characterized by skeletal muscle degeneration associated to myotonia. DM1 results from the instable expansion of CTG repeats within the 3’ untranslated region of the DMPK gene. The accumulation of mutated DMPK mRNAs within nuclear foci leads to the sequestration of the MBNL1 splicing factor and causes splicing misregulation of numerous pre-mRNAs. Among altered events the increase of the inclusion of exon 5 in the human cardiac troponin T (hcTNT) mRNA is of particular importance, since it contributes to the cardiac symptoms presented by the patients. Through collaborative work with N. Sergeant’s team from Lille, the team has studied the molecular bases of hcTNT exon 5 inclusion regulation and mapped 8 MBNL1 binding sites, including 6 new ones, within intronic regions surrounding exon 5. They also identified positive and negative splicing regulatory elements of which protein partners remain unidentified. The first objective of my PhD thesis was to test the functional importance of each individual MBNL1 binding site. The obtained results established that the 6 newly identified MBNL1 binding sites are involved in splicing regulation by MBNL1 and lead us to propose a new regulation model in which MBNL1 binds on triplets of MBNL1 sites present on each side of exon 5 and form a long distance structure via MBNL1-MBNL1 protein interaction. The formation of this looping-structure is expected to isolate exon 5 and limit its recognition by the spliceosome. In addition I searched for protein partners of the identified regulatory elements by affinity chromatography. By this way, I identified hnRNP H as a positive regulator of exon 5 inclusion. Its capacity to compete with MBNL1 to regulate splicing in cellulo by binding on exonic and intronic binding sites was further confirmed. The second part of my PhD work corresponds to the study of the global impact of oxidative stress, generated by exposition of HeLa cells to 500 µM of H2O2, on alternative splicing. This allows us to establish that the response of HeLa cells to oxidative stress involve two distincts phases: an early one (1h-8h) characterized by poor survival rate and high intracellular ROS content and a late phase (16-24h), associated with a decrease of the intracellular ROS level and the overexpression of the long non coding sat III RNAs. Based on this observation, we performed a transcriptome global analysis by using exon arrays from Affymetrix on RNA samples isolated 1, 2, 4 or 24 hours after the induction of the oxidative stress. We identified changes of the gene expression level or mRNA splicing pattern specific of each of the response phases. Data computing by bio-informatic tools identified the most affected cellular processes and functions during the cell response to oxidative stress. In order to better understand the mechanisms underlying alternative splicing modulation during oxidative stress, I started to study the impact of oxidative stress on the expression level and the cellular localization of spliceosome components and most common splicing regulation factors

La maladie de Steinert ou dystrophie myotonique de type 1 (DM1), dystrophie musculaire la plus commune chez l’adulte, est causée par l’expansion instable de triplets CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK (Dystrophia Myotonica Protein Kinase). Cette maladie multisystémique, affectant principalement les muscles squelettiques et le cœur, est liée à l’épissage. En effet, les CUG exp forment des structures secondaires dans le noyau capables de séquestrer la protéine MBNL1, facteur d’épissage alternatif. En parallèle, un autre facteur d’épissage alternatif, CELF1 est stabilisé. La dérégulation de la balance entre ces deux protéines cause des défauts d’épissage, responsables de certains symptômes de la maladie, comme la myotonie, des défauts de conduction cardiaque et une résistance à l’insuline, causés respectivement par l’épissage aberrant du canal chlorure Clcn1, du canal sodique SCN5A et du récepteur à l’insuline IR. De plus, des dérégulations indépendantes de l’épissage sont aussi mises en jeu dans la DM1 mais leur responsabilité dans l’apparition des symptômes de la maladie reste à identifier. Pour identifier des dérégulations transcriptionnelles indépendantes de l’épissage mais liées à la progression et à la sévérité des symptômes, nous avons généré de nouveaux modèles drosophile de la DM1 avec un nombre croissant de répétitions CTG. Ces modèles étudiées au stade larvaire récapitulent les caractéristiques majeures de la DM1 : la formation de foci et une hypercontractilité musculaire. De plus, nous avons identifié dans ce modèle des dérégulations géniques indépendantes de l’épissage mais dépendantes du nombre de répétitions CTG. Notamment, une atténuation de Gbe1, codant pour une enzyme de branchement du glycogène pourrait participer aux phénotypes musculaires. Afin d’étudier les symptômes cardiaques de la maladie qui touchent 80% des patients et représentent la deuxième cause de mortalité, nous avons utilisé le modèle DM1 de drosophile développé dans notre équipe, et réalisé des analyses physiologiques cardiaques sur des mouches adultes qui expriment 960 CTG dans le cœur (Hand>DM1 960 ), un ARNi pour Mbl, l’orthologue de MBNL1, ou qui surexpriment l’orthologue de CELF1, Bru-3. Ces trois modèles DM1 reproduisent les symptômes cardiaques majeurs observés chez les patients comme des défauts de conduction, de l’arythmie (fibrillation) ou encore une cardiomyopathie dilatée. Afin d’identifier des dérégulations géniques susceptibles d’être responsables de ces défauts, nous avons réalisé une analyse transcriptomique par séquençage ARN après collection de l’ARN spécifique du cœur par la technique du TU-tagging. Les gènes dérégulés identifiés dans ces contextes ont été classés en fonction de leur conservation et du niveau de dérégulation. Parmi eux, la surexpression dans le cœur adulte de Straightjacket (Stj), l’orthologue de CACNA2D4 qui code pour une sous-unité d’un canal calcique voltage- dépendant, cause des défauts de conduction et de la fibrillation, mimant ce qui a été observé en contexte DM1 960 et gain de fonction pour Bru-3. Dans l’avenir, nous aimerions confirmer son implication dans la physiologie cardiaque et en particulier dans la DM1 en analysant son expression chez les patients présentant des défauts cardiaques similaires. / The most common muscular dystrophy found in adults, Steinert disease or Myotonic Dystrophy Type 1 (DM1) is caused by an unstable CTG repeat expansion in the 3’ untranslated region of the Dystrophia Myotonica Protein Kinase (DMPK) gene. This multisystemic disease, affecting particularly skeletal muscles and the heart, is called a spliceopathy because it involves the sequestration of the MBNL1 splicing factor by the expanded CUG-carrying transcripts and the stabilization of the CELF1 splicing factor. The misbalance of these two factors is responsible for splicing defects that cause most of the disease symptoms, like myotonia, conduction defects and arrhythmia but also insulin resistance, respectively associated to missplicing of Clcn1, SCN5A and IR. Moreover, DM1 toxicity is also associated to splice-independent deregulations but their link to disease symptoms remain poorly understood. To identify transcriptional deregulations independent of splicing and associated to disease progression and severity, we generated new DM1 Drosophila models with increasing number of CTG repeats. These larval models recapitulated the main DM1 muscular symptoms such as hypercontractility and foci formation and allowed us identifying gene deregulations independent of splicing. Among them, Gbe1 coding for a glycan branching enzyme is attenuated in the DM1 context in a CTG-repeat dependant manner and could participate in the severity of muscle phenotypes. To better understand the causes of cardiac symptoms that represent the second cause of death and affecting 80% of DM1 patients, we took advantage of our DM1 inducible Drosophila model and performed phenotypic analyses on the heart of adult flies expressing: 960 CTG specifically in the heart (Hand>DM1 960 ), a RNAi for the Drosophila MBNL1 orthologue (Muscleblind, Mbl) or overexpressing the CELF1 orthologue (Bruno-3, Bru3). These DM1 adult models display conduction abnormalities, arrhythmicity (fibrillation) and dilated cardiomyopathy (DCM). Thus, these three pathogenic contexts recapitulated collectively the main DM1 cardiac symptoms and prompted us to perform transcriptional profiling to identify symptom’s-associated gene deregulations. To identify new molecular actors responsible for the DM1 associated heart defects, we performed cardiac cell-specific transcriptional analyses by RNA-sequencing, using TU-tagging technique. Then, we selected deregulated candidate genes that could be linked to the particular observed phenotypes and ranked depending on their conservation and deregulation level. Among them, increased expression of Straightjacket (Stj), the CACNA2D4 orthologue, encoding a subunit of voltage- dependent calcium channel results in fibrillation and conduction defects, thus mimicking cardiac symptoms found in DM1 960 and Bru-3 gain of function contexts in which it was up- regulated. Whether identified candidates are deregulated in DM1 patients displaying cardiac abnormalities remains to be tested.

La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est cause par l’expansion anormale d’un triplet CTG dans la partie 3’UTR du gène DMPK, entrainant l’agrégation du transcrit mutant dans des inclusions ribonucléoprotéiques appelées foci. D’après plusieurs études structurales sur des courtes répétitions CUG, il a été proposé que les expansions CUG se replient en une structure en tige-boucle qui interfère avec l’activité de plusieurs facteurs lié au métabolisme de l’ARN et altère leur fonction cellulaire. Le facteur d’épissage muscleblind-like 1 (MBNL1) a été identifié par sa capacité à interagir avec les répétitions CUG. In vivo, ces répétitions entrainent la séquestration de cette protéine aboutissant en une déplétion nucléaire. Un autre facteur d’épissage, la CUG Binding protein (CUGBP1), est également impliqué dans la pathologie. Au lieu d’être séquestré par les répétitions, la stabilité protéique de CUGBP1 est augmentée dans les tissus DM1 entrainant un gain d’activité pour ce facteur. La séquestration de MBNL1 et la stabilisation de CUGBP1 résultent en la dérégulation de l’épissage alternatif de plusieurs transcrits musculaires et du cerveau et la réexpression d’isoformes protéiques fœtales dans les tissus adultes. Cependant, de récentes études suggèrent que d’autres facteurs ou voies de signalisation que celles faisant intervenir MBNL1 et CUGBP1 pourraient être impliquées dans la pathologie DM1.Le but de mon travail de thèse a été d’identifier de nouveaux facteurs ayant la capacité d’interagir avec les répétitions CUG. A l’aide d’une purification sur chromatographie d’affinité utilisant un ARN contenant 95 répétitions CUG comme appât, nous avons identifié l’ARN hélicase p68/DDX5. p68 fait partie de la famille des protéines DEAD-box, caractérisée par un core protéique conservé constitué de neufs domaines hautement conservés, dont le motif DEAD, à l’origine du nom de ces protéines. p68 est impliquée dans de nombreux aspects du métabolisme de l’ARN, dont la transcription, l’épissage, l’export, la traduction et la dégradation des ARN. Nous avons montré, que p68 colocalise avec les foci CUG dans un modèle cellulaire exprimant la partie 3’UTR du gène DMPK contenant de longues répétitions CTG. Nous avons identifié que p68 augmente l’interaction de MBNL1 sur les répétitions CUG et une structure secondaire particulière d’un élément régulateur de l’ARN pré-messager cardiac Troponin T (TNNT2), dont l’épissage est dérégulé dans la pathologie. L’insertion de mutations dans le core de l’hélicase de p68 abolit l’effet de p68 sur la fixation de MBNL1 ainsi que la colocalisation de p68 avec les expansions CUG in vivo, suggérant que le remodelage des structures secondaires ARN de manière ATP-dépendante par p68 facilite l’interaction de MBNL1. Nous trouvons également que la compétence de p68 pour réguler l’inclusion de l’exon alternatif 5 de TNNT2 dépend de l’intégrité des sites de fixation de MBNL1.Nous proposons que p68 agit comme un modificateur de l’activité de MBNL1 sur ces cibles d’épissage ainsi que sur les expansions CUG à l’origine de la pathologie. / Myotonic Dystrophy type I (DM1) is caused by an abnormal expansion of CTG triplets in the 3’ UTR of the DMPK gene, leading to the aggregation of the mutant transcript in nuclear RNA foci. Based on structural studies on short CUG repeats, it has been proposed that expanded CUG repeats fold into an imperfect hairpin structure that interferes with the activities of RNA binding proteins and alters their normal cellular function. The muscleblind-like 1 protein (MBNL1) was identified by its ability to bind to CUG repeats. It has been shown that the expanded mutant transcript promotes the sequestration of the MBNL1 splicing factor in nuclear RNA foci. CUGBP1 is another splicing factor that is involved in DM1. Instead of being sequestered by the repeats, the steady-state level of CUGBP1 is increased in DM1 tissues, leading to a gain of activity of the protein. The sequestration of MBNL1 and the up-regulation of CUGBP1 in DM1 results in the misregulation of alternative splicing of a subset of muscle and brain-specific transcripts, leading to the re-expression of fetal isoforms in adult tissues. However, several recent studies suggest that factors or signaling pathways other than MBNL1 and CUGBP1 could be involved in DM1 pathogenesis.The aim of this work was to isolate new factors that bind to CUG repeats. Using an affinity chromatography strategy with an RNA containing 95 pure CUG repeats, we identified the RNA helicase p68 (DDX5). p68 is a prototype of DEAD-box RNA helicase proteins. This family is characterized by a conserved core, consisting of nine conserved motifs including the DEAD signature, which gives rise to the name to these proteins. p68 is involved in many aspects of RNA metabolism including transcription, RNA processing, RNA export, translation and mRNA degradation. We showed that p68 colocalized with RNA foci in cells expressing the 3’UTR of the DMPK gene containing expanded CTG repeats. We found that p68 increased MBNL1 binding onto pathological repeats and the stem-loop structure regulatory element within the cardiac Troponin T (TNNT2) pre-mRNA, splicing of which is misregulated in DM1. Mutations in the helicase core of p68 prevented both the stimulatory effect of the protein on MBNL1 binding and the colocalization of p68 with CUG repeats, suggesting that remodeling of RNA secondary structure through a ATP-dependant manner by p68 facilitates MBNL1 binding. We also found that the competence of p68 for regulating TNNT2 exon 5 inclusion depended on the integrity of MBNL1 binding sites.We propose that p68 acts as a modifier of MBNL1 activity on splicing targets and pathogenic RNA.

La dystrophie musculaire facioscapulohumérale (FSHD) est la troisième myopathie la plus fréquente en Europe. La maladie atteint progressivement les muscles du visage, des bras et des jambes. Les symptômes apparaissent dans la majorité des cas avant 20 ans et la maladie, souvent douloureuse, provoque fréquemment un handicap majeur qui nécessite de se déplacer en fauteuil roulant. J'ai démontré que la protéine KLF15 est surexprimée dans les tissus des patients FSHD et dans les myoblastes cultivés in vitro et prélevés sur des patients FSHD. Des résultats préliminaires indiquent que la surexpression du facteur KLF15 pourrait être expliquée par le stress oxydant induit par DUX4 et la surexpression de certains facteurs de myogenèse induits par DUX4c. J'ai démontré que KLF15 interagit directement avec les répétitions D4Z4 et contrôle leur fonction d'activation de transcription. Ainsi KLF15 sert de médiateur entre les répétitions D4Z4 et deux gènes dans la région 4q35: FRG2 et DUX4c ce que explique la surexpression de ces deux gènes dans la FSHD. La surexpression du gène DUX4c, homologue du DUX4, perturbe le programme de différentiation musculaire en activant certains facteurs de myogenèse (myomiRs ou microRNAs myogéniques). En somme, la découverte du rôle du facteur KLF15 dans la FSHD met en évidence une boucle de rétrocontrôle positif qui relie la surexpression du facteur KLF15 avec la surexpression des gènes codés dans la région 4q35. Le rôle central du facteur KLF15 dans ce nouveau modèle de la maladie permet d'envisager une nouvelle piste thérapeutique pour la dystrophie FSHD basé sur l'inhibition du facteur KLF15. / Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD), a dominant hereditary disease with a prevalence of 7 per 100,000 individuals, is associated with a partial deletion in the subtelomeric D4Z4 repeat array on chromosome 4q. The D4Z4 repeat contains a strong transcriptional enhancer that activates promoters of several FSHD-related genes. We here report that the enhancer within the D4Z4 repeat binds the Krüppel-like factor KLF15. KLF15 was found to be upregulated during myogenic differentiation induced by serum starvation or by overexpression of the myogenic differentiation factor MYOD. When overexpressed, KLF15 activated the D4Z4 enhancer and led to overexpression of DUX4c (Double homeobox 4, centromeric) and FRG2 (FSHD region gene 2) genes, whereas its silencing caused inactivation of the D4Z4 enhancer. In immortalized human myoblasts the D4Z4 enhancer was activated by the myogenic factor MYOD, an effect that was abolished upon KLF15 silencing or when the KLF15 binding sites within the D4Z4 enhancer were mutated, indicating that the myogenesis-related activation of the D4Z4 enhancer was mediated by KLF15. KLF15 and several myogenesis-related factors were found to be expressed at higher levels in myoblasts, myotubes and muscle biopsies from FSHD patients than in healthy controls. We propose that KLF15 serves as a molecular link between myogenic factors and the activity of the D4Z4 enhancer, and thus contributes to the overexpression of the DUX4c and FRG2 genes during normal myogenic differentiation and in FSHD.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la maladie neuromusculaire la plus fréquente de l'enfant. Son évolution progressive inexorable conduit habituellement au décès dans la troisième décade. La DMD constitue cependant une affection hétérogène pour la sévérité de l'atteinte musculaire, cognitive et cardiaque, et cette hétérogénéité n'est pas totalement expliquée par la localisation des mutations dans le gène de la dystrophine. Ma thèse comporte trois volets: (1) une analyse clinique multivariée d'une cohorte de DMD suivie à long terme qui nous a permis de définir 4 phénotypes distincts de DMD; (2) une étude de corrélation clinico-pathologique qui a identifié la fibrose endomysiale précoce comme seul facteur histologique prédictif de sévérité motrice; (3) la mise au point d'un modèle murin original de myofibrose dystrophique chez la souris mdx déficiente en dystrophine. 1- Étude multiparamétrique clinique. La saisie par la même équipe des données fonctionnelles musculaires, cardiaques, respiratoires et cognitives de 75 patients atteints de DMD (tous génotypés et présentant une absence complète de dystrophine musculaire), suivis pendant >10 ans, a permis d'établir un modèle multiparamétrique satisfaisant à deux dimensions principales, cognitive et motrice, et de définir 4 clusters phénotypiques : (i) DMD cognitive et motrice congénitale (20%), (ii) DMD classique (28%), (iii) DMD motrice pure modérée (22%), (iv) DMD motrice pure sévère (30%). La corrélation génotypephénotype était restreinte à la seule atteinte cognitive. Des indicateurs pronostics précoce ont été identifiés et validés sur une 2ème série de 34 patients. 2- Étude histopathologique. Les variations de sévérité de l'atteinte musculaire n'étant pas expliquées par la génétique moléculaire, nous avons cherché à corréler les paramètres moteurs et la biopsie musculaire prélevée dans le quadriceps à un stade précoce (3-7 ans) chez 25 patients (analyse stéréologique des images numérisées pour les paramètres élémentaires: nécrose/régénération, fibres hypercontractées, adipocytes, fibrose endomysiale et périmysiale). Seule la fibrose endomysiale était associée à un pronostic moteur défavorable (p<0.002) attesté par l'âge de perte de marche, la force du quadriceps et le testing musculaire global à 10 ans. Cette fibrose endomysiale dissociait les capillaires des myofibres (écartement x 2.5), et s'accompagnait d'une augmentation sélective des macrophages CD206+ activés dans la voie alterne (M2) et d'une diminution relative des cellules satellites musculaires (p<0.0001). Ces données suggèrent un rôle clé de la fibrose endomysiale (et des macrophages M2 profibrosant) et dans la sévérité clinique de la DMD. 3- Étude expérimentale. Ces éléments rendent nécessaire la mise au point d'un modèle expérimental de myofibrose dystrophique, la souris mdx présentant peu de fibrose et un déficit moteur modéré et tardif. Nous avons mis au point une nouvelle méthode de lésion musculaire focale profibrosante du tibialis antérieur chez la souris mdx (piqûres multiples quotidiennes pendant 15 jours). Une fibrose endomysiale attestée par un fort immunomarquage du collagène I (à 8, 30, 60 et 90 jours) a été quantifiée et corrélée à la perte de la force musculaire dans la patte lésée (comparée au muscle contralatéral). Ces résultats légitiment et préparent les futures stratégies thérapeutiques "anti-fibrosantes" dans la DMD

La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est cause par l'expansion anormale d'un triplet CTG dans la partie 3'UTR du gène DMPK, entrainant l'agrégation du transcrit mutant dans des inclusions ribonucléoprotéiques appelées foci. D'après plusieurs études structurales sur des courtes répétitions CUG, il a été proposé que les expansions CUG se replient en une structure en tige-boucle qui interfère avec l'activité de plusieurs facteurs lié au métabolisme de l'ARN et altère leur fonction cellulaire. Le facteur d'épissage muscleblind-like 1 (MBNL1) a été identifié par sa capacité à interagir avec les répétitions CUG. In vivo, ces répétitions entrainent la séquestration de cette protéine aboutissant en une déplétion nucléaire. Un autre facteur d'épissage, la CUG Binding protein (CUGBP1), est également impliqué dans la pathologie. Au lieu d'être séquestré par les répétitions, la stabilité protéique de CUGBP1 est augmentée dans les tissus DM1 entrainant un gain d'activité pour ce facteur. La séquestration de MBNL1 et la stabilisation de CUGBP1 résultent en la dérégulation de l'épissage alternatif de plusieurs transcrits musculaires et du cerveau et la réexpression d'isoformes protéiques fœtales dans les tissus adultes. Cependant, de récentes études suggèrent que d'autres facteurs ou voies de signalisation que celles faisant intervenir MBNL1 et CUGBP1 pourraient être impliquées dans la pathologie DM1.Le but de mon travail de thèse a été d'identifier de nouveaux facteurs ayant la capacité d'interagir avec les répétitions CUG. A l'aide d'une purification sur chromatographie d'affinité utilisant un ARN contenant 95 répétitions CUG comme appât, nous avons identifié l'ARN hélicase p68/DDX5. p68 fait partie de la famille des protéines DEAD-box, caractérisée par un core protéique conservé constitué de neufs domaines hautement conservés, dont le motif DEAD, à l'origine du nom de ces protéines. p68 est impliquée dans de nombreux aspects du métabolisme de l'ARN, dont la transcription, l'épissage, l'export, la traduction et la dégradation des ARN. Nous avons montré, que p68 colocalise avec les foci CUG dans un modèle cellulaire exprimant la partie 3'UTR du gène DMPK contenant de longues répétitions CTG. Nous avons identifié que p68 augmente l'interaction de MBNL1 sur les répétitions CUG et une structure secondaire particulière d'un élément régulateur de l'ARN pré-messager cardiac Troponin T (TNNT2), dont l'épissage est dérégulé dans la pathologie. L'insertion de mutations dans le core de l'hélicase de p68 abolit l'effet de p68 sur la fixation de MBNL1 ainsi que la colocalisation de p68 avec les expansions CUG in vivo, suggérant que le remodelage des structures secondaires ARN de manière ATP-dépendante par p68 facilite l'interaction de MBNL1. Nous trouvons également que la compétence de p68 pour réguler l'inclusion de l'exon alternatif 5 de TNNT2 dépend de l'intégrité des sites de fixation de MBNL1.Nous proposons que p68 agit comme un modificateur de l'activité de MBNL1 sur ces cibles d'épissage ainsi que sur les expansions CUG à l'origine de la pathologie.

Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La réparation du muscle squelettique est possible grâce aux cellules satellites et aux cellules stromales résidentes (mrSC), responsables de la régénération myogénique et du remodelage de la matrice extracellulaire (MEC) respectivement. Le maintien à l’état quiescent et la différenciation de ces cellules sont finement régulés par les signaux provenant de leur microenvironnement, aussi appelé niche. Nous avons posé l’HYPOTHÈSE selon laquelle les altérations de ce microenvironnement se répercutent sur le comportement des cellules progénitrices et modulent leur capacité à régénérer le muscle squelettique. Le muscle âgé est caractérisé par la présence de tissu adipeux, une accumulation excessive de MEC (fibrose) ainsi qu’un faible potentiel régénératif. Nous avons donc caractérisé les cellules progénitrices présentes dans le muscle âgé. Nos résultats montrent que les cellules progénitrices myogéniques (CPM) du muscle âgé tendent à se différencier plutôt qu’à proliférer. De plus, nous avons montré une augmentation de la population des mrSC dans le muscle âgé, pouvant expliquer la présence plus importante de tissu adipeux et de MEC. Le muscle de souris dystrophique est caractérisé par des cycles perpétuels de dégénérescence/régénération conduisant à une fibrose du tissu. Puisqu’une modulation de la voie Wnt canonique est responsable de la fibrose de différents organes, nous avons caractérisé son implication dans le muscle des souris dystrophiques. Nous avons montré que l’activation de cette voie induit une augmentation de la prolifération des mrSC ainsi que de leur synthèse de collagène in vitro et in vivo. À l’opposé, l’inhibition de l’activité Wnt canonique induit une diminution de la population des mrSC et du dépôt fibreux. En somme, la voie Wnt canonique favorise la fibrose du muscle dystrophique par l’intermédiaire des mrSC. Des études récentes ont montré que des modifications biomécaniques du microenvironnement peuvent altérer les propriétés souches des CPM. Nous avons examiné l’influence de la rigidité du microenvironnement sur le comportement des CPM. Des analyses en microscopie à force atomique ont montré que la perte de tension des fibres ex vivo causait une légère augmentation de la rigidité du microenvironnement des cellules satellites, favorable à leur prolifération. Nous avons corrélé ces résultats avec une approche in vivo où l’on a causé la perte de tension des fibres par ténotomie. Nos conclusions suggèrent que la rigidité du microenvironnement influence l’activation des cellules satellites et leur état prolifératif. Ces observations ont été mises à profit afin de développer une méthode originale pour isoler les CPM. Celle-ci permet d’obtenir rapidement et à partir de seulement quelques fibres, un nombre important de CPM hautement purifié. En résumé, ces travaux ont permis une meilleure compréhension des facteurs présents dans le microenvironnement des cellules progénitrices et contribuants à la réparation du muscle squelettique.