Dix-huit maladies humaines graves ont jusqu'ici été associées avec des expansions de trinucléotides répétés (TNR) codant soit pour des polyalanines (codées par des codons GCN répétés) soit pour des polyglutamines (codées par des codons CAG répétés) dans des protéines spécifiques. Parmi eux, la dystrophie musculaire oculopharyngée (DMOP), l’Ataxie spinocérébelleuse de type 3 (SCA3) et la maladie de Huntington (MH) sont des troubles à transmission autosomale dominante et à apparition tardive, caractérisés par la présence d'inclusions intranucléaires (IIN). Nous avons déjà identifié la mutation responsable de la DMOP comme étant une petite expansion (2 à 7 répétitions supplémentaires) du codon GCG répété du gène PABPN1. En outre, nous-mêmes ainsi que d’autres chercheurs avons identifié la présence d’événements de décalage du cadre de lecture ribosomique de -1 au niveau des codons répétés CAG des gènes ATXN3 (SCA3) et HTT (MH), entraînant ainsi la traduction de codons répétés hybrides CAG/GCA et la production d'un peptide contenant des polyalanines. Or, les données observées dans la DMOP suggèrent que la toxicité induite par les polyalanines est très sensible à leur quantité et leur longueur. Pour valider notre hypothèse de décalage du cadre de lecture dans le gène ATXN3 dans des modèles animaux, nous avons essayé de reproduire nos constatations chez la drosophile et dans des neurones de mammifères. Nos résultats montrent que l'expression transgénique de codons répétés CAG élargis dans l’ADNc de ATXN3 conduit aux événements de décalage du cadre de lecture -1, et que ces événements sont néfastes. À l'inverse, l'expression transgénique de codons répétés CAA (codant pour les polyglutamines) élargis dans l’ADNc de ATXN3 ne conduit pas aux événements de décalage du cadre de lecture -1, et n’est pas toxique. Par ailleurs, l’ARNm des codons répétés CAG élargis dans ATXN3 ne contribue pas à la toxicité observée dans nos modèles. Ces observations indiquent que l’expansion de polyglutamines dans nos modèles drosophile et de neurones de mammifères pour SCA3 ne suffit pas au développement d'un phénotype. Par conséquent, nous proposons que le décalage du cadre de lecture ribosomique -1 contribue à la toxicité associée aux répétitions CAG dans le gène ATXN3. Pour étudier le décalage du cadre de lecture -1 dans les maladies à expansion de trinucléotides CAG en général, nous avons voulu créer un anticorps capable de détecter le produit présentant ce décalage. Nous rapportons ici la caractérisation d’un anticorps polyclonal qui reconnaît sélectivement les expansions pathologiques de polyalanines dans la protéine PABPN1 impliquée dans la DMOP. En outre, notre anticorps détecte également la présence de protéines contenant des alanines dans les inclusions intranucléaires (IIN) des échantillons de patients SCA3 et MD. / Eighteen severe human diseases have thus far been associated with trinucleotide repeat (TNR) expansions coding for either polyalanine (encoded by a GCN repeat tract) or polyglutamine (encoded by a CAG repeat tract) in specific proteins. Among them, oculopharyngeal muscular dystrophy (OPMD), spinocerebellar ataxia type-3 (SCA3), and Huntington’s disease (HD) are late-onset autosomal-dominant disorders characterised by the presence of intranuclear inclusions (INIs). We have previously identified the OPMD causative mutation as a small expansion (2 to 7) of a GCG repeat tract in the PABPN1 gene. In addition, we and others have reported the occurrence of -1 ribosomal frameshifting events in expanded CAG repeat tracts in the ATXN3 (SCA3) and HTT (HD) genes, which result in the translation of a hybrid CAG/GCA repeat tract and the production of a polyalanine-containing peptide. Data from OPMD suggests that polyalanine-induced toxicity is very sensitive to the dosage and length of the alanine stretch. To validate our ATXN3 -1 frameshifting hypothesis in animal models, we set out to reproduce our findings in Drosophila and mammalian neurons. Our results show that the transgenic expression of expanded CAG repeat tract ATXN3 cDNA led to -1 frameshifting events, and that these events are deleterious. Conversely, the expression of polyglutamine-encoding expanded CAA repeat tract ATXN3 cDNA was neither frameshifted nor toxic. Furthermore, expanded CAG repeat tract ATXN3 mRNA does not contribute to the toxicity observed in our models. These observations indicate that expanded polyglutamine repeats in Drosophila and mammalian neuron models of SCA3 are insufficient for the development of a phenotype. Hence, we propose that -1 ribosomal frameshifting contributes to the toxicity associated with CAG repeat tract expansions in the ATXN3 gene. To further investigate ribosomal frameshifting in expanded CAG repeat tract diseases, we sought to create an antibody capable of detecting the frameshifted product. Here we report the characterization of a polyclonal antibody that selectively recognizes pathological expansions of polyalanine in the protein implicated in OPMD, PABPN1. Furthermore, our antibody also detects the presence of alanine proteins in the intranuclear inclusions (INIs) of SCA3 and HD patient samples.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1), ou maladie de Steinert, est une maladie qui touche plusieurs tissus, dont le système nerveux central (SNC). L’atteinte neurologique est variable et inclut des troubles de la fonction exécutive, des changements de comportement et une hypersomnolence dans la forme adulte, ainsi qu’une déficience intellectuelle marquée dans la forme congénitale. Dans leur ensemble, les symptômes neurologiques ont un fort impact sur le parcours académique, professionnel et les interactions sociales. Aujourd’hui aucune thérapie n’existe pour cette maladie. La DM1 est due à une expansion anormale d’un triplet CTG non-codant dans le gène DMPK. Les ARN messagers DMPK, porteurs de l’expansion, s’accumulent dans le noyau des cellules (sous forme de foci) et perturbent la localisation et la fonction de protéines de liaison à l’ARN, notamment des familles MBNL et CELF, ce qui entraîne des défauts d’épissage alternatif, d’expression, de polyadenylation et de localisation d’autres ARN cibles. Malgré le progrès récent dans la compréhension des mécanismes de la maladie, les aspects cellulaires et moléculaires de l’atteinte neurologique restent méconnus: nous ne connaissons ni la contribution de chaque type cellulaire du cerveau, ni les voies moléculaires spécifiquement dérégulées dans chaque type cellulaire. L’objectif de ma thèse a été de répondre à ces deux questions importantes en utilisant un modèle de souris transgéniques et des cellules primaires dérivées de celui-ci. Pour mon projet, j’ai utilisé les souris DMSXL générées par mon laboratoire. Ces souris reproduisent des caractéristiques importantes de la DM1, notamment l’accumulation des ARN toxiques et la dérégulation de l’épissage alternatif dans plusieurs tissus. L’impacte fonctionnel des transcrits DMPK toxiques dans le SNC des souris DMSXL se traduit par des problèmes comportementaux et cognitifs et par des défauts de la plasticité synaptique. Afin d’identifier les mécanismes moléculaires associés à ces anomalies, une étude protéomique globale a montré une dérégulation de protéines neuronales et astrocytaires dans le cerveau des souris DMSXL. De plus, l’étude de la distribution des foci d’ARN dans les cerveaux des souris et des patients a montré un contenu plus élevé dans les astrocytes par rapport aux neurones. Ensemble, ces résultats suggèrent une contribution à la fois neuronale et gliale dans la neuropathogenèse de la DM1. L’étude protéomique globale des cerveaux des souris DMSXL, a aussi montré des défauts de protéines synaptiques spécifiques des neurones, que nous avons par la suite validés dans le cerveau des patients. SYN1 est hyperphosphorylée d’une façon CELF-dépendante et RAB3A est surexprimé en réponse à l’inactivation de MBNL1. Les protéines MBNL et CELF régulent l’épissage alternatif d’un groupe de transcrits au cours du développement, et leur dérégulation dans la DM1 entraîne l’expression anormale d’isoformes d’épissage embryonnaires dans le tissu adulte. Dans ce contexte, j’ai étudié si les défauts des protéines RAB3A et SYN1 sont associés à une dérégulation d’épissage, et si les anomalies des protéines synaptiques identifiées dans la DM1 reproduisent des évènements embryonnaires de la régulation de RAB3A et SYN1. Mes résultats indiquent que les défauts de ces protéines dans les cerveaux adultes ne sont pas dus à une altération de l’épissage alternatif des transcrits et ne recréent pas des évènements embryonnaires. La neuropathogenèse de la DM1 va, donc, au delà de la dérégulation de l’épissage et d’autres voies moléculaires restent à explorer dans les cerveaux DM1. Afin d’identifier des sous-populations cellulaires susceptibles à l’accumulation des ARN toxiques, nous avons étudié la distribution des foci dans plusieurs régions cérébrales. (...) / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a severe disorder that affects many tissues, including the central nervous system (CNS). The degree of brain impairment ranges from executive dysfunction, attention deficits, low processing speed, behavioural changes and hypersomnia in the adult form, to pronounced intellectual disability in the congenital cases. The neurological manifestations have a tremendous impact on the academic, professional, social and emotional aspects of daily life. Today there is no cure for this devastating condition. DM1 is caused by the abnormal expansion of a CTG trinucleotide repeat in the 3’UTR of the DMPK gene. Expanded DMPK transcripts accumulate in RNA aggregates (or foci) in the nucleus of DM1 cells, disrupting the activity of important RNA-binding proteins, like the MBNL and CELF families, and leading to abnormalities in alternative splicing, gene expression, RNA polyadenylation, localisation and translation. In spite of recent progress, fundamental gaps in our understanding of the molecular and cellular mechanisms behind the neurological manifestations still exist: we do not know the contribution of each cell type of the CNS to brain dysfunction, or the molecular pathways specifically deregulated in response to the CTG expansion. The aim of my PhD project has been to gain insight into these two important questions using a relevant transgenic mouse model of DM1 and cell cultures derived thereof. In my studies I used the DMSXL mice, previously generated in my host laboratory. The DMSXL mice express expanded DMPK mRNA with more than 1,000 CTG repeats. They recreate relevant DM1 features, such as RNA foci and missplicing in multiple tissues. The functional impact of expanded DMPK transcripts in the CNS of DMSXL mice translates into behavioural and cognitive abnormalities and defective synaptic plasticity. To identify the molecular mechanisms behind these abnormalities, a global proteomics analysis revealed changes in both neuron-specific and glial-specific proteins in DMSXL brain. We also investigated RNA foci in DMSXL and human DM1 brains and found non-homogenous distribution between cell types, with a higher foci content in astrocytes relative to neurons. Together these results suggest that both neuronal and glial defects contribute to DM1 neuropathogenesis. The global proteomics analysis of DMSXL brains also identified abnormalities in neuronal synaptic proteins that we have validated in human brain samples. SYN1 is hyperphosphorilated in a CELF-dependent manner while RAB3A is upregulated in association with MBNL1 depletion. CELF and MBNL proteins regulate the alternative splicing of a subset of transcripts throughout development, and their deregulation in DM1 leads to abnormal expression of fetal splicing isoforms in adult DM1 brains. In this context, I have studied if RAB3A and SYN1 deregulations observed in adult brains are associated with splicing abnormalities or if they recreated embryonic expression and phosphorylation events. My results indicate that the synaptic proteins abnormalities observed in adult DMSXL brains are not caused by defective alternative splicing and do not recreate embryonic events. Thus, DM1 neuropathogenesis goes beyond missplicing and other molecular pathways must be explored in DM1 brains. To better understand the cellular sub-populations susceptible of accumulating toxic RNA foci we have studied foci distribution in different brain regions. We identified pronounced accumulation of toxic RNAs in Bergman astrocytes of DMSXL mice cerebellum and DM1 patients, associated with neuronal hyperactivity of Purkinje cells. A quantitative proteomics analysis revealed a significant downregulation of GLT1 – a glial glutamate transporter expressed by the Bergmann cell in the cerebellum. I have confirmed the GLT1 downregulation in other brain regions of mouse and human brain. (...)

En France, les dysfonctions endothéliales représentent environ la moitié des indications de greffes de cornée réalisées chaque année. Cependant, les problématiques liées à la pénurie de greffon, aux difficultés des techniques chirurgicales de greffes endothéliales ainsi qu’aux risques d’échec ou de rejet de greffe poussent les chercheurs à développer de nouvelles thérapies moins invasives et plus efficaces. La thérapie cellulaire cornéenne endothéliale est une des voies de recherche actuellement explorées dont le but est de s’affranchir des aléas de la greffe de cornée. La cornée humaine est un tissu idéal pour la thérapie cellulaire. Grâce à ses caractéristiques d’organe à la fois avasculaire et immunitairement privilégié, les cellules transplantées sont ainsi bien mieux tolérées par rapport aux autres tissus et organes vascularisés. Les avancées dans le domaine des cellules souches, de l'ingénierie, particulièrement avec l’arrivée des greffes de cellules souches épithéliales pour le traitement des pathologies sévères de la surface oculaire, ont suscité un intérêt massif afin d’adapter ces techniques aux cellules endothéliales / In France, around half of all corneal keratoplasties are performed to treat corneal endothelial dysfunction each year. However, the use of endothelial keratoplasty is limited by the technical difficulty of the procedure, a shortage of available grafts, and the potential for graft failure or rejection. These limitations are driving researchers to develop new, less invasive, and more effective therapies. Corneal endothelial cell therapy is being explored as a potential therapeutic measure, to avoid the uncertainty associated with grafting. The human cornea is an ideal tissue for cell therapy as owing to its avascular characteristics, transplanted cells are better tolerated compared with other vascularized tissues and organs. Advances in the field of stem-cell engineering, particularly the development of corneal epithelial stem cell therapy for the treatment of severe diseases of the ocular surface, have aroused a massive interest in adapting cell-therapy techniques to corneal endothelial cells

L’objectif était d’évaluer l’efficacité de thérapies développées pour traiter la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD, due à des mutations du gène de la dystrophine) dans la restauration de déficits cognitifs associés à ce syndrome. Deux pistes thérapeutiques visant à compenser les altérations cérébrales liées à la perte de dystrophine ont été explorées chez les souris mdx, modèle de DMD. Une approche pharmacologique basée sur la surexpression de l’utrophine, homologue de la dystrophine, n’améliore pas les déficits comportementaux des souris mdx. Par contre, une intervention génique basée sur l’épissage de l’exon muté conduit à la restauration d’une dystrophine endogène et une récupération d’altérations cérébrales comme l’agrégation des récepteurs GABAA et la plasticité synaptique hippocampique. Ceci suggère un rôle de la dystrophine dans la plasticité du cerveau adulte et l’applicabilité de cette approche de thérapie génique au traitement des altérations cognitives de la DMD. / Therapies have been developed to treat Duchenne muscular dystrophy (DMD, due to mutation in the dystrophin gene), but their ability to restore the cognitive deficits associated with this syndrome has not been yet studied. We explored two therapeutic approaches to compensate for the brain alterations resulting from the loss of dystrophin in the mdx mouse, a model of DMD. A pharmacological approach based on the overexpression of utrophin, a dystrophin homologue, does not alleviate the behavioural deficits in these mice. In contrast, a genetic intervention based on the splicing of the mutated exon leads to the restoration of endogenous dystrophin and a recovery of brain alterations such as the clustering of GABAA receptors and hippocampal synaptic plasticity in mdx mice. These results suggest a role for dystrophin in adult brain plasticity and indicate that this gene therapy approach is applicable to the treatment of cognitive impairments in DMD.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1), est une maladie génétique héréditaire affectant environ 1/8000 personnes. Les patients souffrant de DM1 développent essentiellement des troubles musculaires tels qu’une faiblesse et une atrophie musculaire. La cause de la DM1 est expliquée par la mutation du gène "DMPK". Lors de ma thèse, j’ai pu démontrer que l’épissage de l’ARNm BIN1 était altéré dans le muscle DM1. En effet, l’exon 7 de BIN1, qui est absent du muscle normal, est exprimé de façon aberrante chez les patients DM1. En utilisant un modèle murin, j’ai prouvé que l’expression forcée de l’exon 7 de BIN1 altérait simultanément la structure et la fonction du muscle. Nous avons notamment observés une diminution de la taille des fibres musculaires et une augmentation de la faiblesse musculaire, comparé à des souris normales. Par conséquent, ce travail aidera à la compréhension du mécanisme de la maladie et pourrait expliquer les causes de la faiblesse musculaire et de l’atrophie. / Myotonic dystrophy of type 1 (DM1), is an inherited genetic disease affecting around 1 in 8000 person. Patients suffering from DM1 develop essentially muscle disorders such as muscle weakness, muscle loss and atrophy. The cause of DM1 is explained by the mutation of a gene called “DMPK“.During my thesis, I discovered that the alternative splicing of BIN1 mRNA was altered in the muscle of DM1 patients. Indeed, the BIN1 exon 7, which is normally absent in healthy muscle, is aberrantly expressed in DM1 muscle. By using a mouse model, I found that the forced expression of BIN1 exon 7 was responsible of the alteration of both muscle structure and function. Notably, we found a decrease in muscle fibers area (atrophy) and an increase of muscle weakness, compared to wild-type mice. Therefore, this work will help in the understanding of the disease mechanism and could explain the causes of muscle weakness and atrophy, which have never been elucidated to this date.

La mitochondrie est de plus en plus reconnue pour sa contribution à la dégénerescence musculaire. Les dysfonctions mitochondriales, en plus de causer une défaillance énergétique, contribuent à la signalisation apoptotique, stimule la production de ROS et peuvent induire une surcharge calcique. Ces caractéristiques sont tous reliées à certains types de myopathies. Cette thèse met en lumières comment certaines dysfonctions mitochondriales peuvent intervenir dans la pathogenèse de diverses myopathies. Nous démontrons que les dysfonctions mitochondriales sont impliqués dans l’atrophie dû à la perte d’innervation. Par contre, la désensabilisation de l’ouverture du pore mitochondrial de transition de perméabilité, via ablation génétique de cyclophiline-D, ne prévient ni la signalisation apoptotique mitochondrial ni l’atrophie. Nous avons aussi observé des dysfonctions mitochondriales dans le muscle atteint de dystrophie musculaire de Duchenne qui furent améliorés suite à une transfection de PGC1-α, laquelle résulta aussi en une amélioration de la pathologie. Finalement, nous démontrons que le recyclage de mitochondrie par les voies de mitophagies et de contrôles de la qualité impliquant Parkin et possiblement d’autres voies de signalisation inconnues sont cruciales au recouvrement cardiaqe lors d’un choc septique. / Mitochondria are increasingly being recognized for their role in contributing in cellular damage. Mitochondrial dysfunctions, in addition to causing energy failure, contribute to apoptotic signaling, stimulate ROS production and calcium overload. These are all features of various types of myopathies. This thesis sheds light on how mitochondrial dyfunctions may contribute to the pathogenesis in certain myopathies that have been found to show mitochondrial abnormalities. Specifically, we found that although mitochondrial dysfunctions are involved in denervation-associated atrophy, desensitizing mitochondrial permeability transition pore opening through genetic ablation of CyclophilinD does not prevent mitochondrial apoptotic signaling nor atrophy in this model of chronic inactivity. We also observed mitochondrial dysfunctions in the Duchenne dystrophic muscle that were improved after PGC1-α transfection, which also resulted in an amelioration of the disease presentation. Finally, we found that mitochondrial recycling, led by Parkin and alternate mitophagy pathways a crucial component of cardiac recovery in sepsis.

Cette thèse porte sur l’étude de l’anatomie de la cornée après 3 techniques de greffe soient, la greffe totale traditionnelle (GTT) et des techniques de greffe lamellaire postérieur (GLP) telles que la greffe lamellaire endothéliale profonde (DLEK) et la greffe endothélium/membrane de Descemet (EDMG) pour le traitement des maladies de l’endothélium, telles que la dystrophie de Fuchs et de la kératopathie de l’aphaque et du pseudophaque. Dans ce contexte, cette thèse contribue également à démontrer l’utilité de la tomographie de cohérence optique (OCT) pour l’étude de l’anatomie des plaies chirurgicales la cornée post transplantation. Au cours de ce travail nous avons étudié l'anatomie de la DLEK, avant et 1, 6, 12 et 24 mois après la chirurgie. Nous avons utilisé le Stratus OCT (Version 3, Carl Zeiss, Meditec Inc.) pour documenter l’anatomie de la plaie. L'acquisition et la manipulation des images du Stratus OCT, instrument qui à été conçu originalement pour l’étude de la rétine et du nerf optique, ont été adaptées pour l'analyse du segment antérieur de l’oeil. Des images cornéennes centrales verticales et horizontales, ainsi que 4 mesures radiaires perpendiculaires à la plaie à 12, 3, 6 et 9 heures ont été obtenues. Les paramètres suivants ont été étudiés: (1) Les espaces (gap) entre les rebords du disque donneur et ceux du receveur, (2) les dénivelés de surface postérieure (step) entre le les rebords du disque donneur et ceux du receveur, (3) la compression tissulaire, (4) le décollement du greffon, 6) les élévations de la surface antérieure de la cornée et 7) la pachymétrie centrale de la cornée. Les mesures d’épaisseur totale de la cornée ont été comparées et corrélées avec celles obtenues avec un pachymètre à ultra-sons. Des mesures d’acuité visuelle, de réfraction manifeste et de topographie ont aussi été acquises afin d’évaluer les résultats fonctionnels. Enfin, nous avons comparé les données de DLEK à celles obtenues de l’EDMG et de la GTT, afin de caractériser les plaies et de cerner les avantages et inconvénients relatifs à chaque technique chirurgicale. Nos résultats anatomiques ont montré des différences importantes entre les trois techniques chirurgicales. Certains des paramètres étudiés, comme le sep et le gap, ont été plus prononcés dans la GTT que dans la DLEK et complètement absents dans l’EDMG. D’autres, comme la compression tissulaire et le décollement du greffon n’ont été observés que dans la DLEK. Ceci laisse entrevoir que la distorsion de la plaie varie proportionnellement à la profondeur de la découpe stromale du receveur, à partir de la face postérieure de la cornée. Moins la découpe s’avance vers la face antérieure (comme dans l’EDMG), moins elle affecte l’intégrité anatomique de la cornée, le pire cas étant la découpe totale comme dans la GTT. Cependant, tous les paramètres d’apposition postérieure sous-optimale et d’élévation de la surface antérieure (ce dernier observé uniquement dans la GTT) finissent par diminuer avec le temps, évoluant à des degrés variables vers un profil topographique plus semblable à celui d’une cornée normale. Ce processus paraît plus long et plus incomplet dans les cas de GTT à cause du type de plaie, de la présence de sutures et de la durée de la cicatrisation. Les valeurs moyennes d’épaisseur centrale se sont normalisées après la chirurgie. De plus, ces valeurs moyennes obtenues par OCT étaient fortement corrélées à celles obtenues par la pachymétrie à ultra-sons et nous n’avons remarqué aucune différence significative entre les valeurs moyennes des deux techniques de mesure. L’OCT s’est avéré un outil utile pour l’étude de l’anatomie microscopique des plaies chirurgicales. Les résultats d’acuité visuelle, de réfraction et de topographie des techniques de GLP ont montré qu’il existe une récupération visuelle rapide et sans changements significatifs de l’astigmatisme, contrairement à la GTT avec et sans suture. La GLP a permis une meilleure conservation de la morphologie de la cornée, et par conséquence des meilleurs résultats fonctionnels que la greffe de pleine épaisseur. Ceci nous permet d’avancer que la GLP pourrait être la technique chirurgicale à adopter comme traitement pour les maladies de l’endothélium cornéen. / This thesis aims to study the anatomy of the corneal wound following 3 techniques of corneal graft: traditional penetrating keratoplasy (PK) and two techniques of posterior lamellar keratoplasy (PLK) which are deep lamellar endothelial keratoplasy (DLEK) and Endothelial-Descemet’s Membrane Graft (EDMG) for the treatment of the endothelial corneal diseases, such as Fuch’s dystrophy and aphakic and pseudopakic bullous keratopathy. In this context, this thesis also contributes to show the utility of the time domain optical coherence tomography (TD-OCT) for studying the anatomy of surgical wounds after corneal transplantation. In this work we studied the anatomy of DLEK, before and 1,6,12 and 24 months after surgery. We used the Stratus OCT. (Version 3, Carl Zeiss, Meditec Inc.) to document the anatomy of the wound. The acquisition and the handling of the images of the Stratus OCT, an instrument originally designed for the study of the retina and the optic nerve, were adapted to analyse the anterior segment of the eye. Vertical and horizontal central images of the cornea, in addition to 4 radial measurements perpendicular to the wound at 12, 3, 6 and 9 hours were obtained. The following parameters were studied: (1) the gap between the edges of the donor disc and those of the recipient, (2) posterior surface mismatch (step) between the edges of the disc donor and those of the recipient, (3) tissue compression, (4) graft detachment, 6) elevations of the anterior corneal surface and 7) the central pachymetry of the cornea. Measurements of the total thickness were compared and correlated with those obtained with an ultrasound pachymeter. Measurements of visual acuity, manifest refraction and topography were also acquired in order to evaluate the functional results. Lastly, we compared the data of DLEK with those obtained from the EDMG and the PK, in order to characterize the wounds and to highlight the advantages and disadvantages relative to each surgical technique.Our anatomical results showed important differences between the three surgical techniques. Some of the studied parameters, like the step and the gap, were more pronounced in PK than in DLEK and completely absent in the EDMG group. Others, like tissue compression and graft detachment were observed only in the DLEK group. This let us predict that the distortion of the wound varies proportionally with the depth of recipient posterior stromal dissection. The less dissection towards the anterior surface (as in EDMG), the less it affects the anatomical integrity of the cornea, the worst case being full thickness trephination as in PK. However, all the parameters of sub-optimal posterior surface apposition and anterior surface elevation (this last only observed in PK) ended up decreasing with time, evolving with variable degrees to a topographic profile more similar to that of a normal cornea. This process appears longer and more incomplete in the cases of PK because of the type of wound, the presence of sutures and the longer healing period. The mean values of central thickness were normal after surgery. Moreover, these mean values obtained by OCT. were strongly correlated with those obtained by ultrasound pachymetry and we did not notice any significant difference between the mean values of the two measurement techniques. OCT proved to be a useful tool for the study of the microscopic anatomy of the corneal surgical wounds. The results of vision, refraction and topography of the techniques of posterior lamellar grafts showed that there was a fast visual recovery and without significant changes in astigmatism, contrary to PK with and without sutures. Posterior lamellar grafts allowed a better conservation of the morphology of the cornea, and consequently better functional results than PK. This enabled us to conclude that posterior lamellar corneal grafts could be the surgical technique of choice for the treatment of corneal endothelial diseases.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD, pour l’abréviation du terme anglais « Fuchs endothelial corneal dystrophy ») est une maladie de l'endothélium cornéen. Sa pathogenèse est mal connue. Aucun traitement médical n’est efficace. Le seul traitement existant est chirurgical et consiste dans le remplacement de l’endothélium pathologique par un endothélium sain provenant de cornées de la Banque des yeux. Le traitement chirurgical, en revanche, comporte 10% de rejet immunologique. Des modèles expérimentaux sont donc nécessaires afin de mieux comprendre cette maladie ainsi que pour le développement de traitements alternatifs. Le but général de cette thèse est de développer un modèle expérimental de la FECD en utilisant le génie tissulaire. Ceci a été réalisé en trois étapes. 1) Tout d'abord, l'endothélium cornéen a été reconstruit par génie tissulaire en utilisant des cellules endothéliales en culture, provenant de patients atteints de FECD. Ce modèle a ensuite été caractérisé in vitro. Brièvement, les cellules endothéliales cornéennes FECD ont été isolées à partir de membranes de Descemet prélevées lors de greffes de cornée. Les cellules au deuxième ou troisième passages ont ensuite été ensemencées sur une cornée humaine préalablement décellularisée. Suivant 2 semaines de culture, les endothélia cornéens reconstruits FECD (n = 6) ont été évalués à l'aide d'histologie, de microscopie électronique à transmission et d’immunomarquages de différentes protéines. Les endothélia cornéens reconstruits FECD ont formé une monocouche de cellules polygonales bien adhérées à la membrane de Descemet. Les immunomarquages ont démontré la présence des protéines importantes pour la fonctionnalité de l’endothélium cornéen telles que Na+-K+/ATPase α1 et Na+/HCO3-, ainsi qu’une expression faible et uniforme de la protéine clusterine. 2) Deux techniques chirurgicales (DSAEK ; pour « Descemet stripping automated endothelial keratoplasty » et la kératoplastie pénétrante) ont été comparées pour la transplantation cornéenne dans le modèle animal félin. Les paramètres comparés incluaient les défis chirurgicaux et les résultats cliniques. La technique « DSAEK » a été difficile à effectuer dans le modèle félin. Une formation rapide de fibrine a été observée dans tous les cas DSAEK (n = 5). 3) Finalement, la fonctionnalité in vivo des endothélia cornéens reconstruits FECD a été évaluée (n = 7). Les évaluations in vivo comprenaient la transparence, la pachymétrie et la tomographie par cohérence optique. Les évaluations post-mortem incluaient la morphométrie des cellules endothéliales, la microscopie électronique à transmission et des immunomarquage de protéines liées à la fonctionnalité. Après la transplantation, la pachymétrie a progressivement diminué et la transparence a progressivement augmenté. Sept jours après la transplantation, 6 des 7 greffes étaient claires. La microscopie électronique à transmission a montré la présence de matériel fibrillaire sous-endothélial dans toutes les greffes d’endothelia reconstruits FECD. Les endothélia reconstruits exprimaient aussi des protéines Na+-K+/ATPase et Na+/HCO3-. En résumé, cette thèse démontre que les cellules endothéliales de la cornée à un stade avancé FECD peuvent être utilisées pour reconstruire un endothélium cornéen par génie tissulaire. La kératoplastie pénétrante a été démontrée comme étant la procédure la plus appropriée pour transplanter ces tissus reconstruits dans l’œil du modèle animal félin. La restauration de l'épaisseur cornéenne et de la transparence démontrent que les greffons reconstruits FECD sont fonctionnels in vivo. Ces nouveaux modèles FECD démontrent une réhabilitation des cellules FECD, permettant d’utiliser le génie tissulaire pour reconstruire des endothelia fonctionnels à partir de cellules dystrophiques. Les applications potentielles sont nombreuses, y compris des études physiopathologiques et pharmacologiques. / Fuchs endothelial corneal dystrophy (FECD) is a primary disease of the corneal endothelium. Its pathogenesis is poorly understood. No medical treatment is effective. Surgical treatment (the only available treatment) carries 10% of immunogenic rejection. Experimental models are needed in order to better understand the disease and to investigate potential autologous treatments (to prevent immunogenic rejection). The overall goal of this thesis is to develop an experimental model for FECD using tissue engineering. This was achieved in three steps. 1) An in vitro tissue-engineered FECD model was created and characterized. Briefly, Descemet’s membranes from patients with late-stage FECD undergoing Descemet’s Stripping Automated Endothelial Keratoplasty (DSAEK) were used to isolate and culture FECD endothelial cells. Second or third-passaged FECD endothelial cells were seeded on a previously decellularized human cornea. After 2 weeks in culture, TE-FECD corneas (n=6) were assessed using histology, transmission electron microscopy (TEM) and immunofluorescence labeling of various proteins. TE-FECD endothelium yielded a monolayer of polygonal cells well adhered to Descemet’s membrane. The TE-FECD corneal endothelium expressed the function-related proteins Na+-K+/ATPase α1 and Na+/HCO3-. Clusterin expression was faint and uniform. 2) In order to determine the best surgical procedure to transplant the TE-FECD corneas in the feline model, a DSAEK procedure was evaluated and compared to penetrating keratoplasty technique. DSAEK assessments included surgical challenges and clinical outcomes. DSAEK technique was challenging to perform in the feline model. Rapid fibrin formation was observed in all DSAEK cases (n=5). 3) The in vivo functionality of the TE-FECD corneas was assessed. TE-FECD corneas were grafted in the feline model (n=7) using penetrating keratoplasty procedure and observed for seven days. In vivo assessments included transparency, pachymetry, optical coherence tomography, endothelial cell morphometry, TEM and immunostaining of function-related proteins. After transplantation, pachymetry gradually decreased and transparency gradually increased. Seven days after transplantation, 6 out of 7 grafts were clear. Post-mortem TEM showed subendothelial loose fibrillar material deposition in all TE-FECD grafts. The TE grafted endothelium expressed Na+-K+/ATPase and Na+/HCO3-. This thesis demonstrates that endothelial cells from late-stage FECD corneas can be used to engineer a corneal endothelium. Compared to DSEAK, penetrating keratoplasty is a more appropriate procedure for corneal transplantation in the feline model, since the DSAEK procedure in the feline model presently yields inconsistent clinical results. Restoration of corneal thickness and transparency demonstrates that the TE-FECD grafts are functional in vivo. This novel FECD living model suggests a potential role of tissue engineering for FECD cell rehabilitation. Potential applications are numerous, including pathophysiological and pharmacological studies.

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