Les dystrophies rétiniennes héréditaires (DRH) sont un ensemble de pathologies rétiniennes incurable provoquant la cécité. Les DRH sont caractérisées par le dysfonctionnement/dégénérescence des photorécepteurs et le remodelage de la structure de la rétine. Une des approches thérapeutiques envisagées pour traiter les DRH est la thérapie génique spécifique, c’est à dire le remplacement du gène défectueux par un gène sain. Cependant, bien qu’efficace, la thérapie génique spécifique n’est pas toujours applicable, en particulier quand la dégénérescence est trop avancée ou quand le gène muté n’est pas connu. Afin de traiter tous les cas de DRH quelle que soit leur origine génétique et leur stade de progression, une approche de thérapie génique d’addition est envisagée : Le transfert d’optogène. Cela consiste à convertir les cellules encore présentes dans la rétine malgré la dégénérescence, en cellule photosensible suite à l’expression d’un optogène (protéine photosensible). Mon projet de thèse a consisté dans un premier temps à évaluer le transfert de gène avec un vecteur AAV2/2 dans les cellules ganglionnaires rétiniennes de chien et de primate non-humain. Cette première partie a permis d’initier un second projet qui a eu pour objectif d’évaluer l’efficacité du transfert d’optogène (Channelrhodopsin-2) pour la restauration de la fonction visuelle dans un modèle canin de dystrophie rétinienne (le chien Rpe65- /-). / Inherited retinal dystrophies (IRD), a group of incurable retinal pathologies, are associated with visual impairments due to a malfunction and/or degeneration of photoreceptors and/or retinal pigment epithelium (RPE). Significant progress in the field of gene therapy has allowed the development and the characterization of an innovative tool to treat IRD patients: recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) that carry and deliver therapeutic nucleic acids. However, due to the heterogenic nature of IRD, gene supplementation will not allow to treat all forms of IRD because: (i) the numbers of mutated genes are unknown according to the state of art; (ii) the dominant forms of IRD in which mutations lead to negative effects are not eligible; (iii) the limit of AAV packaging excludes large-sized mutated genes and (iv) this approach is only applicable when photoreceptors are still alive. To treat all IRD patients, a novel therapeutic approach, independently of the mutated gene and the disease kinetic is suitable: the optogene transfer (light-sensitive protein) to restore photosensitivity in neurodegenerative retina by converting surviving retinal cells into photosensors. The primary goal of my research was to promote and characterize adeno-associated virus type 2-(AAV2) transduction in retinal ganglion cells of dog and non-human primate. A second aim was to investigate the feasibility of AAV2-mediated optogenes transfer in retinal ganglion cells as a therapeutic approach to restore visual function in RPE65 deficient dog, a canine model of IRDs.

Les dystrophies rétiniennes héréditaires (DRH) sont des maladies qui conduisent à une perte de la vision au cours de leur évolution. Les premiers essais cliniques utilisant la thérapie génique pour traiter ces maladies ont été réalisés et apportent des résultats encourageants. En amont de telles études, les essais précliniques s'effectuent le plus souvent sur modèle animal. Cependant, pour un certain nombre de DRH, il n'existe pas de modèle animal approprié ce qui compromet l'arrivée d'un traitement à un stade clinique. C'est le cas de la Choroïdérémie, qui représente 2% des DRH. La choroïdérémie est caractérisée par une perte de la vision nocturne dès la petite enfance et conduit à la cécité autour des 40-50 ans. Son diagnostic précoce et son évolution lente résultent en une grande fenêtre thérapeutique qui fait de la choroïdérémie une bonne candidate pour la thérapie génique. Sur le plan génétique, la maladie est causée par une mutation dans le gène CHM qui est localisé sur le chromosome X et code pour la Rab Escort Protein 1 (REP1). Cette protéine est impliquée dans le processus de prénylation de petites protéines GTPases, les protéines Rab. Afin de pallier au manque de modèle animal, nous avons généré au cours de ce travail de thèse, un modèle cellulaire humain de la choroïdérémie pour évaluer l'efficacité d'un protocole de thérapie génique sur le tissu réellement atteint in vivo. Pour cela, nous avons reprogrammé des fibroblastes de patient CHM-/y en cellules souches pluripotentes induites (iPS), que nous avons ensuite différenciées en Epithélium Pigmentaire Rétinien (EPR). Nous avons caractérisé cet EPR, montrant que c'est une couche monocellulaire polarisée possédant une morphologie et une expression de marqueurs caractéristiques. De plus, ce tissu est fonctionnel, sur le plan du transport de fluide et de la phagocytose, et possède le même phénotype biochimique que celui observé chez les patients. Dans un but de thérapie génique et afin d'évaluer le vecteur viral le plus efficace sur nos cellules, j'ai testé un panel de 5 sérotypes d'AAV et démontré que l'AAV2/5 est le plus efficient pour transduire un EPR dérivé de cellules iPS humaines. J'ai ensuite utilisé un AAV2/5-CAG-CHM afin d'évaluer l'efficacité fonctionnelle du vecteur et j'ai pu montrer qu'outre une expression correcte du transgène, le traitement de cellules de patients déficientes pour REP1 avec ce vecteur permet de restaurer une activité normale de prénylation. Nous avons donc démontré la supériorité d'efficacité de transduction de l'AAV2/5 dans des cellules d'EPR humain et soulignons le potentiel d'un modèle d'EPR pathologique dérivé de cellules iPS pour apporter une preuve de concept de thérapie génique en absence d'un modèle animal approprié. / Inherited retinal dystrophies (IRDs) lead to a progressive vision loss. The first clinical trials using gene transfer to treat such diseases have been performed with positive results. Prior to clinical trials, preclinical studies are usually performed on animal models. However, for many IRDs, appropriate animal models do not exist, which compromises their progress towards a clinical trial. An example of an IRD that lacks an appropriate model is choroideremia, which represents 2% of IRD patients. It is characterized by night blindness in childhood, followed by progressive loss of the visual field resulting in blindness by 40–50 years of age. Its early diagnosis and slow evolution result in a large therapeutic window making choroideremia a good candidate for gene therapy. Genetically, the disease is caused by a mutation in the CHM gene located on the X chromosome and encoding the Rab Escort Protein 1 (REP1). This protein is involved in the prenylation of small GTPases, the Rab proteins. To palliate the lack of an animal model, we generated a human cellular model of choroideremia in order to evaluate the efficacy of a gene therapy approach in the tissue that is affected in vivo.Towards this aim, we reprogrammed REP1-deficient fibroblasts from a CHM-/y patient into induced pluripotent stem cells (iPScs), which we differentiated into retinal pigment epithelium (RPE). We characterized the iPSc-derived RPE that is a polarized monolayer with a classic morphology, expresses characteristic markers, is functional for fluid transport and phagocytosis, and mimics the biochemical phenotype of patients. In terms of gene therapy and to evaluate the most efficient viral vector, I assayed a panel of 5 adeno-associated virus (AAV) vector serotypes and showed that AAV2/5 is the most efficient at transduce the iPSc-derived RPE. I then transduced the iPSc-derived RPE of a choroideremia patient with an AAV2/5-CAG-CHM and demonstrated that this vector is able to restore a normal prenylation function to the cells.To conclude, I demonstrated the superiority of the transduction efficiency of AAV2/5 in the iPSc-derived RPE and highlight the potential of a diseased RPE model derived from iPS cells to provide a proof of concept of gene therapy in the absence of a suitable animal model.

No description available.

Background: Duchenne and Becker muscular dystrophies, collectively referred to as dystrophinopathies, are recessive X-linked disorders characterized by progressive muscle weakness and ultimately cardiac and respiratory failure. Immediate family members are often primary caregivers of individuals with a dystrophinopathy. Methods: We explored the impact of this role by inviting primary caregivers (n = 209) of males diagnosed with childhood-onset dystrophinopathy who were identified by the Muscular Dystrophy Surveillance, Tracking, and Research Network (MD STARnet) to complete a mailed questionnaire measuring perceived social support and stress, spirituality, and family quality of life (FQoL). Bivariate and multivariate analyses examined associations between study variables using the Double ABCX model as an analytic framework. Results: Higher stressor pile-up was associated with lower perceived social support (r = -0.29, p <.001), availability of supportive family (r = -0.30, p <.001) or non-family (r = -0.19, p <.01) relationships, and higher perceived stress (r = 0.33, p <.001); but not with spirituality (r = -0.14, p > 0.05). FQoL was positively associated with all support measures (correlations ranged from: 0.25 to 0.58, p-values 0.01-0.001) and negatively associated with perceived stress and control (r = -0.49, p <.001). The association between stressor pile-up and FQoL was completely mediated through global perceived social support, supportive family relationships, and perceived stress and control; supportive non-family relationships did not remain statistically significant after controlling for other mediators. Conclusions: Findings suggest caregiver adaptation to a dystrophinopathy diagnosis can be optimized by increased perceived control, supporting family resources, and creation of a healthy family identity. Our findings will help identify areas for family intervention and guide clinicians in identifying resources that minimize stress and maximize family adaptation.

A distrofia muscular de cintura 2B (LGMD2B) é uma doença neuromuscular causada pela redução ou ausência da proteína sarcolemal disferlina. A disferlina está envolvida no reparo de membrana por atuar no tráfego e fusão de vesículas após estresse mecânico e, quando deficiente, as alterações nesta via levam à degeneração progressiva e irreversível das fibras musculares. A disferlina também tem sido implicada na inflamação e na miogênese durante a degeneração e regeneração muscular. Recentemente, identificou-se um tricomplexo formado pela disferlina com duas proteínas citoplasmáticas, FAM65B e HDAC6, no início da diferenciação de mioblastos. Investigar a regulação destas interações é importante para avançar na compreensão das funções da disferlina e seu papel na função muscular. Neste estudo, a miogênese e o reparo muscular foram investigados in vivo e in vitro em modelos com deficiência de disferlina. Para estudar o processo regenerativo in vivo, utilizamos um modelo de eletroporação para induzir degeneração/regeneração no músculo distrófico levemente afetado do camundongo disferlina-deficiente SJL/J. A avaliação histopatológica e a expressão relativa dos genes Pax7, Myf5, MyoD e miogenina foram acompanhadas durante a recuperação muscular em diferentes tempos após a lesão. Além disso, investigamos os efeitos da deficiência de disferlina na expressão dos genes Fam65b e Hdac6. Observamos um curso de tempo alterado do processo de degeneração e regeneração, com notável capacidade regenerativa nos camundongos disferlina-deficientes, caracterizada por uma resposta mais rápida e eficaz nos primeiros dias após a lesão, em comparação com os camundongos normais. Além disso, Fam65b e Hdac6 foram ativados nos estágios iniciais da regeneração muscular, também com expressão mais elevada de ambos os genes no camundongo SJL/J. Esses resultados podem estar relacionados à uma possível condição pré-ativada do processo regenerativo no músculo de camundongos distróficos jovens. Para os experimentos in vitro, utilizamos células musculares humanas de pacientes com LGMD2B, com deficiência total de disferlina. A diferenciação muscular induziu a formação de miotubos mais finos e com menor frequência de núcleos por miotubo, sugerindo uma progressão retardada da formação de miotubos em células com LGMD2B. A expressão de mRNA de MYOD e FAM65B não foi aparentemente afetada pela deficiência de disferlina durante a diferenciação, enquanto HDAC6 apresentou um pico transitório após 24 horas, apenas nas células normais. Além disso, o pico da miogenina ocorreu mais cedo nas células normais. Portanto, sugerimos que a disferlina estaria menos envolvida nos eventos iniciais de formação de pequenos miotubos, mas poderia desempenhar um papel importante nos estágios posteriores de diferenciação, que envolvem crescimento e alongamento de miotubos. Estes resultados fornecem dados interessantes para investigações adicionais de como a deficiência de disferlina afeta os reguladores miogênicos durante a diferenciação. Em conjunto, nossos dados sugerem que a deficiência de disferlina provoca alterações temporais na progressão dos eventos de regeneração muscular e de miogênese. A identificação de uma possível regulação dos componentes do tricomplexo pela disferlina pode indicar novas direções para investigar esta via como um potencial alvo para terapias / Limb girdle muscular dystrophy 2B (LGMD2B) is a neuromuscular disease caused by reduction or absence of the sarcolemmal protein dysferlin. Dysferlin is involved in membrane repair by acting on vesicular traffic and fusion after mechanical stress and, when deficient, changes in this pathway lead to progressive and irreversible degeneration of muscle fibers. Dysferlin has also been implicated in inflammation and myogenesis during muscle degeneration and regeneration. Recently, a tricomplex formed by dysferlin with two cytoplasmic proteins, FAM65B and HDAC6, was identified at the earlier stages of myoblast differentiation. Investigating the regulation of these interactions is important to advance in the understanding of the functions of dysferlin and its role in muscle function. In this study, myogenesis and muscle repair were investigated in vivo and in vitro in models with dysferlin deficiency. To study this effect in the regenerative process of muscle in vivo, we used a model of electroporation inducing muscle degeneration/regeneration in the mildly affected dystrophic muscle of dysferlin-deficient SJL/J mouse. The histopathological evaluation and the relative expression of the genes Pax7, Myf5, MyoD and myogenin were accompanied during muscle recovery at different time points after injury. In addition, we investigated the effects of dysferlin deficiency in the expression of genes Fam65b and Hdac6. We observed an altered time course of the degeneration and regeneration process, with remarkable regenerative capacity in dysferlin-deficient mice, characterized by a faster and effective response in the first days after injury, as compared to normal mice. Moreover, Fam65b and Hdac6 were activated at the early stages of muscle regeneration, also with higher expression of both genes in the SJL/J mouse. These results may have been due to a possible pre-activated condition of the regenerative process in the muscle of young dystrophic mice. For the in vitro experiments, we used human muscle cells from patients with LGMD2B, with total deficiency of dysferlin. The muscular differentiation induced the formation of thinner myotubes and reduced frequency of myonuclei per myotube, suggesting a delayed progression of myotube formation in LGMD2B cells. mRNA expression of MYOD and FAM65B was not apparently affected by dysferlin deficiency during differentiation, while HDAC6 exhibited a transient peak, only in healthy cells, after 24 hours. In addition, the myogenin peak occurred earlier in healthy cells. Thus, we suggested that dysferlin would be less involved in the first events of formation of early small myotubes, but could play an important role in the later stages of differentiation, which involves myotube growth and elongation. These results provide interesting data for further investigation of how dysferlin deficiency affects myogenic regulators during differentiation. Taken together, our data suggest that dysferlin deficiency causes temporal changes in the progression of the muscle regeneration and myogenesis events. The identification of possible regulation of tricomplex components by dysferlin may indicate new directions for investigating this pathway as a potential target for therapies

A partir dos resultados do trabalho (de 2006 a 2011) na Clínica de Psicanálise do Centro do Genoma Humano da Universidade de São Paulo USP, que atende prioritariamente afetados de doenças neuromusculares de origem genética, empreendemos uma pesquisa cuja hipótese de trabalho é aquela segundo a qual o diagnóstico de uma alteração genética pode funcionar para a pessoa como um insulto etimologicamente: saltar sobre - e, consequentemente, fixá-la como queixosa, triste, desinteressada do mundo etc. Assim, a pesquisa foi idealizada a partir da compreensão de que, para além da evolução natural da doença degenerativa, a pessoa piora porque, paradoxalmente, busca se relocalizar no insulto. Mostramos que, com o tratamento psicanalítico, ela pode reinventar sua vida singularmente, confrontada à surpresa do diagnóstico. Detectamos um vírus social que nomeamos de RC, as iniciais de Resignação e Compaixão. Com grande frequência, notamos que, após um primeiro momento de revolta do paciente, ele vai da raiva à resignação enquanto, sua família, do choro à compaixão. Essas duas reações, contrárias ao paciente, são, no entanto, muito valorizadas socialmente. Nosso trabalho, indo na contra vertente do RC, teve como objetivo geral discutir: a) como os pacientes da medicina do futuro, aquela que não diz o que lhe aconteceu, ou o que está lhe acontecendo, mas o que pode ou vai lhe acontecer, podem reagir à ocorrência do sofrimento humano de uma forma que piora o seu estado atual e futuro; e b) como a psicanálise pode ser um instrumento importante para o tratamento dessas pessoas, restituindo a elas a responsabilidade pela singularidade de suas vidas, tendo como consequência, não só uma evidente melhora, bem como, por causa disso, eventualmente atrasar o progredir da doença, ganhando tempo para que os avanços na pesquisa genética venham quiçá a beneficiá-los. Especificamente, estuda os efeitos que aproximadamente quinze semanas de tratamento psicanalítico podem ter sobre: a) uma população que teve o diagnóstico de portador de doença degenerativa confirmado; e b) uma população composta por não portadores de doenças degenerativas, mas que, de algum modo, dada a íntima relação estabelecida (parentesco, amorosa ou de amizade) com o portador, poderia influenciar, direta e estreitamente, no dia-a-dia do doente. Para tanto, toma como sujeitos 42 portadores de doenças degenerativas e 22 pessoas que se relacionam com eles a quem foram oferecidas 15 semanas de tratamento psicanalítico. Cada paciente foi avaliado duas vezes (no início e no fim) por meio da utilização de uma adaptação da versão brasileira de uma escala de impressão clínica de mudança. Os seguintes fatos destacaram-se em cada categoria. Geral: 80% dos casos de alteração para melhor na relação do paciente com a doença. Estado mental/cognitivo: quase 50% da população melhorou a possibilidade de se expressar. Comportamento: 72% da população apresentou melhora nos sentimentos depressivos. Vida amorosa: notável melhora em todos os domínios. Posição subjetiva: quase 80% da população passou a se responsabilizar pela própria vida. Concluímos que, o tratamento psicanalítico proporciona alto índice de melhoria imediata do paciente, e pode, ao menos potencialmente, alargar o tempo de instalação da lesão / From the results of the project (2006 to 2011) at the Psychoanalysis Clinic of the Human Genome Center at the University of São Paulo (USP), which gives priority to those suffering from neuromuscular diseases of genetic origin, we undertook a study whose hypothesis is that the diagnosis of a genetic change may act as an insult leaping upon at the patient (insult comes from the Latin insultare to assail, jump upon) and can result in the patient complaining and becoming morose and disinterested in the world. This study was conceived from the awareness that, in addition to the natural progression of the degenerative disease, the patient deteriorates because, paradoxically, they attempt to relocate themselves within the insult. We show that with the help of psychoanalytic treatment, the patient, faced with the surprise of the diagnosis, can reinvent their life in a singular way. We have detected a social virus which we call RC, Resignation and Compassion and have frequently observed that, after initial anger, the patient moves towards resignation while the family changes from weeping to showing compassion. Both reactions, which do not help the patient, are, nevertheless, highly valued socially. Our study, which goes against this RC element, discusses: a) how the patients in the medicine of the future, which does not say what happened, or what is happening, but what may or will happen, can react to the occurrence of human suffering in a way that deteriorates their present and future condition; and b) how psychoanalysis can be an important tool in the treatment of these patients, giving back to them responsibility for the singularity of their lives, resulting in not only a clear improvement but also, as a result of this, a possible delay in the progress of the disease, gaining time during which advances in genetic research may benefit them. We specifically study the effects that approximately fifteen weeks of psychoanalytic treatment may have on: a) a population that had the diagnosis of degenerative diseases confirmed; and, b) a population made up of people not suffering from degenerative diseases, but who, given their close relationship (family, affectionate or friendship) with the patient, could closely affect their day-to-day lives. In order to do so¸ 42 subjects suffering from degenerative diseases, and 22 people who had relationships with them, were offered 15 weeks of psychoanalytic treatment. Each patient was evaluated twice (at the beginning and end) by using an adaptation of the Brazilian version of a scale of clinical impression of change. The following results can be emphasized in each category. General: 80% of patients improved. Mental / cognitive state: almost 50% improved their ability to express themselves. Behavior: 72% improved their depressive tendencies. Love life: remarkable improvements in all areas. Subjective position: almost 80% of the population started to take responsibility for their own lives. We conclude that psychoanalytic treatment has a high rate of immediate improvement in the patient and can, at least potentially, extend the period the degenerative disease requires to take effect

As distrofias musculares constituem um grupo heterogêneo de doenças caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. A fraqueza muscular se manifesta quanto existe um desequilíbrio entre os ciclos de degeneração e regeneração, com subseqüente substituição por tecido conjuntivo e adiposo das fibras musculares eliminadas. Diversos fatores estão implicados nestes processos, e as vias de atuação de cada um deles ainda não são totalmente conhecidas. Os mais importantes marcadores da via miogênica são os fatores Myf5, MyoD, Myf6 e miogenina. Os marcadores da degeneração, por sua vez, são o TGF&#946;-1, citocina inflamatória provavelmente envolvida no processo de fibrose do músculo distrófico, e o aumento da expressão do próprio colágeno, componente da matriz extracelular. O objetivo do presente projeto consistiu em estudar os fatores relacionados com as vias de degeneração e regeneração em modelos murinos distróficos com diferentes defeitos nas proteínas musculares, para elucidação dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos, visando terapias. Para tal, foram estabelecidas três abordagens: 1-) Estudar o potencial terapêutico de células-tronco mesenquimais de medulas óssea, nos modelos Lama2dy-2J/J (deficiente para a proteína &#945;2-laminina) e Largemyd (defeito de glicosilação); 2-) Estudar a expressão relativa dos genes envolvidos nas vias de degeneração e regeneração nos diferentes modelos murinos para distrofias musculares; 3-) Estudar o papel da distrofina e &#945;2-laminina na organização do complexo distrofina-glicoproteínas associadas no músculo esquelético, através da produção de um camundongo duplo-mutante deficiente para estas duas proteínas. Na primeira abordagem, células-tronco mesenquimais de medula, expressando a proteína eGFP, foram injetadas por via sistêmica em camundongos Lama2dy-2J/J e Largemyd, mas não foram localizadas posteriormente no músculo dos animais testados. Testes complementares mostraram que células MSC e C2C12 expressando eGFP permanecem por curtos períodos de tempo no tecido injetado, sugerindo que são eliminadas do músculo distrófico em virtude da expressão permanente de eGFP. Análise funcional realizada nestes animais mostrou uma grande heterogeneidade de resposta nos diversos testes aplicados, compatível com a variabilidade clínica também observada em pacientes humanos. Na segunda abordagem, analisamos a expressão dos genes da cascata de degeneração e regeneração nos modelos distróficos mdx, SJL/J, Lama2dy-2J/J e Largemyd, e correlacionamos estes resultados com o padrão histopatológico de cada modelo. Os resultados observados sugerem que o gene TGF&#946;-1 é ativado pelo processo distrófico em qualquer grau de degeneração, enquanto a ativação da expressão do gene PCOL possivelmente ocorre nos estágios iniciais deste processo. Observou-se também que cada mecanismo patofisiológico atuou de forma diversa na ativação da regeneração, com diferenças na indução da proliferação das células-satélite, mas sem alterações no estimulo à diferenciação. Assim, a disfunção na população de células-satélite pode representar um mecanismo importante na patogênese das distrofias musculares. Na terceira abordagem, um modelo murino duplo-mutante para as proteínas distrofina e &#945;2-laminina foi gerado a partir de cruzamentos das linhagens mdx e Lama2dy-2J/J, com a proporção mendeliana esperada, sendo, portanto, viável. O animal duplo-afetado está apresentando fraqueza muscular mais acentuada que os modelos parentais. Estudos complementares de proteínas musculares serão ainda realizados neste novo modelo para verificar a presença ou não das demais proteínas do DGC e sua relação com o padrão de degeneração/regeneração muscular. / The muscular dystrophies are a heterogeneous group of genetic diseases characterized by progressive and irreversible degeneration of skeletal muscles. Muscle weakness is the consequence of an imbalance between successive cycles of degeneration and regeneration, with further replacement of the degraded muscle fibers by adipose and connective tissues. Several factors are involved these processes and the respective functional pathways are still not well known. Myf5, MyoD, Myf6 and myogenin are important factors responsible for the myogenesis and regeneration in the muscle. One important marker for the degeneration is TGF-1, which is an inflammatory cytokine with a possible role in the stimulation of fibrosis in the dystrophic muscle through the activation of genes related to the expression of collagen. The main objective of this project was to study the factors involved in the degeneration and regeneration pathways, in mice models for muscular dystrophies, carrying different defects in muscle proteins, to better understand the involved pathophysiological mechanisms, aiming future therapies. This was done through three strategies: 1-) The study of the therapeutic potential of transplantation of bone marrow mesenchymal-eGFP transformed stem cells, in Lama2dy-2J/J (a2 laminin deficient mice) and Largemyd (mice with defect in the glycosilation of -DG) ; 2-) The analyses of the relative expression of genes involved in regeneration and degeneration, in different mice models for muscular dystrophies; 3-) The study of the roles of dystrophin and 2-laminin proteins in the organization of the dystrophin-glycoprotein complex in muscle sarcolemma through the generation of a new mouse model, double-mutant for these two proteins. In the first approach, bone marrow mesenchymal stem cells expressing eGFP protein were intravenously injected in Lama2dy-2J/J and Largemyd mice, but these cells were not localized in the muscle of the tested animals after 3 months of experiment. Complementary studies showed that MSC and C2C12 cells expressing eGFP, when directly injected in the muscle of these models, were retained for only a few days, suggesting a rejection against cells expressing eGFP in the dystrophic muscle. Functional analysis showed a high variability among the tested mice, which is similar to the significant clinical variability observed in human patients with muscular dystrophies. In the second approach we quantified the expression of genes involved in degeneration and regeneration pathways in the dystrophic models mdx, SJL/J, Lama2dy-2J/J and Largemyd, and correlated these data with muscle histopathological pattern of each model. The result suggests that TGF&#946;-1 gene is activated in the dystrophic process in all the stages of degeneration while the activation of the expression of the PCOL gene possibly occurs in earliest stages of this process. We also observed that each physiopathological mechanism acted differently in the activation of regeneration, with differences in the induction of proliferation of satellite cells, but with no alterations in stimulation to differentiation. Dysfunction of satellite cells can therefore be an important additional mechanism of pathogenesis in the dystrophic muscle. In the third approach we generated a new dystrophic mouse model, carrying two simultaneous deficiencies of the proteins dystrophin and 2-laminin, by crossing mdx and Lama2dy-2J/J strains. In the offspring, the proportion of affected double-mutant mice was within the expected mendelian proportion, showing therefore, the viability of these defects with life. Only 4 alive animals were obtained up to the present date, and they are being followed for clinical characterization. The phenotype of this double-mutant mouse is very severe, presenting significant weakness, starting earlier and progressing faster that the parental strains. When more affected animals will be available, additional protein studies will be done to verify the effect of these two deficiencies in the organization of the DGC complex and its effect on the cascades of muscle degeneration and regeneration.

As células-satélite musculares vêm sendo muito estudadas em diferentes pesquisas, especialmente com o objetivo de aumentar a compreensão do mecanismo de sua ação na regeneração muscular e as respectivas implicações nas diferentes miopatias, visando identificar possíveis alvos terapêuticos. Dois modelos para distrofias, os camundongos Largemy d e Lama2dy2j/J possuem um padrão de degeneração intenso e bastante semelhante, mas com diferenças na expressão de genes envolvidos na cascata de regeneração. Por isso, estes constituem interessantes modelos para o estudo de possíveis diferenças no mecanismo de ativação e atuação das células-satélite no músculo distrófico. Assim, os objetivos específicos deste projeto consistiram em: 1) isolar e caracterizar por citometria de fluxo as populações de células-satélite dos modelos Largemy d e Lama2dy2j/J em comparação com o normal C57Black6, quanto a expressão de marcadores de miogênese e de células-tronco pluripotentes; e 2) estudar e comparar o perfil de expressão gênica destas populações de células satélites através de microarray de expressão. Na caracterização fenotípica das células isoladas do músculo normal, aquelas que aderem mais precocemente (PP1) e mais tardiamente (PP2) mostram um padrão fenotípico semelhante entre si e com características mais próximas às miogênicas. Já a população de células de adesão bem mais tardia (PP6) apresentou um padrão de marcação misto, mantendo as características miogênicas, mas apresentando tambem padrão de células-tronco mesenquimais, sugerindo o fenótipo de células mais imaturas. Nos músculos distróficos, identificamos diferenças na constituição do pool de células presentes inicialmente no músculo, onde na linhagem Lama2dy2j/J há indícios de uma população em estágio proliferativo, enquanto que na linhagem Largemy d há presença de células com maior imaturidade. Os resultados da analise de expressão gênica nas populações caracterizadas se mostraram concordantes com os fenótipos celulares avaliados por citometria. Identificamos a hipo-expressão de genes ligados à regeneração e remodelamento muscular em ambos modelos distróficos. Considerando os genes diferentemente expressos somente em cada um dos modelos, os resultados sugerem ativação de proliferação celular e inibição da diferenciação na linhagem Lama2dy2j/J e distúrbios na miogênese na linhagem Largemy d. Assim, pudemos identificar vias importantes alteradas em cada um dos modelos que explicam parte das diferenças encontradas nos trabalhos anteriores / Muscle satellite cells have been widely studied, especially to understand their mechanism of action in muscle regeneration and correspondent implications in the different dystrophic processes, aiming the identification of potential therapeutic targets. Two mice models for muscular dystrophies, Largemyd and Lama2dy2j/J, have a pattern of an intense and very similar degeneration, but with differences in the expression of genes involved in the regeneration cascade. Therefore, they are interesting models to study possible differences in the mechanism of activation and action of satellite cells in the dystrophic muscle. The main objectives of this project are: 1) to isolate and characterize by flow cytometry, populations of satellite cells from Largemyd and Lama2dy2j/J models, as compared to normal C57Black6, evaluating the presence of myogenic and pluripotent stem cells markers; and 2) to study and compare gene expression profiles of these populations of satellite cells using microarray technique. In the phenotypic characterization of cells harvested from normal muscle, both faster (PP1) and slower (PP2) populations to adhere in culture flasks show similar phenotypic characteristics, which were closer to myogenic phenotype. On the other hand, the population of cells with very delayed adhesion ability (PP6) presented a mixed pattern, maintaining the myogenic characteristics, but associated to positive mesenchymal stem cell´s markers, suggesting a phenotype of more immature cells. In dystrophic muscles, we could identify differences in the constitution of the first pool of cells present in the Lama2dy2j/J muscle where there is evidence of a population in proliferative stage, while in the Largemyd strain, we found more immature cells. Gene expression profile in the characterized populations showed consistent concordance with the cellular phenotypes assessed by flow citometry. In both dystrophic models, we identified down-regulated genes related to regeneration and remodeling of the muscle. Considering only the genes differently expressed in each dystrophic model, data suggest the activation of cell proliferation and inhibition of differentiation pathways in Lama2dy2j/J strain and altered myogenesis in the Largemyd model. Thus, we identified important altered pathways in each of the dystrophic models that could explain most of the differences in gene expression profile in the muscle, described in our previous work

As Distrofias Musculares Progressivas (DMP) constituem um grupo de doenças genéticas caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é a forma mais comum e grave de DMP. Obedece a herança recessiva ligada ao X e é caracterizada pela ausência de distrofina na membrana das fibras musculares. Atualmente não existe nenhum tratamento efetivo para este grupo de doenças. Deste modo, este trabalho tem como objetivo principal avaliar o potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais de tecido adiposo humano (human Adipose-derived Stem Cells - hASCs) visando à regeneração ou diminuição da degeneração muscular. Para tanto, verificamos o potencial miogênico destas células in vitro, utilizando células musculares de pacientes DMD e in vivo utilizando como modelo camundongos distróficos e cães da raça Golden Retriever portadores de distrofia muscular (GRMD - Golden Retriever Muscular Dystrophy). Demonstramos neste estudo que hASCs são capazes de restaurar a expressão de distrofina in vitro, quando co-cultivadas com células musculares de pacientes DMD. Frente a estes resultados, continuamos nossos estudos em modelos animais, in vivo, e demonstramos que as hASCs são capazes de chegar à musculatura de camundongos distróficos e de cães GRMD, quando injetadas por via venosa, e de restaurar a expressão da proteína muscular defeituosa. Foi possível observar uma melhora funcional nos camundongos injetados. Nos cães GRMD encontramos distrofina humana seis meses após a última injeção entretanto é difícil julgar se houve melhora clínica. Todos esses experimentos de xenotransplantes foram feitos sem imunosupressão e não observamos rejeição. Concluímos que o tecido adiposo é uma fonte de células-tronco com potencial para regeneração muscular in vivo. Contudo é de extrema importância repetir os experimentos em um número maior de cães GRMD e ainda investigar novas estratégias visando melhorar os resultados obtidos neste trabalho, antes de começar qualquer teste clínico. / Progressive muscular dystrophies (PMD) are a clinically and genetically heterogeneous group of disorders caused by the deficiency or abnormal muscle proteins, resulting in progressive degeneration and loss of skeletal muscle function. As effective treatments for these diseases are still unavailable, they have been widely investigated as possible candidates for stem cell therapy. Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), a lethal X-linked disorder, is the most common and severe form of muscular dystrophies, affecting 1 in 3000 male births. Mutations in the DMD gene lead to the absence of muscle dystrophin. The aim of this study is to evaluate the therapeutic potential of human Adipose-derived Stem Cells (hASCs) for muscle regeneration. First we verified the myogenic potential of these cells in vitro co-culturing them with muscle cells from DMD patients and verifying that hASCs are able to restore dystrophin expression in vitro. Subsequently we repeated this experiment in vivo using the dystrophic mice SJL and the dystrophic golden retriever dogs (GRMD - Golden Retriever Muscular Dystrophy) as animal models. We demonstrated that the hASCs are able to reach the muscles of the dystrophic mice and the GRMD dogs when injected systemically and restore expression of absent muscle protein, without any immunosupression. We observed a functional improvement in the injected mice. We found human dystrophin in injected dogs up to 6 months after the last injection. However it is difficult to evaluate if there was clinical improvement in the GRMD dogs due to their great phenotypic variability. We conclude that the adipose tissue is a source of stem cells with potential for muscle regeneration in vivo and that human cells are not rejected even in xenotransplants without immunosuppression. However it is important to repeat the experiments on a larger number of GRMD dogs and to investigate new strategies to improve our findings before starting any clinical trial.

As distrofias musculares formam um grupo amplo e heterogêneo de doenças genéticas, caracterizado basicamente pela degeneração e fraqueza muscular. Ao longo das últimas décadas muitos estudos vêm sendo realizados para a identificação dos genes causadores dessas doenças. Entretanto, apesar da identificação da mutação responsável pela grande maioria das formas descritas, os processos moleculares subjacentes ao defeito genético primário são muito complexos e ainda precisam ser melhor compreendidos. E a compreensão dos mecanismos de cada uma das formas é muito importante para o desenvolvimento adequado de terapias. A avaliação da expressão gênica global por microarranjos de DNA é uma ferramenta bastante poderosa, capaz de produzir uma grande quantidade de dados, delineando o panorama geral do estado do transcriptoma de um determinado tecido ou célula. Assim, os objetivos desse trabalho foram estudar os perfis de expressão do músculo de três linhagens de camundongos modelos de formas distintas de distrofia muscular (Dmdmdx, Largemyd-/- e Dmdmdx/Largemyd-/-) em diferentes fases da progressão da doença (21 dias, três meses e seis meses de idade), com o intuito de caracterizar o processo distrófico e como o perfil de expressão varia com a progressão da idade e a depender da mutação genética. Em cada um dos modelos e idades estudados identificamos um grande número de genes diferencialmente expressos (GDEs), refletindo a complexidade dessas doenças. A análise dos processos e vias biológicas nas quais esses genes estão envolvidos mostrou o forte envolvimento de componentes do sistema imunológico e inflamação, e também de genes relacionados com os processos de degeneração/regeneração e remodelamento da matriz extracelular. De modo geral, as funções biológicas alteradas são bem semelhantes entre as linhagens, sugerindo que apesar de as mutações serem em genes distintos, com funções diferentes, os processos moleculares que são afetados em decorrência dessas mutações são praticamente os mesmos. As maiores diferenças foram vistas na idade de 21 dias, especialmente na linhagem Dmdmdx que apresentou uma grande quantidade de GDEs, dos quais grande parte relacionada com a maior capacidade regenerativa dessa linhagem e, assim, são genes que podem explicar o porquê desses animais apresentarem um fenótipo benigno em relação aos pacientes humanos. A caracterização do modelo duplo-mutante Dmdmdx/Largemyd-/- mostrou que a junção das duas mutações não ocasiona alterações no transcriptoma distintas das obsevadas nas linhagens parentais, sendo que o perfil do duplo-mutante é mais próximo ao de seu parental Largemyd-/-, não apresentando a mesma capacidade regenerativa que o Dmdmdx / The muscular dystrophies form a large and heterogeneous group of genetic diseases, characterized mainly by progressive muscular degeneration and weakness. In the last decades, many studies have been carried on in order to identify the involved genes in these disorders. However, despite the identification of responsible mutations of the majority of the described forms, the underlying molecular processes to the primary mutation are very complex and are not fully understood. And to understand the mechanisms of each form is of major importance to the development of therapies. Global gene expression profiling by DNA microarrays is a powerful tool, able to yield a huge quantity of data, outlining the general landscape of the transcriptome of a given tissue or cell. In this sense, the objectives of this work were to study the expression profile of the muscles from three mice lineages, models for different forms of muscular dystrophy (Dmdmdx, Largemyd-/- and Dmdmdx/Largemyd-/-) in different phases of disease progression (21-day-old, three-month-old and six-month-old), in order to characterize the dystrophic process and how the expression profile changes according to aging and depending on the genetic mutation. In each model and age studied we identified a substantial number of differentially expressed genes (DEGs), reflecting the diseases\' complexity. The analysis of the biological processes and pathways in which these genes are implicated showed a strong involvement of immune system and inflammation components, and also genes related to degeneration/regeneration and extracellular matrix remodeling processes. Altogether, the altered biologic functions are very similar in lineages, suggesting that although mutations are in different genes, with diverse functions, the affected molecular processes due to these mutations are basically the same. The most notable differences were seen on 21-day-old, especially on Dmdmdx lineage that showed a great quantity of DEGs, many of which are related to the better regenerative capacity this lineage exhibits and, thus, they are genes that could explain why these animals manifest a mild phenotype in comparison to human patients. The characterization of the double mutant Dmdmdx/Largemyd-/- showed that the union of both mutations does not bring on alterations on the transcriptome different from those seen in the parental lineages, with the double mutant profile closer to its parental Largemyd-/-, not bearing the same regenerative capacity that Dmdmdx