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Epigenetic inheritance of aberrant DNA methylation signatures as a consequence of chronic paternal alcohol exposure and the effect on embryonic gene expression in miceIsmail, Ayesha January 2015 (has links)
A dissertation submitted to the Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand,
Johannesburg, in fulfillment of the requirements for the degree in Master of Science (Medicine) in
the Division of Human Genetics / Epigenetic mechanisms regulate gene expression, a particularly important activity during
foetal development. DNA methylation contained within promoter and regulatory intergenic
regions influence gene activity. In utero alcohol exposure as a result of maternal
consumption during pregnancy has been associated with disruption of foetal DNA
methylation and gene expression, leading to neurological dysfunction, growth retardation and
facial anomalies. While similar phenotypes in offspring have been associated with chronic
preconception paternal alcohol exposure, the mechanisms underlying these effects remain
largely unexplored.
This study aimed to: (1) validate significant changes in sperm DNA methylation in a list of ten
candidate genes in male mice chronically exposed for ten weeks to ethanol (n=10) compared
to a calorie-equivalent sucrose solution (n=10); (2) validate significant changes in gene
expression in candidate genes in the brain, liver and placenta of E16.5 embryos sired by
ethanol (n=24) compared to sucrose (n=24) treated male mice; (3) quantify DNA methylation
changes in candidate genes in the three embryonic tissues. (4) Lastly, previously generated
microarray data were reanalysed using bioinformatics tools to generate a top ranked
candidate differentially expressed gene list that was used to identify and analyse biological
functions or pathways significantly over represented among these genes using PANTHER
and DAVID.
This study was unable to provide validation for most of the significant differences observed in
the sperm DNA methylome in the original study, most likely because of the low sperm DNA
concentration. Significant methylation differences were however observed at individual CpG
sites in three candidate genes (Igf1r, Odc1, Depdc1b) in specific tissues of embryos sired by
ethanol-exposed males relative to embryos sired by sucrose-treated males. There was
concordance in the direction of altered gene expression between the cases and controls
using the microarray and real-time PCR approaches for two genes in the brain (Grm7 and
Zfp317), three genes in the liver (Igf1r, Vwf and Depdc1b) and one gene in the placenta
vii
(Vwf). However, none of the candidate genes selected for validation showed statistically
significant changes. This may be a result of the modest fold changes observed in the
microarray experiment that as shown in many cases, often do not replicate. The remainder of
the genes showed no changes in expression in the test embryos relative to the control. The
functional enrichment analysis revealed biological processes that were over represented in
the brain and liver indicating that they may be more vulnerable to the effects of alcohol,
compared to the placenta.
Overall, the study could not provide a statistically significant correlation between methylation
changes in the sperm that were inherited by the offspring which subsequently dysregulated
gene expression in the embryo. However, as trends toward significance and significant DNA
methylation changes were observed in the embryonic tissues, this study supports the idea
that preconception paternal alcohol exposure can induce epigenetic alterations in a locus
and organ specific manner within offspring. / MT2016
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Estudos sobre as relações filogenéticas e biogeográficas das espécies do gênero Pimelodella (Siluriformes, Heptapteridae) Eigenmann & Eigenmann, 1888 do Alto Paraná / Studies on the phylogenetic and biogeographical relationships of species of the genus Pimelodella (Siluriformes, Heptapteridae) Eigenmann & Eigenmann, 1888 do Alto ParanaPeixoto, Marilena da Silva 09 August 2011 (has links)
Pimelodella Eigenmann & Eigenmann, 1888 é um dos gêneros mais especiosos pertencentes à família Heptapteridae, com 71 espécies distribuídas desde o sul da América do Sul até o Panamá e América Central. A compreensão das relações filogenéticas desse grupo é ainda bastante confusa devido a dificuldades na identificação das espécies por suas semelhanças morfológicas, além da sua ampla diversidade e distribuição. Para melhor entendermos as relações existentes entre as espécies pertencentes a este gênero, nosso trabalho utilizou abordagens moleculares e morfológicas e foi organizado em quatro capítulos. No primeiro é apresentada uma breve revisão da bibliografia relacionada à Pimelodella, a área de estudo e as ferramentas que foram utilizadas para tentarmos compreender as relações filogenéticas e biogeográficas das espécies pertencentes ao gênero. Assim, para respondermos às questões propostas, no segundo capítulo avaliamos o potencial do método do código de barras do DNA para auxiliar na identificação das espécies, combinado com a análise de alguns caracteres morfológicos diagnósticos. Essas metodologias se mostraram muito úteis e eficazes, e nossos resultados indicam que é possível identificar grande parte das espécies com as metodologias escolhidas. O terceiro capítulo teve como objetivo estabelecer, as relações filogenéticas entre as espécies de Pimelodella incluídas nesse estudo, utilizando para tanto quatro genes mitocondriais (ATPase 6 e 8, citocromo b, COI e ND2). Através da análise de parcimônia foram obtidas seis árvores mais parcimoniosas. Os valores de suporte foram maiores nos nós mais internos. No quarto capítulo, apresentamos uma análise genético-populacional baseada em cinco loci de microssatélites na espécie troglóbia das cavernas da região do PETAR (Parque Estadual Turístico do Alto Ribeira). Os loci amplificados apresentaram altos níveis de polimorfismo e o número de alelos por loci variou de 9 no loco PC58 a 34 no locos PC87, o número médio de alelos por locus foi de 21,2. A estimativa global de FST, considerando-se todas as populações e todos os loci, foi significativamente diferente de zero (FST = 0,1353) sugerindo a ocorrência de diferenciação populacional na amostra. / Pimelodella Eigenmann & Eigenmann, 1888 is one of the most specious genus of the Siluriform family Heptapteridae, with 71 species distributed from southern South America to Panamá and Central America. The understanding of phylogenetic relationships within the genus is somewhat confusing due to the difficulties in morphological identification and its broad distribution. In order to assess the problems with species identification and phylogenetic relationships our work employed morphological and molecular tools is it is organized in four chapters. The first chapter contains an introduction to the problems and a revision of what its known in Pimelodella, as well as a brief description of the tools used. The second chapter deals with species identification and its subdivided into: morphology and the used of DNA barcoding. The results obtained with the combination of these two methodologies indicated, for example, that Pimelodella gracilis might comprise more than one species. The third chapter presents a phylogenetic analysis of the species included in this work based on nucleotide sequences of the mitochondrial genome. The parsimony analysis recovered six most parsimonious trees as expected the support values are larger towards the deeper nodes. The fourth chapter presents an population analysis based on five microsatellite loci to investigate whether or not the troglobitic species P. kronei displays population structuring in the caves of the PETAR (Parque Estadual Turístico do Alto Ribeira). The loci presented high polymorphism, the number of alleles raged from 9 in the locus PC58 to 34 in the locus PC87, the mean number of alleles per loci was 21,2. All loci showed private alleles PC17 and PC58 had 3 alleles and PC90 showed 22 private alleles distributed among all sampling locales. The global FST, estimative was significantly different from zero (FST = 0,1353) suggesting population.
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Gymnotus carapo e Gymnotus sylvius (Teleostei:Gymnotidae): uma abordagem citogenético-molecular / Gymnotus carapo and Gymnotus sylvius (Teleostei:Gymnotidae): a cytogenetic and molecular approachClaro, Felippe Lourenço 16 December 2008 (has links)
Os peixes apresentam uma grande diversidade quanto a sua morfologia, seus habitats e também sua biologia. São encontrados em lagos, córregos, estuários e oceanos, constituindo assim mais de 50% do número total das espécies de vertebrados conhecidas atualmente. Essa fauna tem sido objeto de um número expressivo de estudos citogenéticos e moleculares, tendo-se já conhecimento não só das relações cromossômicas, mas também da sistemática de vários grupos. Essas pesquisas têm investigado não somente o número e fórmula cromossômica, mas também a presença de cromossomos sexuais diferenciados, presença de cromossomos supranumerários, padrões de distribuição da heterocromatina, localização das regiões organizadoras de nucléolo, padrões de bandamento de restrição e replicação, permitindo a localização de diferentes classes de DNAs repetitivos, bem como a identificação de homeologias cromossômicas que auxiliam a compreensão da evolução cariotípica dos grupos. Os estudos moleculares, por sua vez, têm se tornado cada vez mais importantes nesse grupo e têm fornecido dados fundamentais não só no que diz respeito à filogenia dos grupos, como também em relação a regiões repetitivas do DNA e sua importância no genoma. A união dessa área com a Citogenética tem permitido uma maior e melhor compreensão sobre os processos evolutivos associados às alterações de seqüências específicas do genoma visíveis tanto a níveis cromossômicos, quanto moleculares. O gênero Gymnotus (Teleostei: Gymnotiformes) inclui representantes com características biológicas peculiares, o que os torna objeto de estudo de diversas áreas da Biologia. Estudos sobre o gênero incluem sua caracterização cariotípica, estudo das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) polimórficas, bem como estudos envolvendo marcadores moleculares, os quais conjuntamente com a Citogenética permitiram a análise de filogenética molecular, com inferência na evolução cromossômica, permitindo uma melhor compreensão das relações dentro do gênero. No presente trabalho foram levados a efeito estudos sobre as regiões heterocromáticas e os DNAs repetitivos desse grupo, para uma melhor compreensão da organização e localização dessas seqüências no genoma e a identificação de possíveis marcadores moleculares. Foram efetuados ainda, estudos envolvendo a evolução cariotípica das espécies G. carapo e G. sylvius, localização de genes ribossômicos e análise molecular do gene ribossômico 5S juntamente com seu espaçador não transcrito, propiciando uma melhor compreensão da evolução dessa família gênica em Gymnotus. / Fishes present a great diversity in relation to their morphology, habitat and biology. They are found in lakes, rivers, estuaries and oceans, comprising more than 50% of the total number of known vertebrates. Cytogenetic and molecular aspects of the fish fauna have been extensively studied, providing information about their chromosomal relationships and also about the systematic status of several groups. These researches have focused on the description of both chromosomal number and formula as well as the presence of differentiated sex chromosomes, occurrence of B-chromosomes, patterns of heterochromatin distribution, localization of nucleolar organizer regions, restriction or replication banding profiles allowing to locate distinct classes of repetitive DNAs and to identify chromosomal homeologies in order to understand the karyotypic evolution in distinct groups. On the other hand, molecular studies have become of utmost importance in this group, providing essential data about phylogeny of many groups and about repetitive DNA regions and their role in the genome. The union between this approach and cytogenetics has favored a better comprehension about the evolutionary processes associated with visible alterations in specific sequences within the genome at both chromosomal and molecular levels. The genus Gymnotus is composed of representatives with peculiar biological features, which turn them suitable for studies in a variety of biology approaches. Genetic studies in this genus comprise karyotype characterization, analysis of polymorphic NORs, besides studies of molecular markers that, coupled with cytogenetics, have fostered molecular phylogenetic analyzes with inferences on their chromosomal evolution, which have led to a better understanding about the interrelationships in the group. In the present work, we carried out studies about the heterochromatic regions and the repetitive DNAs in this group for a better comprehension about the organization and localization of these sequences in the genome and identification of potential molecular markers. Furthermore, studies related to the karyotype evolution in the species G. carapo and G. sylvius, location of ribosomal genes and molecular analysis of both 5S ribosomal gene and its non-transcribed spacer were performed to provide a better comprehension about the evolution of this gene family in Gymnotus.
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Efeito de lesões em DNA produzidas por luz Ultravioleta no processo de replicação do genoma de células de mamíferos / Effects of lesions in DNA produced by UV light in the genome replication of mammalian cellsSchumacher, Robert 15 December 1981 (has links)
Estudou-se o comportamento frente a radiação UV de células humanas XP12RO, deficientes em reparo-excisão de dímeros de pirimidina. Cinéticas de incorporação de precursor radiativo de DNA em tempos crescentes apos a exposição a UV mostraram uma rápida inibição da taxa de síntese, até se alcançar um platô bem abaixo do valor obtido para células não irradiadas. Tanto o tempo para que este platô fosse alcançado quanto o valor basal de síntese obtido dependiam da dose de UV fornecida. Este tempo era compatível com o necessário para que a maquinaria de replicação percorresse a distância média interdímeros esperada para a dose de UV aplicada. Verificou-se também que o DNA recém-sintetizado após UV apresentava um peso molecular e uma taxa de elongação bem menores que nos controles não irradiados, sugerindo todos estes resultados que o dímero se constitue num bloqueio temporário para a replicação de DNA. Utilizando uma metodologia baseada no tratamento do DNA nativo com S1 endonuclease de Aspergillus oryzae, específica para DNA simples-fita, foi possível detectar a existência de lacunas de DNA replicado após UV, lacunas estas que desaparecem gradativamente com o passar do tempo pós-irradiação. DNA não irradiado manteve-se refratário à enzima, nas mesmas condições. A digestão enzimática acarretava o aparecimento de duas populações distintas de DNA, uma de alto peso molecular e outra de peso molecular bem menor, ambas se equivalendo em quantidade. Este fenômeno pôde ser observado em uma ampla faixa de doses de UV, tanto em células XP12RO como em outras linhagens celulares, e mesmo sob condições diversas de proliferação celular. Além disso, o desaparecimento das lacunas, no caso de células de roedor previamente irradiadas com UV, era retardado pela presença de cafeína, um conhecido inibidor de reparo pós-replicação (RPR) nestas linhagens. Foi efetuada uma análise da progressão da forquilha de replicação e da distribuição de lacunas do DNA replicado após UV, através de ensaios enzimáticos combinados com bandeamento de DNA em gradientes isopícnicos de CsCl. Os resultados assim obtidos levaram-nos a considerar um modelo de replicação a partir de molde lesado onde síntese descontínua (3\'-5\') propicia a formação de lacunas, enquanto que síntese contínua (5\'-3\') é retardada temporariamente pela presença da lesão, sem contudo acarretar a formação de descontinuidades físicas no DNA replicado. A mesma metodologia de digestão de DNA com S1 endonuclease permitiu verificar a ocorrência de uma nítida relação causal entre a frequência de lacunas e a frequência correspondente de dímeros, em crescentes doses de UV, sugerindo fortemente que dímeros estão opostos às lacunas no DNA recém sintetizado. Além disso, um tratamento estatístico da cinética de clivagens enzimáticas observada para as lacunas tornou possível calcular a extensão física destas, detectando-se a presença de duas populações distintas, onde 65% correspondem a 1250 nucleotídeos e 35% correspondem a 150 nucleotídeos. Finalmente, foi verificado que DNA recém-sintetizado longos tempos após UV apresenta um drástico declínio da frequência de lacunas, não obstante a frequência de dímeros permanecer essencialmente inalterada. Estes resultados favorecem a hipótese de ocorrer um processo induzido de RPR, o qual permitiria à maquinaria de replicação transpor eficientemente os dímeros presentes, apesar destes não terem propriedades codificadoras. / The synthesis of DNA in human XP12RO cells, deficient in excision repair of pyrimidine dimers was studied. The rate of incorporation of radioactive precursors into DNA was measured at different times after irradiation. The DNA synthesis decreases shortly after irradiation, reaching a lateau whose value and time to be attained was dependent on the UV dose. This time period was the one expected for the replication machinery to coyer the interdimer distance at the UV dose applied. It was also verified that the newly synthesized DNA after UV irradiation presented much smaller molecular weight and elongation rate, when compared with the non-irradiated controls. These results suggest that the dimer imposes a delay to DNA replication machinery. Using a methodology based on the treatment of native DNA with S1-endonuclease from Aspergillus orizae, specific for single-stranded DNA, it was possible to detect gaps in the DNA replicated after UV treatment. Thesee gaps disapeared gradually with time after irradiation. The nonirradiated DNA remained refractory to the enzyme, under the same experimental conditions. The enzymatic digestion originated approximately equal alounts of two distinct double-stranded DNA populations, one of high molecular weight and other of much smaller molecular weight. This fenomenon could be seen on a wide range of UV doses, in XP12RO cells as well as in other cells lines, and did not depend on the particular conditions of cell proliferation. Furthermore, the gap disappearence, in the case of rodent cells previously irradiated with UV, was delayed by the presence of caffeine, a known post-replication repair (PRR) inhibitor in these cell lines. An analysis of the progression of the replication fork and of the distribution of gaps in the DNA replicated after UV irradiation was carried out through enzymatic assays combined with DNA banding in isopicnic CsCl gradients. The results thus obtained led us to consider a model for replication on damaged template, whereby gaps are formed only in the strand replicating opposite the fork movement (3\'-5\'). The strand replicating in the same direction as the fork movement (5\'-3\') is temporarily delayed by the presence of the lesion, without originating gaps in the replicative DNA. The same methodology of DNA digestion with S1-endonuclease permitted us to verify the occurrence of a nitid relationship between the gap frequency and the corresponding dimer frequency, for different doses of UV, strongly suggesting that the dimers are opposite the gaps in the newly-synthesized DNA. Furthermore, an statistical analysis of the dependende of DNA cleavage by S1-endonuclease on the enzyme concentration rendered it possible to calculate the size of the gaps. Two distinct populations were detected, 65% corresponding to 1250 nucleotides and 35% corresponding to 150 nucleotides. Finally, it was verified that the nascent DNA synthesized long periods after UV are essentially free of gaps although the dimer frequency remained almost unaltered. These results favour the hypothesis of the occurrence of an induced process of PRR, which would permit the replication machinery to efficiently bypass the dimers, in spite of the fact that these lesions do not exhibit codifying properties.
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Efeito de inibidores da metilação de DNA sobre a neurotoxicidade induzida por iodeto de 1-metil-4-fenilpiridínio (MPP+) em modelo de células neuroniais / The effect of DNA methylation inhibitors on 1-methyl-4-phenylpyridinium iodide (MPP +) induced neurotoxicity in cultured neuronal cells modelCantelmo, Rebeca Araujo 09 October 2017 (has links)
A Doença de Parkinson é a segunda doença neurodegenerativa mais comum na atualidade. Cerca de 10% dos casos da doença estão relacionados com fatores genéticos e os outros 90% são devido a fatores ambientais e epigenéticos. Evidências indicam alterações na metilação de genes relacionados ao desenvolvimento da doença de Parkinson. No entanto, não se sabe o efeito de inibidores da metilação de DNA sobre a neurotoxicidade induzida por MPP+, uma neurotoxina que mimetiza processos neurodegenerativos associados ao Parkinson in vitro. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito dos inibidores da metilação de DNA (RG108, n-ftaloil-l-triptofano e 5azadC, 5-aza-2´-deoxycytidina) e do doador universal de grupamentos metil (SAM, S-adenosilmetionina) sobre neurotoxicidade induzida por MPP+ em cultura de células imortalizadas (PC12), por meio da análise da viabilidade celular avaliada no teste do MTT (3 - [4,5 dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazólio); e da análise de neuritogênese, na presença e na ausência de MPP+. Os resultados demonstraram que: 1. o tratamento com DNMTi (inibidor da DNA metiltransferase) ou com SAM induziram efeito per se sobre a viabilidade celular, apenas quando incubados em altas concentrações e em perídos prolongados (24h); 2. não modificaram a morte celular induzida pelo MPP+, em baixas concentrações, mas agravaram a neurotoxicidade quando incubados em altas concentrações ou por períodos prolongados (24h); 3. essas drogas induziram neuritogênese per se e potencializaram a neuritogênese induzida pelo NGF (fator de crescimento neural); 4. protegeram parcialmente contra a diminuição da neuritogênse induzida pelo MPP+. O conjunto de dados sugere que tanto os DNMTi quanto o SAM podem ser citotóxicos, dependen de suas concentrações e do tempo de exposição à droga. No entanto, essas drogas são capazes de aumentar a neuritogênese (diferenciação celular) e proteger contra a neurotoxicidade celular induzida pelo NGF, em células diferenciadas. / Parkinson\'s disease is the second most common neurodegenerative disease nowadays. About 10% of the disease cases are related to genetic factors and the other 90% are due to environmental and epigenetic factors. Evidence indicates changes in DNA methylation in genes related to the development of Parkinson\'s disease. However, the effect of DNA methylation inhibitors on MPP+-induced neurotoxicity, a drug that mimics neurodegenerative processes associated with Parkinson\'s in vitro, is not known. The aim of this study was to evaluate the effect of DNA methylation inhibitors (RG108, N-phthalyl-L-tryptophan and 5azadC, 5-aza-2?-deoxycytidine) and of the universal donor of methyl group (SAM, S-adenosyl methionine) on: 1. MPP+ -induced neurotoxicity in culture of immortalized cells (PC12), by analysis of cell viability in the MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium) test; 2. neuritogenesis, in the presence and absence of MPP +. Results indicated that: 1. treatment with DNMTi or SAM induced effects per se on cell viability only at higher concentrations and after prolonged periods of incubation (24h); 2. DNMTi (DNA methyltransferase inhibitors) and SAM increased cell differentiation and neuritogenesis per se, especially when incubated for 30 minutes, as well as they potentiated NGF-induced neurogenesis; 3. the drugs attenuated MPP+-induced effects on neuritogenesis. Altogether, these data suggests short treatment with both DNMTi and SAM do not cause cellular cytotoxicity (cell death), but are able to increase neuritogenesis (cell differentiation) and protect against MPP+-induced neurotoxicity in differentiated cells.
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Utilização da técnica de identificação genética: panorama da realidade dos serviços oficiais de identificação brasileiros e a importância da atuação do cirurgião-dentista na equipe forense / Using the technique of genetic identification: picture of reality official identification of the Brazilian and the importance of role of dentistry-on forensic teamBaraldi, Andréia Moribe 13 February 2009 (has links)
A análise do DNA pode ser considerada um dos principais progressos técnicos para investigação criminal desde a descoberta das impressões digitais. Seu surgimento trouxe novos paradigmas para os critérios utilizados na formulação da culpabilidade no campo do Direito Penal, bem como no estabelecimento da certeza jurídica nas relações de filiação, campo do Direito Civil. Foi incorporada à rotina forense pelas polícias de países do primeiro mundo e começa a ser introduzida no contexto pericial em alguns Estados do Brasil. No entanto, o uso destas técnicas de identificação genética origina uma série de exigências de qualidade e excelência aos laboratórios que as realizam. Portanto, definição de normas, estabelecimento de padrões e criação de sistemas de credenciamento e certificação tornaram-se absolutamente necessários. Levando-se em consideração a crescente influência exercida pelo DNA no contexto forense, este trabalho teve como objetivo conhecer a realidade brasileira diante desta tecnologia e a importância da atuação do cirurgião-dentista na equipe forense. Para isso, tentou-se contato com o serviço oficial de identificação central da capital de cada um dos vinte e seis estados brasileiros além do Distrito Federal. Participaram da pesquisa 17 (dezessete) Estados (Minas Gerais, Goiás, Rio Grande do Sul, Pará, Pernambuco, Alagoas, Paraná, São Paulo, Paraíba, Bahia, Rio de Janeiro, Roraima, Amapá, Maranhão, Rio Grande do Norte, Ceará e Tocantins). A coleta de dados foi realizada através de um questionário. A partir deste foi possível estabelecer que a maioria dos serviços (88%) faz uso da técnica de identificação genética. Dentre estes, apenas o Rio Grande do Norte não adota protocolos de coleta e armazenamento das amostras biológicas. O sangue é a amostra biológica de eleição, porém em casos de ossadas ou quando o cadáver encontra-se carbonizado e/ou avançado estado de decomposição, os dentes são utilizados como fonte de DNA. Geralmente as amostras biológicas coletadas são provenientes de crimes sexuais. Apesar de marcas de mordida serem evidências freqüentemente encontradas em crimes desta natureza, a coleta de saliva (suabe) é realizada apenas em 43% dos Estados. Dentre as diversas categorias de profissionais que compõem a equipe de DNA forense, os farmacêuticos se destacam (43%). Possuem certificado de creditação apenas 50% dos laboratórios (São Paulo, Rio de Janeiro, Paraná, Rio Grande do Sul, Bahia, Roraima e Amapá). O presente trabalho permitiu compreender a maneira pela qual esses serviços estão se estruturando e desenvolvendo essa tecnologia. Através dos resultados obtidos neste estudo foi possível verificar a influência crescente exercida pela técnica de DNA nos processos de identificação, a importância da atuação de uma equipe multiprofissional - uma vez que a contribuição de cada área e a metodologia empregada no processo serão influenciadas pela condição do material biológico apresentado para o exame - e ressaltar a importância dos conhecimentos específicos do odontolegista, principalmente pelo fato dos elementos dentários e da saliva constituírem potenciais fontes de DNA. / The analysis of DNA can be considered major technical advances for criminal investigation since the discovery of fingerprints. Its emergence has brought new paradigms for the criteria used in the formulation of culpability in the field of criminal law, as well as the establishment of legal certainty in relations of affiliation, field of civil law. It was incorporated in routine forensic police from the countries of first world and beginning to be introduced in the context expert in some Brazilian states. However, the use of these techniques of genetic identification, gives quality requirements and excellence laboratories that perform them. Therefore, setting standards, setting principle and creating systems of accreditation and certification have become absolutely necessary. Taking into account the growing influence of the DNA in the forensic context, this study aimed to know the Brazilian reality on this technology and the importance of the role of surgeon-dentist in the forensic team. For this reason, attempts were made to contact the department\'s official identification center of the capital of each of the twenty-six Brazilian states than the Federal District. Participated in the survey 17 (seventeen) States (Minas Gerais, Goiás, Rio Grande do Sul, Para, Pernambuco, Alagoas, Paraná, São Paulo, Paraíba, Bahia, Rio de Janeiro, Roraima, Amapá, Maranhão, Rio Grande do Norte, Ceara and Tocantins). Data collection was conducted through a questionnaire. From this could be established that the majority of services (88%) made use of the technique of genetic identification. Among these, only the Rio Grande do Norte do not adopt protocols for collection and storage of biological samples. The blood is the biological sample of choice, but in cases of carcass or when the corpse is carbonized and / or advanced state of decomposition, the teeth are used as a source of DNA. Usually the samples are collected from sexual crimes. Despite the bite marks are frequently found evidence in such crimes, the collection of saliva (swab) is performed only in 43% of the states. Among the various categories of professionals who make up the team of forensic DNA, pharmacists are stressed (43%). They certificate of accreditation of laboratories only 50% (São Paulo, Rio de Janeiro, Paraná, Rio Grande do Sul, Bahia, Roraima and Amapá). This work could understand the way in which these services are structuring and developing this technology. Through the results of this study was to check the growing influence exercised by the technique of DNA in cases of identification, the importance of the many occupational, since the contribution of each area and the methodology employed in the process will be influenced by the condition of biological material submitted for review and emphasize the importance of specific knowledge of forensic dentist, mainly because of dental elements, in cases of advanced decomposition and charring, and the saliva, bite marks on this, are potential sources of DNA.
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Novel methods for specific detection and quantification of covalently closed circular DNA in sera and biopsies of hepatitis B patients. / CUHK electronic theses & dissertations collectionJanuary 2011 (has links)
In conclusion, two new methods of cccDNA quantitation were developed and validated. The two assays are complementary to each other and may be used in patients with extreme HBV DNA levels. These cccDNA assays should be further validated in larger studies and may become important tests for diagnostic, prognostic and treatment monitoring purposes. / Over 350 million people worldwide suffer from chronic hepatitis B virus (HBV) infection, which leads to many cases of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. HBV covalently closed circular DNA (cccDNA) is a critical intracellular replicative intermediate and cannot be eliminated during antiviral therapy. Current methods for cccDNA detection are limited by false positive detection due to the interference by HBV relaxed circular DNA (rcDNA). The tests also have limited sensitivity to detect cccDNA at low concentrations. Hence, we aimed to develop a highly sensitive and highly specific assay for cccDNA detection with wide linear range. / The modified Bowden's assay had the highest intrahepatic cccDNA detection rate (60 positive results out of 61 cases). The detection rate of the modified Bowden's assay is significantly higher than that of the Bowden's assay. On the other hand, the cccDNA detection rate in serum samples was low at 20--27% by all 3 assays. In 5 samples in which cccDNA was undetectable by the Bowden's assay but detectable by the other two assays, a point mutation in the HBV genome was found in the forward primer binding site of the Bowden's assay. This partly explained the false negative results. / The quantification result of cccDNA by the bisulfite conversion assay was significantly lower than that by the Bowden's assay assay (P=0.001) and the modified Bowden's assay (P=0.003). When the total HBV DNA was higher than 107 copies/ml, the serum cccDNA level detected by the bisulfite conversion assay was significantly lower than that detected by the Bowden's assay (P=0.008) and the modified Bowden's assay (P=0.046). When the total HBV DNA is less than 107 copies/ml, there were no significant differences. This suggests that the bisulfite conversion assay was less affected by rcDNA even in samples containing a high viral load. / With this background, two new cccDNA assays were developed and optimized. Bowden's assay was used as a standard to evaluate the performance of new assays. The first new assay (modified Bowden's assay) involved the use of new primers and probes that targeted more conserved regions in the HBV genome. The second assay adopted the bisulfite conversion method, which introduced gene sequence changes into the HBV genome and thereby enhance the specificity of the assay. Capillary sequencing was performed to find mutations in primers and probe range of different assays. / Yu, Ling. / Advisers: Vincent Wai-Sun Wang; Joseph Jao-Yiu Sung. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 73-06, Section: B, page: . / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 105-111). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. [Ann Arbor, MI] : ProQuest Information and Learning, [201-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.
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Mitochondrial function in the evolutionary origin of the female germ linede Paula, Wilson Brasil Marcelino January 2013 (has links)
Oxidative phosphorylation couples ATP synthesis to respiratory electron transport. This coupling occurs in mitochondria, which carry DNA. Respiratory electron transport in the presence of molecular oxygen generates mutagenic reactive oxygen species (ROS) at a frequency that is itself increased by mutation. Damage to mitochondrial DNA (mtDNA) therefore accumulates within the lifespan of individual organisms. Syngamy requires motility of one gamete, and this motility requires ATP. It has been proposed that that oxidative phosphorylation is absent in the special case of quiescent, template mitochondria, and that these remain sequestered in oocytes and female germ lines. Oocyte mtDNA is thus protected from damage. Here I present evidence that female gametes, which are immotile, repress mitochondrial DNA transcription, mitochondrial membrane potential (!!m), and ROS production. In contrast, somatic cells and male gametes are seen actively to transcribe mitochondrial genes for respiratory electron carriers, and to produce ROS. I find that this functional division of labour between sperm and egg is widely distributed within the animal kingdom, and characterised by contrasting mitochondrial size and morphology. If quiescent oocyte mitochondria alone retain the capacity for an indefinite number of accurate replications of mtDNA, then "female" can be defined as that sex which transmits genetic template mitochondria. Template mitochondria then give rise to mitochondria that perform oxidative phosphorylation in somatic cells and in male gametes of each new generation. Template mitochondria also persist within the female germ line, to populate the oocytes of daughters. Thus mitochondria are maternally inherited.
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Diversidade molecular dos Ancistrini (Loricariidae: Siluriformes) reofílicos da ecorregião Xingu-TapajósRibeiro, Emanuell Duarte 15 March 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013-03-15 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / With more than 5,700 species described, Neotropical ichthyofauna is considered the most
diverse vertebrate fauna of the world. Neotropical fishes represent 20% of all fish species
in the world. Therefore any attempt to understand evolution of vertebrates must rely on
the understanding of the diversification of fishes in the Amazon basin and adjacent
regions. Among the drainages that comprise the Amazon basin, the Xingu and Tapajós
are particularly notable for the large number of rapids and waterfalls, which occur in the
transition area between the Brazilian Shield and the Amazonian plain. The environment
of the rapids is characterized by a set of extreme environmental features, requiring
morphophysiological and behavioral specializations of the associated ichthyofauna. With
approximately 250 valid species, the tribe Ancistrini has strong association with rapidly
moving waters, and are an important component of the rheophilic fish fauna of the Xingu-
Tapajós aquatic ecoregion. The Xingu and Tapajós Rivers are considered historically
under-sampled, and the high number of species that have been described in recent years
is indicative of the need to expand the taxonomic studies in this ecoregion. The recent
infrastructure investments by the federal government into the construction oof
hydroelectric developments raises to the state of urgency the need to increase the number
of studies aimed to describe and elucidate the processes that generated these communities.
For these reasons, the present study aimed to characterize the molecular diversity and
phylogenetic structure of ancistrine communities of the Xingu-Tapajós aquatic ecoregion
with the goal of clarifying the historical and ecological processes responsible for the
current pattern of species co-occurrence. Analyses of DNA barcodes revealed the
existence of 46 species of Ancistrini in the ecoregion, that are distributed in 16 genera,
one of them probably being a new genus. The high concordance between morphologically
and molecularly identified species indicates the reliability of the methodology of DNA
barcoding for the identification/delimitation of species, making it a useful tool for the
necessary acceleration of the description of new species of Neotropical ichthyofauna. The
importance of biotic interactions suggested by analysis of phylogenetic community
structure meets the theories proposed for the formation of communities of fish in lotic
environments. However some evidence suggests that this difference may be the result of
bias related to the taxonomic and geographical scales of the current study. / Com mais de 5.700 espécies descritas a ictiofauna neotropical é considerada a mais
diversa fauna de vertebrados. Os peixes neotropicais representam 20% de todas as
espécies de peixes do mundo. Deste modo qualquer tentativa de se entender a completa
evolução dos vertebrados deve incluir a diversificação dos peixes na bacia amazônica e
regiões adjacentes. Dentre as drenagens que compõem a bacia amazônica, os rios Xingu
e Tapajós se destacam pelo grande número de corredeiras e cachoeiras, que ocorrem na
área de transição entre o escudo brasileiro e a planície amazônica. Os ambientes de
corredeira apresentam um conjunto de características extremas à ictiofauna, requerendo
dessa especializações morfofisiológicas e comportamentais. Com aproximadamente 250
espécies válidas, a tribo Ancistrini apresenta forte relação aos ambientes de águas
correntosas e são um importante componente da ictiofauna reofílica da ecorregião
aquática Xingu-Tapajós. O Xingu e Tapajós são considerados rios historicamente pouco
amostrados, e o elevado número de espécies que vem sendo descritas nos últimos anos é
um indicativo da necessidade de ampliação de estudos taxonômicos nessa ecorregião. Os
recentes investimentos do governo federal na construção de empreendimentos
hidroelétricos eleva a um estado de urgência a necessidade do aumento de estudos que
visem descrever e elucidar os processos que geraram essas comunidades. Por esses
motivos, o presente estudo teve como objetivo caracterizar a diversidade molecular e
estrutura filogenética das comunidades de Ancistrini da ecorregião aquática Xingu-
Tapajós a fim de esclarecer os processos ecológicos e históricos responsáveis pelo atual
padrão de co-ocorrência de espécies. As análises de DNA barcodes revelaram a existência
de 46 espécies de Ancistrini na ecorregião, essas estão distribuídas por 16 gêneros, sendo
um deles um provável gênero novo. A elevada concordância do banco de dados molecular
e as espécies morfologicamente identificadas, indica a confiabilidade da metodologia de
DNA barcoding na identificação/delimitação de espécies, sendo assim uma ferramenta
útil ao necessário aceleramento da descrição de novas espécies da ictiofauna neotropical.
A importância das interações bióticas sugerida pelas análises de estruturação filogenética
de comunidades vai de encontro às teorias propostas para formação de comunidades de
peixes em ambientes lóticos. Entretanto algumas evidências apontam que essa diferença
pode ser resultado de viés relacionados às escalas taxonômicas e geográficas utilizadas
nesse estudo.
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Código de barras de DNA como ferramenta para o estudo da biodiversidade de peixes da família Cichlidae na bacia AmazônicaCarvalho, Ana Paula Costa de 30 June 2014 (has links)
Submitted by Gizele Lima (gizele.lima@inpa.gov.br) on 2017-06-21T19:24:42Z
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Previous issue date: 2014-06-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Neotropical cichlids are a diverse group, which comprises about 60 genera and at least
1300 species are recognized. They are distributed in Central and South America, Texas, West
Indies, Africa, Madagascar, Syria, Israel, Iran, Sri Lanka, southern coast of India. The
diversity found in the Cichlid family covers the most different morphological and ecological
aspects that facilitate the adaptation of this fish family. In addition, evidence based on
molecular data showed that most of the diversification of the Neotropical fish fauna occurred
recently. These features make it difficult to understand the taxonomy and identification of this
fauna, becoming a major challenge for molecular tools. In this context, this study aimed to
test the effectiveness of DNA barcode methodology (COI gene) to identify and delineate the
diverse ictiofauna of freshwater cichlids in the Neotropics. For this purpose, 59 species of
Amazon basin fish were analyzed, being sampled by up to five specimens, morphologically
identified beforehand, and 147 DNA barcode sequences obtained. Morphological data were
combined with the molecular where only nine species showed agreement in both methods of
identification. Of the 45 species analyzed, 40 (88.8%) were correctly identified by the barcode
sequencing. The main values of intraspecific and interspecific genetic divergence by K2P in
molecular clusters were 0% and 55%. Seven cryptic species (15.5%) as well as seven
complexes of species (15.5%) were verified and approximately five species (11.2%) showed
absence of mutual monophyly. This study is the first to analyze a large number of freshwater
fish species in South America, including a large number of closely related species. The results
confirmed the effectiveness of barcode to signal cryptic species and species complexes, which
have recently undergone a process of irradiation, in addition to discriminate most species
analyzed. The results also revealed genetic differences suggesting reproductive isolation and
cryptic speciation in seven species. Finally, the results will contribute significantly for the
Life Barcode International Project, and for the FISH-BOL campaign providing sequences of
barcodes on the identification of these species by specialists and non-specialists, as well as
allowing them to be available for use in other applications. / Os ciclídeos neotropicais constituem um grupo variado, no qual compreendem cerca de 60
gêneros e pelo menos 1300 espécies são reconhecidas. São distribuídas na América Central e
do Sul, Texas, Índias Ocidentais, África, Madagascar, Síria, Israel, Irã, Sri Lanka, litoral do
sul da Índia. A diversidade encontrada na família Cichlidae abrange os mais diferentes
aspectos morfológicos e ecológicos, que facilitam na adaptação dos peixes desta família.
Além disso, evidências com base nos dados moleculares mostraram que a maior parte da
diversificação da ictiofauna Neotropical ocorreu recentemente. Estas características tornam
difícil a compreensão da taxonomia e identificação dessa fauna, tornando um grande desafio
para as ferramentas moleculares. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo testar a
eficácia da metodologia do código de barras de DNA (gene COI) para identificar e delimitar a
ictiofauna diversificada de ciclídeos em água doce da região Neotropical. Para esta finalidade,
foram analisadas 59 espécies de peixes na bacia Amazônica, sendo amostrado por até cinco
espécimes, identificadas a priori morfologicamente, e obtidas 147 sequências de código de
barras de DNA. Foram combinados os dados morfológicos com os moleculares, onde apenas
nove espécies apresentaram concordância em ambos os métodos de identificação. Das 45
espécies analisadas, 40 (88,8%) foram corretamente identificadas pelas sequências de códigos
de barras. Os principais valores de divergência genética intraespecífica e interespecífica pelo
K2P nos agrupamentos moleculares foram 0% e 55%. E verificou-se sete espécies crípticas
(15,5%), sete complexos de espécies (15,5%) e aproximadamente cinco espécies (1 1,2%)
mostraram ausência de monofilia recíproca. Este estudo é o primeiro analisar um grande
número de espécies de peixes de água doce da região Neotropical, incluindo um grande
número de espécies estreitamente relacionadas. Os resultados confirmaram a eficácia do
código de barras para sinalizar espécies crípticas e complexos de espécies, que passaram
recentemente por um processo de irradiação, além de discriminar a maioria das espécies
analisadas. Os resultados também revelaram divergências genéticas sugestivas de isolamento
reprodutivo e especiação críptica em sete espécies. Enfim, os resultados obtidos contribuirão
significamente para o projeto Internacional do Código de Barras da Vida, e para a campanha
FISH-BOL fornecendo as sequências de código de barras para uso na identificação dessas
espécies por especialistas e não-especialistas, e permitindo-lhes estar disponível para uso em
outras aplicações.
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