A importância da modulação da inflamação no tratamento de doenças inflamatórias bem como a dificuldade na determinação dos parâmetros de irradiação laser levou-nos a estudar os efeitos de diferentes protocolos de fototerapia com laser em baixa intensidade (potência, energia, local e momento de irradiação) no tratamento e prevenção do processo inflamatório agudo utilizando o modelo experimental de edema de pata induzido por carragenina (CGN) em três linhagens de camundongos (Balb-c, SWISS e C57BL/6). A primeira etapa do trabalho avaliou diferentes combinações de energia (1J e 3J) com diferentes potências (30, 60 e 100mW) em camundongos Balb-c irradiados na pata 1 e 2h após a injeção da CGN. A segunda etapa estudou diferentes combinações de local (pata, linfonodo inguinal e ambos) e momentos de irradiação (2 e 1h antes, 1h e imediatamente antes da CGN, 1 e 2h após e 3,5 e 4,5h após a CGN) utilizando parâmetros de irradiação fixos (1J, 100mW , 35J/cm2, área do spot 0,028cm2). A terceira etapa comparou diferentes linhagens de camundongos (Balb-c e C57Bl/6) nos melhores parâmetros de local e momento encontrados na etapa 2. Em todas as etapas foi avaliada a alteração de volume da pata através da pletismografia e o infiltrado inflamatório por histomorfometria ou análise da mieloperoxidase (MPO). Os resultados mostraram que a fototerapia com laser preveniu e tratou o edema assim como modulou o processo inflamatório com irradiações na pata e no linfonodo inguinal, de acordo com os parâmetros e a linhagem utilizada. / The importance of modulation of inflammation on the treatment of inflammatory diseases and the difficulty in determining the laser irradiation parameters has led us to study the effects of different protocols of phototherapy with low intensity laser (power, energy, time and place of irradiation) in the treatment and prevention of edema in acute inflammatory process using the experimental model of paw edema induced by carrageenan (CGN) in three strains of mice (Balb-c, Swiss and C57BL/6). The first stage of the study evaluated different combinations of energy (1J and 3J) with different powers (30, 60 and 100mW) in Balb-C mice paw irradiated 1 and 2h after injection of CGN. The second stage studied different combinations of location (foot, inguinal lymph nodes and both) and exposure time (2 and 1h before, 1h and immediately before the CGN, 1 and 2h and 3.5 and 4.5h after CGN) using fixed irradiation parameters (1J, 100mW, 35J/cm2, spot area of 0.028 cm2). The third stage compared different strains of mice Balb-c and C57BL/6) in the best local and time parameters found in step 2. At all stages, we evaluated the change in paw volume by plethysmography and inflammatory infiltrate by histomorphometry or analysis of myeloperoxidase (MPO). The results showed that laser phototherapy treated and prevented edema and modulated the inflammatory process with paw and inguinal lymph nodes irradiations accordingly with the parameters and mice strain used.

As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A2 (PLA2), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA2. A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA2 apresentou alta identidade com PLA2s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA2. Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis (Km) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de Kcat = 0,41 min-1, ou número de turnover, e a eficiência catalítica Kcat/Km= 1,02 mM-1min-1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e ?-glutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos. / Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A2 (PLA2), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre- and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA2. The amino acid sequence of Lmr-PLA2 showed high identity with PLA2s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA2. Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were Vmax = 1.147 nmol/min/mL and Km = 0.404 mM; Kcat = 0.41 min-1, or turnover number, e a catalytic efficiency, Kcat/Km = 1.02 mM-1min-1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and ?-glutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA2 make this molecule promising for drug development.

INTRODUÇÃO: O edema peritumoral (EP) está presente em aproximadamente 60% dos meningiomas. Os fatores responsáveis pela formação do edema e sua importância clínica permanecem como foco de discussão. OBJETIVOS: Analisar a correlação entre a presença de edema com características clínicas, cirúrgicas, radiológicas e recorrência tumoral. MÉTODOS: Foram selecionados 61 pacientes portadores de meningiomas benignos submetidos a tratamento cirúrgico pelo Grupo de Tumores Encefálicos e Metástases do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Foram incluídos no estudo os portadores de meningiomas benignos submetidos a ressecção tumoral completa (Simpson 1 e 2). Foram excluídos pacientes portadores de meningiomas malignos ou atípicos e aqueles localizados em tubérculo selar, seio cavernoso, forame magno, intraventriculares e região petroclival. RESULTADOS: Encontramos correlação entre as maiores medidas de edema peritumoral e recorrência tumoral (p = 0,042) e tumores com margens irregulares (p < 0,011) na análise bivariada. Além disso, os pacientes que apresentaram maiores volumes tumorais apresentaram maiores medidas de edema (p = 0,035) e nos pacientes com menores medidas de edema a localização tentorial foi mais freqüente (p = 0,032). Verificamos que ao estudo de regressão logística, o EP apresenta correlação com tumores maiores que 40 cm3 (Odds ratio=15,977), crises convulsivas (Odds ratio=3,469) e para cada cm3 acrescida ao tamanho tumoral o risco de edema cresce 1,082 vez (Odds ratio). CONCLUSÕES: Considerando os resultados obtidos, o EP esteve associado a maior recorrência tumoral, tumores multilobulados, grandes e a presença de crises convulsivas. A localização tentorial mostrou-se como um fator protetor ao EP. O EP pode estar associado a um potencial invasivo aumentado em meningiomas. Desta forma, o seu estudo aprofundado poderá trazer dados adicionais para o esclarecimento dos mecanismos de formação dos meningiomas e de seu comportamento biológico levando ao melhor manejo clínico dos pacientes. / INTRODUCTION: Approximately 60% of meningiomas are associated with peritumoral edema.Various causative factors have been discussed in the literature. PURPOSES: Investigate the correlation of peritumoral edema with clinical, radiological and surgical aspects, and recurrence rate of meningiomas. METHODS: Sixty one benign meningiomas submitted to surgical treatment by the Group of Brain Tumors and Metastasis of the Division of Neurosurgery of the Hospital das Clínicas of São Paulo Medical School of São Paulo University. All patients underwent complete surgical ressection (Simpson 1 and 2) and were excluded the atypical and malignant hystopathological grades. The tumors located in the cavernous sinus, tuberculum sellae region, foramen magnum region, ventricular space and petroclival region were excluded. RESULTS: Edema extention had a positive correlation with the higher recurrence rates (p = 0,042) and with the presence of irregular margins (p < 0,011) on bivariate analysis. Meningiomas with greater edema sizes also showed correlation with large meningiomas (p = 0,035) and the ones with smaller edema sizes correlated with the tentorial location (p=0,032). Multivariate analysis showed an association between peritumoral brain edema and the presence of seizures (Odds ratio=3,469), large meningiomas (Odds ratio=15,977), and for each cubic centimeter added to its size, the risk of edema increased 1,082 times (Odds ratio). CONCLUSION: Peritumoral brain edema correlated with recurrence, irregular margins, seizures and larger tumors. The tentorial location demonstrated smaller edema sizes. Peritumoral brain edema may be related to meningioma\'s invading potentiality and may play a role in the recurrence pontential of the tumor. As a consequence, it\'s reasonable to consider edema\'s presence as an additional factor to be taken into account when arranging layout of strategies for meningiomas treatment.

A remoção dos terceiros molares é um procedimento cirúrgico amplamente realizado com diversas indicações. A prevalência do edema e da dor, no período pósoperatório, é freqüente, podendo ocasionar alteração da qualidade de vida dos pacientes. O objetivo principal foi avaliar dor, edema e qualidade de vida após a exodontia de terceiros molares e suas variações de acordo com a posição do dente. Desenvolvemos um estudo prospectivo intervencional com 86 pacientes cujo planejamento pré-operatório era extrair dois terceiros molares do mesmo lado no mesmo tempo cirúrgico. Os pacientes foram divididos em dois grupos, dependendo da posição do terceiro molar inferior, segundo a classificação de Pell-Gregory (1942) e Winter (1933). A dor, o edema e a qualidade de vida foram às variáveis avaliadas antes (pré operatório) e depois (pós-operatório por sete dias) do procedimento cirúrgico. A dor foi quantificada de acordo com uma escala visual numérica (0-4), o edema através de uma escala visual ilustrativa (A-D), e a qualidade de vida através do questionário Oral Health Impact Profile (OHIP-14). Os dados foram digitados e analisados no pacote estatístico STATA 10.0, com estatística descritiva e inferencial. O nível de significância utilizada foi de 95%. Resultados: A variação da dor, do edema e do OHIP total ao longo dos dias de pós-operatório foi significativa. A dor e o edema pós-operatórios estiveram presentes até o 5PO. Os valores de OHIP-14 foram altos no 1PO e 2PO e retornaram ao valor incial no 6PO (pré-operatório). Os domínios que apresentaram os maiores índices de pacientes com impacto foram 2, 3 e 4. Conclusão: A dor, o edema e o OHIP estão ligados a dificuldade cirúrgica de exodontia dos terceiros molares. A dor pós-operatória teve um comportamento decrescente ao longo dos dias. O edema teve um comportamento progressivo (3PO) e posteriormente decrescente. O impacto na QV ocorre no pós-operatório imediato (1 e 2PO) e retorna aos valores normais rapidamente (6PO).A pesquisa teve aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da FOUSP (Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo) sob o número FR 266884 protocolo 108/2009. / Third molar extraction surgery is widely performed with several indications. Pain and swelling prevalence are usual after surgery with potential effects on patients quality of life. Our primary aim was to evaluate the pain, swelling and quality of life after third molar tooth extraction surgery and the effects according to its original position. We performed an interventional prospective study within 86 patients whom preoperative planning is removal of two third molar teeth from the same side at one-time procedure. Two groups of patients were divided depending on their initial positioning classification (Pell and Gregory end Winter). Pain, swelling and quality of life are the outcomes that were evaluated before and after (seven days) the surgical procedure by the main researcher. Pain was quantified according to a numeric visual score (range 0 to 4), swelling with an illustrated visual score (range A to D) and quality of life by Oral Health impact Profile questionary (OHIP-14). Data will was treated and analyzed according to STATA 10.0, software, and descriptive and inferential statistics were performed. The significance level that was used is 0,05. Results: The variation of pain, swelling and OHIP total among the days after surgery was significant. The pain and swelling after surgery were present until the fifth day after surgery. The highest OHIP scores were at the first and second days after the procedure and returned to the initial value on sixth day (preoperative). The domains that have higher rates, with impaction patients lifes were 2, 3 and 4. Conclusion: Pain, swelling and OHIP are linked to the difficulty of surgical extraction of third molars. The postoperative pain had a decreasing behavior over the day. The swelling behavior was progressive (third day) and then decreases. The impact on QoL occurs in the immediate postoperative period (first ande second days) and returns to normal quickly (6PO). The study had the approval of ethics committee from University of Sao Paulo Dental School (FR 266884- 108/2009).

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T17:42:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Huaco_FrankDenisTorres_D.pdf: 4738657 bytes, checksum: 14194646f90e694d6d1598ef9b7fc870 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Neste trabalho descrevemos a purificação, caracterização estrutural e os efeitos locais e sistêmicos de uma nova metaloprotease de baixa massa molecular, denominada BtaHF (Bothriopsis taeniata Hemorrhagic Factor). A proteína foi purificada a partir do veneno total da serpente Bothriopsis taeniata usando cromatografía exclusão molecular convencional (Sephadex G-75), seguida de uma cromatografia de alta eficiência de troca iônica (coluna DEAE 8HR APMinicolumn). A nova metaloprotease BtaHF apresenta um alto grau de pureza e homogeneidade molecular e possui uma massa molecular de 25968,16 Da. A BtaHF apresentou atividade caseinolítica com uma temperatura e pH ótimos de 37-40 oC e 8, respectivamente. A atividade caseinolítica da BtaHF foi inibida por EGTA, EDTA e DTT, mas os inibidores PMSF e SBTI não apresentaram efeito. O íon Ca+2 é importante para a estabilidade da metaloprotease BaHF, aumentando atividade caseinolítica da enzima, entretanto, os íons Zn+2 e Mn+2 inibem a atividade enzimática desta enzima. A BtaHF é uma enzima ?-fibrinogênolítica por degradar rapidamente à cadeia A do fibrinogênio após 15 minutos de incubação, enquanto a cadeia B? é completamente degradada após 6 horas. Por outro lado, a BtaHF não possui atividade fibrinolítica ou arginine amidase. A análise de composição de aminoácidos mostrou que a BtaHF possui caráter ácido e apresenta 6 resíduos de cisteína. No estudo de homologia a BtaHF apresentou maior identidade sequencial com metaloproteases com atividade hemorrágica da classe P-I como a BaP1 (Bothrops asper). A metaloprotease BtaHF possui atividade hemorrágica fraca com uma dose hemorrágica mínima de 20,14 ?g/animal. Esta metaloprotease mostrou atividade edematogênica que mostrou ser dose-dependente e teve um efeito permaneceu após 6 horas de injeção. Ambos os efeitos estão relacionados à atividade proteolítica e ao correto enovelamento da BtaHF, una vez que foram inibidas por agentes quelantes (EDTA e EGTA) e redutor (DTT). A metaloprotease BtaHF não possui atividade miotóxica, embora tenha atividade citotóxica em fibroblastos C2C12. A análise histológica do músculo gastrocnêmio de camundongo confirmou a atividade hemorrágica e edematogênica da metaloprotease, assim como, a ausência de atividade miotoxica. A metaloprotease BtaHF produz efeitos sistêmicos específicos quando injetado via endovenosa em camundongos. A nível do tecido pulmonar, a toxina produz alteração da estrutura alveolar com hemorragia significativa, engrossamento dos septos alveolares e inflamação. A BtaHF não produz hemorragia no tecido renal, mas alterou a estrutura glomerular, além de alterações no citoplasma das células dos túbulos proximal e distal. Contrariamente, esta toxina não produz efeito nenhum a nível hepático. A BtaHF consome o fibrinogênio plasmático de modo dose e tempo-dependente, produzindo incoagulabilidade sanguínea após uma hora. Estudos in vitro revelaram atividade pro-coagulante dose-dependente, ao reduzir os índices PT e APPT. A utilização de metodologias de purificação de alta eficiência permitram a purificação da metaloprotease BtaHF. Assim, esta abordagem pode ser aplicada nos estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológicos e farmacológicos, podendo deduzir o papel desenvolvido pela metaloprotease purificada nos efeitos biológicos produzidos pelo veneno total de Botriopsis taeniata. As informações produzidas no presente trabalho permitiram sugerir que as principais funções das metaloproteases de veneno de serpente da classe P-I são manter a hemorragia característica dos envenenamentos botrópicos e participar da imobilização da presa promovendo rápidos efeitos próinflamatórios / Abstract: In this work we described the purification, structural characterization and the local and systemic effects of a new low molecular weight snake venom metalloproteinase, named BtaHF. This protein was purified from the Bothriopsis taeniata crude venom combining conventional molecular exclusion (Sephadex G-75 column) followed by an ion exchange (DEAE 8HR APMinicolumn) chromatography on a HPLC system. The new metalloproteinase BtaHF showed a high degree of purity and molecular homogeneity with a molecular mass of 25968.16 Da. BtaHF showed caseinolytic activity with an optimum temperature and pH of 37-40 °C and 8, respectively. The caseinolytic activity was inhibited by EGTA, EDTA and DTT, but PMSF and SBT-I did not show inhibitory effect. The Ca+2 ion shown to be important for protein stability enhancing its caseinolytic activity, on the contrary, Z+2 and Mn+2 showed inhibitory effects upon the enzymatic activity of this protein. The metalloproteinase BtaHF is an ?-fibrigenolytic enzyme, rapidly degraded fibrinogen A? chain within 15 minutes, while fibrinogen B? chain is degraded after 6 hours. This enzyme did not show fibrinolytic or arginine amidase activities BtaHF is an acidic protein due the mayor proportion of acidic amino acid in its amino acid composition with 6 cysteinyl residues. By the homology study BtaHF share a high sequence identity other weakly hemorrhagic P-I class SVMP such BaP1 isolated from Bothrops asper snake venom This new metalloproteinase, BtaHF, have a weak hemorrhagic with a minimum hemorrhagic dose of 20.14 ?g. Also, this metalloproteinase showed dose-dependent paw edemaforming activity, this effect remain six hours after inoculation. Both hemorrhage and edemaforming activities were related to the enzymatic activity and correct fold of BtaHF, since chelating (EDTA and EGTA) and reducing (DTT) agents inhibited these activities. On the other hand, this enzyme did not show miotoxic activity, although, showed citotoxic activity on C2C12 fibroblast. Histological analysis of mice gastrocnemius muscle confirmed that the metalloproteinase produce local hemorrhage and pro-inflammatory effects, as well as, the absence of miotoxic activity. This metalloproteinase, BtaHF, produce specific systemic effects when injected endovenously in mice. On lung tissue level these toxin produce alteration of alveolus structure with significant hemorrhage, thickness of alveolus septum and inflammation. On renal tissue BtaHF did not produce hemorrhage, but, was observe alteration of glomerulus structure, along with cytoplasmatic alterations of distal and proximal tubulus cells. On the other hand, were not observed any alterations on hepatic tissue. BtaHF deplete completely plasma fibrinogen levels in a time and dose-depended manner, reaching blood incoagulability after one hour. BtaHF shown dose-dependent pro-coagulant activity "ex vivo" reducing PT and APPT index. The metalloproteinase BtaHF was purified using a high efficient system. Thus, this approach can be applied to biochemical, structure-function, physiologic and pharmacologyc studies which allow infer the role of this enzyme in the biological effects produce by Bothriopsis taeniata crude venom. The information here presented suggest that the mainly functions of P-I class snake venom metalloproteinases are the maintenance of the characteristic hemorrhagic effect of the botropic venoms and participate of prey immobilization by promoting rapid inflammatory effects / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Alice da Cruz Höfling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T19:45:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stavale_LeilaMiguel_M.pdf: 25008584 bytes, checksum: 8754f8fc3865217986eb0137679176e9 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV), também conhecida como aranha armadeira, é uma mistura complexa de peptídeos com ação neurotóxica em alguns canais iônicos. No sistema nervoso central (SNC) alguns peptídeos do PNV causam permeabilização da barreira hematoencefálica (BHE) e interferem na liberação de neurotransmissores. A BHE, embora essencial para a manutenção da homeostase do SNC, pode representar uma barreira muito restritiva para o acesso de drogas terapêuticas ao microambiente neural. O entendimento dos mecanismos associados à disfunção da BHE é relevante do ponto de vista científico e médico. O objetivo do estudo foi investigar alguns mecanismos envolvidos na neurotoxicidade do veneno da Phoneutria nigriventer em ratos Wistar (Rattus norvegicus). Para esse fim, o efeito vasogênico causado pela neurotoxicidade do veneno no cérebro, foi examinado através da avaliação da expressão de aquaporina 4 (AQP4), uma proteína formadora dos canais de água e abundantemente localizada nos pés astrocitários perivasculares e relacionada com o aparecimento de edema no cérebro. A análise da expressão da proteína foi feita por imunohistoquímica e western blotting e a expressão de RNAm por PCR em tempo real no cerebelo e hipocampo de animais neonatos (14 dias) e adultos (8 semanas). Os resultados obtidos mostraram aumento da expressão de AQP4 e seu RNAm nos animais envenenados, que entretanto foi variável em função do tempo de envenenamento (2, 5 ou 24 h), da região do cerebelo ou hipocampo examinada e da idade dos animais. Os resultados mostraram também intensa marcação anti-AQP4 ao redor de vasos com edema perivascular ou não, como também entre os corpos neuronais e seus prolongamentos. Concluímos que a AQP4 tem papel nas alterações de volume dos astrócitos perivasculares e na formação e resolução do edema ao redor da BHE causado pelo PNV. A dinâmica da expressão da AQP4 no cerebelo e hipocampo em função do tempo, região e idade dos animais sugere a existência de fatores intrínsicos que modulam diferencialmente a funcionalidade da BHE em função do microambiente local. A compreensão dos mecanismos envolvidos no envenenamento por PNV pode contribuir para o desenvolvimento de ferramentas úteis para a intervenção clínica, bem como pode ser relevante para o entendimento dos mecanismos relacionados ao funcionamento da BHE e de proteínas envolvidas na formação de canais de água, como a AQP4 / Abstract: The Phoneutria nigriventer spider venom (PNV), also known as armed-spider, is a complex mixture of ion channels-acting peptides which exhibit neurotoxic action. In the central nervous system (CNS), PNV-containing peptides cause permeabilization of the blood-brain barrier (BBB) and interfere with neurotransmitter release. The BBB, although essential for the maintenance of homeostasis of the CNS, may represent a very restrictive barrier for the access of therapeutic drugs into the neural microenvironment. The understanding of BBB impairment-associated mechanisms are of scientific and medical importance. The aim of this study was to investigate some of the mechanisms involved in the neurotoxicity caused by Phoneutria nigriventer venom in Wistar rats (Rattus norvegicus). To this end, the vasogenic effect caused by the venom neurotoxicity in the brain was examined by evaluating the expression of aquaporin 4 (AQP4), a water channel forming protein abundantly expressed in perivascular astrocytic endfeet processes and associated to the formation and resolution of edema in the brain. The analysis of AQP4 expression was assessed in the cerebellum and hippocampus of neonate (14 day-old) and adult rats (8 week-old) through immunohistochemistry and western blotting, and the expression of mRNA by Real Time-PCR. The results showed increases of AQP4 expression and its mRNA in the envenomed animals, which though showed time- (2, 5 or 24h), regional- (regions of the cerebellum and hippocampus examined) and age-associated differences. Marked anti-AQP4 labeling was found around vessels with or without edema and among the neuron bodies and their processes. We conclude that AQP4 has a role in the volume alterations of the perivascular astrocytes and in the formation and resolution of edema around the BBB induced by PNV. The variability of the dynamics of AQP4 expression in the cerebellum and hippocampus in function of the time, region and animals age suggests the existence of intrinsic factors that modulate the BBB functionality depending on the molecular biology dynamics of the local microenvironment. The understanding of the mechanisms involved in the envenomation by PNV can contribute to the development of useful tools for clinical intervention, and may be relevant for understanding the mechanisms related to the functioning of the BBB and proteins involved in the formation of water channels, such as AQP4 / Mestrado / Histologia / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Pain is the most common complaint in the medical field and the identification of compounds that can effectively treat painful states without induction of side-effects remains a major challenge in biomedical research. The aim of the present study was to investigate the antinociceptive effect of a novel compound, 3-(4-fluorophenyl)-5-trifluoromethyl-1H-1-tosylpyrazole (compound A) in several models of pain in mice and compare with those produced by the known trifluoromethyl-containing pyrazole compound celecoxib. Compound A or celecoxib were administrated by oral (78 780 μmol/kg), intrathecal (9 22.5 nmol/site) or intracerebroventricular (9 22.5 nmol/site) routes. Oral administration of either compound A or celecoxib abolished the mechanical allodynia, but not the oedema caused by intraplantar injection of carrageenan. Similarly, compound A reduced the overt nociception, but not the oedema, produced by bradykinin or capsaicin. However, compound A (500 μmol/kg, orally) did not alter nociception nor oedema caused by intraplantar injection of prostaglandin E2 or glutamate, whereas celecoxib reduced only the nociception induced by the former. Moreover, oral and intrathecal administration of compound A or celecoxib also reduced the nociception induced by acetic acid. However, only celecoxib reduced the acetic acid-induced nociception when it was injected by the intracerebroventricular route. Finally, neither compound A nor celecoxib was able to produce antinociceptive effect in the tail-flick test or to alter the motor performance and the body temperature. Besides, compound A or celecoxib did not induce gastric lesion. Thus, compound A seems to be an interesting prototype for the development of novel analgesic drugs. / A dor é uma das maiores queixas na área médica e a identificação de compostos que possam tratar efetivamente os estados dolorosos, sem induzir efeitos colaterais, permanece um grande desafio na pesquisa biomédica. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito antinociceptivo de um novo composto 3-(4-fluorfenil)-5-trifluormetil-1H-1-tosilpirazol (composto A) em diferentes modelos de dor em camundongos e comparar os seus efeitos com aqueles produzidos por um pirazol contendo trifluormetil em sua estrutura, o celecoxibe. O composto A ou o celecoxibe foram administrados por via oral (78 780 μmol/kg), intratecal (9 22,5 nmol/sitio) ou intracerebroventricular (9 22,5 nmol/sitio). A administração oral do composto A ou do celecoxibe aboliram a alodínia mecânica, mas não o edema, causado pela injeção intraplantar de carragenina. Do mesmo modo, a administração do composto A reduziu a nocicepção, mas não o edema, produzido pela bradicinina ou capsaicina. Entretanto, o composto A administrado por via oral (500 μmol/kg) não alterou a nocicepção nem o edema causados pela injeção intraplantar de prostaglandina E2 (PGE2) ou glutamato. Já o celecoxibe, reduziu somente a nocicepção induzida pela PGE2. Além disso, a administração oral ou intratecal do composto A ou celecoxibe também reduziu a nocicepção induzida por ácido acético. Quando administrados por via intracerebroventricular, somente o celecoxibe foi capaz de reduzir a nocicepção induzida por ácido acético. Finalmente, o composto A ou o celecoxibe não alteraram a nocicepção térmica aguda, a performance motora ou a temperatura corporal dos animais, nem produziram lesões gástricas quando administrados por via oral. Consequentemente, o composto A parece ser um interessante protótipo para o desenvolvimento de novas drogas analgésicas.

Orientadores: Sérgio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T10:47:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carregari_VictorCorasolla_M.pdf: 2297387 bytes, checksum: fc95267d0ed3c753978294fe999d0cf7 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O presente trabalho apresenta a purificação e caracterização bioquímica de uma nova PLA2 neurotóxica nomeada BbilTX-I isolada do veneno da serpente Bothriopsis bilineta. Esta proteína foi purificada através de dois passos cromatográficos, em Sephadex G75 e HPLC de fase reversa C18 (?Bondapak Watters). A BbilTX-I é uma PLA2D49, com elevada atividade catalítica, massa molecular de 14185,48 Da, e alta similaridade na sua sequência N-terminal com outras PAL2 de veneno de serpentes. A temperatura ótima para a atividade enzimática da BbilTX-I está entre 25Cº e 37 ºC. A fração BbilTX-I é cálcio dependente e tem a atividade enzimática bastante diminuída quando testadas com os íons divalentes. Da mesma forma como outras PLA2 descritas na literatura, a BbilTX-I mostra o pH ótimo em torno de 8. A fração F3 isoladas de crotapotinas crotálicas e a DA2-II extraída do soro de Didelphis albiventris apresentaram um efeito inibitório de mais de 50% sobre a atividade enzimática da toxina BbilTX-I. O efeito da concentração do substrato 4-nitro-3-(octanoiloxi) ácido benzóico sobre a atividade enzimática da BbilTX-I demonstrou que a toxina é uma enzima monomérica com tendência alostérica sugerindo provavelmente um mecanismo de cooperatividade positiva mnemônical. A PLA2 BbilTX-I inserida em preparação isolada de biventer cervicis de pintainho apresentou um efeito bloqueador da transmissão nervosa na junção neuromuscular, em doses de 10, 20, 30 e 50?g/ml e causou 50% de bloqueio em 20 minutos com 10 ?g/ml, 30 minutos com 20 ?g/ml, 22 minutos com 30 ?g/ml e 20 minutos com 50 ?g/ml. Como não houve alteração significativa na resposta ao KCl (usado para detectar danos na membrana celular) e à Acetilcolina (usada para identificar atividade sobre os receptores colinérgicos nicotinicos) podemos dizer que a PAL2 BbilTX-I é uma neurotoxina pré-sináptica não miotoxica, que atua no terminal nervoso da sinapse neuromuscular interferindo sabre a liberação da ACh. A crotapotina F3 isolada do veneno da serpente Crotalus durissus cascavella e o fator anti-homorrágico DA2-II isolado do soro de Dildelphis albiventris inibiram em 64% e 57% respectivamente a atividade edematizante da fração BbilTX-I demonstrando que a ação inflamatória desta proteína é dependente de sua ação catalítica / Abstract: In this present work we described the purification and functional characterization of a new neurotoxic PLA2, named BbilTX-I from Bothriopsis bilineata snake venom. This protein was by the combination of two chromatographic steps, Molecular Exclusion on a Sephadex lunm and Reverse Phase HPLC (RP-HPLC) on a C18 ?-Bondapack (Waters) column. BbilTX-I is a monomeric PLA2-D49 showing high purity degree in SDS-PAGE in both reducing and non-reducing conditions. The purity of the toxin was confirmed by MALDI-TOF mass spectrometry and shows a molecular mass of 14185.48 Da. BbilTX-I posses a high catalytic activity upon 4-nitro-3-(octanoiloxi) benzóic acid as a substrate compare with other bothropic PLA2. The optimal temperature and pH for BbilTX-I activity was determinate between 25-37 °C and around 8, respectively. This PLA2 is Ca+2 dependent but others divalent ions significatively reduce its catalytic activity, when pre­incubated with the protein. Also were tested the effects of fraction F3, crotapotin from Crotalus durrisous cascavela, and anti-hemorrhagic factor DA2-Il from Didelphis albiventris opossum sera under optimal conditions; both fraction showed an inhibitory effect over the BbilTX-I catalytic activity. At different concentrations of the substrate this monomeric PLA2 show an allosteric behavior suggesting a positive cooperative mnemonical enzyme mechanism in the catalysis. BbilTX-I showed an inhibitor effect on neuromuscular nerve transmissions on the isolated muscle biventer cervicis. At doses at 10, 20, 30 and 50 g/ml it elicited a blockade of 50% of 20, 30, 22 and 20 minutes, respectively. The effect displayed by BbilTX-I did not with the responses evoked by the addition of KCl (cell membrane damage) and (Ach functionality of cholinergic receptors), thus, we can argue that BbliTX-I is a pre-synaptic neurotoxin impairing the Ach liberation. BbilTX-I shows itself as an edematogenic PLA2 when injected in the mouse right footpad, it elicited a 70% higher than of edema when compare with the control. The edemetogenic activity of this PAL2 is related to its catalytic activity since both are inhibited by F3 crotapotin and DA2-II, 64 and 57% respectively. The reproducibility of biological activity, through the pharmacologic effects, only is possible by the use of chemically homogeneous fractions that hold biological function integrity. This fraction was obtain with high efficiency methodologies like HPLC, mass spectrometry, this result can be associated with the biological activity, disregarding the subjectivity caused by the venom or by impure fractions. This kind of methodologies can be applied to biochemical, structure and function, logical and pharmacological studies, which can reveal unknown mechanism in the function-structure relationship of snake venom PLA2 / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Vital Paulino Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T05:19:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santana_AlanaMendonca_M.pdf: 2805390 bytes, checksum: 9512111e988de78a1ffde9d9f877658b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos das combinações fixas dos análogos de prostaglandinas com timolol sobre a barreira hematoaquosa, a espessura macular central e a pressão intraocular (PIO), em pacientes pseudofácicos com glaucoma primário de ângulo aberto. Neste ensaio clínico randomizado, com observador mascarado e duração de 6 meses, os pacientes foram tratados uma vez por dia (20:00 horas) com lubrificante (grupo controle) ou com a combinação fixa de maleato de timolol 0,5% e latanoprosta 0,005% (CFLT), maleato de timolol 0,5% e bimatoprosta 0,03% (CFBT) ou maleato de timolol 0,5% e travoprosta 0,004% (CFTT). Foi incluído no estudo apenas um olho de 61 pacientes: CFLT (n=16), CFBT (n=15), CFTT (n=15) e grupo controle (n=15). A barreira hematoaquosa foi avaliada por meio do &quot;laser flare meter¿ antes do início do uso das medicações e após 15 dias, 1,2,3,4,5 e 6 meses de tratamento. A PIO foi medida sempre às 9:00 horas, nas mesmas ocasiões. A espessura macular central foi avaliada por meio da tomografia de coerência óptica antes do uso das medicações, após 1 e 6 meses de tratamento ou na hipótese de piora da acuidade visual. Não houve aumento estatisticamente significante nos valores médios de &quot;flare¿ em comparação aos valores iniciais em todos os grupos (p>0,05) em todas as visitas, exceto no grupo CFTT no primeiro mês (p=0,0476) e no grupo CFLT (p=0,0129) no terceiro mês de seguimento. Não houve diferença estatisticamente significativante entre os valores médios de &quot;flare¿ entre os grupos durante o estudo (p>0,05). A média dos valores da espessura macular central aumentou significativamente nos grupos CFLT (p=0,012) e CFTT (p=0,0419) no primeiro mês de tratamento em relação aos valores iniciais. Não houve aumento estatisticamente significante nos valores médios da espessura macular central em relação aos valores iniciais em todos os grupos após 6 meses de tratamento (p>0,05) e não ocorreu diferença estatisticamente significante entre os grupos durante o estudo (p>0,05). A PIO média inicial foi significativamente menor no grupo controle (p=0,0000). Todas as combinações fixas reduziram significativamente a PIO em todas as visitas (P<0,0001), com efeito hipotensor semelhante entre si (p=0,816). Estes resultados indicam que o uso das combinações fixas de análogos de prostaglandinas com timolol não aumentou significativamente a média dos valores de &quot;flare¿ ou a média da espessura macular após 6 meses de tratamento nesta população / Abstract: The aim of this study was to investigate the effects of prostaglandin analogues and timolol fixed-combinations on the blood-aqueous barrier, central macular thickness and intraocular pressure (IOP) in pseudophakic patients with primary open angle glaucoma. In this randomized, masked-observer, 6-month clinical trial, patients were treated once daily (8 pm) with lubricant eye drops (control group), 0,5% timolol and 0,005% latanoprost fixed-combination (LTFC), 0,5% timolol and 0,03% bimatoprost fixed-combination (BTFC) or 0,5% timolol and 0,004% travoprost fixed-combination (TTFC). One eye of 61 patients were included in the study: LTFC (n=16), BTFC (n=15), TTFC (n=15) and control group (n=15). The blood-aqueous barrier status was assessed using the laser flare meter before the medications were started and after 15 days, 1, 2, 3, 4, 5 and 6 months of treatment. The IOP was measured always at 9 am, at the same intervals. The central macular thickness was evaluated with optical coherence tomography before medications were started, after 1 and 6 months of follow-up or if a patient showed decreased visual acuity at any time during follow-up. There was no significant increase in mean flare measurements from baseline in all groups (p>0.05) in all visits, except TTFC group at 1 month (p=0,0476) and LTFC group at 3 months (p=0,0129). There were no significant differences in mean flare values among the groups (p>0.05). Mean central macular thickness values were significantly higher in LTFC (p=0,012) and TTFC groups (p=0,0419) at 1 month of follow-up. There was no significant increase in mean central macular thickness values from baseline in all groups (p>0.05) after 6 months and no significant differences among the groups (p>0.05) during follow-up. At baseline, mean IOP was significantly lower in control group (p=0,0000). All fixed-combinations significantly reduced IOP in all follow-up visits, with similar lowering effect (p=0,816). These findings indicate that the use of prostaglandin analogues and timolol fixed-combinations didn't significantly increased mean flare values or mean central macular thicknes measurements after 6 months of follow-up in this population / Mestrado / Oftalmologia / Mestra em Ciências Médicas

published_or_final_version / Physiology / Doctoral / Doctor of Philosophy