Para avaliar a encefalopatia em gatos infectados experimentalmente pelo vírus da imunodeficiência dos felinos, foram obtidas amostras de encéfalo após necropsia de nove gatos previamente inoculados pelo subtipo B do vírus e monitorados por quatro anos. As amostras foram fixadas em formalina 10% para coloração em Hematoxilina-eosina, e em metacarn para avaliação análise imunohistoquímica. Através da técnica de imunohistoquímica, as lâminas de encéfalo foram incubadas com anticorpos específicos para os antígenos Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP) e Vimentina para marcação de astrócitos e com anticorpos para a proteína p24 do capsídeo viral do FIV. Nas lâminas marcadas para GFAP foram observados astrócitos em substância branca e cinzenta em quantidade moderada, sugerindo astrocitose reativa. Houve marcação mais evidente da região subpial e em alguns animais das regiões perivasculares. A marcação para vimentina mostrou raras células distribuídas pelo neurópilo e forte marcação de astrócitos na região subependimária nos ventrículos laterais e IV ventrículo, o que pode indicar um aumento da proliferação e migração de células tronco. Também foram observadas alterações como: nódulos gliais, vacuolização da substância branca, satelitose e focos de calcificação de meninge. A satelitose indica a presença de processo degenerativo em desenvolvimento. A marcação para a proteína p24 confirmou a presença de células microgliais infectadas. Raros astrócitos com marcação citoplasmática foram vistos em apenas um animal. Curiosamente, houve marcação dos neurônios da camada granulosa do cerebelo. Esta técnica deve ser mais bem explorada para o uso em diagnóstico post mortem. Esses resultados sugerem que os animais infectados experimentalmente pelo FIV subtipo B apresentam alterações microscópicas mesmo na ausência de sinais clínicos neurológicos. / To evaluate the encephalopathy in cats experimentally infected with feline immunodeficiency vírus, were obtained brain samples from autopsies of nine cats previously inoculated with subtype B virus and monitored for four years. The samples were fixed in 10% formalin for hematoxylin-eosin staining, and in metacarn for immunohistochemical analysis. Throuh the immunohistochemistry technique, the brain slides were incubated with antibodies against the glial fibrillary acidic protein (GFAP) and vimentin to mark astrocytes and against the viral capsid protein p24 of FIV. On the GFAP marked slides, astrocytes were observed in gray and white matter in moderate amounts, suggesting reactive astrocytosis. There was evident reactivity in the subpial area and in some animals, around blood vessels. The markup for vimentin showed rare cells distributed throughout the neuropil, and strong labeling of astrocytes in the subependymal region of the lateral ventricules and fourth ventricule, which may indicate an increased rate of proliferation and migration of stem cells. The histopathological changes observed were: glial nodules, white matter vacuolization, sattelitosis and foci of meningial calcification. The sattelitosis indicates the presence of degenerative process in developing. The use of antibodies against the protein p24 confirmend the presence of infected microglia in the brain of infected animals. Rare astrocytes with cytoplasmic staining were seen in only one animal. Interestling, there was labeling of neurons in the granular layer of the cerebellum. This technique should be further exploited for use in post-mortem diagnosis. These results suggest that animals experimentally infected with FIV subtype B show microscopic changes in the absence of clinical neurologic signs.

Las enfermedades priónicas, también conocidas como EETs (Encefalopatías Espongiformes Transmisibles), son un grupo de enfermedades neurodegenerativas fatales que, debido a su transmisibilidad potencial han tenido un gran impacto social, político y económico en las últimas décadas. Las EETs afectan a los humanos y a algunos grupos de animales, presentan largos períodos de incubación y producen la muerte pocos meses después de la aparición de la sintomatología clínica. Su origen se atribuye a la presencia, multiplicación y deposición de una proteína anormal llamada prión. El prión (o PrPSc) es una forma mal conformada de la proteína priónica celular (PrPc), presente en condiciones fisiológicas en las membranas de las células. El prión es parcialmente resistente a las proteasas, resistente a desinfectantes físico-químicos convencionales, y capaz de convertir de forma auto-catalítica a la PrPc dando lugar a la propagación en cadena de la forma patogénica. El prión es transmisible, no sólo entre individuos de una misma especie sino también entre individuos de especies diferentes. Las EETs animales más importantes son el scrapie, que afecta a las ovejas y las cabras, y la encefalopatía espongiforme bovina (EEB), que afecta a las vacas (vulgarmente conocida como "mal de las vacas locas").En el caso de las EETs humanas, las más relevantes son la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), el síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS), el insomnio familiar fatal (FFI) y el Kuru. La ECJ tiene una incidencia de 1 o 2 casos por millón de habitantes y año en todo el mundo, afecta por igual a hombres y mujeres, y cursa con demencia, mioclonías y ataxia cerebelar. Neuropatológicamente, provoca pérdida neuronal, astrocitosis, microgliosis y cambio espongiforme. La presencia de la proteína 14-3-3 en el LCR y de un EEG típico, son factores diagnóstico, aunque el diagnóstico definitivo se hace a nivel post-mortem con la detección de la PrPSc por inmunohistoquímica y/o western blot.El impacto social y sobre la salud pública y animal que han tenido las enfermedades priónicas en las últimas décadas fue originado, en gran medida, por la epidemia de EEB que afectó en los años 90 al Reino Unido, principalmente. Esta epidemia se atribuyó a la alimentación de las vacas con piensos enriquecidos con proteínas procedentes de ovejas infectadas con scrapie. Debido a la transmisibilidad ínter-específica de los priones, éstos infectaron a las vacas y éstas, al pasar a la cadena alimenticia, a los humanos, dando lugar a la nueva variante de la ECJ. La ECJ tiene un origen esporádico en un 85% de los casos, es decir, el inicio de la enfermedad se produce de manera espontánea, a pesar de que éste se asocia a la presencia de priones residuales en el SNC, a la generación de mutaciones puntuales en el gen de la PrP (PRNP) o bien a la conversión espontánea de la PrP debido a alteraciones físico-químicas de la proteína. En el 10% de los casos, la ECJ es genética y hereditaria, es decir, se atribuye a mutaciones en el PRNP que pasan a las células germinales y a la nueva generación. En este escenario, se habla de ECJ familiar. El 5% de los casos de ECJ restantes se asocian a una transmisión iatrogénica, es decir, por contaminación durante transplantes, tratamientos hormonales, manipulación quirúrgica, etc., aunque este tipo de transmisión está prácticamente erradicada. El propósito general de esta tesis es el estudio de las EETs dirigido a incrementar el conocimiento acerca de los mecanismos celulares y moleculares implicados en la neuropatología de estas enfermedades. Si bien la multiplicación y deposición del prión se consideran los detonantes de la neuropatología y sintomatología clínica asociadas a las EETs, es asumible que los mecanismos involucrados en estas alteraciones sean complejos y tengan un origen multifactorial. En este escenario, las alteraciones en la neurotransmisión y la disfunción de algunos grupos de proteínas relacionados con la supervivencia celular se consideran cruciales en el desarrollo de las enfermedades priónicas y de sus fenómenos neuropatológicos asociados. Atendiendo a las observaciones anteriores, esta tesis se ha enfocado a estudiar el papel que juegan ciertos grupos de proteínas en la neurotransmisión, la espongiosis y la muerte neuronal. Para abordar experimentalmente cada una de estas líneas de interés, nuestros estudios van ecaminados a: conocer el estado de la vía de señalización vinculada a la transmisión glutamatérgica y de adenosina; conocer el papel de los canales de agua o aquaporinas cerebrales en relación a la vacuolización y al cambio espongiforme característico de las EETs y, por último, estudiar la vía de señalización de las MAPKs en relación a la degeneración neuronal. Estos estudios se realizan sobre corteza frontal de material humano post-mortem de casos con ECJ y sobre la corteza cerebral de un modelo murino de la EEB, esto es, de ratones transgénicos para la PrP bovina infectados con EEB en diferentes estadíos de desarrollo de la enfermedad. Los resultados obtenidos muestran, en primer lugar, un deterioro de las vías de señalización de los receptores metabotrópicos de glutamato de grupo I en la corteza frontal de ECJ así como en la corteza cerebral de un modelo murino de la EEB asociado al progreso de la enfermedad, lo cual sugiere que las fosfolipasas y los elementos constituyentes de la transducción de señales de dicha vía son particularmente sensibles a las EETs. En segundo lugar, se ha encontrado un incremento de la expresión y la actividad de los receptores A1 de adenosina en la corteza frontal de casos con ECJ así como un aumento de la expresión de estos receptores en corteza cerebral de un modelo murino de la EEB asociado al progreso de la enfermedad. El incremento en los niveles de A1Rs puede ser una respuesta al daño neuronal, teniendo en cuenta su papel neuroprotector en el SNC. En tercer lugar, se ha detectado un incremento de la expresión de AQP1 y AQP4 en la corteza frontal de casos con ECJ así como en la corteza cerebral de un modelo murino de la EEB asociado al progreso de la enfermedad. El incremento de la expresión de AQPs se puede asociar a una alteración de la homeostasis celular y a la formación de vacuolas que pueden contribuir al cambio espongiforme característico de las enfermedades priónicas. Por último, se ha encontrado un descenso de los niveles proteicos de los factores de transcripción c-fos y CREB en la corteza frontal de casos con ECJ, en contraste con el mantenimiento de los niveles de las MAPKs. El agotamiento de c-fos y CREB puede inducir neurodegeneración en estadios terminales de ECJ, considerando su papel mediador en los fenómenos de muerte y supervivencia celular.Si bien, los resultados que se desprenden de esta tesis mejoran la comprensión de los fenómenos celulares y moleculares que acompañan a la patología de las EETs, serán necesarios estudios ulteriores con modelos celulares y animales para conocer con mayor exactitud de qué modo y en qué medida contribuye el prión a estas alteraciones. / Prion diseases, also known as Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs), are a group of fatal neurodegenerative diseases that have had an important social, political and economical impact in the last decades, according to their potential transmissibility. TSEs affect human and animals, and their incubation period is long. They caused death after a few months from the first clinical symptoms. TSEs origin is associated to the presence, multiplication and deposition of an abnormal protein called prion. Prion, also called PrPSc, is an abnormal form of the cellular prion protein (PrPC), which is a cell-anchored glycoprotein expressed in a wide range of animal tissues but it is enriched into the central nervous system (CNS). Prions are partially resistant to protease digestion and also resistant to conventional physical-chemical treatments. Prions are able to recruit PrPC leading to the propagation of the pathogenic conformation. Prions are transmissible, not only between individuals from the same specie, but also between individuals from different species.The most important animal TSEs are scrapie, affecting sheep and goats, and Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) affecting cows (also called mad cow disease). In humans, TSEs include Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome (GSS), Fatal Familial Insomnia (FFI) and Kuru. CJD has an incidence of 1 or 2 cases per million of population within a year around the world, affects both men and women and causes dementia, myoclonia and cerebellar ataxia. Neuropathologically, CJD is characterized by neuron loss, astrocytosis, mycroglyosis and spongiform change. The presence of 14-3-3 protein in CSF and a typical EEG are diagnosis factors but final diagnosis is done by PrPSc detection by immunohistochemistry of Western blotting. The impact of TSEs on public and animal health in the last decades was originated, mainly, by the BSE epidemic which affected United Kingdom in the nineties. This epidemic was attributed to the enrichment of cows food with proteins derived from scrapie-infected sheep. Due to the inter-specific transmissibility of prions, cows became infected from consumption of cow-derived food. CJD has a sporadic origin in 85% of cases. This origin is associated to the presence of residual prions into the brain or to punctual mutations in the prion protein gene (PRNP) or to a spontaneous PrP conversion due to physical or chemical environmental changes. The rest of CJD cases have an inherited or an iatrogenic transmission.The general purpose of this thesis is the study of TSEs directed to increase knowledge about cellular and molecular mechanisms involved in the neuropathology of prion diseases. It can be assumed that the multiplication and accumulation of prions into the CNS are likely the causes of TSEs, but also that mechanisms associated to neuropathologycal alterations linked to prion pathology have probably a multifactor origin. In this scenario, the alterations in neurotransmission and the dysfunction of many groups of proteins related to cell survival are considered crucial in the development of prion diseases and their neuropathological features. Giving some consideration to these observations, this thesis has been focused in the study of the role of some groups of proteins in neurotransmission, spongiform change and neuron loss. More specifically, we have studied signalling pathways linked to glutamate and adenosine transmission, water channel brain aquaporins in relation with vacuolization and spongiform change, and MAPKs signaling in relation with neurodegeneration. All these studies have been done on human cerebral cortex from neurological post-mortem material of CJD cases and on the cerebral cortex of BSE-infected PrP-bovine transgenic mice at different stages of disease progression. The results obtained show, first of all, impaired group I metabotropic glutamate transmission and also increased adenosine A1 receptor signaling in the cerebral cortex of CJD cases and, on the other hand, in the cerebral cortex of a BSE murine model with disease progression. Increased adenosine A1 receptor levels could be a response to neuronal damage due to the neuroprotective role of these receptors into the brain. In addition, we have found an increased AQP1 and AQP4 expression in the cerebral cortex of CJD cases and in the cortex of a BSE murine model with disease progression. Increased AQPs expression in brain could be associated with abnormal cell homeostasis and with the formation of vacuoles which can lead to spongiform change. Finally, we have also found decreased c-fos and CREB levels, in both inactivated and activated forms, in frontal cortex of CJD cases and also in the cerebral cortex of a BSE murine model with disease progression. Decreased c-fos and CREB transcription factors are associated with cell death and cell death, so could lead to neurodegeneration in terminal stages of CJD. Although the results presented here can improve the understanding of cellular and molecular events involved in TSEs pathology, further studies using animals and cell models would be necessary to know more exactly whether prions can lead to these alterations.

Orientador: Fernando Gomes Romero / Coorientador: Carlos Antonio Caramori / Banca: Anderson Marliere Navarro / Banca: Sergio Alberto Rupp Paiva / Resumo: Entre as complicações da cirrose, a encefalopatia hepática (EH) tem alta prevalência e interfere diretamente na qualidade de vida dos pacientes. O estado nutricional possui extrema importância para o prognóstico da doença, estando independentemente ligado a morbi-mortalidade. Por conta disso, a avaliação nutricional é fundamental para que seja realizado o diagnóstico nutricional precoce e assim se inicie o tratamento dietoterápico. No entanto, a avaliação do estado nutricional desses pacientes é um desafio, porque muitas das ferramentas utilizadas na população saudável podem ter seus resultados afetados pela retenção hídrica e pela depleção muscular, bastante comuns em cirróticos. A dietoterapia indicada para esses pacientes deve ser hipercalórica e hiperproteica, porém, a ingestão de proteínas é historicamente um ponto controverso do tratamento dietético. Nosso objetivo foi avaliar o estado nutricional através de diferentes métodos, a ingestão alimentar com ênfase na ingestão proteica e também a qualidade de vida de pacientes cirróticos com EH e observar a relação desses fatores entre si. O estudo foi transversal e incluiu 60 indivíduos com cirrose e EH submetidos à avaliação do consumo alimentar por recordatório de 24 horas, da qualidade de vida pelo questionário SF-36 e do estado nutricional através da bioimpedância elétrica (BIA), do exame de absorciometria por raios X de dupla energia (DEXA), da avaliação antropométrica e da força de preensão palmar (FAM). A média de idade foi 56,1 ± 12,9 anos e 61,7% dos indivíduos tinha EH clinicamente manifesta (os demais tinham a forma subclínica). Na avaliação do estado nutricional, o índice de massa corporal (IMC) detectou prevalência de sobrepeso e obesidade em 56,7% dos indivíduos e os exames de BIA e DEXA mostraram médias elevadas de porcentagem de massa gorda (29,8 ± 8,0 % e 30,1 ± 7,0 %, respectivamente). Ao mesmo tempo, outros... / Abstract: Hepatic encephalopathy (HE) has high prevalence among cirrhosis complications and has a big impact on quality of life of patients. Additionally, the nutritional status of these patients is important and independently linked to morbidity and mortality. For this reason, nutritional evaluation is essential to provide early nutrition diagnosis, allowing the start of the dietary treatment. However, the assessment of nutritional status of these patients is a challenge because many of the tools applied to the healthy population can be altered by water retention and muscle depletion, quite common in cirrhotic. These patients should receive high-calorie and high-protein diet, but the protein intake is historically a controversial point in the dietary treatment of cirrhotic individuals. The aims of this study were to evaluate the nutritional status of cirrhotic subjects with HE by different methods, investigate their food and protein intake and their quality of life, observing the relations of these factors to each other. This was a cross-sectional study that included 60 patients, whose dietary intake was assessed through 24-hour recall, quality of life evaluated using the SF-36 questionnaire and the nutritional status by bioelectrical impedance analysis (BIA), dual energy X-ray absorptiometry (DEXA), anthropometric assessment and handgrip strength (HGS). The mean age was 56.1 ± 12.9 years, and 61.7% of subjects had overt HE (the remaining patients had the subclinical form). The body mass index (BMI) detected a high prevalence of overweight and obesity (56,7%), whilst BIA and DEXA pointed a high percentage of body fat (29.8 ± 8.0 ± 7.0% and 30.1%, respectively). Other measures such as handgrip strength and thickness of the adductor pollicis muscle (APM) showed higher rates of undernourished subjects: 81.7% and 73.3%. Through the appendicular muscle mass index (AMMI), 16.7% of the sample was classified as sarcopenic and 7.4% with sarcopenic ... / Mestre

Resumo não disponível

Introdução: Os potenciais evocados auditivos e visuais são propostos como exames úteis no diagnóstico da encefalopatia hepática subclínica. Entretanto não existem estudos demonstrando a sua utilidade na população de pacientes pediátricos. Este estudo foi realizado na tentativa de avaliar diferentes tipos de potenciais na detecção da encefalopatia hepática subclínica na população pediátrica candidata a transplante hepático. Métodos: Realizou-se um estudo de caso controle onde potenciais evocados auditivos e visuais foram realizados em 15 pacientes pediátricos candidatos a transplante hepático que não apresentavam sinais clínicos de encefalopatia hepática. As latências de onda obtidas, nesses exames, foram comparadas com 16 controles saudáveis com faixas etárias similares. Exames laboratoriais de função hepática e eletroencefalograma foram, também, realizados para examinar as suas correlações com os resultados dos potenciais evocados. Resultados: Não foram encontradas diferenças, estatisticamente significativas entre os pacientes e os controles nos potenciais evocados auditivos, porém no potencial evocado visual, os pacientes candidatos a transplante hepático demonstraram latências N1 (N75) significativamente prolongadas quando comparadas com os controles. Não houve atraso significativo nas outras ondas. Por outro lado, latências prolongadas no potencial evocado auditivo tiveram uma correlação positiva com anormalidades no eletroencefalograma, apenas entre crianças com patologia hepática. Tal correlação não foi observada no potencial evocado visual. Conclusões: Os potenciais evocados podem ser usados na detecção de alterações relacionadas à encefalopatia hepática nos pacientes pediátricos, todavia outros estudos são necessários para determinar as suas especificidades e sensibilidades.

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Clinicamente pode se apresentar como sonolência, agitação, delírium e coma. A presença da EAS está associado a maior mortalidade e pior prognóstico. Muitos pacientes apresentam dano cognitivo a médio e longo prazo que pode ser irreversível. Neste trabalho, padronizamos o modelo de injeção de fezes intraperitoneal em camundongos Swiss para facilitar o estudo da EAS. No modelo utilizado podemos caracterizar o choque com queda da pressão arterial 6 e 24h após a indução da sepse, disfunção metabólica caracterizada pelo aumento de lactato, disfunção hepática e renal com aumento de uréia, creatinina, TGO e TGP em 24h. a resposta inflamatória foi caracterizada pelo aumento de citocinas plasmática e no líquido peritoneal. IL-6 e MIP-1\03B1 aumentaram em 6h e24h tanto no plasma quanto no líquido peritoneal. IL-1\03B2, citocina de liberação precoce, teve aumento no plasma nas primeiras 6h. Leucócitos totais, mononucleares e neutrófilos mais evidente em 24h. Dano cognitivo foi verificado em animais sobreviventes após 10 dias do insulto da sepse Observamos aumento no consumo de oxigênio pelo córtex cerebral em 6h e seguido de queda em 24h. Houve aumento na captação de glicose pelo cérebro tanto em 6h e 24h. Aumento no dano oxidativo foi verificado a partir do aumento de TBARS em 6h nas regiões pré frontal, estriado, córtex e cerebelo. Concluímos que o modelo de injeção de fezes intraperitoneal é capaz de reproduzir a sepse clínica nos aspectos inflamatórios e de disfunção orgânica. O modelo também foi capaz de reproduzir a EAS com dano cognitivo, alterações no consumo de oxigênio pela mitocôndria, no metabolismo da glicose e de estresse oxidativo no cérebro. Mudanças no metabolismo energético, associado a aumento no consumo de glicose pelo córtex cerebral, além da resposta inflamatória propiciaram o estresse oxidativo. O conjunto de alterações observadas pode justificar o desenvolvimento de danos cognitivo persistente observado tanto neste modelo quanto na clínica / Sepsis and multiple organ dys function syndrome represent a clinical problem of great importance, mainly due to its high incidence in critical patients and its high mortality. Although therapeutic measures have been able to reduce mortality, many sepsis survivors are not able to regain their usual activities. Experimental trials in animals are an important tool to study the pathophysiology and the treatment of sepsis. The sepsis associated encephalopathy is often the first organ dysfunction to arise. Clinically it may present as drowsin ess, agitation, delirium and coma. The presence of sepsis associated encephalopathy is associated with increased mortality and worse prognosis. Many patients persist with cognitive impairment that may be irreversible. In this study, we establishe d a model of abdominal sepsis in mice that facilitates the study of sepsis associated encephalopathy. From this model we detected cognitive impairment on the animals that survived sepsis, and acute changes related to sepsis associated encephalopathy as mit ochondrial dysfunction, metabolic changes and oxidative damage. This model is characterized by the drop of blood pressure 6 and 24h after induction of sepsis, increased blood lactate and increased urea, creatinine, AST and ALT at 24 hours. Inflamation was characterized by increased inflammatory cytokines in plasma and peritoneal fluid. IL - 6 and MIP - 1α increased at 6h and 24h in both plasma and peritoneal fluid. IL - 1β, an early release cytokine, was increased in plasma on the first 6h. Total leukocytes, mon onuclear cells and neutrophils decreased in plasma during the first 6 hours with a tendency to recovery at 24 hours. Peritoneal fluid leukocytes, mononuclear cells and neutrophils increased markebly at 24h. We observed an increase in oxygen consumption by cerebral cortex in 6 h and then decreased at 24 hours. There was an increase in glucose uptake by the brain in both 6h and 24h. Oxidative damage was assessed by the increase of TBARS in 6h at the pre frontal regions, nucleus striatum, cortex and cerebellu m. Cognitive impairment was observed in animals that survived 10 days after the insult of sepsis. We conclude that this model was able to reproduce inflammatory aspects and organ dysfunction observed in sepsis. The model was also able to reproduce sepsis associated encephalopathy and changes in cognitive damage, oxygen consumption, glucose metabolism and oxidative damage. Bioenergetic damage associated with high glucose uptake and inflammatory response leaded to oxidative damage. These acute changes may be responsible for the cognitive damage observed at this model and on clinical practice.

As encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs), ou doenças do príon, ocorrem tanto nos animais como no homem, são responsáveis por doenças transmissíveis e hereditárias e provocam lesões degenerativas no encéfalo. A presença de uma forma protéica anormal (PrPSc), ao invés da sua forma normal (PrPC), no tecido encefálico e linforreticular é característica peculiar das EETs. Essa proteína é altamente insolúvel, resistente à degradação por proteases e se deposita eventualmente sob forma de placas amiloides na substância cinzenta. Tais placas provocam a morte maciça de neurônios e células gliais, causando vacuolização intensa no tecido afetado. A partir da implantação do programa de vigilância epidemiológica da encefopatia espongiforme bovina (EEB), coordenado pelo Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros e Outras Encefalopatias (PNCRH) do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), o Setor de Patologia Veterinária da UFRGS tem sido requisitado frequentemente para realização de exames de necropsias e de materiais de animais com suspeita de scrapie. A técnica de imuno-histoquímica (IHQ) é o teste para o diagnóstico das EETs mais específico disponível até o momento, sendo cada vez mais utilizado para diagnóstico, rastreamento, estudo da patogênese e fornecimento de informações comparativas em nível molecular. Por outro lado, a genotipagem é uma ferramenta importante no auxílio da identificação da suscetibilidade genética a scrapie, tornando o diagnóstico mais seguro, além de possibilitar a identificação de casos atípicos de scrapie, como a Nor98. Este trabalho consistiu na realização da IHQ para proteína priônica no tecido nervoso e no tecido linforreticular, como método diagnóstico de scrapie em ovinos e caprinos, associado à genotipagem dos ovinos. Entre 2009 e 2012 foram realizadas colheitas de materiais para exames de IHQ e coloração por hematoxilina-eosina em amostras de tecidos de ovinos das raças Suffolk, Santa Inês, Dorper e mestiços. As amostras foram obtidas a partir de biopsias e necropsias para diagnóstico de scrapie. Foi realizada também a genotipagem nos animais para os códons 136, 154 e 171 da proteína PRP, e em alguns casos no códon 141. Foram realizadas três repetições da IHQ para cada amostra positiva para PrPSc. O diagnóstico por IHQ no tecido linforreticular foi considerado positivo quando o material apresentou um número de, no mínimo, três folículos linfoides com centros germinativos marcados pela técnica. Entre os resultados obtidos neste trabalho pode-se incluir o primeiro diagnóstico positivo para scrapie de genótipo resistente (ARR/ARR) não Nor98, na espécie ovina no Brasil, com marcação por IHQ nas tonsilas palatínicas, terceira pálpebra e mucosa reto-anal. Este animal era pertencente a um rebanho de ovinos mestiços Sufolk, no qual foram diagnosticados mais nove animais positivos para scrapie nas tonsilas palatínicas, terceira pálpebra e mucosas reto-anal. A coleta e envio de material de vários órgãos linfoides foi considerada importante por possibilitar a confirmação da presença ou não do agente em pelo menos dois deles, reduzindo o número de casos considerados suspeitos, o risco de falsos positivos, e parte, senão a totalidade, dos casos com material insuficiente para diagnóstico. Em necropsia, a coleta de tonsilas palatínicas mostrou-se eficaz pelo seu alto índice de marcação positiva. A coleta de amostras de sangue foi importante para a realização do teste de genotipagem, permitindo avaliar o grau de resistência/susceptibilidade do animal, complementando os resultados de IHQ. / Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), the prion diseases, occurs both in animals and in humans, are responsable for a transmissible and hereditary disease, and cause degenerative lesions in the brain tissue. The presence of an abnormal protein (PrPSc), instead of its normal form (PrPC), on the nervous and lymphoreticular tissue is characteristic of TSEs. This protein is highly insoluble and resistant to degradation by proteases and eventually settles in the gray matter in the form of amyloid plaques that causes massive death of neurons and glial cells, causing intense vacuolization in the affected tissue. After the establishment of the Bovine Spongiform Encephalopathy surveillance program, coordinated by the National Rabies and Other Encephalopathies Control Program, the Setor de Patologia Veterinária of UFRGS has been usually required to proceed necropsy and other diagnosis in suspicious animals. The immunohistochemistry (IHC) is the most specific technique actually used to TSEs identification, being increasingly used to diagnosis, traceability, pathogenesis study and providing comparative information on the molecular level. On the other hand, genotyping is an important tool on scrapie genetic susceptibility identification, making more secure the diagnosis, beyond to enable the atypical scrapie cases identification, like Nor98. This work consisted to performing IHC to prionic protein, on nervous system and lymphoreticular tissue, as scrapie diagnostic method in sheep and goat, associate to genotyping in sheep. Sheep tissues were sampled from Suffolk, Santa Inês, Dorper and crossbreed to proceed IHC and hematoxilin-eosin staining between 2009 and 2012. The samples were obtained by biopsy and necropsy to scrapie diagnose. Genotyping of codons 136, 154 and 171 of PRP protein was performed, as well as a few of codon 141. The monoclonal antibody anti-prion F98/160.1.5 and F99/97.6.1 was used at the IHC. For each positive sample three repetitions were performed. The diagnostic by IHC at lymphoreticular tissue was considered positive when it shows at minimum three follicles with germinal centers stained. Among the obteined results, could be included the first diagnostic of scrapie not Nor98 in resistant genotype (ARR/ARR) sheep in Brazil. This animal belongs to a Suffolk sheep flock in which were diagnosed more nine scrapie positive animals showing IHC staining on tonsils, third eyelid and rectal mucosa. The sampling and dispatch of many lymphoid tissues was considered important to enable the confirmation of agent presence or not in at least two of them, reducing the number of suspicious cases, the risk of false positive, and part, if not all, of cases with insufficient material for diagnosis. At necropsy, the tonsils collecting showed efficient by the it high positive staining level. Blood sampling becomes important to proceed genotyping test, allowing measure the animal resistance/susceptibility grade, complementing the IHC results.

A encefalopatia hepática (HE) é uma desordem neuropsiquiátrica que ocorre devido à falência aguda e crônica do fígado. Os mecanismos pelos quais esta doença se desenvolve não estão completamente esclarecidos, porém acredita-se que a amônia é um dos principais fatores patofisiológicos da HE. Além disso, distúrbios no sistema de neurotransmissão GABAérgico têm sido relacionado com a HE. Para estudar os efeitos da HE e da amônia sobre o SNC, desenvolvemos nesta tese um modelo de co-cultura de neurônios GABAérgicos e astrócitos provenientes camundongos que demonstrou-se bastante reproduzível, de fácil execução e representativo da interação metabólica entre neurônios e astrócitos. Também, foi verificado que a amônia exerce um papel deletério para o metabolismo energético do sistema neurotransmissor GABAérgico. As coculturas de neurônios GABAérgicos e astrócitos quando expostos à altas concentrações de amônia, apresentaram o aumento da glicólise e da atividade do ciclo de Krebs. Além disso, foi constatado que os processos de detoxificação de amônia estavam bastante ativos, demonstrados pelo aumento das concentrações intracelulares e extracelulares de glutamina. A síntese e liberação de alanina também se encontrou aumentada, e seu papel como um agente detoxificante de amônia pode ser fundamental para os neurônios GABAérgicos. A síntese de GABA também apresentou-se alterada tanto no modelo de HE em ratos submetidos à ligação do ducto biliar (BDL), como também nas co-culturas de neurônios GABAérgicos e astrócitos expostos à amônia. Detectou-se que em ambos os modelos a síntese de GABA que envolve o ciclo de Krebs estava favorecida, quando comparada com aquela que ocorre sem o envolvimento do ciclo de Krebs. O que exatamente significa esta alteração nas rotas síntese de GABA ainda não está esclarecido, porém sabe-se que o GABA sintetizado via o ciclo de Krebs é aquele que está relacionado ao “pool” vesicular deste neurotransmissor inibitório. Empregando o modelo BDL, também estudamos os efeitos da HE sobre parâmetros comportamentais e cognitivos. Demonstramos que os animais BDL apresentam prejuízos na organização espacial e temporal das atividades locomotora e exploratória, como também na memória de curta duração para na tarefa de reconhecimento de objeto. De uma maneira geral, o trabalho desenvolvido nesta tese traz novas informações sobre os processos neuroquímicos e comportamentais envolvidos na HE que podem contribuir para o entendimento dos mecanismos patofisiológicos desta doença. / Hepatic encephalopathy (HE) is a neuropsychiatric disorder which arises due to acute or chronic liver disease. The mechanisms by which this disease develops are still not completely understood, however, it is well described that ammonia plays a pivotal role in the pathophysiology of HE. Moreover, disturbances in the GABAergic neurotransmitter system have been related to the development of HE. Aiming to study the effects of ammonia and HE in the SNC, in this thesis we standardized a model of co-culture of GABAergic neurons and astrocytes obtained from mouse. It was shown that the co-culture system was very reproducible, easy to be performed and representative of the neuronal-astrocytic interaction. The work here developed also showed that ammonia was detrimental for the energy metabolism of the GABAergic neurons and astrocytes. The co-cultures when incubated with ammonia had an increase in glycolysis and TCA cycle activity. Moreover, it was demonstrated that the detoxifying processes were highly active during hyperammonemia, i.e. increased synthesis and release of glutamine. Alanine synthesis was also increased during incubation with ammonia, and we suggest that its synthesis and release might be fundamental for the detoxification of GABAergic neurons. In another study of this thesis, we demonstrate that GABA synthesis was altered both in co-cultures of neurons and astrocytes exposed to ammonia, as well as in brain of rats with HE induced by bile duct ligation (BDL). In both systems studied, GABA synthesis via TCA cycle was favored, when compared to the one which occurs without TCA cycle involvement.To each extent this altered GABA synthesis influences the GABAergic system is not clear, however, it is known that GABA synthesized via TCA cycle is the pool related to the vesicular GABA pool. In addition, employing the BDL model, we studied the effect of HE on behavioral and cognitive parameters. The BDL rats showed impairment of spatial-temporal organization of the locomotor and exploratory activities and also in short term memory during the object memory recognition task. Therefore, the work developed during this thesis brings new information about the neurochemical and behavioral processes involved in HE, which can contribute for the understanding of the pathophysiologycal mechanisms of this disease.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:22:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-11. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:28:39Z : No. of bitstreams: 1 000851629.pdf: 2433691 bytes, checksum: 15d23aa68fa6e2409553220bd1136b2b (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Entre as complicações da cirrose, a encefalopatia hepática (EH) tem alta prevalência e interfere diretamente na qualidade de vida dos pacientes. O estado nutricional possui extrema importância para o prognóstico da doença, estando independentemente ligado a morbi-mortalidade. Por conta disso, a avaliação nutricional é fundamental para que seja realizado o diagnóstico nutricional precoce e assim se inicie o tratamento dietoterápico. No entanto, a avaliação do estado nutricional desses pacientes é um desafio, porque muitas das ferramentas utilizadas na população saudável podem ter seus resultados afetados pela retenção hídrica e pela depleção muscular, bastante comuns em cirróticos. A dietoterapia indicada para esses pacientes deve ser hipercalórica e hiperproteica, porém, a ingestão de proteínas é historicamente um ponto controverso do tratamento dietético. Nosso objetivo foi avaliar o estado nutricional através de diferentes métodos, a ingestão alimentar com ênfase na ingestão proteica e também a qualidade de vida de pacientes cirróticos com EH e observar a relação desses fatores entre si. O estudo foi transversal e incluiu 60 indivíduos com cirrose e EH submetidos à avaliação do consumo alimentar por recordatório de 24 horas, da qualidade de vida pelo questionário SF-36 e do estado nutricional através da bioimpedância elétrica (BIA), do exame de absorciometria por raios X de dupla energia (DEXA), da avaliação antropométrica e da força de preensão palmar (FAM). A média de idade foi 56,1 ± 12,9 anos e 61,7% dos indivíduos tinha EH clinicamente manifesta (os demais tinham a forma subclínica). Na avaliação do estado nutricional, o índice de massa corporal (IMC) detectou prevalência de sobrepeso e obesidade em 56,7% dos indivíduos e os exames de BIA e DEXA mostraram médias elevadas de porcentagem de massa gorda (29,8 ± 8,0 % e 30,1 ± 7,0 %, respectivamente). Ao mesmo tempo, outros... / Hepatic encephalopathy (HE) has high prevalence among cirrhosis complications and has a big impact on quality of life of patients. Additionally, the nutritional status of these patients is important and independently linked to morbidity and mortality. For this reason, nutritional evaluation is essential to provide early nutrition diagnosis, allowing the start of the dietary treatment. However, the assessment of nutritional status of these patients is a challenge because many of the tools applied to the healthy population can be altered by water retention and muscle depletion, quite common in cirrhotic. These patients should receive high-calorie and high-protein diet, but the protein intake is historically a controversial point in the dietary treatment of cirrhotic individuals. The aims of this study were to evaluate the nutritional status of cirrhotic subjects with HE by different methods, investigate their food and protein intake and their quality of life, observing the relations of these factors to each other. This was a cross-sectional study that included 60 patients, whose dietary intake was assessed through 24-hour recall, quality of life evaluated using the SF-36 questionnaire and the nutritional status by bioelectrical impedance analysis (BIA), dual energy X-ray absorptiometry (DEXA), anthropometric assessment and handgrip strength (HGS). The mean age was 56.1 ± 12.9 years, and 61.7% of subjects had overt HE (the remaining patients had the subclinical form). The body mass index (BMI) detected a high prevalence of overweight and obesity (56,7%), whilst BIA and DEXA pointed a high percentage of body fat (29.8 ± 8.0 ± 7.0% and 30.1%, respectively). Other measures such as handgrip strength and thickness of the adductor pollicis muscle (APM) showed higher rates of undernourished subjects: 81.7% and 73.3%. Through the appendicular muscle mass index (AMMI), 16.7% of the sample was classified as sarcopenic and 7.4% with sarcopenic ...

A encefalopatia hepática (HE) é uma desordem neuropsiquiátrica que ocorre devido à falência aguda e crônica do fígado. Os mecanismos pelos quais esta doença se desenvolve não estão completamente esclarecidos, porém acredita-se que a amônia é um dos principais fatores patofisiológicos da HE. Além disso, distúrbios no sistema de neurotransmissão GABAérgico têm sido relacionado com a HE. Para estudar os efeitos da HE e da amônia sobre o SNC, desenvolvemos nesta tese um modelo de co-cultura de neurônios GABAérgicos e astrócitos provenientes camundongos que demonstrou-se bastante reproduzível, de fácil execução e representativo da interação metabólica entre neurônios e astrócitos. Também, foi verificado que a amônia exerce um papel deletério para o metabolismo energético do sistema neurotransmissor GABAérgico. As coculturas de neurônios GABAérgicos e astrócitos quando expostos à altas concentrações de amônia, apresentaram o aumento da glicólise e da atividade do ciclo de Krebs. Além disso, foi constatado que os processos de detoxificação de amônia estavam bastante ativos, demonstrados pelo aumento das concentrações intracelulares e extracelulares de glutamina. A síntese e liberação de alanina também se encontrou aumentada, e seu papel como um agente detoxificante de amônia pode ser fundamental para os neurônios GABAérgicos. A síntese de GABA também apresentou-se alterada tanto no modelo de HE em ratos submetidos à ligação do ducto biliar (BDL), como também nas co-culturas de neurônios GABAérgicos e astrócitos expostos à amônia. Detectou-se que em ambos os modelos a síntese de GABA que envolve o ciclo de Krebs estava favorecida, quando comparada com aquela que ocorre sem o envolvimento do ciclo de Krebs. O que exatamente significa esta alteração nas rotas síntese de GABA ainda não está esclarecido, porém sabe-se que o GABA sintetizado via o ciclo de Krebs é aquele que está relacionado ao “pool” vesicular deste neurotransmissor inibitório. Empregando o modelo BDL, também estudamos os efeitos da HE sobre parâmetros comportamentais e cognitivos. Demonstramos que os animais BDL apresentam prejuízos na organização espacial e temporal das atividades locomotora e exploratória, como também na memória de curta duração para na tarefa de reconhecimento de objeto. De uma maneira geral, o trabalho desenvolvido nesta tese traz novas informações sobre os processos neuroquímicos e comportamentais envolvidos na HE que podem contribuir para o entendimento dos mecanismos patofisiológicos desta doença. / Hepatic encephalopathy (HE) is a neuropsychiatric disorder which arises due to acute or chronic liver disease. The mechanisms by which this disease develops are still not completely understood, however, it is well described that ammonia plays a pivotal role in the pathophysiology of HE. Moreover, disturbances in the GABAergic neurotransmitter system have been related to the development of HE. Aiming to study the effects of ammonia and HE in the SNC, in this thesis we standardized a model of co-culture of GABAergic neurons and astrocytes obtained from mouse. It was shown that the co-culture system was very reproducible, easy to be performed and representative of the neuronal-astrocytic interaction. The work here developed also showed that ammonia was detrimental for the energy metabolism of the GABAergic neurons and astrocytes. The co-cultures when incubated with ammonia had an increase in glycolysis and TCA cycle activity. Moreover, it was demonstrated that the detoxifying processes were highly active during hyperammonemia, i.e. increased synthesis and release of glutamine. Alanine synthesis was also increased during incubation with ammonia, and we suggest that its synthesis and release might be fundamental for the detoxification of GABAergic neurons. In another study of this thesis, we demonstrate that GABA synthesis was altered both in co-cultures of neurons and astrocytes exposed to ammonia, as well as in brain of rats with HE induced by bile duct ligation (BDL). In both systems studied, GABA synthesis via TCA cycle was favored, when compared to the one which occurs without TCA cycle involvement.To each extent this altered GABA synthesis influences the GABAergic system is not clear, however, it is known that GABA synthesized via TCA cycle is the pool related to the vesicular GABA pool. In addition, employing the BDL model, we studied the effect of HE on behavioral and cognitive parameters. The BDL rats showed impairment of spatial-temporal organization of the locomotor and exploratory activities and also in short term memory during the object memory recognition task. Therefore, the work developed during this thesis brings new information about the neurochemical and behavioral processes involved in HE, which can contribute for the understanding of the pathophysiologycal mechanisms of this disease.