Bostrychia tenella, proveniente dos costões rochosos da Praia Dura, no Estado de São Paulo. Para atingir este objetivo, foram realizados culturas isoladas dos microrganismos e a co-cultura entre o fungo T68 e a cianobactéria CENA139; técnicas de extração por partição volume/volume; métodos cromatográficos como cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), bem como técnicas espectroscópicas e espectrométricas de RMN 1-D e 2-D, CL-EM, CG-EM, além de desreplicação (utilizando o banco de dados MarinLit® e o Dicionário de Produtos Naturais. Foram isoladas três substâncias do fungo estudado: Esterigmatocistina, T68ARf60_a e T68ARf60_b. A micotoxina esterigmatocistina foi isolada também a partir da co-cultura entre o fungo e a cianobactéria. Este trabalho mostrou que houve interações ecológicas competitivas na cultura mista entre Cyanobium sp. CENA139 e o fungo T68, resultando na prevalência da cultura fúngica. Para finalizar, este trabalho avaliou a atividade biológica dos extratos brutos das culturas isoladas e co-cultura, não apresentando atividade antimicrobiana. Entretanto, o extrato bruto T68 mostrou-se fototóxico nos ensaios de fototoxicidade e a substância isolada esterigmatocistina foi citotóxica e fotoxóxica no mesmo ensaio, além de exercer citotoxicidade frente à linhagem tumoral HepG2 no ensaio de citotoxicidade MTT. / This study had as main objective the evaluation of the chemical and biological profiles of two strains of microorganisms, the cyanobacteria Cyanobium sp. CENA139, from Ilha do Cardoso mangroves, São Paulo State, and the endophytic fungus T68, Xylariaceae family, isolated from the red algae Bostrychia tenella, from the rocky shores at Praia Dura, São Paulo State. To accomplish this objective, we performed isolated cultures of the microorganisms and the co-culture between the fungus T68 and the cyanobacteria CENA139; partition extraction techniques; chromatographic methods such as thin layer chromatography and high performance liquid chromatography. Also, we performed spectroscopic and spectrometric techniques of NMR 1-D and 2-D, LC-MS, GC-MS, besides dereplication using data sources as MarinLit® and the Dictionary of Natural Products. Three compounds were isolated from the endophytic fungus culture: Sterigmatocystin, T68ARf60_a and T68ARf60_b. The mycotoxin sterigmatocystin was also isolated from the co-culture. This study showed that there was competitive ecological interactions between Cyanobium sp. CENA139 and the fungus T68 in the co-culture, resulting in the prevalence of the fungal culture. Finally, this study evaluated the biological potential of the crude extract from both isolated cultures and the co-culture, not exerting antimicrobial activity. Nevertheless, the T68 crude extract was shown to be phototoxic on the phototoxicity assays and the isolated sterigmatocystin was both cytotoxic and phototoxic in the same assay, besides exerting cytotoxicity on the tumor cell line HepG2 in the MTT assay.

Submitted by William Justo Figueiro (williamjf) on 2015-07-06T23:27:47Z No. of bitstreams: 1 09a.pdf: 771261 bytes, checksum: c8d36f36fd0e9b6396c5bad8e1ea3681 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-06T23:27:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 09a.pdf: 771261 bytes, checksum: c8d36f36fd0e9b6396c5bad8e1ea3681 (MD5) Previous issue date: 2014 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / UNISINOS - Universidade do Vale do Rio dos Sinos / Microrganismos vivendo no interior dos tecidos das plantas sem causar efeitos prejudiciais visíveis de sua presença são chamados endofíticos. As bactérias endofíticas podem promover o crescimento das plantas de várias maneiras: através da secreção de reguladores de crescimento vegetal, pela solubilização de fosfato, entre outras. Na busca de práticas agrícolas ambientalmente sustentáveis, tem sido dada considerável atenção à fixação biológica de nitrogênio atmosférico. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar, através de métodos dependentes de cultivo, a ocorrência de bactérias endofíticas em colmos e folhas de duas amostras das variedades “RG 121” e “RG 900” de arroz irrigado, num sistema de cultivo convencional. Foram coletadas plantas de arroz de duas variedades na Estação Experimental do Arroz, do Instituto Rio Grandense do Arroz (EEA-IRGA), Cachoeirinha/RS, no ano agrícola 2012/2013. As plantas coletadas em campo foram submetidas à desinfecção superficial, seguida do isolamento e cultivo das bactérias endofíticas em meios de cultura semi-sólidos, livres de nitrogênio: NFb (Azospirillum brasilense/A. lipoferum), JNFb (Herbaspirillum seropedicae/H. rubrisubalbicans) e LGI-P (Gluconacetobacter diazotrophicus). Ao final desses procedimentos, foram obtidos 190 isolados bacterianos, os quais agruparam-se, de acordo com suas características fenotípicas, em 29 morfotipos. A partir disso, o padrão de distribuição dos morfotipos entre oito condições foi avaliado por Análise de Correspondência Destendenciada (DCA). As oito condições foram: C1 = amostra (planta) 1, variedade “RG 121”, colmos; C2 = amostra 1, variedade “RG 121”, folhas; C3 = amostra 1, variedade “RG 900”, colmos; C4 = amostra 1, variedade “RG 900”, folhas; C5 = amostra (planta) 2, variedade “RG 121”, colmos; C6 = amostra 2, variedade “RG 121”, folhas; C7 = amostra 2, variedade “RG 900”, colmos; C8 = amostra 2, variedade “RG 900”, folhas. Os dois primeiros eixos da DCA explicaram 28,5 % da variância total do conjunto de dados - 23,9 % de explicação somente pelo eixo 1. Ainda, foi realizada uma Análise de Componentes Principais (PCA) na tentativa de estabelecer quais morfotipos melhor explicam as diferenças observadas entre as condições. Deste modo, os eixos 1 e 2 da PCA tiveram uma proporção de explicação acumulada correspondente a 45,61 %, sendo o eixo 1 responsável por 25,91 % destes. Por fim, em função do número de isolados obtidos por grupo fenotípico, pôde-se calcular o índice de diversidade de Shannon-Weaver (H’), que relaciona a riqueza e uniformidade de espécies (morfotipos) para cada área (condição) em estudo. Estes foram testados par-a-par pelos métodos de bootstrapping e permutação quanto a possíveis diferenças significativas. De modo que valores de H’ estatisticamente diferentes apresentados por algumas das combinações de condições puderam ser relacionados à amostra (planta), à estrutura vegetal (colmos e folhas) e à variedade, isolada ou conjuntamente. O crescimento bacteriano em meios de cultura livres de nitrogênio, em condições microaerofílicas, infere a ocorrência da capacidade de fixação biológica de nitrogênio. / Microorganisms living within the tissues of plants without causing visible detrimental effects of their presence are known as endophytes. The endophytic bacteria can promote plant growth in various ways: by secreting plant growth regulators, by phosphate solubilization, among others. In pursuit of environmentally sustainable agricultural practices, considerable attention has been given to the biological nitrogen fixation. Thus, the aim of this study was to evaluate, by culture-dependent methods, the occurrence of endophytic bacteria in stems and leaves of two samples of varieties “RG 121” e “RG 900” of irrigated rice, on a conventional cropping system. Rice plants from two varieties were collected in the Estação Experimental do Arroz, from Instituto Riograndense do Arroz (EEA-IRGA), Cachoeirinha/RS, in the agricultural year 2012/2013. Plants collected in the field were submitted to surface disinfection, followed by isolation and cultivation of endophytic bacteria in semisolid, nitrogen-free, culture media: NFb (Azospirillum brasilense/A. lipoferum), JNFb (Herbaspirillum seropedicae/H. rubrisubalbicans) and LGI-P (Gluconacetobacter diazotrophicus). At the end of these procedures, 190 bacterial isolates were obtained, which were grouped, according to their phenotypic characteristics, in 29 morphotypes. From this, the pattern of distribution of morphotypes in eight conditions was assessed by Detrended Correspondence Analysis (DCA). The eight conditions were: C1 = sample (plant) 1, variety "RG 121", stems; C2 = sample 1, variety "RG 121", leaves; C3 = sample 1, variety "RG 900", stems; C4 = sample 1, variety "RG 900", leaves; C5 = sample (plant) 2, variety "RG 121", stems; C6 = sample 2, variety "RG 121", leaves; C7 = sample 2, variety "RG 900", stems; C8 = sample 2, variety "RG 900", leaves. The first two axes of DCA explained 28.5 % of the total variance of the data set - 23.9 % of explanation only by axis 1. In addition, a Principal Components Analysis (PCA) was performed in attempt to establish which morphotypes best explain the observed differences between the conditions. Thus, the axes 1 and 2 of the PCA had a proportion of accumulated explanation corresponding to 45.61 %, being the axis 1 responsible for 25.91 % of them. Finally, according to the number of isolates obtained by phenotypic group, the Shannon-Weaver diversity index (H’) were calculated, which relates the richness and evenness of species (morphotypes) for each area (condition) in study. These were tested pair-to-pair by bootstrapping and permutation methods for possible significant differences. Thus, statistically different values of H' presented by some of the combinations of conditions could be related to the sample (plant), plant structure (stems and leaves) and variety, individually or together. The bacterial growth in nitrogen-free culture media, under microaerophilic conditions, implies the occurrence of biological nitrogen fixation capacity.

Os organismos marinhos constituem uma fonte potencial de metabólitos secundários biologicamente ativos. Neste contexto, os micro-organismos isolados de algas marinhas, dentre eles fungos endofíticos, representam alvos para a pesquisa de novas substâncias com potencial farmacológico pronunciado. Substâncias naturais provenientes de espécies de fungos associados às algas marinhas vêm sendo bastante utilizadas em formulações fotoprotetoras devido à ação antioxidante e ao potencial contra a radiação solar. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo a investigação biológica e química dos fungos endofíticos marinhos pertencentes à família Xylariaceae, o Annulohypoxylon stygium, o Cladosporium sp. e o Acremonium implicatum (Hypocreaceae). A princípio, foi realizado um screening para avaliar a absorção de luz ultravioleta na faixa do UVA e UVB pelos extratos obtidos em escala piloto destes fungos endofíticos associados às algas marinhas. O extrato do fungo A. stygium apresentou intensa absorção na região do UV, mostrando-se promissor para a produção de metabólitos secundários com ação fotoprotetora. Além do ensaio proposto, foi realizada a avaliação do potencial antibacteriano e antifúngico da espécie A. stygium. O estudo químico em escala ampliada deste fungo proporcionou o isolamento e identificação de uma substância inédita da classe derivada da 2,5- dicetopiperazina, 3-benzilideno-2-metil-hexahidro-pirrolo [1,2-?] pirazina-1,4-diona (Sf3), e além desta, foram isolados mais quatro metabólitos como, os diasteroisômeros 1-fenil-1,2- propanediol (Sd2) e 1-fenil-1,2-propanediol (Sd3), 1,3-benzodioxole-5-metanol (Sc1), 1,2- propanodiol-1-(1,3-benzodioxol-5-il) (Se1). Ainda foi possível a desreplicação de substâncias via cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), entre elas o ácido palmítico, palmitato de metila, ácido metil linoléico, ácido oléico, álcool benzílico e o piperonal. Quanto ao estudo da atividade biológica, não foi observado potencial antibacteriano e antifúngico para os extratos e frações do fungo. Entretanto, notouse um potencial como fotoprotetor in vitro para as frações n-Hexano/AcOEt (2:3) e n- Hexano/AcOEt (1:4) obtidas a partir do extrato do cultivo de 28 dias do fungo A. stygium, extraído com solventes diclorometano/metanol (CH2Cl2/MeOH 2:1) e para a substância (Sf3) isolada do mesmo. Desta forma, o estudo químico e biológico do fungo Annulohypoxylon stygium demonstrou potencial para a produção de metabólitos secundários com atividade fotoprotetora, visto que uma estrutura inédita com esta atividade foi isolada e identificada como produto natural. / Marine organisms consist of a potential source of biologically active secondary metabolites. In this context, the microorganisms isolated from marine algae, including fungal endophytes represent targets for the search of new substances with pronounced pharmacological potential. Natural substances from fungal species associated with marine algae, have been widely used in sunscreens formulations due to the antioxidant action and the potential against solar radiation. Thus, this study aimed to research biological and chemical profile of marine endophytic fungi belonging to the Xylariaceae family, the Annulohypoxylon stygium, the Cladosporium sp. and Acremonium implicatum (Hypocreaceae). First of all, a screening was performed to evaluate the absorption of ultraviolet light in the range of UVA and UVB by extracts obtained in pilot scale of these endophytic fungi associated with seaweed. The fungus extract A. stygium showed intense absorption in the UV region, being promising for the production of secondary metabolites with sunscreen action. In addition to the proposed test was performed to evaluate the antibacterial and antifungal potential of the species A. stygium. The chemical studies on increased scale of this fungus provided the isolation and identification of a novel compound of the class derived from 2,5-diketopiperazine, 3- benzylidene-2-methylhexahydropyrrolo [1,2-?] pyrazine-1,4-dione (Sf3), and beyond, four metabolites were isolated like of the diasteroisomers 1-phenyl-1,2-propanediol (Sd2) and 1- phenyl-1,2-propanediol (Sd3), 1,3-benzodioxole-5-methanol (Sc1), 1,2-propanodiol-1-(1,3- benzodioxol-5-il) (Se1). Furthermore was possible to dereplicate substances by means of gas chromatography-mass spectrometry (CG-MS) analyses: palmitic acid, methyl palmitate, methyl linoleic acid, oleic acid, benzyl alcohol and piperonal. Regarding to biological activity evaluation, it was not observed antibacterial and antifungal potential for extracts and fractions of the fungus. However, it was observed as a potential sunscreen in vitro for fractions n-Hexane/AcOEt (2:3) and n-Hexane/AcOEt (1:4) obtained from extract after 28 days growth culture of the fungus A. stygium. The mycelia were extracted with solvents dichloromethane/methanol (CH2Cl2/MeOH 2:1) and the compound Sf3 was isolated from the same extract. Thus, the chemical and biological study of the fungus Annulohypoxylon stygium demonstrated the potential for production of secondary metabolites with sunscreen activity, since a novel structure displaying this potential was isolated and identified as a natural product.

Estimativas apontam haver no mundo 12 milhões de pessoas infectadas por diferentes espécies de Leishmania, estando 350 milhões de pessoas em situação de risco. A leishmaniose é um grave problema de saúde pública mundial e entretanto não há tratamentos eficientes para o controle desta doença. Fungos endofíticos são fontes promissoras de metabólitos secundários bioativos e isso se deve em parte a sua estreita interação com as plantas hospedeiras. Extratos de culturas do fungo Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc., isolado como endofítico de Smallanthus sonchifolius (yacon), demonstrou em estudos anteriores ser uma fonte promissora de metabólitos secundários distintos, apresentando atividades antibacteriana, antifúngica, citotóxica para linhagens de células tumorais e antiparasitária. Devido a elevada atividade antileishmania detectada, culturas do fungo Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. foram realizadas em duas etapas distintas de cultivo. Obteve-se 1,47g de extrato AcOEt, o qual foi posteriormente fracionado por cromatografia líquida a vácuo. As frações resultantes foram fracionadas por cromatografia líquida clássica e cromatografia líquida de alta eficiência em escala preparativa. Dez substâncias foram isoladas, oito a partir de frações bioativas e suas estruturas foram elucidadas por análises de experimentos de RMN 1D: RMN 1H, RMN 13C e DEPT e 2D: COSY 1H-1H, HMQC 1H-13C e HMBC 1H-13C. As substâncias I e III apresentaram atividade esquistossomicida, causando 100% de morte nos parasitas quando avaliadas nas concentrações de 200 e 50 ?g/mL, respectivamente. Análises por microscopia eletrônica de varredura mostraram alterações morfológicas como o possível mecanismo de ação destas substâncias. As substâncias VII e IX, que parecem ser inéditas na literatura, apresentaram atividade antileishmania com valores de CI50 de 12,54 e 3,04 ?g/mL frente Leishmania braziliensis e 8,78 e 2,87 ?g/mL frente L. chagasi, respectivamente. O presente trabalho corrobora fungos endofíticos como uma fonte promissora, ainda pouco explorada, de novos metabólitos com atividade antileishmania e esquistossomicida. / Leishmaniais affects over 12 million people and 350 million people in 88 countries are at risk. Recognised as a major public health problem, leishmaniasis causes high morbidity and mortality levels. There are currently no vaccines and the available chemotherapy against leishmaniasis still suffers from high toxicity, serious side effects, require long-term treatment and present clinical resistance. Endophytic fungi are promising source of bioactive secondary metabolites due in part of their close interaction with the host plants. In previous studies the fungus Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc., isolated as endophytic fungus from Smallanthus sonchifolius (yacon), demonstrated to be a promising source of secondary metabolites with antibacterial, antifungal, antitumoral and antileishmanial activities. In view of the high antileishmanial activity previously detected, in the present study the endophytic fungus Arthrinium state of Apiospora montagnei was cultivated in a liquid medium under standardized culture condition, yielding 1.47 g of EtOAc extract, which was further fractionated by vacuum liquid chromatography, and the resulting fractions fractionated by liquid chromatography and high performance liquid chromatography. Ten compounds were isolated, nine from bioactive fractions. Their chemical structures were elucidated by analysis of NMR experiments 1D: RMN 1H, RMN 13C and DEPT and 2D: COSY 1H-1H, HMQC 1H-13C and HMBC 1H-13C. The substances I and III showed schistosomicidal activity, causing 100% death of the parasites when evaluated at concentrations of 200 and 50 ?g/mL, respectively. Analysis by scanning electron microscopy suggested that morphological changes are possibly the mechanism of action of these substances. Two new compounds, VII and IX, showed antileishmanial activity with IC50 values of 12.54 and 3.04 ?g/mL against Leishmania braziliensis and 8.78 and 2.87 ?g/mL against L. chagasi, respectively. The present work supports endophytic fungi as a promising source of new metabolites underexplored with antileishmanial and schistosomicidal activity.

Organismos marinhos são reconhecidos por apresentarem potencial elevado para a produção de produtos naturais com estruturas moleculares únicas. Neste âmbito marinho, os fungos endofíticos são considerados como uma fonte promissora de substâncias bioativas, apresentando moléculas oriundas do metabolismo secundário mais significativas biologicamente do que aquelas produzidas por seus hospedeiros. Dentro deste contexto, este trabalho teve como objetivo principal a avaliação dos perfis químico e biológico do fungo endofítico Aspergillus unguis isolado da alga Palmaria decipiens, proveniente da Ilha Robert, Antártica. Para análise dos metabólitos secundários produzidos por A. unguis foram utilizados métodos cromatográficos como cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), bem como técnicas espectroscópicas e espectrométricas de RMN 1-D e 2-D, CL-EM, CG-EM, inclusive para elucidação estrutural das substâncias isoladas. Todos os dados obtidos foram comparados com aqueles descritos na literatura e/ou com aqueles apresentados no software MarinLit® e o Dicionário de Produtos Naturais. Foram isoladas três substâncias do fungo estudado: Nidulina (DEP-1), pico 4-fração 8 (DEP-2) e pico 6-fração 8 (DEP-3). Todas são moléculas da classe das depsidonas, cuja nidulina já é uma molécula reportada na literatura. As outras duas são estruturas inéditas na literatura até o presente momento, uma vez que ainda não foram encontrados dados possibilitando a comparação com moléculas conhecidas. Concomitantemente, foram realizados experimentos para avaliação da atividade biológica de extratos, frações e substância isolada. As substâncias DEP-2 e DEP-3 foram submetidas para avaliação do potencial leishmanicida. As promastigotas IC50 para DEP-2 foram 68,1 ± 8,1, com índice de seletividade de 5,7, enquanto para os amastigotas o valor foi de 55,9 ± 0,6, com índice de seletividade 6,9, em comparação com os controles Amfotericina B com IC50 promastigota 3,5 ± 0,03 com índice de seletividade 6,6 e IC50 amastigotas 5,3 ± 0,2, índice de seletividade 4, 6 e Pentamidina com IC50 promastigotas 29,9 ± 0,08, índice de seletividade 1.2 e amastigotas IC50 18,2 ± 0,6, 1,9. Para DEP-3, o IC50 para promastigotas foi de 69,6 ± 0,7, com índice de seletividade 1,2. Considerando que a IC50 para amastigotas foi de 55,0 ± 0,2, com índice de seletividade 1,6, em comparação com os controles Amfotericina B com IC50 promastigote 3,48 ± 0,03, com índice de seletividade 6,6 e IC50 amastigotas 5,3 ± 0,2, índice de seletividade 4,6. Pentamidina com promastigotas IC50 29,9 ± 0,08, índice de seletividade 1,2 e amastigotas IC50 18,2 ± 0,6; índice de seletividade 1,9. O DEP-1 foi submetido para a avaliação da fotoestabilidade e fototoxicidade como considerado foto estável com uma queda na fotoestabilidade inferior a 0,1. E a DEP-2 e a DEP-3 estavam em mistura foram enviadas para análise da atividade microbiana e concluiu-se que há atividade sinérgica contra S. aureus, uma vez que o DEP-2 sozinha apresentou CIM de 100 ?g / mL e em mistura foi obtido CIM de 6,25 ?g / mL. / Marine organisms are recognized by present high potential for the production of natural products with unique molecular structures. In this context, the endophytic fungi are considered as a promising source of bioactive compounds, showing molecules from the secondary metabolism more biologically meaningful than those produced by their hosts. Within this context, this work had as main objective the evaluation of the chemical and biological profiles of the endophytic fungus Aspergillus unguis isolated from the alga Palmaria decipiens, from Robert Island, Antarctica. For analysis of secondary metabolites produced by A. unguis chromatographic methods were used as thin-layer chromatography (CCD) and high performance liquid chromatography (HPLC), as well as spectroscopic and spectrophotometric techniques such as NMR 1-D and 2-D, LC-MS, GC-MS, including for structural elucidation of isolated substances. All the data obtained were compared with those described in the literature and/or with those presented in the MarinLit ® software and the Dictionary of Natural Products. From the studied fungi, three substances were isolated: Niduline (DEP-1), peak-4 fraction-8 (DEP-2) and peak-6 fraction-8 (DEP-3). All molecules present depsidone skeleton, whose Niduline is the most molecule reported in the literature. The other two are unpublished structures in the literature up to the present time, since until now it has not yet been found enabling data for comparison with known molecules. At the same time, experiments were performed to evaluate the biological activity of extracts, fractions and isolated substance. The substances DEP-2 and DEP-3 were submitted to test to evaluate the leishmanicidal potential. The promastigotes IC50 for DEP-2 was 68.1 ± 8.1, with selectivity index was 5.7; while for amastigotes the value was 55.9 ± 0.6, with selectivity index 6.9, compared with controls Amphotericin B with IC50 promastigote 3,5 ± 0,03 with selectivity index 6.6, and IC50 amastigotes 5.3 ± 0.2; selectivity index 4.6 and Pentamidine with IC50 promastigotes 29.9 ±0.08, selectivity index 1.2 and IC50 amastigotes 18.2 ± 0.6, selectivity index 1.9. For DEP-3 the IC50 for promastigotes was 69.6±0.7, with selectivity index 1.2; whereas the IC50 for amastigotes was 55.0±0.2, with selectivity index 1.6, compared with controls Amphotericin B with IC50 promastigote 3.48 ± 0.03, with selectivity index 6.6 and IC50 amastigotes 5.3 ± 0.2, selectivity index 4.6. Pentamidine with IC50 promastigotes 29.9 ±0.08, selectivity index 1.2 and IC50 amastigotes 18.2 ± 0.6, selectivity index 1.9. DEP-1 was submitted for evaluation of photostability and phototoxicity as considered photostable with a drop in photostability of less than 0.1. Since the compounds DEP-2 and DEP-3 were sent in a mixture for analysis of the microbial activity and it was concluded that there is a synergistic activity against S. aureus, since DEP-2 alone had a MIC of 100 ?g/mL and in mixture obtained a MIC of 6.25 ?g/mL.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vera.pdf: 2531477 bytes, checksum: 5a02810a0fd91027af8891fb7a147973 (MD5) Previous issue date: 2002-02-28 / The characterization of the plasmid pLK39.was the aim of work.pLK39 was isolated from a endophytic Gram-negative, bactéria isolated from leaves form Solanum lycocarpum (Lobeira). In order to obtain a selection marker which would characterization in Escherichia coli the kanamycin, resistence gene from pUC4K. was subcloned into the PstIsite of pLK39. The characterization of PLK39 was basedon studies of stability, incompatibility, determination of the copy number and through DNA sequencing. The stability was carried out in Escherichia coli XL10 cells. Cells transformed with pLK39 were inoculated in Lúria broth containing Kanamycin (50μg/ml) during24 hours. After 24 hours of incubation one sample of the culture was in medim with and without selective pressure, and inoculated in Lúria broth without pressure médium, for 240 generations. After 240 generations 81,5% of cells maintained the plasmid, showing that pLK39is highly stable in Escherichia coli to make the incompatibility test, cells of Escherichia coli XL10 were co-transformed with pLK39/pUC18; pBR322 and pLK39/pACYC184. After 240 generations, the plasmid pLK39 iof detected in all systems used, showing the compatibility of pLK39 with the plasmids tested. The copý number pLK39 was estimated by the intensity of plasmidial bands in agarose gel, electrophoresis using a photodocumentation and analysis system (KODAK EDAS). The copý number of pLK39 was estimated as 25 copies per cell. PLK39 was digested with Sau3AI restriction and subcloned into the BamHI site of plasmid pUC18. The recombinant clones were sequenced and 1637 pb reading fragment was obtained. This sequence showed high homology with pSW200, pSW100, pEC3, pUCD5000 and pBERT, which were isolated from Gram-negative bacteria. This sequence possesses two possible genes. The ORF I showed high homology with mobB gene from plasmid pSW200 (96%), pSW100 (96%), pEC3 (94%), pUCD5000 (94%) and pBERT (87%). The ORF II showed homology with mobD gene from plasmids pSW200 (92%), pSW100 (90%), pEC3 (90%) and PUCD5000 (89%). / O objetivo deste trabalho foi caracterizar o plasmídeo pLK39. Este plasmídeo foi extraído de uma bactéria endofítica Gram-negativa, isolada da folha de Solanum Lycocarpum (Lobeira). Este plasmídeo apresenta um tamanho de aproximadamente 4,5 kb. Visando obter uma marca de seleção para permitir sua caracterização em células de Escherichia coli, foi introduzido o gene de resistência à Kanamicina, extraído do plasmídeo pUC4K. A caracterização do pLK39 foi realizada através de estudos de estabilidade, incompatibilidade, estimativa do número de cópias e através de seqüenciamento de parte do plasmídeo. A estabilidade foi testada em células de Escherichia coli XL10. Células transformadas com pLK39 foram cultivadas em meio Lúria suplementado com Kanamicina (50 μg/mL) durante 24 horas uma amostra da cultura era plaqueada em meio seletivo e em meio sem pressão seletiva parte dessa amostra foi inoculada em meio Lúria sem pressão seletiva e incubado por 24 até atingir 240 gerações. Após 240 gerações 81.5% das células mantiveram o plasmídeo, mostrando que o pLK39 é bastante estável em células de Escherichia coli. Para realização do teste de incompatibilidade, células de Escherichia coli XL10 foram co-transformadas com os plasmídeos pLK39/pUC18, pLK39/pBR322 e pLK39/pACYC184. Após 240 gerações, foi detectada a presença do plasmídeo pLK39 em todos os sistemas testados, demonstrando a compatibilidade do pLK39 com os plasmídeos testados. O número de cópias do pLK39 foi estimado através da comparação da intensidade das bandas plasmidiais, obtidas através de eletroforese em gel de agarose, realizada a partir de uma extração de plasmídeos de células de Escherichia coli XL10 transformadas com pUC18, pBR322 e pLK39. A quantificação de cada banda foi realizada utilizando o sistema de fotodocumentação e analise (KODAK EDAS). O número de cópias do pLK39 foi estimado em 25 cópias por células. O plasmídeo pLK39 foi digerido com enzima de restrição Sau3AI e sub-clonado no sítio de BamHI do plasmídeo pUC18. Os clones recombinantes foram seqüenciados. Foi obtido um fragmento com 1.637 pb. Essa seqüência apresentou uma grande homologia com os plasmídeos pSW200, pSW100, pEC3, pUCD5000 e pBERT, os quais foram isolados de diferentes bactérias Gram-negativas. A seqüência apresentou dois possíveis genes. A ORF I apresentou grande homologia com o gene mobB dos plasmídeos pSW200 (96%), pSW100 (96%), pEC3 (94%), pUCD5000 (94%) e pBERT (87%). A ORF II apresentou homologia com o gene mobD dos plasmídeos pSW200 (92%), pSW100 (90%), pEC3 (90%) e PUCD5000 (89%).

Os organismos marinhos constituem uma fonte potencial de metabólitos secundários biologicamente ativos. Neste contexto, os micro-organismos isolados de algas marinhas, dentre eles fungos endofíticos, representam alvos para a pesquisa de novas substâncias com potencial farmacológico pronunciado. Substâncias naturais provenientes de espécies de fungos associados às algas marinhas vêm sendo bastante utilizadas em formulações fotoprotetoras devido à ação antioxidante e ao potencial contra a radiação solar. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo a investigação biológica e química dos fungos endofíticos marinhos pertencentes à família Xylariaceae, o Annulohypoxylon stygium, o Cladosporium sp. e o Acremonium implicatum (Hypocreaceae). A princípio, foi realizado um screening para avaliar a absorção de luz ultravioleta na faixa do UVA e UVB pelos extratos obtidos em escala piloto destes fungos endofíticos associados às algas marinhas. O extrato do fungo A. stygium apresentou intensa absorção na região do UV, mostrando-se promissor para a produção de metabólitos secundários com ação fotoprotetora. Além do ensaio proposto, foi realizada a avaliação do potencial antibacteriano e antifúngico da espécie A. stygium. O estudo químico em escala ampliada deste fungo proporcionou o isolamento e identificação de uma substância inédita da classe derivada da 2,5- dicetopiperazina, 3-benzilideno-2-metil-hexahidro-pirrolo [1,2-?] pirazina-1,4-diona (Sf3), e além desta, foram isolados mais quatro metabólitos como, os diasteroisômeros 1-fenil-1,2- propanediol (Sd2) e 1-fenil-1,2-propanediol (Sd3), 1,3-benzodioxole-5-metanol (Sc1), 1,2- propanodiol-1-(1,3-benzodioxol-5-il) (Se1). Ainda foi possível a desreplicação de substâncias via cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), entre elas o ácido palmítico, palmitato de metila, ácido metil linoléico, ácido oléico, álcool benzílico e o piperonal. Quanto ao estudo da atividade biológica, não foi observado potencial antibacteriano e antifúngico para os extratos e frações do fungo. Entretanto, notouse um potencial como fotoprotetor in vitro para as frações n-Hexano/AcOEt (2:3) e n- Hexano/AcOEt (1:4) obtidas a partir do extrato do cultivo de 28 dias do fungo A. stygium, extraído com solventes diclorometano/metanol (CH2Cl2/MeOH 2:1) e para a substância (Sf3) isolada do mesmo. Desta forma, o estudo químico e biológico do fungo Annulohypoxylon stygium demonstrou potencial para a produção de metabólitos secundários com atividade fotoprotetora, visto que uma estrutura inédita com esta atividade foi isolada e identificada como produto natural. / Marine organisms consist of a potential source of biologically active secondary metabolites. In this context, the microorganisms isolated from marine algae, including fungal endophytes represent targets for the search of new substances with pronounced pharmacological potential. Natural substances from fungal species associated with marine algae, have been widely used in sunscreens formulations due to the antioxidant action and the potential against solar radiation. Thus, this study aimed to research biological and chemical profile of marine endophytic fungi belonging to the Xylariaceae family, the Annulohypoxylon stygium, the Cladosporium sp. and Acremonium implicatum (Hypocreaceae). First of all, a screening was performed to evaluate the absorption of ultraviolet light in the range of UVA and UVB by extracts obtained in pilot scale of these endophytic fungi associated with seaweed. The fungus extract A. stygium showed intense absorption in the UV region, being promising for the production of secondary metabolites with sunscreen action. In addition to the proposed test was performed to evaluate the antibacterial and antifungal potential of the species A. stygium. The chemical studies on increased scale of this fungus provided the isolation and identification of a novel compound of the class derived from 2,5-diketopiperazine, 3- benzylidene-2-methylhexahydropyrrolo [1,2-?] pyrazine-1,4-dione (Sf3), and beyond, four metabolites were isolated like of the diasteroisomers 1-phenyl-1,2-propanediol (Sd2) and 1- phenyl-1,2-propanediol (Sd3), 1,3-benzodioxole-5-methanol (Sc1), 1,2-propanodiol-1-(1,3- benzodioxol-5-il) (Se1). Furthermore was possible to dereplicate substances by means of gas chromatography-mass spectrometry (CG-MS) analyses: palmitic acid, methyl palmitate, methyl linoleic acid, oleic acid, benzyl alcohol and piperonal. Regarding to biological activity evaluation, it was not observed antibacterial and antifungal potential for extracts and fractions of the fungus. However, it was observed as a potential sunscreen in vitro for fractions n-Hexane/AcOEt (2:3) and n-Hexane/AcOEt (1:4) obtained from extract after 28 days growth culture of the fungus A. stygium. The mycelia were extracted with solvents dichloromethane/methanol (CH2Cl2/MeOH 2:1) and the compound Sf3 was isolated from the same extract. Thus, the chemical and biological study of the fungus Annulohypoxylon stygium demonstrated the potential for production of secondary metabolites with sunscreen activity, since a novel structure displaying this potential was isolated and identified as a natural product.

Estimativas apontam haver no mundo 12 milhões de pessoas infectadas por diferentes espécies de Leishmania, estando 350 milhões de pessoas em situação de risco. A leishmaniose é um grave problema de saúde pública mundial e entretanto não há tratamentos eficientes para o controle desta doença. Fungos endofíticos são fontes promissoras de metabólitos secundários bioativos e isso se deve em parte a sua estreita interação com as plantas hospedeiras. Extratos de culturas do fungo Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc., isolado como endofítico de Smallanthus sonchifolius (yacon), demonstrou em estudos anteriores ser uma fonte promissora de metabólitos secundários distintos, apresentando atividades antibacteriana, antifúngica, citotóxica para linhagens de células tumorais e antiparasitária. Devido a elevada atividade antileishmania detectada, culturas do fungo Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. foram realizadas em duas etapas distintas de cultivo. Obteve-se 1,47g de extrato AcOEt, o qual foi posteriormente fracionado por cromatografia líquida a vácuo. As frações resultantes foram fracionadas por cromatografia líquida clássica e cromatografia líquida de alta eficiência em escala preparativa. Dez substâncias foram isoladas, oito a partir de frações bioativas e suas estruturas foram elucidadas por análises de experimentos de RMN 1D: RMN 1H, RMN 13C e DEPT e 2D: COSY 1H-1H, HMQC 1H-13C e HMBC 1H-13C. As substâncias I e III apresentaram atividade esquistossomicida, causando 100% de morte nos parasitas quando avaliadas nas concentrações de 200 e 50 ?g/mL, respectivamente. Análises por microscopia eletrônica de varredura mostraram alterações morfológicas como o possível mecanismo de ação destas substâncias. As substâncias VII e IX, que parecem ser inéditas na literatura, apresentaram atividade antileishmania com valores de CI50 de 12,54 e 3,04 ?g/mL frente Leishmania braziliensis e 8,78 e 2,87 ?g/mL frente L. chagasi, respectivamente. O presente trabalho corrobora fungos endofíticos como uma fonte promissora, ainda pouco explorada, de novos metabólitos com atividade antileishmania e esquistossomicida. / Leishmaniais affects over 12 million people and 350 million people in 88 countries are at risk. Recognised as a major public health problem, leishmaniasis causes high morbidity and mortality levels. There are currently no vaccines and the available chemotherapy against leishmaniasis still suffers from high toxicity, serious side effects, require long-term treatment and present clinical resistance. Endophytic fungi are promising source of bioactive secondary metabolites due in part of their close interaction with the host plants. In previous studies the fungus Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc., isolated as endophytic fungus from Smallanthus sonchifolius (yacon), demonstrated to be a promising source of secondary metabolites with antibacterial, antifungal, antitumoral and antileishmanial activities. In view of the high antileishmanial activity previously detected, in the present study the endophytic fungus Arthrinium state of Apiospora montagnei was cultivated in a liquid medium under standardized culture condition, yielding 1.47 g of EtOAc extract, which was further fractionated by vacuum liquid chromatography, and the resulting fractions fractionated by liquid chromatography and high performance liquid chromatography. Ten compounds were isolated, nine from bioactive fractions. Their chemical structures were elucidated by analysis of NMR experiments 1D: RMN 1H, RMN 13C and DEPT and 2D: COSY 1H-1H, HMQC 1H-13C and HMBC 1H-13C. The substances I and III showed schistosomicidal activity, causing 100% death of the parasites when evaluated at concentrations of 200 and 50 ?g/mL, respectively. Analysis by scanning electron microscopy suggested that morphological changes are possibly the mechanism of action of these substances. Two new compounds, VII and IX, showed antileishmanial activity with IC50 values of 12.54 and 3.04 ?g/mL against Leishmania braziliensis and 8.78 and 2.87 ?g/mL against L. chagasi, respectively. The present work supports endophytic fungi as a promising source of new metabolites underexplored with antileishmanial and schistosomicidal activity.

Lipases são enzimas que catalisam a hidrólise de triacilgliceróis em ácidos graxos, mono e diacilgliceróis e glicerol. Em contraste com as esterases, lipases são ativadas apenas quando estão adsorvidas a uma interface óleo-água. Lipases têm sido amplamente utilizadas em muitos processos industriais, tais como química orgânica, formulações de detergentes e de produtos como cosméticos e farmacêuticos. A principal preocupação na produção de enzimas comerciais é a proteção da sua estabilidade em solução aquosa. A água facilita ou medeia uma variedade de vias de degradação física e química, durante as etapas de purificação, transporte e armazenamento. Por conseguinte, formulações sólidas são desenvolvidas para alcançar uma vida útil aceitável para essas substâncias. Spray drying é comumente usado como uma técnica de desidratação na indústria farmacêutica para fabricação de produtos em pó diretamente do estado líquido. No presente trabalho, a purificação e caracterização bioquímica de lipases produzidas pelo fungo endofítico Cercospora kikuchii, bem como os efeitos de adjuvantes no processo de secagem destas enzimas foram estudados. A lipase bruta foi purificada à homogeneidade através de cromatografia de interação hidrofóbica e gel filtração. A lipase foi purificada 5,54 vezes, com rendimento de 9% e a atividade específica de 223,6 U/mg. O peso molecular da enzima foi estimado em 65,1 kDa por SDS-PAGE e 73,5 kDa utilizando cromatografia de gel filtração, indicando que provavelmente trata-se de um monômero. A lipase mostrou um pH ótimo em 4,6 e uma temperatura ótima de 35°C. Cerca de 80,2% de sua atividade foi mantida após incubação a 40°C durante 2 horas. A Vmax e Km foram 10,28 mmol/min/mg de proteína e 0,03240 mM, respectivamente, utilizando pNPP como substrato. As lipases presentes no extrato bruto e as lipases ligadas ao micélio foram caracterizadas para avaliar o potencial de utilização em biocatálise. A lipases no extrato bruto apresentaram atividade máxima a 60ºC e pH 6,2, enquanto que as lipases ligadas ao micélio apresentaram atividade máxima a 50ºC e pH 5,4. Nos estudos de efeito da temperatura sobre a atividade enzimática, as lipases no extrato bruto mantiveram-se estáveis a 50°C, com 85,3% de atividade residual após 2 horas de incubação. As lipases ligadas ao micélio mantiveram pelo menos 75,1% de atividade residual após 2 horas de incubação a 80°C. Estes resultados mostram que as lipases de C. kikuchii têm propriedades cinéticas e termoestabilidade desejáveis para aplicações em biocatálise. As lipases presentes no extrato bruto foram secas em spray dryer com diferentes adjuvantes, e sua estabilidade foi avaliada. A recuperação da atividade enzimática após a secagem, com a adição de 10% de lactose, -ciclodextrina, maltodextrina, manitol, goma arábica, e trealose variou de 63 a 100%. A atividade da enzima foi totalmente perdida durante a secagem do extrato bruto na ausência de adjuvantes. A maioria dos adjuvantes utilizados manteve pelo menos 50% da atividade enzimática a 5°C e 40% a 25°C, após 8 meses de armazenagem. As lipases secas com 10% de - ciclodextrina mantiveram 72% da atividade a 5°C no mesmo período. A partir destes resultados preliminares foi realizada a otimização do processo de secagem utilizando -ciclodextrina, maltodextrina e lactose como adjuvantes. A análise estatística dos resultados experimentais permitiu a determinação das condições ótimas para a retenção da atividade enzimática (RAE), a saber: concentração de adjuvantes de secagem de 12,05%, temperatura de entrada do gás de secagem em 153,6oC e vazão do extrato enzimático alimentado de 9,36 g/min, para - ciclodextrina e maltodextrina como adjuvantes. Para lactose, o estudo mostrou que o aumento da quantidade de adjuvante de secagem e/ou diminuindo a temperatura do gás de entrada tem um efeito positivo sobre a retenção da atividade enzimática do produto seco. Após o processo de purificação foi realizada a secagem da enzima parcialmente purificada e da lipase pura, com estes três adjuvantes. A manutenção da atividade enzimática variou 90,6-100% quando foram utilizadas as condições ótimas para cada adjuvante de secagem. Concluindo, as lipases produzidas por C. kikuchii podem ser eficientemente secas por spray dryer, uma vez que a atividade enzimática foi mantida no extrato bruto, na lipase pura e na lipase semi-purificada submetidas à secagem. / Lipases are enzymes that catalyze the hydrolysis of triacylglycerols to fatty acids, mono and diacylglycerols, and glycerol. In contrast to esterases, lipases are activated only when they are adsorbed to an oilwater interface. They have been widely used in many industrial processes such as organic chemical, detergent and cleaning formulations and in products like cosmetics and pharmaceutical products. The main concern in the production of commercial enzymes is to protect their stability in aqueous solution. Water facilitates or mediates a variety of physical and chemical degradation pathways, active during protein purification, shipping and storage. Consequently, dry solid formulations are developed to achieve an acceptable protein shelf life. Spray drying is commonly used as a dehydration technique in the pharmaceutical industry for making powdery products directly from the liquid. In the present work, the purification and biochemical characterization of lipases produced by endophytic fungus Cercospora kikuchii as well as the effects of adjuvants on the spray drying process of theses enzymes were studied. The crude lipase was purified to homogeneity by hydrophobic interaction chromatography and gel filtration. The lipase purified was 5.54-fold with 9% recovery and the specific activity was 223.6. The molecular mass of the lipase was estimated to be 65.1 kDa using SDS-PAGE and 73.5 using gel filtration chromatography, indicating that the lipase is a monomer. The lipase demonstrated an optimum pH at 4.6, an optimum temperature of 35°C. About 80.2% of its activity was retained after incubation at 40°C for 2 hours. The Vmax and Km were 10.28 mol/min/mg protein and 0.03240 mM, respectively, using pNPP as substrate. The lipases present in crude extract and the mycelium-bound lipases were characterized in order to evaluate the potential for use in biocatalysis. The crude extract showed maximum activity at 60ºC and pH 6.2 while the myceliumbound lipases showed maximum activity at 50ºC and pH 5.4. In tests of the temperature effect on the enzymatic activity, the lipases in the crude extract was stable at 50°C, with 85.3% residual activity after 2 hours of incubation. The mycelium-bound lipases maintained at least 75.1% of residual activity after 2 h incubation at 80°C. These results show that the lipases of C. kikuchii have kinetic properties and stability characteristics suitable to applications in biocatalysis. The lipases present in crude extract were spray dried with different adjuvants, and their stability was evaluated. The recovery of the enzyme after drying with 10% of lactose, -cyclodextrin, maltodextrin, mannitol, gum arabic, and trehalose ranged from 63% to 100%; but the enzyme activity was lost in the absence of adjuvants. Most of the adjuvants used kept up at least 50% of the enzymatic activity at 5°C and 40% at 25°C after 8 months. The lipase dried with 10% of -cyclodextrin retained 72% of activity at 5°C. From these preliminary results the optimization of drying process using -cyclodextrin, maltodextrin and lactose as adjuvants was carried out. Statistical optimization of the experimental results allowed the determination of the processing conditions that maximized the retention of the enzymatic activity (RAE), namely: concentration of drying adjuvants of 12.05 %, inlet temperature of the drying gas of 153.6oC, and flow rate of the enzymatic extract fed to the dryer of 9.36 g/min, for the b-cyclodextrin and maltodextrin as adjuvants. For lactose as adjuvant the study showed that increasing the amount of drying adjuvant and/or decreasing the inlet gas temperature has positive effect on the retention of enzymatic activity of the dried product. After the purification process was carried out the drying of the partially purified enzyme and pure lipase, using these three adjuvants. The retention of enzymatic activity ranged from 90.6 to 100% when was used the optimal conditions for each drying adjuvant. Concluding, the lipases produced by C. kikuchii may be efficiently spray dried since its activity enzimatic was retained in crude extract, pure lipase and in semi-purified lipase after drying.

Bactérias endofíticas provavelmente desenvolveram uma relação com planta hospedeira através de processos coevolucionários, podendo influenciar de alguma forma na fisiologia da planta. Na literatura, há muitos relatos sobre espécies de Bacillus endofíticos, no entanto, poucos se referem a espécie B. thuringiensis (Bt). Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi isolar, identificar e caracterizar Bt de mandioca. Todos os isolados identificados como Bt produziram cristais pontuais e apenas um isolado, IIRAC22, produziu cristais amorfos maiores. Esse isolado apresentou genes cry4A, cry4B e cry10 e toxicidade a larvas de Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus, evidenciando ser Bt var. israelensis. Todos os isolados produziram quitinase, sugerindo que elas podem ter ação controladora sobre fungos fitopatogênicos e insetos. Houve também produção de pectinase, enzimas envolvidas na penetração de planta hospedeira e estabelecimento como endófito. Esses Bt endofíticos podem levar ao desenvolvimento de produtos biotecnológicos para controle de insetos. / Endophytic bacteria probably developed a relationship with their plant host through coevoltionary processes what could influence in the physiology of the plant. In the literature, there are many reports about endophytic Bacillus species, however, few reports cite endophytic B. thuringiensis (Bt). Thus, the aim of the present work was to isolate, identify and characterize Bt from cassava. All the isolates identified as Bt were able to produce punctual crystals, but only one isolate, IIRAC22, produced large amorphous crystals. This isolate presented cry4A, cry4B and cry10 genes and toxicity against larvae of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus, evidencing to be Bt var. israelensis. All the isolates produced quitinase, suggesting that they can control phytopathogeni fungi and insects. There was also pectinase production, enzyme involved in the penetration of plant hosts and establishment as endophytes. These endophytic Bt can take to the development of biotechnological products for the control of insect.