Este trabalho teve por finalidade o desenvolvimento e validação de métodos para análise estereosseletiva de alguns fármacos e metabólitos, bem como a aplicação desses métodos na avaliação do potencial de fungos, principalmente endofíticos, em processos de biotransformação. Os seguintes fármacos foram selecionados para esse estudo: fluoxetina, propranolol, omeprazol, oxibutinina e ibuprofeno. Para determinação simultânea dos enantiômeros da fluoxetina (FLX) e norfluoxetina (NFLX) em meios de cultura de fungos endofíticos, empregou-se a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por absorção no ultravioleta, em um sistema com duas colunas em série, sendo uma de fase reversa (C18) e outra com fase estacionária quiral (Chirobiotic® V). A fase móvel foi composta por etanol: tampão acetato de amônio 15 mmol L-1, pH 5,90: acetonitrila (77,5: 17,5: 5, v/v/v) e a detecção foi realizada em 227 nm. A extração líquido-líquido foi empregada na preparação das amostras. As curvas analíticas foram lineares no intervalo de concentração de 12,5 a 3750 ng mL-1 (r 0,996) para todos os enantiômeros analisados. Os coeficientes de variação e erros relativos obtidos nos estudos de precisão e exatidão foram inferiores a 10%. Nas condições empregadas, os cinco fungos endofíticos estudados não foram capazes de promover a biotransformação da FLX (reação de demetilação). A eletroforese capilar foi empregada para análise enantiosseletiva do propranolol (PROP) e 4-hidroxipropranolol (4-OHPROP). A melhor condição de resolução dos enantiômeros foi encontrada com a aplicação de um planejamento experimental de Box-Behnken: solução de eletrólitos composta por tampão trietilamina / ácido fosfórico (TEA/H3PO4), 25 mmol L-1, pH 9,00, carboximetil--ciclodextrina 4% (m/v) como seletor quiral e análise realizada na voltagem de 17 kV. O método de extração líquido-líquido também foi empregado para preparação das amostras. As curvas analíticas foram lineares no intervalo de concentração de 0,25 a 10,0 g mL-1 para 4-OHPROP e de 0,10 a 10,0 g mL-1 para PROP, apresentando coeficientes de correlação (r) 0,995 para todos os enantiômeros analisados. Os coeficientes de variação e erros relativos obtidos nos estudos de precisão e exatidão foram inferiores a 15%. Os cinco fungos endofíticos em estudo se mostraram eficientes na biotransformação estereosseletiva do PROP, com maior formação do metabólito (-)-(S)-4-OHPROP. O fungo Glomerella cingulata (VA1), em especial, apresentou uma concentração de 1,745 g mL-1 do enantiômero (-)-(S)-4-OHPROP depois de 72 horas de incubação, ao passo que a formação do enantiômero (+)-(R)-4-OHPROP não foi observada. A utilização deste fungo em escalas ampliadas pode ser uma fonte promissora de obtenção do metabólito 4-OHPROP na forma enantiomericamente pura. A determinação simultânea de omeprazol (OMZ), 5-hidroxiomeprazol (5-HOMZ) e omeprazol sulfona (OMZ SUL) em meio de cultura Czapek Dox modificado ii tamponado foi realizada empregando um método rápido de análise por cromatografia líquida de ultra eficiência com detector por arranjo de diodos (UPLC / DAD), usando coluna monolítica de fase reversa e eluição por gradiente. OMZ, 5-HOMZ e OMZ SUL foram extraídos das amostras utilizando uma mistura de acetato de etila: t-butil metil éter (9: 1, v/v). A separação foi obtida empregando uma coluna RP 18 Chromolith Fast Gradient endcapped e fase móvel constituída por 0,15% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) em água (solvente A) e 0,15% (v/v) de TFA em acetonitrila (solvente B). Os tempos de retenção foram de 0,70 min para 5-HOMZ, 0,74 min para OMZ, 0,77 min para OMZ SUL e 0,91 min para o padrão interno (bupropiona, BUP). O método foi linear no intervalo de 0,2 a 10,0 g mL-1 (r 0,995) para todos os analitos. O processo de biotransformação foi realizado durante apenas 24 horas de incubação, por causa de problemas de estabilidade do OMZ. Por esse mesmo motivo, a biotransformação estereosseletiva não foi avaliada. Apenas três fungos apresentaram formação do metabólito 5-HOMZ, e dentre estes, apenas o fungo Botritis cinerea (BC) produziu esse metabólito em concentração superior ao limite de quantificação do método. A formação do metabólito OMZ SUL foi observada para todos os fungos, exceto para Glomerella cingulata (VA1) e Guignardia mangiferae (VA15). Esses fungos podem ser úteis para a obtenção dos metabólitos do OMZ, mas estudos detalhados do comportamento do fármaco nas condições de cultivo são necessários, uma vez que este substrato pode sofrer degradação em meio ácido e na presença de luz. A análise simultânea dos enantiômeros da oxibutinina (OXY) e da N-desetiloxibutinina (DEOB) em meio de cultura Czapek foi obtida empregando a cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV (HPLC/UV). Os analitos foram separados usando coluna quiral Chiralpak AD e fase móvel constituída por hexano: isopropanol: etanol: dietilamina (94: 4: 2: 0,05, v/v/v/v) e detectados em 210 nm. Um estudo piloto de biotransformação empregando os mesmos fungos e as condições de biotransformação utilizadas para os demais fármacos mostrou que não houve a formação do metabólito de interesse. Além disso, não houve uma diminuição significativa da concentração de OXY durante o período de incubação, o que poderia ser um indicativo da formação de outros metabólitos não monitorados nas condições de análise. Como a reação de desetilação da OXY para formar a DEOB não foi observada nos experimentos, não foi necessário realizar a validação do método analítico. A separação simultânea do ibuprofeno (IBP), dos enantiômeros do 2-hidroxi-ibuprofeno (2-OH-IBP) e dos estereoisômeros do carboxi-ibuprofeno (COOH-IBP) foi realizada empregando-se uma coluna Chiralpak AS-H e fase móvel constituída por hexano: isopropanol: TFA (95: 5: 0,1, v/v/v). O solvente extrator usado na extração líquido-líquido foi uma mistura de hexano: acetato de etila (1: 1, v/v). A detecção foi feita por espectrometria de massas (MS/MS), com a fonte de ionização por eletronebulização operada no modo positivo (ESI+). O método foi linear nos intervalos de 0,1 a 20,0 g mL-1 para IBP, de 0,05 a 7,5 g mL-1 para o cada enantiômero do 2-OH-IBP e de 0,025 a 5,0 g mL-1 para cada estereoisômero do COOH-IBP. Os demais parâmetros de validação obtidos para o método apresentaram-se dentro dos limites recomendados pela literatura. Os sete fungos endofíticos estudados se mostraram eficientes na biotransformação do IBP em seu principal metabólito 2-OH-IBP, mas apenas os fungos Nigrospora sphaerica (SS67) e Chaetomium globosum (VR10) iii biotransformaram o IBP de forma enantiosseletiva mais acentuada, observando-se maior formação do metabólito ativo (+)-(S)-2-OH-IBP. A não estereosseletividade observada para os demais fungos pode ser indício de uma possível conversão quiral do fármaco, similar a que ocorre em humanos. A formação dos estereoisômeros do COOH-IBP não foi observada, provavelmente, porque sua rota de formação envolve uma seqüência de reações. Os resultados apresentados nesse trabalho mostram que fungos, particularmente os endofíticos, podem ser uma fonte promissora para obtenção de metabólitos de fármacos, inclusive de forma enantiomericamente pura. / This work aimed the development and validation of suitable methods for the stereoselective analysis of some drugs and metabolites, as well as, the application of these methods to assess the potential of fungi, mainly the endophytic ones, in biotransformation processes. The following drugs were selected for this study: fluoxetine, propranolol, omeprazole, oxybutynin and ibuprofen. The simultaneous determination of fluoxetine (FLX) and norfluoxetine (NFLX) enantiomers in culture media of endophytic fungi was carried out by high-performance liquid chromatography with UV-detection, in a system of two columns coupled in series, in which one of them was a reversed phase (C18) column and the another one was a chiral stationary phase column (Chirobiotic ® V). The mobile phase consisted of ethanol: ammonium acetate buffer, 15 mol L-1, pH 5.90: acetonitrile (77.5: 17.5: 5, v/v/v) and the detection was performed at 227 nm. Liquid-liquid extraction was employed for sample preparation. The analytical curves were linear over the concentration range of 12.5 to 3750 ng mL-1 (r 0.996) for all enantiomers evaluated. The coefficients of variation and relative errors obtained in the evaluation of method precision and accuracy were lower than 10%. In the studied conditions, the five endophytic fungi used were not able to perform the biotransformation of FLX (demethylation reaction). Capillary electrophoresis was employed for the enantioselective analysis of propranolol (PROP) and 4-hydroxypropranolol (4-OHPROP). The best condition for enantiomer resolution was obtained by applying an experimental design of Box-Behnken: electrolyte solution composed of triethylamine / phosphoric acid (TEA/H3PO4) buffer, 25 mmol L-1, pH 9.00, with 4% (w/v) carboxymethyl--cyclodextrin as the chiral selector and analysis performed at 17 kV. Liquid-liquid extraction was also used for sample preparation. The analytical curves were linear over the concentration range of 0.25 to 10.0 g mL-1 for 4-OHPROP and 0.10 to 10.0 g mL-1 for PROP, presenting correlation coefficients (r) 0.995 for all enantiomers evaluated. The coefficients of variation and relative errors obtained in the evaluation of precision and accuracy were lower than 15%. All the five endophytic fungi (Phomopsis sp. (TD2), Glomerella cingulata (VA1), Penicillium crustosum (VR4), Chaetomium globosum (VR10) and Aspergillus fumigatus (VR12)) showed effectiveness in the stereoselective biotransformation of PROP, with higher formation of (-)-(S)-4-OH-PROP. The fungus Glomerella cingulata (VA1), in particular, showed a concentration of 1.745 g mL-1 for the enantiomer (-)-(S)-4-OHPROP after 72 hours of incubation, whereas there was no formation of the enantiomer (+)-(R)-4-OHPROP. Therefore, the use of this fungus in large scale may be a promising source to obtain 4-OHPROP in the enantiomerically pure form. A fast analytical method based on ultra-performance liquid chromatography / diode array detector (UPLC/DAD) using a monolithic reversed phase column and gradient elution was developed for the simultaneous determination of omeprazole (OMZ), 5-hydroxyomeprazole (5-HOMZ) and omeprazole sulfone (OMZ SUL) in modified and buffered Czapek-Dox culture medium. OMZ, 5-HOMZ and OMZ SUL were extracted using a mixture of ethyl acetate: methyl t-butyl ether (9: 1, v/v). The separation was achieved using a Chromolith Fast Gradient RP 18 endcapped column with the mobile phase consisting of 0.15% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA) in water (solvent A) and 0.15% (v/v) TFA in acetonitrile (solvent B). Retention times were 0.70 min for 5-HOMZ, 0.74 min for OMZ, 0.77 min for OMZ SUL and 0.91 min for internal standard (bupropion, BUP). The method was linear over the concentration range of 0.2 to 10.0 g mL-1 (r 0.995) for all analytes. The biotransformation process was carried out only within 24 hours of incubation, due to OMZ instability. For the same reason, the stereoselectivity in this process was not evaluated. The formation of the metabolite 5-HOMZ was observed only for three fungi, and among them, only the fungus Botrytis cinerea (BC) produced this metabolite in concentrations higher than the limit of quantification. The formation of OMZ SUL was observed for all fungi, except for Guignardia mangiferae (VA1) and Glomerella cingulata (VA15). The fungi evaluated in this study can be useful to obtain the metabolites of OMZ, but detailed study of the drug stability in culture conditions is required, since this substrate can undergo degradation in acidic conditions and in the presence of light. The simultaneous analysis of oxybutinin (OXY) and N-desethyloxybutinin (DEOB) enantiomers in Czapek culture medium was carried out by liquid chromatography with UV detection (HPLC/UV). The analytes were separated using a Chiralpak AD column employing as mobile phase hexane: isopropanol: ethanol: diethylamine (94: 4: 2: 0.05, v/v/v/v) and detection at 210 nm. A pilot study of biotransformation using the same fungi and conditions employed for the biotransformation of the other drugs showed that the metabolite of interest was not formed. Moreover, the decrease in the concentration of OXY, which could be indicative of the formation of other metabolites not monitored under the conditions of analysis, was not observed. Since the reaction of OXY desethylation to form DEOB was not observed in the experiments, the validation of the analytical method was not required. The method for the simultaneous analysis of ibuprofen (IBP), 2-hydroxyibuprofen (2-OH-IBP) enantiomers and carboxyibuprofen (IBP-COOH) stereoisomers was developed using a Chiralpak AS-H column and a mobile phase consisting of hexane: isopropanol: TFA (95: 5: 0.1, v/v/v). A mixture of hexane: ethyl acetate (1: 1, v/v) was used as solvent extractor for sample preparation. The detection was performed by tanden mass spectrometry (MS/MS) with the electrospray interface operated in the positive mode (ESI+). The method was linear over the concentration range of 0.1 to 20.0 g mL-1 for IBP, 0.05 to 7.5 g mL-1 for each 2-OH-IBP enantiomer and 0.025 to 5.0 g mL-1 for each COOH-IBP stereoisomer. The other validation parameters studied were within the limits established in the literature. The seven studied endophytic fungi showed to be efficient in the biotransformation of IBP to its main metabolite 2-OH-IBP, however, only the fungi Nigrospora sphaerica (SS67) and Chaetomium globosum (VR10) biotransformed IBP enantioselectively, with greater formation of the active metabolite (+)-(S)-2-OH-IBP. The lack of stereoselectivity observed for the other fungi could be caused by a possible chiral inversion process occurring for IBP, in a similar way that happens in humans. The formation of COOH-IBP stereoisomers was not observed probably because the route of formation of this metabolite requires a sequence of reactions. The results presented here show that fungi, particularly the endophytic ones, may be a promising source to obtain the metabolites of drugs, including in their enantiomerically pure form.

Os organismos marinhos constituem uma fonte potencial de metabólitos secundários biologicamente ativos. Neste contexto, os micro-organismos isolados de algas marinhas, dentre eles fungos endofíticos, representam alvos para a pesquisa de novas substâncias com potencial farmacológico pronunciado. Substâncias naturais provenientes de espécies de fungos associados às algas marinhas vêm sendo bastante utilizadas em formulações fotoprotetoras devido à ação antioxidante e ao potencial contra a radiação solar. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo a investigação biológica e química dos fungos endofíticos marinhos pertencentes à família Xylariaceae, o Annulohypoxylon stygium, o Cladosporium sp. e o Acremonium implicatum (Hypocreaceae). A princípio, foi realizado um screening para avaliar a absorção de luz ultravioleta na faixa do UVA e UVB pelos extratos obtidos em escala piloto destes fungos endofíticos associados às algas marinhas. O extrato do fungo A. stygium apresentou intensa absorção na região do UV, mostrando-se promissor para a produção de metabólitos secundários com ação fotoprotetora. Além do ensaio proposto, foi realizada a avaliação do potencial antibacteriano e antifúngico da espécie A. stygium. O estudo químico em escala ampliada deste fungo proporcionou o isolamento e identificação de uma substância inédita da classe derivada da 2,5- dicetopiperazina, 3-benzilideno-2-metil-hexahidro-pirrolo [1,2-?] pirazina-1,4-diona (Sf3), e além desta, foram isolados mais quatro metabólitos como, os diasteroisômeros 1-fenil-1,2- propanediol (Sd2) e 1-fenil-1,2-propanediol (Sd3), 1,3-benzodioxole-5-metanol (Sc1), 1,2- propanodiol-1-(1,3-benzodioxol-5-il) (Se1). Ainda foi possível a desreplicação de substâncias via cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), entre elas o ácido palmítico, palmitato de metila, ácido metil linoléico, ácido oléico, álcool benzílico e o piperonal. Quanto ao estudo da atividade biológica, não foi observado potencial antibacteriano e antifúngico para os extratos e frações do fungo. Entretanto, notouse um potencial como fotoprotetor in vitro para as frações n-Hexano/AcOEt (2:3) e n- Hexano/AcOEt (1:4) obtidas a partir do extrato do cultivo de 28 dias do fungo A. stygium, extraído com solventes diclorometano/metanol (CH2Cl2/MeOH 2:1) e para a substância (Sf3) isolada do mesmo. Desta forma, o estudo químico e biológico do fungo Annulohypoxylon stygium demonstrou potencial para a produção de metabólitos secundários com atividade fotoprotetora, visto que uma estrutura inédita com esta atividade foi isolada e identificada como produto natural. / Marine organisms consist of a potential source of biologically active secondary metabolites. In this context, the microorganisms isolated from marine algae, including fungal endophytes represent targets for the search of new substances with pronounced pharmacological potential. Natural substances from fungal species associated with marine algae, have been widely used in sunscreens formulations due to the antioxidant action and the potential against solar radiation. Thus, this study aimed to research biological and chemical profile of marine endophytic fungi belonging to the Xylariaceae family, the Annulohypoxylon stygium, the Cladosporium sp. and Acremonium implicatum (Hypocreaceae). First of all, a screening was performed to evaluate the absorption of ultraviolet light in the range of UVA and UVB by extracts obtained in pilot scale of these endophytic fungi associated with seaweed. The fungus extract A. stygium showed intense absorption in the UV region, being promising for the production of secondary metabolites with sunscreen action. In addition to the proposed test was performed to evaluate the antibacterial and antifungal potential of the species A. stygium. The chemical studies on increased scale of this fungus provided the isolation and identification of a novel compound of the class derived from 2,5-diketopiperazine, 3- benzylidene-2-methylhexahydropyrrolo [1,2-?] pyrazine-1,4-dione (Sf3), and beyond, four metabolites were isolated like of the diasteroisomers 1-phenyl-1,2-propanediol (Sd2) and 1- phenyl-1,2-propanediol (Sd3), 1,3-benzodioxole-5-methanol (Sc1), 1,2-propanodiol-1-(1,3- benzodioxol-5-il) (Se1). Furthermore was possible to dereplicate substances by means of gas chromatography-mass spectrometry (CG-MS) analyses: palmitic acid, methyl palmitate, methyl linoleic acid, oleic acid, benzyl alcohol and piperonal. Regarding to biological activity evaluation, it was not observed antibacterial and antifungal potential for extracts and fractions of the fungus. However, it was observed as a potential sunscreen in vitro for fractions n-Hexane/AcOEt (2:3) and n-Hexane/AcOEt (1:4) obtained from extract after 28 days growth culture of the fungus A. stygium. The mycelia were extracted with solvents dichloromethane/methanol (CH2Cl2/MeOH 2:1) and the compound Sf3 was isolated from the same extract. Thus, the chemical and biological study of the fungus Annulohypoxylon stygium demonstrated the potential for production of secondary metabolites with sunscreen activity, since a novel structure displaying this potential was isolated and identified as a natural product.

Os antibióticos vem sendo empregados por décadas no combate as infecções bacterianas mas, muitos deles são usados como agentes antitumorais, imunissupressores, lipocolesterolégicos, inibidores de enzimas e agentes antiparasitários. Os microrganismos, e dentre eles os fungos, são produtores de metabólitos secundáros, com atividades biológicas, cuja produção é regulada para impedir uma superprodução desnecessária. O aumento na produção de uma substância só é conseguido desregulando tal processo o que é pssível através de manipulação genética ou nutricional. O presente projeto teve por objetivo otimizar as condições de cultivo do fungo endofítico Papulaspora immersa para incrementar a produção de metabólitos secundários com atividades antibacteriana, antiparasitária, antifúngica e antitumoral. O fungo foi cultivado em duas etapas: inicialmente em meio pré-fermentativo por 48 horas seguido de transferência da massa micelial obtida para meio fermentativo Czapek e nesta etapa vários parâmetros que alteram as condições de cultivo foram variados. Os cultivos foram realizados assepticamente a 30°C e sob agitação constante e o filtrado das culturas foram particionados com solventes orgânicos obtendo-se os extratos, aceto etílico, butanólico, etanólico e aquoso. Nos estudos iniciais o tempo de cultivo no meio fermentativo foi de 20 dias (condição padrão) e sob esta condição, o extrato aceto etílico apresentou a melhor atividade antibacteriana para Pseudomonas aeruginosa (CIM = 90 g/mL) e não foi detectada atividade frente a Escherichia coli , assim como não foi observada atividade antifúngica para estes extratos. As seguintes variáveis foram testadas nas condições de cultivo no meio fermentativo : período de incubação, fonte de carbono, fonte de nitrogênio, pH, temperatura e a proporção das fontes carbono/nitrogênio do meio. Cada extrato obtido proveniente das diferentes condições de cultivo foi avaliado para atividade antibacteriana, antitumoral, antifúngica e inibidora das enzimas gGAPDH deTrypanosoma cruzi e APRT de Leishmania tarentolae em ensaios de CIM. O extrato que apresentou a melhor atividade antibacteriana foi obtido das seguintes condições de cultivo: meio suplementado com 3,0% de sacarose; 0,2% de Nitrato de sódio; pH inicial 5,0, após 9 de incubação a 30 °C, ou seja, CIM de 90 g/mL para P. aeruginosa e de 100 g/mL para E. coli. Nestas mesmas condições obteve-se os melhores níveis de atividade antitumoral frente as três linhagens humanas avaliadas (HCT-8, MDA-MB435 e SF295). A melhor atividade inibitória da enzima parasitária APRT de L. tarentolae (79,82 %) foi obtida do extrato aceto etílico proveniente do cultivo em meio fermentativo nas mesmas condições anteriores, porém quando a cultura era incubada a 35°C e não a 30°C. Significativa atividade inibitória sobre esta enzima (79,25 %) foi também obtida de extrato aceto etílico proveniente da mesma condição de cultivo anteriormente citada, porém em pH 4,0 a 30°C, condição na qual a atividade antibacteriana mostrou-se insignificante. Nenhum dos extratos analisados apresentou atividade inibitória significativa para a enzima parasitária gGAPDH de T. cruzi. A otimização das condições de cultivo do fungo Papulaspora immersa demonstrou que 9 dias de cultivo em meio fermentativo eram suficientes para a produção de metabólitos secundários com atividades biológicas e que é possível obter-se uma determinada atividade em maior concentração dependendo por exemplo do pH ou da temperatura em que se cultiva esse fungo. / Due to the increase in the microbial resistance to the current antibiotics, investigations in substances with antimicrobial activities, as well as substances with antiparasite and antitumoral activities, become relevant. Among the important natural sources in the development of new drugs, the secondary metabolites of microorganism have showed promising results, producing different structural components and a great number of biologically active compounds. Endophytic fungi, known for habiting the interior of plants at some point in their life cycle, without causing visible symptoms of diseases, present a high proportion of new isolated substances with biological activity, but are seldom studied for this purpose. The current project aimed to optimize the culture conditions of the endophytic fungus Papulaspora immersa, in order to increase the production of secondary metabolites with antibacterial, antifungal and antitumoral activities. The fungus was cultured in two steps: pre-fermentative medium for 48 hours, aiming to obtain micelial mass, followed by transference to Czapek fermentative medium, and reincubation in different times. The cultures were performed asseptically at 30°C and under Constant agitation. After filtration of the culture fluid and partition with organic solvents, the following extracts were obtained: acethyl ethylic, butanolic, ethanolic and aquous. In the initial studies, the culture was performed in Czapek fermentative medium for 20 days of incubation, the standard culture condition. In this condition, the extract acethyl ethylic showed the best antibacterial activity with Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of 90 µg/mL for Pseudomonas aeruginosa. Antifungal activity was not observed for these extracts. Afterwards, the incubation period, carbon source, nitrogen source, pH, temperature and proportion of carbon/nitrogen sources varied. Each extract obtained from the different culture conditions was evaluated in MIC assays and the best condition was selected. The extract that showed the best antibacterial activity was obtained from the culture in fermentative medium after 9 days of incubation using saccharosis (3.0%) as carbon source and sodium nitrate (0.2%) as nitrogen source, in pH 5.0 at 30 °C with MIC values of 90 µg/mL for P. aeruginosa, and 100 µg/mL for E. coli. The culture condition that resulted in the production of the best antitumoral activity was the same detected for the antibacterial activity. In this condition, the endophytic fungus Papulaspora immersa hás also produced secondary metabolites that demonstrated to be very active against the three human tumoral cell lines evaluated (HCT-8, MDA-MB435 and SF295). The best culture conditions for the production of secondary metabolites with inhibitory activity of the parasitary enzyme APRT of L. tarentolae were obtained from extracts cultured in the same conditions previously described, except for the fact that the incubation temperature was 35°C and presented inhibitory activity of 79.82 %. High inhibitory activity over this enzyme (79.25 %) was also obtained in these same conditions, but with an initial pH of the culture of 4.0 and at 30°C. None of the extracts analyzed present significant inhibitory activity for the parasitary enzyme gGAPDH of T. cruzi. The optimization of the culture conditions of the fungus Papulaspora immersa has demonstrated to be very important for the production of secondary metabolites with biological activities. To conclude, it can be said that the determination of the ideal culture conditions allowed to diminish the incubation time from 20 to 9 days and find the conditions that maximize the content of substances with the different activities in the extracts of P. immerse, such as, for example, the differential synthesis of substances in different pH and temperature values, which shows the importance of the abiothyc variables in the synthesis of secondary metabolites.

O ambiente marinho, pela própria diversidade orgânica que representa, tem sido reconhecido como fonte promissora de metabólitos secundários biologicamente ativos. Algas marinhas produzem grande variedade de substância terpenoídicas, aromáticas e de origem policetídica, e bioensaios têm demonstrado importante potencial biológico relativo a estes metabólitos. Micro-organismos associados às algas, tais como fungos endofíticos, também representam importante e promissora fonte de produtos naturais com esqueletos estruturalmente diversos. Bostrychia é um gênero algal fisiológica e biogeograficamente bem estudado mas são escassas as informações quanto à sua composição química, predominando a descrição de polióis e de moléculas de baixo peso molecular. Neste trabalho, os resultados da comparação dos perfis cromatográficos de espécies de Bostrychia representam uma primeira abordagem qualitativa dos constituintes polares do conjunto de espécies desse gênero ocorrentes no litoral norte do estado de São Paulo, e deverá ser complementado por meio do isolamento e identificação estrutural de seus constituintes majoritários. O isolamento de fungos endofíticos a partir de B. radicans (coletadas em ambiente de costão rochoso e manguezal) e B. tenella (coletadas no costão rochoso) possibilitou a preservação de 135 linhagens disponíveis para estudos posteriores. Dentre as linhagens isoladas de B. radicans costão, dez foram selecionadas para cultivo em meio sólido e entre estas três (C75, C81 e C82) foram selecionadas para estudos químicos e biológicos. As linhagens C81 e C82 foram identificadas por dados moleculares como Phomopsis longicolla e Penicillium brevicompactum, respectivamente. Foram isoladas e identificadas três substâncias conhecidas a partir de P. longicolla (18-deoxicitocalasina H, ácido micofenólico e dicerandrol C) e duas a partir de P. brevicompactum (ácido micofenólico e seu derivado metilado). Nos ensaios biológicos, a fração hexânica de P. longicolla apresentou alta atividade antimicrobiana (abaixo de 100g.mL-1), bem como um de seus metabólitos isolados (atividade abaixo de 10g.mL-1), frente às bactérias Staphylococcus aureus e S. saprophyticus. Esse mesmo metabólito também apresentou potencial de inibição de degranulação de mastócitos e atividade citotóxica, reforçando o potencial dos micro-organismos endofíticos na biossíntese de compostos que possam auxiliar no desenvolvimento de novos fármacos. Em conjunto, os resultados obtidos mostram que algas marinhas e fungos endofíticos associados representam uma importante área a ser explorada em relação ao potencial biológico de produtos naturais. / The marine environment, due to its organic diversity, has been recognized as a promising source of new biologically active secondary metabolites. Seaweeds produce a large variety of terpenoidic, aromatic and poliketids substances. Bioassays have been demonstrated significant biological potential concerning these metabolites. Microorganisms associated with algae, such as endophytic fungi, also represent important and promising source of natural products with molecularly-diverse structures. Bostrychia is an ecophysiology, biogeographically well-studied algal genus, but information about its chemical composition is scarce, prevailing reports about its polyol and low-molecular-weight contents. In this work, the results of the comparison of the chromatographic profiles of Bostrychia species growing in the north coast of São Paulo State represent a first qualitative approach of the polar constituent in this genus, and may be complemented by isolation and identification of their majority constituents. The isolation of endophytic fungi from B. radicans (collected in rocky shore and mangrove environment) and B. tenella (collected in the rocky shore) allowed the preservation of 135 strains available for posterior studies. Among the strains isolated from B. radicans rocky shore, ten were selected for cultivation in solid medium and three (C75, C81 e C82) were selected for chemical and biological studies. C81 and C82 strains were identified by molecular data as Phomopsis longicolla and Penicillium brevicompactum, respectively. Three known substances were isolated and identified from P. longicolla (18-deoxycytochalasin H, mycophenolic acid and dicerandrol C) and two from P. brevicompactum (mycophenolic acid and its methyl derivative). Biological assays revealed the hexanic fraction of P. longicolla presenting high antimicrobial activity (below of 100g.mL-1) against Staphylococcus aureus and S. saprophyticus, as well as one of its isolated metabolites (activity below of 10g.mL-1). This metabolite also presented mast cell degranulation inhibition and cytotoxic activity, reinforcing the potential of endophytic microorganisms in the byosinthesis of compounds that can be useful in the new drugs development. As a summary, the results show that algae and their endophytic fungi associated represent an important field to be explored in terms of biological potential of natural products.

Biotransformações são reações de compostos orgânicos realizadas por microrganismos, plantas ou enzimas isoladas. A transformação de um composto em particular pode ser realizada em grupos funcionais com ou sem degradação de seu esqueleto. Neste trabalho foram utilizados fungos endofíticos e de solo na biotransformação da lactona sesquiterpênica enidrina e do diterpeno afidicolina. A enidrina possui atividade antidiabética e anti-inflamatória. A afidicolina possui pronunciada atividade antitumoral, antiviral e leishmanicida. Foram realizados experimentos de biotransformação da enidrina e da afidicolina com os fungos endofíticos Penicillium crustosum VR4, Papulospora immersa SS13, Fusarium oxysorium SS50 e com o fungo de solo Rhizopus stolonifer. A biotransformação da enidrina com fungo endofítico Papulospora immersa SS13 levou à obtenção de um derivado di-hidroxilado, produzido pela abertura do epóxido presente no éster da cadeia lateral desta lactona sesquiterpênica. Este produto só havia sido previamente obtido na literatura por semi-síntese a partir da enidrina. Os experimentos de biotransformação da afidicolina não levaram ao isolamento e identificação de produtos. Reações semi-sintéticas com a afidicolina foram mais eficientes para a obtenção de derivados deste diterpeno. Foram obtidos cinco derivados semi-sintéticos da afidicolina: dois derivados mono-éteres de silício, um di-éter de silício, um derivado tetra-acetilado e um tri-acetilado. Ainda, na purificação dos produtos reacionais isolou-se o produto natural 3-desoxiafidicolina. Todos os derivados afidicolanos foram submetidos ao ensaio frente a Leishmania major. A afidicolina, a 3-desoxiafidicolina e a afidicolina tri-acetilada exibiram as atividades leishmanicidas mais significativas. Foram calculadas as lipofilicidades dos derivados afidicolanos. A maior atividade observada para o derivado tri-acetilado da afidicolina pode estar relacionada com sua maior capacidade de cruzar as membranas celulares. Este trabalho levou ao isolamento de um produto de biotransformação da enidrina e à identificação de novos derivados afidicolanos naturais e semi-sintéticos com atividade leishmanicida. / Biotransformations are reactions of organic compounds made by intact microbial cells, plant cells or enzymes isolated. The transformation of a particular compound can be carried out at functional groups, with or without degradation of the carbonic skeleton. In this work endophytic and soil fungal strains were applied for the biotransformation of the bioactive terpenes enhydrin (sesquiterpene lactone) and aphidicolin (diterpene). Enhydrin shows anti-diabetic and anti-inflammatory activity. Aphidicolin has been reported as an antiviral, antitumoral and leishmanicidal hit. The endophytes Penicillium crustosum VR4, Papulospora immersa SS13, Fusarium oxysporium SS50 and the soil fungus Rhizopus stolonifer have been screened for the biotransformation of enhydrin and aphidicolin. The biotransformation of enhydrin, catalyzed by the endophytic P. immersa SS13, led to the isolation of a dihydroxy-derivative, a product of the sesquiterpene lactone side chain epoxide opening. This product had only been obtained previously by chemical means. The biotransformation experiments using aphidicolin as substrate were not successful in the production of derivatives. The derivatives of aphidicolin were more efficiently prepared through semi-synthetic approaches. Five aphidicolin semi-synthetic derivatives were obtained: two silicon mono-silyl ether derivatives, one silicon bis-silyl ether derivative, one tetra-acetylated derivative and one triacetylated derivative. During the purification of synthetic mixtures, the natural product 3-deoxyaphidicolin was also isolated. All the aphidicolane derivatives have been assayed against Leishmania major. Aphidicolin, 3-deoxyaphidicolin and triacetylated aphidicolin showed the higher leishmanicidal activities. The lipophilicities of aphidicolane derivatives were calculated. The higher activity presented by the triacetylated aphidicolin may be due to its higher ability to cross the cell membranes. This work led to the isolation of one biotransformation product of enhydrin and to the identification of new natural and semi-synthetic leishmanicidal aphidicolanes.

O estudo das interações planta-microrganismos tem sido de grande interesse ao longo dos últimos anos. Atualmente, as interações que ocorrem entre microrganismos que vivem em estreita relação também vêm merecendo grande atenção, pois forças competitivas e mutualísticas podem induzir a produção de novos metabólitos bioativos. Portanto, estudar interações existentes entre os microrganismos endofíticos que colonizam uma mesma planta parece ser uma estratégia promissora para a obtenção de substâncias quimicamente diferentes, eventualmente bioativas. Através da utilização de culturas mistas de microrganismos, o presente trabalho contribuiu para o conhecimento da relação existente entre os fungos endofíticos SS13 (Papulaspora immersa), SS50 (Fusarium oxysporum), SS67 (Nigrospora sphaerica), SS77 (Alternaria tenuissima) e SS84 (Phoma betae), isolados da planta medicinal Smallanthus sonchifolius (yacon), e sua implicação no aumento da diversidade química de produtos naturais microbianos, com o intuito de se identificar metabólitos secundários anticancerígenos. Para isso, os fungos foram cultivados em culturas singles e mistas em meios de cultivo líquidos e semi-sólidos. Foram utilizados diferentes meios de cultura, diferentes maneiras de se estabelecer o cultivo misto e diferentes formas de extração. Os extratos foram analisados química e biologicamente. Após fracionamento, foram isoladas cinco substâncias: afidicolina (I), 3-desóxi-afidicolina (II), estenfiperilenol (III), alterperilenol (IV) e alternariol monometil éter (V), sendo as duas primeiras de origem terpênica e as outras de origem policetídica. As substâncias I e II foram produzidas pelo fungo SS67, sendo que a produção de I aparentemente aumentou nas culturas mistas líquidas com SS13 e SS84, diminuindo consideravelmente na cultura mista com SS77. Devido à afidicolina ser um composto altamente citotóxico, os cultivos do fungo SS67 originaram extratos muito ativos frente aos ensaios de citotoxicidade em células cancerígenas. A substância III, primeiramente, só foi detectada por CLAE-DAD na cultura mista dos fungos SS67 e SS77, e a produção da substância IV foi maior nessa cultura mista que na cultura simples do fungo SS77 (meio fermentativo de extrato de malte). Provavelmente esses compostos foram produzidos por SS77 em resposta à presença de SS67. O extrato obtido durante esse cultivo misto foi o que apresentou maior atividade citotóxica frente à linhagem celular MDAMB-435 (câncer de mama). Posteriormente, a substância III foi também isolada da cultura simples do fungo SS77 cultivado em outras condições (meio fermentativo PDB), juntamente com a substância V. Os experimentos de antagonismo em placa de Petri envolvendo esses dois fungos revelaram, ainda, a presença de vários outros compostos na zona de inibição, que não correspondem às substâncias previamente isoladas de meio líquido, e podem ser responsáveis pelo efeito antagônico observado em meio semi-sólido. Os experimentos de atividade antagônica dos metabólitos produzidos pelos fungos evidenciaram que muitos compostos ativos, provavelmente, são produzidos em quantidades ínfimas, o que impossibilita a detecção por CLAE-DAD. Além disso, verificou-se que a substância I não possui atividade antifúngica significativa contra os fungos SS13, SS50 e SS77 e que a inibição de SS67 por SS77 ocorre devido à produção de compostos difusíveis em meio semi-sólido, e ainda, muito provavelmente, pela produção da substância III e IV em meio líquido, além de outros policetídeos. A produção de metabólitos secundários por fungos endofíticos deve ocorrer em consequência do papel ecológico que desempenham na natureza. Assim, a utilização de culturas mistas desses microrganismos deve induzir a produção de compostos que não seriam produzidos em condições não naturais. / The study of plant-microbe interactions has been of great interest over the past years. Currently, the interactions that occur among organisms that live in close relationship also have been receiving great attention because mutualistic and competitive forces may induce the production of new bioactive metabolites. Therefore, studying the interactions between endophytic microorganisms that colonize the same plant seems to be a promising strategy for obtaining chemically different substances that might also be bioactive. Through the utilization of mixed microbial cultures, this study contributed to knowledge of the relationship among the endophytic fungi SS13 (Papulaspora immersa), SS50 (Fusarium oxysporum), SS67 (Nigrospora sphaerica), SS77 (Alternaria tenuissima) and SS84 (Phoma betae), isolated from the medicinal plant Smallanthus sonchifolius (yacon), and its role in the increase of the chemical diversity of microbial natural products, in order to identify anticancer secondary metabolites. For this aim, the fungi were grown in single and mixed cultures, both in liquid and semi-solid media. Different media, different approaches to establish the mixed cultures and different extraction methods were used. The extracts were analyzed chemically and biologically. After the fractionation, five compounds were isolated: aphidicolin (I), 3-deoxy-aphidicolin (II), stemphyperylenol (III), alterperylenol (IV) and alternariol monomethyl ether (V). Compounds I and II are terpene derivatives, while III, IV and V are polyketide derivatives. The substances I and II were produced by the fungus SS67, and the production of I apparently increased in liquid mixed cultures with SS13 and SS84, decreasing considerably in mixed culture with SS77. Due to the high cytotoxic activity of aphidicolin (I), the cultures of the fungus SS67 originated extracts highly active in the cytotoxicity assays in cancer cells. Substance III was only detected by HPLC-DAD in the mixed culture between the fungi SS67 and SS77, and the production of compound IV was higher in this mixed culture when compared to the single culture of the fungus SS77 (malt extract medium). Probably these compounds were produced by SS77 in response to the presence of SS67. The extract obtained during this mixed culture showed the highest cytotoxic activity against the cell line MDAMB-435 (breast cancer). In a subsequent fermentation in PDB medium, compound III was also isolated from the single culture of the fungus SS77 grown, along with compound V. Additionally, antagonism experiments in Petri dishes with these two fungi revealed the presence of several other compounds in the inhibition zone, which does not correspond to the substances previously isolated from the liquid medium, and may be responsible for the antagonistic effect observed in semi-solid medium. The experiments of antagonistic activity of metabolites produced by fungi showed that many active compounds are probably produced in very small quantities, making it impossible to detect by HPLC-DAD. Moreover, it was found that aphidicolin (I) did not have significant antifungal activity against the fungi SS13, SS50 and SS77 and that the SS67 inhibition by SS77 is due to the production of diffusible compounds in semi-solid medium, and likely, due to the production of compound III and IV in liquid medium, and other polyketides. The production of secondary metabolites by endophytic fungi probably occurs as a result of the ecological role they play in nature. Thus, the use of mixed cultures of these microorganisms may induce the production of compounds that would not be produced under unnatural conditions.

O ambiente marinho tem sido reconhecido como uma importante fonte de metabólitos secundários biologicamente ativos. Neste contexto, fungos endofíticos associados a algas ganharam importância nas últimas décadas, como alvos alternativos para a pesquisa de produtos naturais. O presente trabalho teve como o objetivo o estudo químico e biológico de duas linhagens de fungos endofíticos associados à alga vermelha Bostrychia radicans. Inicialmente foi realizada a triagem química e biológica (atividade antitumoral e antimicrobiana) dos extratos brutos das duas linhagens selecionadas, linhagens M20 (Hypocrea lixii) e M23 (Eutypella sp), obtidos a partir de cultivos em escala piloto, tanto variando-se os meios de cultivo e bem como períodos de crescimento. O extrato da linhagem M20 cultivada em arroz apresentou potencial citotóxico interessante quando submetido a ensaios utilizando células tumorais HCT-116. Ainda, após a análise química, esta linhagem foi selecionada para o cultivo em escala ampliada, visando o isolamento e elucidação estrutural dos metabólitos secundários presentes neste fungo. O estudo químico em escala ampliada da linhagem M20, espécie Hypocrea lixii, proporcionou o isolamento e identificação de quatro metabólitos: ácido 3-hidroxi-5-metóxi-6-metil-1,3-diidro-isobenzofurano-4- carboxílico (S1), 3,7-dimetóxi-6-metil-1-oxo-1,3-diidro-isobenzofurano-4-carbaldeído (S3), galactitol (S4), convolvulol (S5), além do isolamento de dois metabólitos que ainda não foram completamente elucidados, S2 e S6. Os metabólitos S1 e S3 são metabólitos inéditos como produtos naturais. Além disso, foi possível a identificação de 14 substâncias via cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), entre elas hidrocarbonetos, ácidos graxos, inclusive insaturados, aldeídos, aldeídos ?,?-insaturados e esteróide. As substâncias S1 e S4 foram submetidas à avaliação de atividade biológica (atividade antibacteriana, antifúngica, anticolinesterásica e antitumoral), porém nenhum resultado positivo foi constatado. Foi realizada avaliação da atividade tumoral das frações da linhagem M20, e as frações M20F e M20H apresentaram atividade citotóxica seletiva para linhagens de células tumorais. Em um segundo momento foi realizado o cultivo em escala ampliada da linhagem M23 (Eutypella sp) que proporcionou o isolamento da R-5-metilmeleína (S7). Dessa forma, o estudo químico de fungos endofíticos associados à alga Bostrychia radicans mostrou-se promissor na busca de novas estruturas químicas, visto que já foram isoladas e identificadas duas estruturas inéditas como produtos naturais. / The marine environment has been recognized as an important source of biologically active secondary metabolites. In this context, endophytic fungi associated with algae gained importance in recent decades, as alternative to natural products research targets. The present work had as goal the chemical and biological study of two strains of endophytic fungi associated with red algae Bostrychia radicans. The chemical and biological screening (antimicrobial and antitumor activity) of the crude extracts of two selected strains, M20 (Hypocrea lixii) and M23 (Eutypella sp), were obtained from pilot-scale cultivation, by means of culture media and growth period variation. The M20 strain extract, grown in rice, showed an interesting cytotoxic potential front HCT -116 tumor cells and after chemical analysis, this strain was selected for cultivation on a large scale, with the purpose of secondary metabolites isolation. Chemical studies of M20 species strain Hypocrea lixii, performed on an enlarged scale, afforded the isolation and identification of four metabolites: 3-hydroxy-5-methoxy-6- methyl-1,3-dihydro-isobenzofuran-4-carboxylic acid (S1), 3,7 dimethoxy-6-methyl-1-oxo- 1,3-dihydro-isobenzofuran-4-carbaldehyde (S3), galactitol (S4), convolvulol (S5), in addition the isolation of two metabolites which have not yet been fully elucidated, S2 and S6. The S1 and S3 metabolites are novel metabolites as natural products. Furthermore, it was possible to identify 14 compounds by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), including hydrocarbons, fatty acids, besides unsaturated ones, aldehydes, ?,?-unsaturated aldehydes and steroid. The S1 and S4 compounds were subjected to biological activity evaluation (antibacterial, antifungal, antitumor and acetylcholinesterase potential), but without any positive result. Assessment of tumor activity of fractions of the M20 strain was performed, and the M20F and M20H fractions showed selective cytotoxicity to tumor cell lines. In a second step, the M23 strain (Eutypella sp) was grown on a large scale, resulting in the R-5-metilmeleina (S7) isolation. Thus, the chemical study of endophytic fungi associated to Bostrychia radicans algae proved to be promising concerning the search for new chemical compounds discovery, since it yielded two new structures as natural products.

O presente projeto teve por objetivo a otimização das condições de cultivo do fungo endofítico Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. para incrementar a produção de metabólitos secundários com atividades antibacteriana, antifúngica, antiparasitária e antitumoral. O fungo foi cultivado em meio líquido em duas etapas distintas, primeiramente em 200 mL de meio pré-fermentativo de Jackson por 48 horas a 30 °C sob agitação constante (120 rpm), e posteriormente, reinoculando a massa micelial assepticamente obtida na etapa pré-fermentativa, em 400 mL de meio fermentativo Czapek, seguido de reincubação a 30 °C sob agitação constante (120 rpm). Após filtração do fluido da cultura e partição com solventes orgânicos obteve-se os extratos, aceto etílico, butanólico, etanólico e aquoso. A condição de cultivo padrão, cultivo inicial em meio fermentativo Czapek, foi realizada por 20 dias de incubação. Os extratos provenientes desta condição de cultivo foram avaliados quanto às atividades antibacteriana e antifúngica. O extrato aceto etílico apresentou, nesta condição de cultivo, a melhor atividade antibacteriana com concentração inibitória mínima (CIM) de 270 ?g/mL para Escherichia coli, não sendo observada atividade antifúngica nestes extratos. Após avaliação inicial foram realizadas modificações na condição de cultivo padrão em meio fermentativo, objetivando a otimização da atividade antibacteriana, anteriormente reportada. Avaliou-se as variáveis, período de incubação, fonte de carbono, fonte de nitrogênio, pH, temperatura e proporção carbono/nitrogênio do meio, respectivamente. Cada variável foi aferida realizando ensaios de CIM dos extratos provenientes dos diferentes cultivos realizados, selecionando a melhor condição para a otimização da variável seguinte. A melhor condição para a produção de metabólitos secundários com atividade antibacteriana foi obtida em 9 dias de incubação utilizando-se sacarose (3,1%) como fonte de carbono e nitrato de sódio (0,1%) como fonte de nitrogênio, em pH 4 a 30 °C com valor de CIM de 90 ?g/mL para Escherichia coli e P. aeruginosa atividade esta superior a detectada sob a condição de cultivo padrão. Para a atividade antifúngica, anteriormente não detectada, a melhor condição de cultivo foi com a utilização de sacarose (3,1%) e nitrato de sódio (0,1%) em pH 4 a 30 °C para Aspergillus fumigatus (CIM de 130 ?g/mL) e sacarose (3,0%) e nitrato de sódio (0,2%), em pH 4 a 30 °C para Candida albicans ( CIM de 140 ?g/mL). A melhor condição de cultivo para a produção de metabólitos secundários com atividade antitumoral foi obtida com a utilização de sacarose (3,0%) como fonte de carbono e nitrato de sódio (0,2%) como fonte de nitrogênio, em pH 4 a 30 °C para as três linhagens tumorais humanas avaliadas (HCT-8, MDA-MB435 e SF295) nas quais detectou-se 100% de inibição de crescimento celular, esta condição foi também responsável pela melhor atividade inibitória da enzima APRT de L. tarentolae, apresentando 66,41% de inibição, indicando possível atividade antiparasitária. A otimização de condições de cultivo do fungo Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. mostrou-se relevante para a produção de metabólitos secundários bioativos. / The purpose of the current project was to optimize the conditions of culture of the endophytic fungus Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. in order to increase the production of secondary metabolites with antibacterial, antifungal, antiparasitary and antitumor activities. The fungus was cultivated in a liquid medium in two different steps; first, in 200 mL of Jackson pre-fermentative medium for 48 hours at 30 °C, under constant agitation (120 rpm), and subsequently, reinoculating the mycelial mass aseptically obtained in the pre-fermentative step in 400 mL of Czapek fermentative medium, followed by reincubation at 30 °C under constant agitation (120 rpm). After filtration of the culture fluid and partition with organic solvents, the following extracts were obtained: acetyl ethylic, buthanolic, ethanolic and aqueous. The standard culture condition, initial culture in Czapek fermentative medium, was performed during 20 days of incubation. The extracts obtained from this culture condition were evaluated regarding the antibacterial and antifungal activities. The acetyl ethylic extract presented, in this culture condition, the best antibacterial activity, with a Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of 270 ?g/mL for Escherichia coli; antifungal activity was not observed in this extracts. After the initial evaluation, modifications in the standard culture condition in fermentative medium were performed, aiming to optimize the previously reported antibacterial activity. The following variables were assessed: incubation period, carbon source, nitrogen source, pH, temperature and proportion of carbon/nitrogen in the medium. Each variable was evaluated using MIC assays of the extracts obtained from the different cultures performed, allowing the selection of the better condition for the variable optimization. The best condition for the production of secondary metabolites with antibacterial activity was obtained in 9 days of incubation, using sucrose (3.1%) as the carbon source and sodium nitrate (0.1%) as the nitrogen source, in pH 4 at 30 °C, with a MIC value of 90 ?g/mL for Escherichia coli and P. aeruginosa, which was superior to the activity detected under the standard culture condition. For the antifungal activity, previously undetected, the best culture condition was obtained using sucrose (3.1%) and sodium nitrate (0.1%) in pH 4 at 30 °C for Aspergillus fumigatus (MIC of 130 ?g/mL), and sucrose (3.0%) and sodium nitrate (0.2%), in pH 4 at 30 °C for Candida albicans (MIC of 140 ?g/mL). The best culture condition for the production of secondary metabolites with antitumor activity was obtained using sucrose (3.0%) as the carbon source and sodium nitrate (0.2%) as the nitrogen source, in pH 4 at 30 °C, for the three human tumor cell lines assessed (HCT-8, MDA-MB435 and SF295), in which 100% of cell growth inhibition was detected; this condition also accounted for the best inhibitory activity of the enzyme APRT of L. tarentolae, presenting 66,41% of inhibition, indicating possible antiparasitary activity. The optimization of the culture conditions for the fungus Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. proved to be relevant for the production of bioactive secondary metabolites.

Três fungos endofíticos isolados de Viguiera robusta (Asteraceae) foram cultivados em três meios de cultivo distintos (Czapek, arroz e extrato de malte) e também em culturas binárias em extrato de malte. Para a extração dos cultivos em extrato de malte foi utilizada a resina diaion HP-20, que promove a adsorção dos metabólitos produzidos pelo fungo, aumentando o rendimento dos extratos. Os extratos e frações obtidos foram submetidos à análise química por meio de técnicas cromatográficas e RMN 1H e a ensaios diversos biológicos para a comparação de seus perfis. O estudo químico do extrato de Chaetomium globosum (VR-10), cultivado em arroz, levou a isolamento da substância S1 (chaetoglobosina E), que apresenta elevada atividade citotóxica e é uma ferramenta importante em biologia química. Também de C. globosum foi isolado a substância S2 (dimetil-tereftalato), o qual já foi identificado como metabólito de fungo endofítico e também de planta. De Pestalotiopsis guepini (VR-8), cultivado em Czapek, foi isolada a substância S3 (tirosol), relatado na literatura como molécula sinalizadora em Candida albicans. Do fungo Cladosporium sphaerospermum (VR-2), após cultivo em arroz, foram isoladas três substâncias: marcfortina A (S4), a marcfortina B (S5) e a marcfortina C (S6) e (S7), substâncias com pronunciada atividade antiparasitária. Foi desenvolvido um método via CLAE-DAD-MS/MS para identificação rápida de derivados de marcfortina, o qual possibilitiou a identificação da substância S7 (marcfortina D) no extrato bruto de C. sphaerospermum. A análise conformacional da marcfortina A (S4) foi realizada através de experimentos de NOE-diff e técnicas de modelagem molecular. Os resultados obtidos nos bioensaios após diferentes cultivos dos fungos endofíticos indicaram que estes são fontes promissoras de substâncias bioativas, constituindo ferramentas importantes na busca por novos compostos. / Three endophytic fungi isolated from Viguiera robusta (Asteraceae) were cultivated in three different culture media (Czapek, rice and malt extract) and also in mixed cultures in the malt extract medium. Diaion HP-20 resin was used for the malt extract cultures extraction increasing the yields of the extracts. Extracts and fractions have been submitted to chemical analyses by chromatographic techniques and 1H NMR, and also to several bioassays for the comparison of their chemical and biological profiles. Chemical study of the rice culture extract from Chaetomium globosum (VR-10) gave the citotoxic compound S1 (chaetoglobosin E), an important chemical biology tool. C. globosum also led to the isolation of compound S2 (dimethyl-terephthalate), previously isolated from an endophytic fungus and also from plants. Compound S3 (tyrosol) has been isolated from the Czapek culture extract of Pestalotiopsis guepini (VR-8). Tyrosol has been reported as a quorum sensing molecule in Candida albicans. Three compounds have been isolated from Cladosporium sphaerospermum (VR-2) rice cuture extract: marcfortine A (S4), marcfortine B (S5) and marcfortine C (S6). Marcfortines have been reported as potent antiparasitic compounds. A HPLC-DAD-MS/MS was developed for the rapid identification of marcfortine derivatives, which allowed the identification of compound S7 (marcfortine D) in the crude extract from C. sphaerospermum. The conformational analysis of marcfortine A (S4) was carried out by NOE-diff experiments and molecular modeling techniques. Bioassays results showed that the endophytic fungi should be considered as promising sources of novel and bioactive compounds.

Estimativas apontam haver no mundo 12 milhões de pessoas infectadas por diferentes espécies de Leishmania, estando 350 milhões de pessoas em situação de risco. A leishmaniose é um grave problema de saúde pública mundial e entretanto não há tratamentos eficientes para o controle desta doença. Fungos endofíticos são fontes promissoras de metabólitos secundários bioativos e isso se deve em parte a sua estreita interação com as plantas hospedeiras. Extratos de culturas do fungo Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc., isolado como endofítico de Smallanthus sonchifolius (yacon), demonstrou em estudos anteriores ser uma fonte promissora de metabólitos secundários distintos, apresentando atividades antibacteriana, antifúngica, citotóxica para linhagens de células tumorais e antiparasitária. Devido a elevada atividade antileishmania detectada, culturas do fungo Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. foram realizadas em duas etapas distintas de cultivo. Obteve-se 1,47g de extrato AcOEt, o qual foi posteriormente fracionado por cromatografia líquida a vácuo. As frações resultantes foram fracionadas por cromatografia líquida clássica e cromatografia líquida de alta eficiência em escala preparativa. Dez substâncias foram isoladas, oito a partir de frações bioativas e suas estruturas foram elucidadas por análises de experimentos de RMN 1D: RMN 1H, RMN 13C e DEPT e 2D: COSY 1H-1H, HMQC 1H-13C e HMBC 1H-13C. As substâncias I e III apresentaram atividade esquistossomicida, causando 100% de morte nos parasitas quando avaliadas nas concentrações de 200 e 50 ?g/mL, respectivamente. Análises por microscopia eletrônica de varredura mostraram alterações morfológicas como o possível mecanismo de ação destas substâncias. As substâncias VII e IX, que parecem ser inéditas na literatura, apresentaram atividade antileishmania com valores de CI50 de 12,54 e 3,04 ?g/mL frente Leishmania braziliensis e 8,78 e 2,87 ?g/mL frente L. chagasi, respectivamente. O presente trabalho corrobora fungos endofíticos como uma fonte promissora, ainda pouco explorada, de novos metabólitos com atividade antileishmania e esquistossomicida. / Leishmaniais affects over 12 million people and 350 million people in 88 countries are at risk. Recognised as a major public health problem, leishmaniasis causes high morbidity and mortality levels. There are currently no vaccines and the available chemotherapy against leishmaniasis still suffers from high toxicity, serious side effects, require long-term treatment and present clinical resistance. Endophytic fungi are promising source of bioactive secondary metabolites due in part of their close interaction with the host plants. In previous studies the fungus Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc., isolated as endophytic fungus from Smallanthus sonchifolius (yacon), demonstrated to be a promising source of secondary metabolites with antibacterial, antifungal, antitumoral and antileishmanial activities. In view of the high antileishmanial activity previously detected, in the present study the endophytic fungus Arthrinium state of Apiospora montagnei was cultivated in a liquid medium under standardized culture condition, yielding 1.47 g of EtOAc extract, which was further fractionated by vacuum liquid chromatography, and the resulting fractions fractionated by liquid chromatography and high performance liquid chromatography. Ten compounds were isolated, nine from bioactive fractions. Their chemical structures were elucidated by analysis of NMR experiments 1D: RMN 1H, RMN 13C and DEPT and 2D: COSY 1H-1H, HMQC 1H-13C and HMBC 1H-13C. The substances I and III showed schistosomicidal activity, causing 100% death of the parasites when evaluated at concentrations of 200 and 50 ?g/mL, respectively. Analysis by scanning electron microscopy suggested that morphological changes are possibly the mechanism of action of these substances. Two new compounds, VII and IX, showed antileishmanial activity with IC50 values of 12.54 and 3.04 ?g/mL against Leishmania braziliensis and 8.78 and 2.87 ?g/mL against L. chagasi, respectively. The present work supports endophytic fungi as a promising source of new metabolites underexplored with antileishmanial and schistosomicidal activity.