Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas / Made available in DSpace on 2012-10-18T01:33:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-25T16:19:13Z : No. of bitstreams: 1 179178.pdf: 1977932 bytes, checksum: 93e10b5b87881c883bc0ffe283686899 (MD5) / Este estudo procurou avaliar os efeitos da [endotelina-1] (ET-1) na motilidade de diferentes porções do trato biliar extra-hepático isolado de cobaia. Os resultados obtidos revelaram que a ET-1 (0,1 a 100 nM) não causou qualquer resposta contrátil dos ductos hepático e cístico ou da porção proximal do [ducto biliar comum] (DBC), assim como, estas preparações não responderam a colecistocinina-8 (CCK-8; 0,1 a 100 nM), a histamina, ao carbacol (10 nM a 100 µM) ou ao KCL 80 mM. Embora o carbacol e a CCK-8 causaram contrações da porção distal do DBC, a ET-1 não causou qualquer resposta contrátil desta porção. A indometacina (5,6 µM) não alterou a reatividade da porção distal do DBC à CCK-8, mas potencializou as resposta ao carbacol e revelou efeitos contráteis da ET-1. A ET-1, a sarafotoxina S6c(0,1 a 100 nM) e a histamina (10 nM a 100 µM) não induziram qualquer efeito contrátil das porções ampular (EOA) e papilar (EOP) do [esfíncter de Oddi]. Em contraste, o carbacol induziu contrações de ambas as porções do EO e a CCK-8 causou apenas pequenas contrações transitórias. Diferentemente da CCK-8, a incubação das preparações com ET-1 ou sarafotoxina S6c causou inibição da contração induzida pelo carbacol em anéis de EOA, mas não EOP. A indometacina aboliu o efeito inibitório causado pela ET-1 (100 nM) sobre as contrações induzidas pelo carbacol no EOA. O efeito depressor da ET-1 no EOA foi parcialmente bloqueado pelo BQ-123 (antagonista ETA), inalterado pelo BQ-788 (antagonista ETB) e totalmente abolido com a incubação das preparações de EOA com ambos os antagonistas. Tais achados permitem concluir que a ET-1, in vitro, não causa qualquer efeito contrátil em nenhum dos ductos do trato biliar extra-hepático, mas inibe as contrações induzidas pelo carbacol no EOA. A síntese de [prostanóides] inibe um efeito contrátil direto da ET-1 na porção distal do ducto biliar comum e também bloqueia o efeito depressor, mediado por [receptores ETA e ETB,] da ET-1 sobre as contrações induzidas pelo carbacol no EOA de cobaia

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-22T07:45:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 229657.pdf: 563902 bytes, checksum: f082a57d58bbfa546797c5aea265f768 (MD5) / O presente estudo investigou a importância de receptores ETB para endotelinas na modulação da resposta de camundongos à aplicação de estímulos nociceptivos químico e térmico e mecânico não nociceptivo na pata traseira. A administração intraplantar de sarafotoxina S6c, um agonista seletivo de receptores ETB, causou hiperalgesia à formalina e à capsaicina e também causou alodinia mecânica, mas não afetou a reatividade à estimulação térmica. As curvas para estes efeitos da sarafotoxina S6c apresentaram formato de sino, ou seja, doses mais elevadas foram inefetivas em causar hiperalgesia química ou alodinia mecânica. Contudo, estas mesmas doses elevadas de sarafotoxina S6c apresentaram efeito hiperalgésico e alodínico quando administradas junto com naltrexona, um antagonista não seletivo de receptores opióides. Antagonistas seletivos de receptores opióides dos tipos m (CTOP ou naloxonazina) ou k (Nor-BNI), mas não d (naltrindole), também conferiram efeito hiperalgésico à sarafotoxina S6c sobre a segunda fase da resposta nociceptiva à formalina. Os resultados indicam que receptores ETB sensibilizam a pata de camundongos a estímulos nocivos químicos e mecânico não nocivo. Contudo, a intensidade desta influência hiperalgésica e alodínica dos receptores ETB é limitada pelo acoplamento adicional destes a um mecanismo analgésico envolvendo a ativação de um sistema opioidérgico local.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2014-08-06T18:09:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 326969.pdf: 3104173 bytes, checksum: 5d02a0f655863a8fa851c60dbe174ee1 (MD5) Previous issue date: 2014 / A dipirona foi introduzida na prática clínica em 1922. Entretanto, apesar dos mais de 90 anos de uso, o seu mecanismo analgésico ainda não foi completamente elucidado. Como já foi demonstrado que a febre induzida por ET-1 é bloqueada pelo tratamento sistêmico com dipirona, neste trabalho avaliamos a capacidade da dipirona e dos seus metabólitos, 4-AA e 4-MAA, de atenuar a nocicepção aguda e hiperalgesia mecânica induzidas pela administração de ET-1. Camundongos receberam uma injeção de ET-1 (10 pmol) na pata traseira direita e, por 30 min, foi cronometrado o tempo gasto lambendo a pata injetada como índice de nocicepção declarada. Em seguida, os animais foram eutanaziados e as patas, coletadas para determinação do edema. Em outro experimento, os animais foram avaliados entre 30 min e 5 h após a injeção de ET-1 através do número de reações de retirada da pata após 10 aplicações do filamento de Von Frey (0,6 g) em intervalos de 30 s, com o objetivo de determinar a hiperalgesia mecânica. O tratamento com a dipirona e seus metabólitos foi feito pelas via sistêmica (i.p., 30 min antes da ET-1), local (s.c. na pata, 20 min antes da ET-1) ou central (i.t.; 15 min antes da ET-1). Foi realizada determinação da atividade da MPO, contagem de células inflamatórias e quantificação dos níveis das citocinas IL-1ß e IL-10 na pele da pata dos animais 15 min ou 4 h após a administração de ET-1. Na nocicepção aguda, todas as substâncias foram efetivas, mas apenas através das vias i.p. e i.t., sendo que a administração de doses semelhantes dos dois metabólitos sugere que a 4-AA é mais efetiva que a 4-MAA. Nenhum tratamento apresentou efeito anti-edematogênico. Na hiperalgesia mecânica o tratamento pelas vias i.p., s.c. e i.t. mostrou efeito anti-hiperalgésico, mas apenas a dipirona e a 4-MAA foram efetivas. A administração de ET-1 não provocou aumento da atividade de MPO ou induziu migração de células inflamatórias para o sítio da administração, mas aumentou os níveis de IL-1ß apenas 4 h após a administração do peptídeo, mostrando sua importância para o estabelecimento da hiperalgesia mecânica, mas não da nocicepção aguda. Os níveis de IL-10, contudo, não foram alterados. O pré-tratamento i.p. com dipirona ou 4-MAA reduziu esses níveis, mas a 4-AA não surtiu efeito. Portanto, o efeito antinociceptivo da dipirona e de seus metabólitos na nocicepção aguda induzida por ET-1 é principalmente central, enquanto que o efeito anti-hiperalgésico é resultante de fatores centrais e locais que envolvem a ação de IL-1ß, provavelmente de células locais e residentes.<br> / Abstract : Dipyrone was introduced into the clinical practice in 1922. However, despite of being used for over 90 years, the mechanism of its analgesic action still has not being completely elucidated. As it was already shown ET-1-induced fever is blocked by systemic pre-treatment with dipyrone, in this study we evaluated the ability of dipyrone and its main metabolites, 4-AA, and 4-MAA, to attenuate ET-1-induced acute nociception and mechanical hyperalgesia Mice received an s.c. ET-1 injection (10 pmol) into the right hindpaw and the time spent licking the injected paw was determined throughout a period of 30 min. By the end of the test the animals were euthanized and the paws were collected for oedema determination. In another set of experiments, animals were evaluated from 30 min up to 5 h after ET-1 administration for mechanical hyperalgesia through the number of paw withdrawal after 10 applications of a von Frey filament (0,6 g) in 30 s intervals. Pre-treatment with dipyrone and its metabolites was done through the systemic (i.p., 30 min before ET-1), local (s.c., 20 min before ET-1) or central (i.t., 15 min before ET-1) routes. Inflammatory cells migration was determined through histology with HE colouring and quantification MPO activity. The quantification of the cytokines IL-1ß and IL-10 was also performed. In the acute nociception all the drugs were effective, but only the i.p. and i.t. routes. The administration of similar doses of the metabolites suggests that 4-AA is more effective than 4-MAA. No treatment showed anti-oedematogenic effects. Mechanical hyperalgesia was attenuated through all the treatment routes, but only dipyrone and 4-MAA were effective. ET-1 did not cause increase in MPO activity or induced inflammatory cell migration, but increased IL-1ß levels (only 4 h after ET-1, which shows that this cytokine is important for the establishment of mechanical hyperalgesia). IL-10 levels remained unaffected. The IL-1ß levels were diminished only in animals pre-treated with i.p. dipyrone or 4-MAA. Therefore, the antinociceptive effect of dipyrone and its metabolites in acute nociception induced by ET-1 results mainly from central action, while the anti-hyperalgesic effects appeared from a combination of central and local components, involving IL-1ß liberation, most likely from local and resident cells. Thus, we showed evidences that indicate a new mechanism through which dipyrone may act as an analgesic drug.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 1994. / Made available in DSpace on 2013-12-05T20:21:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 94857.pdf: 1543078 bytes, checksum: b9b4697207724d8b0fbf65768696a9a7 (MD5) Previous issue date: 1994 / Os efeitos das endotelinas (ETs) no íleo de cobaia submetido a estimulação elétrica de campo foram avaliados. As ETs causaram depressão transitória das respostas neurogênicas e contração sustentada. O efeito depressor independe da síntese de eicosanoídes ou da ativação de canais de cálcio do tipo "L" e parece ser mediado por receptores ETB, pois a ET-1, ET-3 e sarafotoxina S6c são equipotentes e seus efeitos resistentes ao bloqueio por BQ-123. O efeito contratil das ETs depende em parte de eicosanoídes e é fortemente inibido por nicardipina ou cromacalina. Esse efeito das ETs parece ser mediado por receptores ETA e ETB, pois a ET-1 e mais potente que a ET-3 ou sarafotoxina S6c e p BQ-123 bloqueia os efeitos da ET-1, mas não os da sarafotoxina S6c. Além disso, a ET-1 causa dessensibilização a ET-1 mas não a sarafotoxina S6c. Os receptores envolvidos nos efeitos depressor e contratil das ETs não são acoplados através de proteínas g sensíveis a toxina de Bordetella pertussis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T15:42:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 203608.pdf: 485100 bytes, checksum: 270d03eb8fc06f2b7851942951efdcc0 (MD5) / O presente estudo investigou os mecanismos celulares e mediadores envolvidos nas respostas nociceptiva, hiperalgésica e edematogênica, induzidas pela injeção intraplantar (i.pl.) de endotelina-1 (ET-1) em camundongos. O degranulador de mastócitos, composto 48/80, injetado

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-19T22:41:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-26T02:44:43Z : No. of bitstreams: 1 183670.pdf: 21795467 bytes, checksum: 190c190b8aa500694eb142940aeb7515 (MD5) / O presente estudo investigou os efeitos nociceptivo, hiperalgésico e edematogênico de [endotelinas] (ETs) injetadas por via intraplantar na pata de camundongos. Além disso, avaliou a contribuição das ETs endógenas para a [nocicepção] (NOCI) e a [hiperalgesia] (HIPER) desencadeadas por ovoalbumina (OVA) em animais sensibilizados ao antígeno. A HIPER foi avaliada como a potencialização da NOCI induzida por capsaicina. A ET-1 causou efeitos nociceptivo, hiperalgésico e edematogênico dependentes de dose. Estas respostas foram bloqueadas por A-127722.5 ou BQ-123 (antagonistas ETA), mas não por BQ-788 (antagonista ETB). Além disso, sarafotoxina S6c (S6c) e IRL 1620 (agonistas ETB) não deflagram nenhum dos efeitos da ET-1. Porém, o BQ-788 revelou um efeito hiperalgésico à ET-3, e a S6c inibiu a HIPER à ET-1 sem alterar suas ações nociceptiva ou edematogênica. Em outros experimentos, a NOCI induzida por OVA em animais sensibilizados foi reduzida por bosentan (antagonista ETA/ETB), BQ-123 ou A-127722.5, e aumentada por A-192621.1 (antagonista ETB). Finalmente, a HIPER à capsaicina induzida por OVA foi bloqueada por bosentan, A-127722.5 ou A-192621.1. Estes resultados demonstram que as ETs contribuem para efeitos pró-nociceptivos (inclusive alérgico) e edematogênico mediados por receptores ETA em camundongos, enquanto os receptores ETB modulam distintamente estas respostas ao peptídeo.

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:40:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) fernando_conte_ioc_mest_2007.pdf: 1430095 bytes, checksum: e0a9456ac3f4a153b4eb4280d44a16da (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As endotelinas (ETs) são peptídeos, sintetizados por diversos tipos celulares, que exercem seus efeitos através da ligação a dois receptores celulares específicos, ET A e ET B. Níveis aumentados de ET -1 foram encontrados no plasma e no liquido sinovial de pacientes com artrite reumatóide, uma doença auto imune inflamatória crônica caracterizada pelo influxo celular, formação de edema e destruição da articulação. O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel das ETs na inflamação articular no modelo de artrite induzida por zimosan. Inicialmente, camundongos C57BL/6 receberam injeção intra-articular (i.a.) de ET-1 (10 pmol/cav) que, nas primeiras 6 h, induziu a migração de leucócitos, principalmente neutrófilos (sal O,25±0,OO5 x ET-1 O,93±0,OO7 x 10 elevado a 5 células/cav), a formação de edema (sal 0,12±0,04 x ET-1 0,47±0,09 \0394 mm/joelho) que atingiu o pico em 6 h e retomou aos níveis basais em 24 h A sarafotoxina S6c, agonista seletivo do receptor ET B, induziu em 6 h o recrutamento celular, predominantemente neutrófilos (sal 0,13±0,018 x S6c 0,661±0,134 x 10 elevado a 5 células/cav) e a formação de edema (sal 0,14±0,04 x S6c 0,37±0,05 \0394 mm/joelho). Em seguida, camundongos CS7BU6 foram pré-tratados i.a. com antagonistas de receptor ET A e ETB (BQ123 e BQ788, 0,15-150 pmol/cav, respectivamente) 5 mio antes da indução da artrite por zimosan. O pré-tratamento com BQ123 ou BQ788 (15 pmollcav) reduziu, nas 6 primeiras horas, o acúmulo de neutrófilos (64 e 73 % respectivamente), a formação de edema (40 e 61 % respectivamente) e a produção de TNF-\03B1 (39 e 51 % respectivamente) induzi da por zimosan. Vinte e quatro horas após, ambos pré-tratamentos reduziram o acúmulo de neutrófilos (65 e 61 % respectivamente), a formação de edema (43 e 52 % respectivamente) e a produção de CXCLl (12 e 11 % respectivamente). Mais aindas o estímulo i.a. com zimosan reduziu significativamente a intensidade de expressão de ETb (6 e 24 h) e ETa (24 h). Tomados em conjunto, esses dados apontam para a participação das ETs, atuando através de seus dois receptores, na inflamação articular / Endothelins (ETs) are peptides produced by a wide variety of cells that exert their functions through ET A and ET B receptors. Increased ET - 1 l evels were found in plasma and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis, an autoimmune disease characterized by cell influx, edema formation and joint destruction. The aim of this study was to evaluate the role of ETs in knee joint inflammatio n induced by zymosan. We evaluated in C57BL/6 mice the effect of intra - articular (i.a.) injection of ET - 1 (10 pmol/cav) in C57BL/6 mice induced at 6 h an increase on cellular migration, mainly due to neutrophil accumulation (sal 0.25±0.005 x ET - 1 0.93±0.00 7 x 10 5 cells/knee) and on edema formation (sal 0.12±0.04 x ET - 1 0.47±0.09 ? mm/knee), that peaked within 6 h and returned to basal levels at 24 h. A selective ET B receptor agonist, sarafotoxin S6c (S6c; 30 pmol/cav; i.a.), induced at 6 h a significant increase on cellular recruitment, mainly by neutrophil accumulation (sal 0.13±0.018 x S6c 0.661±0.134 x 10 5 cells/knee) and on edema formation (sal 0.14±0.04 x S6c 0.37±0.05 ? mm/knee). Next, we evaluated the effect of i.a. injection of ET A and ET B receptor antagonists (BQ - 123 and BQ - 788, 0,15 - 150 pmol/cav, respectively) o n zymosan - induced arthritis in C57BL/6 mice. Pre - treatment with BQ - 123 and BQ - 788 (15 pmol/cav) reduced 6 h zymosan - induced accumulation of neutrophil (64 and 73 % respectively) edema formation (40 and 61 % respectively) and TNF - a levels (39 and 51 % respe ctively); as well as 24 h zymosan induced neutrophil influx (65 and 61 % respectively), edema formation (43 and 52 % respectively) and CXCL1 levels (12 and 11 % respectively). Moreover, 6 and 24 h after zymosan stimulation we observed a significant decreas e on ET B receptor expression when compared to control group, whereas ET A receptor expression was reduced only within 24 h after stimulation. Taken together, this results point to a participation of ETs on knee joint inflammation

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-19T08:46:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-26T00:39:12Z : No. of bitstreams: 1 183504.pdf: 23422219 bytes, checksum: 5d0f985ca26ace66a571ab32ff41361a (MD5) / O estudo avalia as ações contráteis das [endotelinas] (ETs) na [vesícula biliar] (VB) de [cobaia], comparando-as com aquelas da VB de [coelho], bem como o papel de [prostanóides] e do [cálcio intracelular] nas contrações induzidas através de receptores ETA e ETB. A ET-1 é um potente agonista contrátil da VB de coelho, que parece expressar um predomínio maior de receptores ETB sobre os ETA do que a VB de cobaia. Os prostanóides são importantes na mediação/modulação dos efeitos contráteis das ETs na VB de cobaia, pois a [indometacina] (INDO) inibe as contrações por elas induzidas, e esses peptídeos estimulam a produção de prostaciclina. As contrações tônicas induzidas pelas ETs na VB de cobaia correlacionam-se a aumentos proporcionais da concentração de cálcio intracelular livre. Os perfis inibitórios da INDO sobre as contrações e aumentos da fluorescência induzidas pelas ETs na VB de cobaia sugerem que receptores ETA e ETB sinalizam a produção de conjuntos distintos de prostanóides que exercem influências inibitórias e excitatórias na contratilidade do músculo liso, respectivamente. A relevância fisiológica e/ou fisiopatológica destes achados permanece a ser esclarecida.

Orientador: Gilberto de Nucci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-21T06:44:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faro_RenatodoRegodeAraujo_M.pdf: 2120397 bytes, checksum: 1e48a1f282cdc1ee3080753dbcfb0f3a (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Os efeitos vasculares da endotelina-1 (ET-1) , da sarafotoxina 6b (S6b) e o IRL-1620 foram investigados em leito arterial hepático isolado de cão antes e durante a infusão de inibidores da ciclo-oxigenase e da óxido nítrico sintetase (indometacina e L-NAME, respectivamente). Administrações de noradrenalina (NA) foram usadas como agente vasoconstritor controle em nossos experimentos. Após a retirada cirúrgica do órgão, a veia cava (porções abdominal e supra-diafragmática), veia porta e artéria hepática foram canuladas. O órgão foi perfundido através da artéria hepática e da veia porta com solução nutritiva de .Krebs oxigenada e aqueci da a 37oC. Injeções em bolus de ET-1 (0.4-400 pmol), S6b (0.4-400 pmol), IRL-1620 (40-1200 pmol) e NA (5-500 nmol) foram feitas através da artéria hepática e as respostas da prepa~ação foram registradas em polígrafo. A administrações de ET -1 e S6b nduziram uma resposta vasoconstritora dependente da dose e de longa duração, acompanhadas de liberação significativa de prostaciclina (PGI2). A infusão de indometacina (5,6 J.!M) neste sistema tendeu a aumentar, porém não significativamente, as respostas vasculares induzidas por estes agonistas. A subseqüente infusão de L-NAME (10 J.!M), potenciou a resposta vasoconstritora induzida tanto pela ET-1 quando pela S6b (P<0.05). A infusão de IRL-1620 não produziu efeito significativo na resistência vascular arterial hepática mesmo na presença simultânea dos antagonistas. A infusão do antagonista seletivo para receptores ET A (FR 139317; 0,3 J.!M), .reduziu significantemente as respostas vasoconstritoras induzidas por ET-1 e S6b, sem no entanto afetar a resposta induzida por NA. O IRL-1620 (mas não a ET-1) foi capaz de produzir uma liberação significativa de hemoglobina do circuito hepático, sem no entanto causar uma resposta pressórica importante. Isso sugere uma distribuição preferencial de receptores do tipo ETS no leito venoso hepático. Estes resultados indicam que as respostas pressóricas do fígado isolado e perfundido de cão às administrações de ET-1 e S6b, que são medidas principalmente por n ativação de receptores ET A no leito arterial hepático são moduladas pela liberação acoplada de mediadores vasodilatadores incluindo a PGI2 e o óxido nítrico (NO) / Abstract: The vascular effects of endothelin-1 (ET-1; ET A and ETB receptor agonist), sarafotoxin 6b (S6b; ET A receptor agonist) and I RL-1620 (ET B receptor agonist) were investigated in the isolated canine liver arterial circuit before and afier infusions of indomethacin (cyclo-oxygenase inhibitor) and N(()L nitro arginine methyl ester (L-NAME; nitric oxide synthesis inhibitor). Noradrenaline (NA) was used as a control vasoconstrictor agent. The vena cava, portal vein and hepatic artery were cannulated in vitro and the liver was perfused ~via the hepatic artery and the portal v~in with oxygenated Krebs solution at 37oC. Intra-arterial bolus injections of either ET-1 (0.4 - 400 pmol) or S6b (0.4 400 pmol) induced dose-dependent and long-Iasting vasoconstriction accompanied by significant prostacyclin release. The vasoconstrictor responses to these peptides were increased (but no significantly) during the infusion of indomethacin (5.6 ~M). Subsequent infusion of L-NAME (10 ~M) potentia~ed both ET-1 and S6b- induced vasoconstriction (p<0.05) as well as NA- induced vasoconstriction. IRL-1620 had no significant effect on the hepatic arterial vascular resistance, even in the presence of indomethacin and L-NAME. Infusion of the ET A receptor antagonist FR 139317 (0.3 ~M) markedly reduced both the ET -1 and S6b - induced vasoconstrictions without affecting those evoked by NA. IRL-1620 (but not ET-1) induced a significant release of haemoglobin into the venous effluent, suggesting that ET B receptors are located in the venous bed of the hepatic circulation. These results indicate that the pressor responses to ET -1 and S6b in this system are modulated by the concomitant release of vasodilator mediators, including prostacyclin and nitric oxide. These effects appear to depend primarily on the activation of the ET A receptor / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica / La Enzima Convertidora de Endotelina - 1c (ECE-1c) es una metaloproteasa de membrana que participa en la síntesis de Endotelina-1 y se ha demostrado que tiene un rol en invasión en cáncer de mama, ovario y próstata. La región N-terminal de ECE-1c posee tres sitios putativos de fosforilación por la proteína kinasa CK2. En esta tesis se estudió la fosforilación de ECE-1c por CK2 y cómo esto afecta la migración e invasión celular en un modelo de cáncer de colon. La hipótesis de esta tesis fue “La proteína kinasa CK2 fosforila y estabiliza a ECE-1c, promoviendo la invasividad de células de cáncer colorrectal”. El objetivo general fue determinar si la proteína kinasa CK2 fosforila a ECE-1c en su extremo N-terminal afectando su estabilidad y si esto tiene un efecto en el potencial invasivo de células de cáncer colorrectal. Para responder a esto se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Determinar si CK2 fosforila a ECE-1c en su región N-terminal in vitro y en líneas celulares de cáncer colorrectal; 2. Estudiar si CK2 regula mediante fosforilación la estabilidad ECE-1c en células no tumorales y de cáncer colorrectal; y 3. Evaluar si CK2 regula vía ECE-1c la migración e invasividad in vitro de células de cáncer colorrectal. Un análisis in silico mostró que la región N-terminal de ECE-1c contiene tres sitios putativos de fosforilación por CK2: Thr9, Ser18 y Ser20. En base a este antecedente se realizaron ensayos in vitro utilizando ATP radiactivo y la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GST como sustrato, mostrando que CK2 es capaz de fosforilar dicha región. Estos resultados fueron confirmados al analizar los sustratos fosforilados con espectrometría de masas, mostrando que los residuos fosforilados in vitro fueron Ser18 y Ser20. Para demostrar si la fosforilación ocurre en un contexto celular, se inmunoprecipitó ECE-1 en tratamiento con el inhibidor de CK2, TBB, desde células de cáncer de colon DLD-1. La marca de fosforilación se detectó con un anticuerpo antifosfo-S/T/Y, mostrando que la inhibición de CK2 disminuye la marca de fosforilación de ECE-1 total. Posteriormente se evaluó si los niveles de ECE-1 eran afectados por la inhibición de CK2 en células embrionarias HEK-293T y de cáncer de colon DLD- 1. Tal como se esperaba, la inhibición de CK2 utilizando TBB o CX-4945 disminuyó los niveles proteicos de la ECE-1 endógena y de la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GFP en ambas líneas celulares. Adicionalmente, se realizaron ensayos de estabilidad proteica utilizando cicloheximida y se mostró que la inhibición de CK2 con TBB disminuyó la estabilidad de la región N-terminal de ECE-1c fusionada a GFP en células embrionarias HEK-293T y de cáncer de colon DLD-1. Por otro lado, las mutantes de ECE-1c fosfomimética (DDD) y no fosforilable (AAA) por CK2 expresadas en células CHO-K1, demostraron tener mayor y menor estabilidad proteica, respectivamente. Finalmente, ensayos funcionales de migración-3D e invasión celular utilizando cámaras de transwell/matrigel, mostraron que ECE-1c es capaz de aumentar el potencial migratorio/invasivo de células de cáncer de colon DLD-1. Además, la sobreexpresión de la mutante no fosforilable por CK2 (AAA) no fue capaz de modificar la capacidad migratoria ni invasiva de esta línea celular. En conclusión, estos resultados sugieren que CK2, por fosforilación en el extremo N-terminal, aumenta la estabilidad de ECE-1c, lo que conduce a un aumento en la invasión de células de cáncer de colon. Estos hallazgos dan luces de un nuevo mecanismo por el cual CK2 promueve la progresión maligna de esta devastadora enfermedad / Endothelin Converting Enzyme - 1c (ECE-1c) is a membrane metalloprotease involved in endothelin-1 synthesis and has been shown to have a role in invasion promotion in breast, ovarian and prostate cancer. N-terminal region of ECE-1c has three putative phosphorylation sites for CK2. In this thesis, we studied whether ECE-1c phosphorylation by CK2 affects cell migration and invasion in a colon cancer model. The hypothesis of this thesis was "CK2 protein kinase phosphorylates and stabilizes ECE-1c, thereby promoting invasiveness of colorectal cancer cells." The overall objective was to determine whether CK2 protein kinase phosphorylates ECE-1c at its N-terminal affecting its stability and whether this has an effect on the invasive potential of colorectal cancer cells. In order to answer this, the following specific objectives were considered; 1. To determine whether CK2 phosphorylates ECE-1c at its Nterminal region in vitro and in colon cancer cell lines; 2. To study whether CK2 phosphorylation regulates ECE-1c stability in non-tumor and colorectal cancer cells; and 3. To evaluate whether CK2 regulates migration and invasion of colorectal cancer cells via ECE-1c phosphorylation. An in silico analysis showed that the N-terminal region of ECE-1c has three putative phosphorylation sites for CK2: Thr9, Ser18 and Ser20. Based on this background, we performed an in vitro phosphorylation assay using radioactive ATP and the N-terminal region of ECE-1c fused to GST as substrate, showing that CK2 phosphorylates this region. These results were confirmed by analyzing phosphorylated substrates with mass spectrometry, showing that the phosphorylated residues were Ser18 and Ser20. To show whether phosphorylation occurs in a cellular context, we performed and immunoprecipitation assay inhibiting CK2 with TBB in DLD-1 colon cancer cells, detecting ECE-1 phosphorylation mark. Phosphorylation was detected with an antifosfo-S/T/Y antibody showing that CK2 inhibition decreases ECE-1 phosphorylation mark. Subsequently we assessed whether ECE-1 levels were affected by CK2 inhibition in HEK-293T cells and DLD-1 colon cancer cells. As expected, CK2 inhibition using TBB or CX-4945 decreased protein levels of endogenous ECE-1 and N-terminal region of ECE-1c fused to GFP in both cell lines. Additionally, assays of protein stability were performed using cycloheximide and showed that inhibition of CK2 with TBB decreased stability of the N-terminal region of ECE-1c fused to GFP in HEK-293T and DLD-1 colon cancer cells. In this context, ECE-1c mutants phosphomimetic and not phosphorylatable by CK2 expressed in CHO-K1 cells were shown to have more or less protein stability, respectively. Finally, functional assays and 3D-cell migration and invasion using Transwell chambers, showed that ECE-1c is capable of increasing the migration/invasiveness potential in DLD-1 cells. In addition, the nonphosphorylatable by CK2 mutant was not able to increase migration or invasive capacity. In conclusion, these results suggest that colon cancer cell invasion is promoted by protein kinase CK2 through the increase of endothelinconverting enzyme-1c protein stability by phosphorylation of its N-terminal end. These findings shed lights on a novel mechanism by which CK2 promotes malignant progression of this devasting disease / Conicyt; Fondecyt