L’ischémie/reperfusion (I/R) occurrente à toutes transplantations d’organe solide, constitue un stimulus pro-autophagique/pro-apoptotique pour les cellules endothéliales. Nous avons récemment démontré que les cellules endothéliales apoptotiques (CEapo) sécrètent des vésicules apoptotiques exosome like (ApoExo) qui induisent une réponse auto-immune et accélèrent le rejet vasculaire dans un modèle de greffe aortique chez la souris. Ces ApoExo qui diffèrent des corps apoptotiques classiques par leur structure et leur contenu protéique contiennent le fragment C-terminal du perlécan, LG3. Le LG3, un auto-antigène d’importance en transplantation, favorise le remodelage vasculaire et est augmenté en circulation chez les patients greffés rénaux atteints d’un rejet vasculaire. De plus, la présence d’anticorps anti-LG3 avant la transplantation est associée à un risque plus élevé de développer un rejet vasculaire chez des patients greffés du rein et à la perte du greffon à long terme. Il est connu que la génération du fragment LG3 implique la protéolyse du perlécan par la cathepsine L, une protéase lysosomiale, mais le mécanisme de transport de ce fragment au sein des ApoExo est encore inconnu. Nous avons émis l’hypothèse que l’activité lysosomiale et l’autophagie jouent un rôle important dans la maturation et le chargement du LG3 dans les vésicules ApoExo sécrétées par les CEapo. Une étude longitudinale de microscopie électronique chez les cellules endothéliales humaines carencées en sérum pendant 1h, 2h et 3h, nous a révélé la présence du perlécan / fragment LG3 au sein de compartiments autophagiques (autophagosomes et autophagolysosomes) à différentes étapes du processus autophagique. Après 3 heures de carence en sérum, nous avons identifié le fragment LG3 dans des vésicules membranaires situées au sein de grands réseaux vacuolaires s’apparentant à des autophagolysosomes. L’inhibition de la cathepsine L, de l’acidification du lysosome et de l’autophagie diminuent la présence du fragment LG3 dans les vésicules ApoExo sans affecter la sécrétion de vésicules démontrant donc le rôle de l’autophagie dans l’intégration du fragment LG3 au sein des ApoExo. Toutefois, l’injection de vésicules ApoExo LG3-, provenant de cellules murines aortiques traitées à la bafilomycine, dans un modèle murin de greffe aortique induit une réponse auto-immune anti-LG3 ainsi qu’un remodelage vasculaire à des niveaux similaires aux souris ayant reçu des ApoExo véhicule. Une analyse protéomique de ces vésicules ApoExo LG3-, nous a révélé que la bafilomycine modifie le contenu protéique des ApoExo en induisant une augmentation de la présence de protéines lysosomiales et de la matrice extracellulaire dont le perlécan. Ceci suggère que la présence du motif LG3 au sein du perlécan natif non clivé dans les ApoExo LG3- pourrait être responsable de la mise en place de la réponse anti-LG3 observées chez les souris. Les travaux de ce doctorat ont permis de mettre en évidence que l’autophagie dans les cellules endothéliales productrices d’ApoExo ne régule pas l’immunogénicité des ApoExo. Cependant, elle régule au sein des cellules endothéliales apoptotiques le transport et le clivage du perlécan qui lui est immunogène. En effet, l’autophagie module les différentes formes de perlécan natif et clivé sécrétées dans les ApoExo. L’étude chez la souris greffée nous a donc permis de considérer non plus l’implication du fragment LG3 mais l’implication du motif LG3 présent au sein du perlécan natif non clivé et de ses différentes formes intermédiaires dans la réponse auto-immune anti-LG3 et le rejet vasculaire. La modulation de la sécrétion du perlécan et du LG3 dans les ApoExo constitue une cible thérapeutique potentielle afin de diminuer la réponse auto-immune pouvant augmenter le dommage vasculaire après la greffe / Ischemia/reperfusion (I/R) occurring in all solid organ transplantation, constitute a proautophagic / pro-apoptotic stimulus on endothelial cells. We recently demonstrated that apoptotic endothelial cells (CEapo) secrete apoptotic exosome-like vesicles (ApoExo) that induce autoimmune response and accelerate vascular rejection in a mouse aortic transplant model. These ApoExo, that differ from classical apoptotic bodies in structure and protein content, contain the C-terminal fragment of perlecan, LG3. LG3, an autoantigen of importance in transplantation, promotes vascular remodeling and is increased in circulation in renal transplant patients undergoing vascular rejection. In addition, the presence of anti-LG3 antibodies prior to transplantation is associated with a higher risk of developing vascular rejection in kidney transplant patients and long-term graft loss. It is known that the generation of LG3 fragment involves the proteolysis of perlecan by cathepsin-L, a lysosomal protease, but the mechanism of export of this fragment within ApoExo is still unknown. We hypothesized that lysosomal activity and autophagy play an important role in the maturation and the secretion of LG3 in ApoExo vesicles secreted by CEapo. Longitudinal electron microscopy study after 1h, 2h and 3h in serum starved endothelial human cells revealed the presence of perlecan / LG3 fragment within autophagic compartments (autophagosomes and autophagolysosomes) at different stages of the autophagic process. After 3 hours of serum starvation, we identified LG3 fragment in membrane vesicles located within large vacuolar networks reminiscent of autophagolysosomes. Inhibition of cathepsin-L, of lysosomal acidification and of autophagy decrease the presence of LG3 fragment in ApoExo vesicles without affecting vesicle secretion thus demonstrating the role of autophagy in the secretion of LG3 fragment within ApoExo. However, Injection of ApoExo LG3- vesicles from bafilomycin-treated aortic murine cells into a murine aortic transplant model induces autoimmune anti-LG3 response and vascular remodeling at levels similar to the ApoExo vehicle mice control group. Proteomic analysis of ApoExo from bafilomycin-treated aortic murine cells has demonstrated that bafilomycin modifies ApoExo protein content by inducing an increase of the presence of lysosomal proteins and the extracellular matrix, including perlecan. This suggests that the presence of LG3 motif in uncleaved native perlecan in ApoExo LG3- could be responsible for the establishment of the anti-LG3 response as well as the vascular remodeling observed in mice. Collectively, these results demonstrate that autophagy in endothelial cells producing ApoExo does not regulate the immuogenicity of ApoExo. However, it regulates within apoptotic endothelial cells the processing and cleavage of perlecan who is immunogenic. Indeed, autophagy modulates the different forms of native and cleaved perlecan secreted in ApoExo. Grafted mice study thus allowed us to consider neither the involvement of the LG3 fragment but the implication of the LG3 motif present in the uncleaved native perlecan and its intermediate forms in the anti-LG3 autoimmune response and vascular rejection. Modulating perlecan and LG3 secretion in ApoExo vesicles is a potential therapeutic target to reduce the autoimmune response that can increase vascular damage after transplantation.

L’insuffisance rénale aiguë (IRA) est une complication clinique associée à une mortalité significative. Parmi les diverses causes d'IRA, l'ischémie-reperfusion (IRI) est une étiologie importante, en particulier dans le contexte de la transplantation rénale. Les types de mort cellulaire programmée (MCP) activées dans l'IRA induite par IRI ont été étudiées par des nombreux groupes. L’atteinte tubulaire épithéliale est classiquement considérée comme le principal contributeur à l'IRA.En effet, plusieurs morts programmées de cellules tubulaires ont été démontrées dans la littérature. Cependant, les lésions endothéliales microvasculaires rénales attirent davantage l'attention en tant qu'inducteurs cruciaux de dysfonctionnement microvasculaire et de fibrose rénale progressive. Ainsi, certaines équipes de recherche, dont la nôtre a rapporté le développement de l'apoptose endothéliale rénale en association avec l’IRI. Le but de mon travail était donc de caractériser les types de mort cellulaire microvasculaires secondaires à l’IRI et leur contribution à la dysfonction rénale. Pour évaluer l'importance de l'apoptose dans l'IRA induite par IRI, nous avons utilisé un modèle murin d’IRI chez des souris caspase-3 knock-out (KO) et sauvages, avec clampage de l'artère rénale pendant 30 minutes (modèle IRA légère) ou 60 minutes (modèle IRA sévère). Dans le modèle IRA légère, notre résultat montre que la carence en caspase-3 empêche la mort apoptotique des cellules endothéliales dans toutes les phases de l'IRA, atténuant la raréfaction microvasculaire, le dépôt de collagène et la fibrose rénale. L’absence de caspase-3 favorise aussi le maintien d’une perméabilité endothéliale microvasculaire normale à long terme. Toutefois, l’invalidation de la caspase-3 aggrave la mort cellulaire tubulaire à court terme en favorisant la nécroptose, mais améliore l’homéostasie tubulaire à long terme grâce à la préservation des capillaires péritubulaires (PTCs) permettant un maintien de la perfusion tubulaire. En outre, le déficit en caspase-3 est également associé à un effet protecteur contre la raréfaction microvasculaire rénale, la fibrose rénale progressive, ainsi qu'une perméabilité endothéliale améliorée et une préservation de la fonction rénale dans le modèle d’IRA sévère. En conclusion, nos résultats démontrent l'effet crucial de l’apoptose endothéliale microvasculaire en tant qu'inducteur de dysfonctionnement microvasculaire rénal, de raréfaction microvasculaire et de fibrose rénale progressive dans la physiopathologie de l'IRA légère et sévère induite par l'IRI. Ils établissent aussi l’importance prédominante de l’atteinte microvasculaire plutôt que tubulaire épithéliale dans la prédiction de la perte de fonction rénale à long terme suite à une IRI. / Acute kidney injury (AKI) is a crucial clinical event, with increasing incidence and mortality. Among various pathogenesis of AKI, ischemia-reperfusion injury (IRI) is an important etiology, especially in the renal post-transplant scenario. The complex of programmed cell deaths (PCD) developed in IRI-induced AKI has been proven in a number of investigations. Renal tubular epithelial injury has been considered as the major contributor in AKI and multiple programmed tubular epithelial cell (TECs) deaths have been demonstrated in the literature. However, renal microvascular endothelial injury is attracting more attention as an important inducer of microvascular dysfunction and renal progressive fibrosis. Some investigators, including our team, have reported the development of renal endothelial apoptosis in the condition of ischemia. Apoptosis, a commonly known programmed cell death, has been elucidated in both renal TECs and microvascular endothelial cells (ECs) post-IRI and the activation of caspase-3 functions as the key effector of caspase-dependent apoptosis. To verify the importance of apoptosis in IRI- induced AKI, we applied the in vivo murine renal IRI model in wild-type and caspase-3 KO mice, with clamping the renal artery for 30 minutes (mild AKI model) or 60 minutes (severe AKI model). In regard to the mild AKI model, our result demonstrates that caspase-3 deficiency prevents ECs apoptotic death in all phases of AKI, attenuating microvascular rarefaction, collagen deposition, and renal fibrosis, while maintaining physical endothelial permeability in the long-term. Meanwhile, caspase-3 deletion aggravates tubular injury in the short-term by promoting TECs necroptosis but ameliorates long-term tubular injury through preserved peritubular capillaries (PTCs) function. Furthermore, caspase-3 deficiency also demonstrated a protective effect against renal microvascular rarefaction, progressive renal fibrosis, as well as enhanced endothelial permeability in the severe AKI model. Conclusively, our findings determine the crucial effect of microvascular endothelial apoptosis as an inducer of renal microvascular dysfunction, microvascular rarefaction, and progressive renal fibrosis in the pathophysiology of mild and severe AKI induced by IRI. Additionally, our results demonstrate the predominant importance of microvascular endothelial injury over tubular epithelial injury in predicting renal function loss at long-term post-IRI.

La rétinopathie du prématuré, modélisée par les modèles de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR), est l’une des principales causes de cécité dans l’enfance. Elle est constituée d’une première phase de vaso-oblitération rétinienne et choroïdienne suivie d’une phase de néovascularisation post-ischmémique rétinienne. La phase de dégénérescence vasculaire est entre autres liée d’une part à une baisse de l’expression des facteurs pro-angiogéniques et d’autre part à une inflammation rétinienne excessive. Toutefois, les mécanismes post-transcriptionnels à l’origine de ces phénomènes demeurent peu connus. La dérégulation des microARNs (miRs), des ARNs non codants régulant négativement l'expression des gènes, est impliquée dans la modulation de multiples processus physiologiques et pathologiques dont l’angiogenèse et l'inflammation. Cependant, le rôle des miRs dans l’angiogenèse et l’inflammation au cours de l’OIR reste à explorer. Basé sur l’établissement préalable d’un profil de modulation de l’expression des miRs au cours de l’OIR, nous avons sélectionné et caractérisé dans cette thèse le rôle d’un miR sur la fonction angiogénique puis d’un miR sur la fonction inflammatoire dans l’OIR. Nous avons caractérisé dans un premier temps, le miR-96. L’expression du miR-96 était significativement diminuée in vivo dans la rétine et la choroïde lors de la phase de vaso-oblitération du modèle murin de l’OIR. In vitro, le miR-96 était régulé négativement par l’hyperoxie dans les cellules endothéliales rétiniennes. La supplémentation en miR-96 avait un effet pro-angiogénique sur les cellules endothéliales rétiniennes soumises à l’hyperoxie par la préservation de la signalisation de facteurs angiogéniques, tels que VEGF et Ang2, leur permettant de maintenir leur capacité de migration et de tubulogenèse. In vivo, la supplémentation intravitréenne en miR-96 exerçait également ces fonctions vaso-protectives et permettait de préserver la microvascularisation rétinienne et choroïdienne par le maintien du niveau d’expression physiologique de VEGF et Ang2. Dans un second temps, nous avons caractérisé le miR-125a. L’expression du miR-125a était significativement diminuée in vivo dans la rétine lors de la phase de vaso-oblitération du modèle murin de l’OIR, mais également in vitro dans les cellules microgliales soumises à l’inflammation par hyperoxie ou LPS, ce qui était inversement corrélé à une augmentation de cytokines pro-inflammatoires telles que TNF-a, IL-6 et IL-16. Le miR-125a a été caractérisé comme anti-inflammatoire et sa supplémentation dans les cellules microgliales activées diminuait significativement l’expression de ces marqueurs pro-inflammatoires. La modification du sécrétome des cellules microgliales permettait une récupération des capacités angiogéniques des cellules endothéliales rétiniennes avec amélioration de leur prolifération et de leur tubulogenèse. In vivo, la supplémentation intravitréenne en mir-125a permettait de maintenir une expression physiologique de TNF-a, IL-6 et IL-16, ce qui était associé à une diminution de la vaso-oblitération rétinienne. Collectivement, ces travaux ont permis d’identifier et de caractériser le rôle du miR-96 dans la dysfonction angiogénique et du miR-125a dans la dysfonction inflammatoire lors de l’OIR. Cette thèse démontre pour la première fois qu’une thérapie basée sur la modulation de miRs spécifiques permettait de prévenir la dégénérescence vasculaire de l’OIR. Ces résultats pourraient constituer la base de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement précoce des rétinopathies ischémiques comme la rétinopathie du prématuré. / Retinopathy of prematurity is one of the leading causes of blindness in childhood and is represented by oxygen-induced retinopathy (OIR) models. It’s characterized by a first phase of retinal and choroidal vasoobliteration followed by a retinal neovascularization. The vascular degeneration is partly linked to a decrease in the expression of pro-angiogenic factors and to an excessive retinal inflammation. However, the post-transcriptional mechanisms implicated remain poorly understood. microRNAs (miRs) are non-coding RNAs that negatively regulate gene expression. Dysregulation of miRs is involved in the modulation of multiple physiological and pathological processes including angiogenesis and inflammation. However, the role of miRs in angiogenesis and inflammation during OIR remains to be explored. Based on the prior establishment of the modulation profile of miRs expression during OIR, we selected and characterized in this thesis the role of a miR on the angiogenic function then another miR on the inflammatory function in OIR. We first characterized the miR-96. In vivo, miR-96 expression was significantly downregulated in the retina and choroid during the vaso-obliteration phase of OIR rat. In vitro, miR-96 was downregulated by hyperoxia in retinal endothelial cells. miR-96 overexpression had a pro-angiogenic effect on retinal endothelial cells subjected to hyperoxia by preserving the signaling of angiogenic factors including VEGF and Ang2. This allowed to maintain their capacity for migration and tubulogenesis. In vivo, intravitreal supplementation with miR-96 also exerted these vasoprotective functions and preserved retinal and choroidal microvasculature by maintaining the physiological expression level of VEGF and Ang2. Secondly, we characterized the miR-125a. In vivo, the expression of miR-125a was significantly reduced in the retina during the vaso-obliteration phase of the OIR rat. In vitro, miR-125a was downregulated in microglial cells subjected to inflammation by hyperoxia or LPS, which was inversely correlated with an increase in pro-inflammatory cytokines such as TNF-a, IL-6 and IL-16. miR-125a was characterized as anti-inflammatory and its overexpression in activated microglial cells significantly decreased the expression of these pro-inflammatory markers. The modification of the secretome of the microglial cells allowed a recovery of the angiogenic capacities of the retinal endothelial cells with improvement of their proliferation and their tubulogenesis. In vivo, intravitreal supplementation with mir-125a maintained a physiological expression of TNF-a, IL-6 and IL-16, which was associated with a decrease in retinal vaso-obliteration. Collectively, these tasks identified and characterized the role of miR-96 in angiogenic dysfunction and miR-125a in inflammatory dysfunction during OIR. This thesis demonstrates for the first time that a therapy based on the modulation of specific miRs can prevent the OIR vascular degeneration. These results could form the basis of new therapeutic strategies in the early treatment of ischemic retinopathies such as retinopathy of prematurity.

De nombreuses études se sont intéressées aux effets délétères de la ménopause dans l’augmentation du risque de maladies cardiovasculaires et de troubles cognitifs. La chute des concentrations en hormones sexuelles liée à la ménopause impacte la pression artérielle, premier acteur responsable dans l’augmentation de la prévalence des maladies cardiovasculaires et des troubles cognitifs. Dans la population masculine, l’activité physique et ses effets notamment hypotenseurs apparaissent comme une stratégie non pharmacologique hautement efficace dans le maintien de la santé cardiovasculaire et cognitive. En revanche, les effets bénéfiques d’un mode de vie physiquement actif sur la pression artérielle, la santé vasculaire et la santé cognitive ne sont pas encore globalement admis chez les femmes post-ménopausées. Par conséquent, l'objectif de cette thèse était d'étudier l'impact de la ménopause sur la pression artérielle, les facteurs qui la régulent et les fonctions cognitives chez des femmes physiquement actives. A partir de la littérature existante, nous avons formulé l’hypothèse générale que la pression artérielle et les fonctions cognitives seraient préservées chez femmes post-ménopausées (stade + 1 de la classification STRAW+10) physiquement actives (≥150 min/sem d’activité physique à intensité modérée ou ≥ 75 min/sem d’activité physique à intensité vigoureuse) par rapport à des femmes pré-ménopausées (stade -3 de la classification STRAW+10) physiquement actives. Nous avons également formulé l’hypothèse que les marqueurs de santé vasculaires seraient préservés chez ces femmes post-ménopausées physiquement actives par rapport au groupe de femmes pré-ménopausées physiquement actives. Une revue de littérature et deux études transversales ont été réalisées pour vérifier ces hypothèses. Notre revue de littérature a mis en évidence : L’effet de la privation d'hormones sexuelles sur les mécanismes physiologiques impliqués dans l'augmentation de la pression artérielle à la ménopause. L'effet bénéfique de l’activité physique dans la prévention et le traitement de l'hypertension chez les femmes ménopausées. Les limites actuelles de la littérature scientifique quant aux effets bénéfiques de l’activité physique sur les mécanismes physiologiques régulant la pression artérielle. Nos études expérimentales ont permis de conclure que : Les femmes post-ménopausées physiquement actives ont des valeurs moyennes de pressions artérielles (systolique et diastolique) et des marqueurs vasculaires (rigidité artérielle, fonction endothéliale, sensibilité du baroréflexe) préservés par rapport aux femmes pré-ménopausées physiquement actives. Ces mêmes femmes post-ménopausées physiquement actives performent aussi bien que leurs homologues pré-ménopausées aux tests cognitifs évaluant la vitesse de traitement et les fonctions exécutives notamment pour les composantes inhibition et alternance. En revanche, elles performent moins bien que le groupe pré-ménopausées pour les tests évaluant la mémoire de travail. Cette thèse montre donc que d’être physiquement actif a des effets positifs sur la pression artérielle et les fonctions vasculaires des femmes en début de ménopause. Cependant cela ne permet pas de limiter totalement la baisse de la performance cognitive, notamment dans les domaines cognitifs évaluant les fonctions exécutives (mémoire de travail). Nous concluons que d’être physiquement actif permet de compenser certaines conséquences vasculaires, mais pas certaines conséquences cognitives associées à la transition ménopausique. / Numerous studies have focused on the deleterious effects of menopause that result in a greater risk of cardiovascular diseases and cognitive disorders. The fall in sex hormone concentrations associated with menopause increases blood pressure, which is the main factor involved in the increased prevalence of cardiovascular diseases and cognitive disorders. In males, the hypotensive effects of physical activity are a highly effective non-pharmacological strategy for maintaining cardiovascular and cognitive health. In contrast, the beneficial effects of a physically active lifestyle on blood pressure, vascular health, and cognitive health are not yet generally accepted in post-menopausal females. Therefore, the aim of this thesis was to study the effect of menopause on blood pressure, its regulating factors and cognitive function in physically active females. Based on the existing literature, we formulated the general hypothesis that blood pressure and cognitive functions would be preserved in physically active (≥150 min/week of moderate intensity physical activity or ≥75 min/week of vigorous intensity physical activity) post-menopausal females (stage +1 of the STRAW+10 classification) compared with physically active pre-menopausal females (stage -3 of the STRAW+10 classification). We also hypothesized that markers of vascular health would be preserved in the physically active post-menopausal group compared with the physically active pre-menopausal group. A literature review and 2 cross-sectional studies were performed to test these hypotheses. Our literature review highlighted: o The effect of sex hormone deprivation on the physiological mechanisms involved in increased blood pressure during menopause. The beneficial effect of physical activity in the prevention and treatment of hypertension in post-menopausal females. o The current knowledge gaps of the scientific literature regarding the beneficial effects of physical activity on the physiological mechanisms regulating blood pressure. Our experimental studies concluded that: o Physically active post-menopausal females have preserved mean values of systolic and diastolic blood pressures and physiological mechanisms involved in blood pressure regulation (arterial stiffness, endothelial function, baroreflex sensitivity) compared with physically active pre-menopausal females. o Physically active post-menopausal females perform as well as their pre- menopausal counterparts in cognitive tests evaluating processing speed and executive functions, particularly for the inhibition and alternation components. However, they performed worse than the pre-menopausal group on tests assessing working memory. Taken together this thesis shows that being physically active has positive effects on blood pressure and vascular function in early post-menopausal females. However, a physically active lifestyle does not completely limit the decline in cognitive performance, especially in cognitive domain assessing executive functions (working memory). We conclude that being physically active compensates for some vascular consequences, but not all cognitive consequences associated with the menopausal transition.

Les plaquettes sont essentielles au développement lymphatique dès l’embryogenèse et maintiennent la séparation lympho-sanguine au cours de la vie. Elles participent directement à la lymphangiogenèse et à la réparation des vaisseaux en plus d’améliorer l’intégrité lymphatique in vitro. En présence d’apolipoprotéine A-I (apoA-I), les plaquettes consolident les connexions intercellulaires en adhérant à l’endothélium lymphatique. Toutefois, les plaquettes sont absentes de la lymphe, contrairement à leurs vésicules extracellulaires (pEVs) exprimant un protéome similaire. De plus, leur concentration dans la lymphe s’accentue en condition d’inflammation chronique, par exemple lors de l’athérosclérose. En ayant caractérisé les effets de ces vésicules sur l’intégrité lymphatique durant ma maîtrise, nous montrons que les pEVs sont rapidement internalisées par les LECs et aident à préserver l’intégrité lymphatique des effets délétères des constituants de la lymphe tels que les EVs dérivées des globules rouges (rbEVs). In vitro, des concentrations physiologiques de pEVs limitent la production d’espèces réactives d’oxygène (ROS) et diminuent la nécrose des cellules. Comme les pEVs injectées dans le derme de la peau sont prises en charge par les cellules endothéliales des vaisseaux lymphatiques collecteurs et qu’elles voyagent jusqu’aux ganglions afférents, nous croyons qu’une partie des pEVs circulantes dans la lymphe serait cruciale pour le maintien d’une fonction lymphatique adéquate lors de maladies chroniques inflammatoires telles que l’athérosclérose. / Platelets have a protective role in lymphatic function both at the embryogenic stage and throughout life by maintaining blood-lymphatic separation. In addition, platelets enhance the integrity of lymphatic endothelial cells (LECs) in vitro and appear to exert a shielding effect on the lymphatic endothelium by consolidating the connexion between lymphatic endothelial cells when incubated with apolipoprotein A-I (apoA-I). Whereas platelets are absent from lymph, platelet extracellular vesicles (pEVs) are abundantly circulating within lymphatic vessels, and their level increases during chronic inflammation such as atherosclerosis. Having characterized their effect on lymphatic integrity during my Master internship, we show that pEVs are rapidly internalized by LECs, which in turn help preserve the integrity of the lymphatic endothelium when harmful blood constituent such as red blood cell EVs (rbEVs) are infiltrating lymph. In vitro, physiological concentrations of pEVs are limiting the production of reactive oxygen species (ROS) by lymphatic endothelial cells and decreasing their necrosis rate. Furthermore, pEVs injected in the skin interstitium travel through the collecting lymphatics and are rapidly internalized by LECs, which in turn might help preserve the integrity of the lymphatic endothelium. Lymph pEVs might be critical for the maintenance of a proper lymphatic function during chronic inflammatory settings such as atherosclerosis.

La dégénérescence vasculaire et l’incapacité l’organisme à produire des vaisseaux sanguins de façon adéquate lors d’une condition ischémique est un fait saillant des rétinopathies ischémiques telles que la rétinopathie du prématuré (ROP). La ROP demeure la principale cause de défaillance visuelle et dans les cas extrêmes, de cécité chez les nourrissons prématurés. Elle présente deux phases distinctes soit une phase initiale clef de vasooblitération (VO) rétinienne et choroïdale qui entraînent la deuxième phase de néovascularisation (NV) rétinienne désorganisée et excessive. Au cours du développement normal, la NV oculaire a recours au phénomène d’angiogenèse qui consiste en la formation de nouveaux capillaires à partir de vaisseaux préexistants et de vasculogenèse qui consiste en la formation de nouveaux capillaires à partir de cellules endothéliales progénitrices dérivées de la moelle osseuse (BM-EPCs). Cette vasculogenèse implique la mobilisation des EPCs de la moelle osseuse vers la circulation afin d’être recrutées au site de NV pour contribuer de façon directe, soit en intégrant directement les structures vasculaires pour former des néovaisseaux, ou bien de façon indirecte par leur activité paracrine en libérant différents facteurs de croissance vasculaires. Toutefois, les mécanismes moléculaires impliqués dans la dysfonction des EPCs lors de la ROP sont encore mal compris. Au cours de mon mémoire, mes travaux ont ciblé la première phase de VO rétinienne afin de promouvoir la revascularisation par une thérapie basée sur une supplémentation d’EPCs natives ou reprogrammées. Compte tenu du rôle capital des EPCs dans la NV, mon mémoire s’est d’abord intéressé au rôle de Nogo-A (une protéine de la famille de réticulon), connue pour son action anti-angiogénique, sur l'activité fonctionnelle des EPCs en condition de ROP. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) simulant la ROP. L’objectif global de ce projet consiste à évaluer l’interrelation entre l’effet de l’hyperoxie (une condition clef de la ROP) sur la voie de signalisation Nogo-A et de son récepteur NgR1 sur la fonction des EPCs. Premièrement, les résultats obtenus montrent une augmentation de l’expression de Nogo-A et NgR1 chez les BM-EPCs soumis ex vivo à l’hyperoxie, mais aussi dans les EPCs extraites des rats OIR. En addition, l’augmentation de l’expression de Nogo-A/NgR1 par l’hyperoxie corrèle avec la dysfonction angiogénique des EPCs caractérisées par une diminution de leurs capacités de migration et de tubulogenèse. De façon intéressante, l’inhibition de Nogo-A (par un peptide neutralisant) améliore la capacité migratoire et tubulogénique des EPCs, et protège leur fonction contre l’hyperoxie. Également, l’inhibition de Nogo-A induit l’expression du facteur angiogénique et mobilisateur d’EPCs, SDF-1, suggérant que NgR1 régule négativement l’expression de SDF-1. Par ailleurs, nous avions également pour objectif final d’évaluer l’efficacité protectrice d’une supplémentation d’EPCs natives ou reprogrammées (Nogo-/-) pour améliorer la revascularisation rétinienne dans un modèle de rat OIR. Les résultats montrent qu’une supplémentation intrapéritonéale d’EPCs natives diminue significativement la VO rétinienne, mais que cet effet pro-angiogénique devient plus prononcé par le traitement d’EPCs préconditionnées (reprogrammées par l’inhibition de Nogo-A) chez les rats OIR. Collectivement, nos résultats démontrent que : 1) l’hyperoxie cause une dysfonction angiogénique des BM-EPCs en induisant Nogo-A ce qui contribue à la VO rétinienne chez les rats OIR, et que 2) une supplémentation d’EPCs conditionnées (reprogrammées par l’inhibition de Nogo-A) est plus efficace qu’une supplémentation d’EPCs natives pour améliorer la réparation vasculaire rétinienne. Pour conclure, nous mettons donc en évidence une cible potentielle qui est la protéine Nogo-A afin de préserver l’activité biologique des EPCs et ultimement, l’intégrité vasculaire chez les rats OIR. / Vascular degeneration and the inability of the body to produce adequate blood vessels during an ischemic condition is a salient feature of ischemic retinopathies such as retinopathy of prematurity (ROP). ROP remains the leading cause of visual impairment and in extreme cases, blindness in premature infants. It presents two distinct phases: a key initial phase of retinal and choroidal vasoobliteration (VO) which leads to the second phase of disorganized and excessive retinal neovascularization (NV). During normal development, ocular NV uses the phenomenon of angiogenesis which consists of the formation of new capillaries from pre-existing vessels and vasculogenesis which consists of the formation of new capillaries from progenitor endothelial cells derived from the marrow bone (BM-EPCs). This vasculogenesis involves the mobilization of EPCs from the bone marrow to the circulation in order to be recruited at the NV site to contribute directly, either by directly integrating the vascular structures to form new vessels, or indirectly by their paracrine activity by releasing different vascular growth factors. However, the molecular mechanisms involved in the dysfunction of EPCs during ROP are still poorly understood. During my thesis, my work targeted the first phase of retinal VO in order to promote revascularization by therapy based on supplementation of native or reprogrammed EPCs. Given the capital role of EPCs in NV, my thesis was first interested in the role of Nogo-A (a protein of the reticulon family), known for its anti-angiogenic action, on the functional activity of EPCs in ROP condition. To do this, we used an oxygen-induced retinopathy (OIR) model simulating ROP. The overall objective of this project is to assess the interrelationship between the effect of hyperoxia (a key condition of ROP) on the Nogo-A signaling pathway and its NgR1 receptor on the function of EPCs. First, the results obtained show an increase in the expression of Nogo-A and NgR1 in BM-EPCs subjected to hyperoxia ex vivo, but also in EPCs extracted from OIR rats. In addition, the increase in the expression of Nogo-A / NgR1 by hyperoxia correlates with the angiogenic dysfunction of EPCs characterized by a decrease in their capacity for migration and tubulogenesis. Interestingly, inhibition of Nogo-A (by a neutralizing peptide) improves the migratory and tubulogenic capacity of EPCs, and protects their function against hyperoxia. Also, inhibition of Nogo-A induces expression of the angiogenic and mobilizing factor of EPCs, SDF-1, suggesting that NgR1 negatively regulates the expression of SDF-1. In addition, our final objective was also to evaluate the protective efficacy of supplementation of native or reprogrammed EPCs (Nogo - / -) to improve retinal revascularization in an OIR rat model. The results show that intraperitoneal supplementation of native EPCs significantly decreases retinal VO, but that this pro-angiogenic effect becomes more pronounced by treatment of preconditioned EPCs (reprogrammed by inhibition of Nogo-A) in OIR rats. Collectively, our results demonstrate that: 1) hyperoxia causes angiogenic dysfunction of BM-EPCs by inducing Nogo-A which contributes to retinal VO in OIR rats, and that 2) supplementation of conditioned (reprogrammed by inhibition of Nogo-A) is more effective than supplementation of native EPCs in improving retinal vascular repairs. To conclude, we therefore highlight a potential target which is the Nogo-A protein in order to preserve the biological activity of EPCs and ultimately, vascular integrity in OIR rats.

Les propriétés antioxydantes du resvératrol sont d’un grand intérêt pour contrer la dysfonction endothéliale où la contribution du stress oxydant est majeure. Cette dysfonction endothéliale est d’ailleurs bien caractérisée en hypertrophie ventriculaire gauche (HVG). Cette étude vise à explorer les effets thérapeutiques du resvératrol sur la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques associée à l’HVG. L’HVG est induite suite à un cerclage aortique (CA) sur des porcelets de 2 mois. Le resvératrol est ensuite administré à 20 mg/kg/jour per os aux animaux répertoriés dans différents groupes. Le groupe 1 comprend les animaux contrôles sans CA alors que le groupe 2 représente les porcelets ayant subit le CA sans traitement. Le groupe 3 comprend les animaux traités pendant les 60 jours après la chirurgie alors que le groupe 4 est traité seulement à partir du 30ème jour jusqu’au jour 60. Des analyses échocardiographiques et histologiques ont été effectuées afin de déterminer le degré d’hypertrophie et l’impact du resvératrol sur la progression de l’HVG alors que la réactivité vasculaire a été évaluée par des expériences de chambres d’organes. La dysfonction endothéliale a été étudiée in vitro par quantification des métabolites nitriques et des niveaux de GMPc tandis que le stress oxydant est décrit par les niveaux d’angiotensine II (Ang II) et de protéines carbonylées. Les courbes dose-réponse à la sérotonine du groupe 3 traité pendant les 60 jours au resvératrol ont démontré une relaxation vasculaire significativement améliorée comparé au groupe 2 non-traité (p<0,05). Le pourcentage de changement du rapport de la masse du ventricule gauche sur la masse corporelle (LVmass/BW) a démontré une inhibition du développement de l’HVG dans le groupe 3 alors que le groupe 4 n’a pas eu d’effets bénéfiques des 30 jours de traitement au resvératrol. La biodisponibilité du NO représentée par la mesure de ses métabolites en circulation (398,71±21,74 ; 151,04±14,95 ; 241,86±15,53 ; 208,17±26,52 uM pour les groupes 1, 2, 3 et 4 respectivement, p<0,001 pour groupe 1 et 3 vs groupe 2) et par le niveau de GMPc a été augmentée avec l’administration du polyphénol (2,54±0,63 ; 0,67±0,45 ; 1,71±0,25 ; 1,98±0,29 pmol/ml pour les groupes 1, 2, 3 et 4 respectivement, p<0,05 pour groupe 1, 3 et 4 vs groupe 2). Le rôle antioxydant du resvératrol a été confirmé avec une réduction des niveaux de protéines carbonylées chez le groupe 3 comparé aux valeurs du groupe 2 (0,14±0,05 vs 0,33±0,03 nmol/mg respectivement) sans diminution des niveaux d’Ang II. Le resvératrol a aussi réduit l’hypertrophie des cardiomyocytes et la fibrose interstitielle. Ainsi, le resvératrol peut effectivement réduire la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques et limiter l’occurrence de remodelage myocardique associé à l’HVG, principalement à travers l’activation de la signalisation dépendante du NO. / Antioxidant properties of resveratrol are of great interest regarding endothelial dysfunction in which oxidative stress has a major causative role. This dysfunction is well characterized in left ventricular hypertrophy (LVH). The current study was designed to explore the effects of resveratrol as a treatment for the coronary endothelial dysfunction associated with LVH. An aortic banding (AB) was performed on swine to induce LVH on two-month-old swine for 60 days. Resveratrol was administered at 20 mg/kg/d per os to different groups. Group 1 represented healthy controls while group 2 was not treated. After AB, group 3 received resveratrol from day 1 to 60 post-surgery whereas group 4 was treated from day 30 to 60 only. Echocardiographic and histological studies were performed to evaluate the degree of LVH. Vascular reactivity of epicardial coronary arteries was assessed in organ chamber experiments. Endothelial dysfunction was evaluated in vitro by nitric oxide (NO) metabolites and cyclic guanosine-3,5-monophosphate (cGMP) while angiotensin II (Ang II) levels and protein carbonylation evaluated Oxidative stress. After treatment, the LVmass/body weight ratio was improved in group 3 associated with reduced cardiomyocyte hypertrophy and interstitial fibrosis (p<0.05). Dose-response curves to serotonin for the resveratrol treated group 3 demonstrated a greater vascular relaxation compared to LVH untreated group 2 (p<0.05). Bioavailability of NO measured by its circulating metabolites (398,71±21,74; 151,04±14,95 ; 241,86±15,53 ; 208,17±26,52 uM for groups 1, 2, 3 and 4 respectively, p<0,001 for groups 1 and 3 vs group 2) and by vascular cGMP (2,54±0,63 ; 0,67±0,45 ; 1,71±0,25 ; 1,98±0,29 pmol/ml for groups 1, 2, 3 and 4 respectively, p<0,05 for group 1,3 and 4 vs group 2) was increased. The antioxidant effect of the polyphenol was confirmed by decreased protein carbonylation with the 60 days treatment (0,14±0,05 vs 0,33±0,03 nmol/mg for group 3 vs 2) associated to unchanged Ang II levels. Therefore, resveratrol effectively reduces epicardial coronary endothelial dysfunction and limits the occurrence of cardiac remodelling associated with LVH, mainly through an NO-dependent pathway.

L'ingénierie tissulaire est reconnue comme une méthode potentielle pour réparer ou régénérer les tissus endommagés. Malgré de grandes avancées dans l'ingénierie tissulaire, la réussite de la construction de tissus complexes avec des réseaux vascularisés reste un défi. Dans les modèles d'angiogenèse actuels, les cellules endothéliales sont ensemencées au hasard, n'offrant pas de structure organisée. La technologie de bioimpression par laser offre une résolution d'impression précise. Par cette technique, les structures microvasculaires peuvent être construites pour la fabrication d'organes complexes, ou pour modéliser la progression de la maladie ou les modèles de réponse aux médicaments. Dans cette étude, des techniques de bio-impression au laser ont été utilisées pour étudier le guidage de l'angiogenèse in vitro. Deux techniques basées sur le laser, le transfert direct induit par laser (LIFT) et le transfert latéral induit par laser (LIST) sont utilisées. Comparée à LIFT, la technologie LIST offrait des conditions idéales pour l'impression cellulaire telles que la concentration cellulaire requise pour la formation du tubes endothéliaux et l'uniformité du motif désiré. Nous avons réalisé le modelage de la formation de structures de type capillaire dans des motifs organisés via l'impression LIST. Les constructions de type capillaire formées présentent des motifs uniformes. Les structures formées ont été analysées par microscopie confocale et reconstruction d'images 3D. Bien que le développement de la lumière endothéliale soit incomplet, la technique développée possède le potentiel d'atteindre une stabilisation et un développement de la lumière si l'on recrute un deuxième type de cellule tel que les fibroblastes ou les péricytes. / Tissue engineering has been well acknowledged as a potential method to repair or regenerate damaged tissues in the human body, fulfilling the limitations and shortage in autologous and organ transplantations. Despite great advances in engineering tissues with simple geometry and low requirement for oxygen and blood supply such as cartilage, skin and cornea, success in constructing 3D complex tissues with vascularized networks remains a major challenge. Angiogenesis plays an important role in vascular development in vivo. In current angiogenesis models, endothelial cells are seeded randomly not offering precise and desired patterning. Laser-based bioprinting technology offers precise and high cell printing resolution. By using laser-based bioprinting technology, microvascular structures can be constructed as a platform for complex organ fabrication, disease progression and drug response models. In this study, laser-based bioprinting techniques are employed to study angiogenesis guidance in vitro by patterning endothelial cells. Two laser-based techniques, Laser-Induced Forward Transfer (LIFT) and Laser-Induced Side Transfer (LIST) are used as patterning tools. Compared to LIFT, LIST technology provided ideal conditions for cell printing such as required cell concentration for endothelial tube formation and pattern uniformity. In this study, we achieved the guidance of capillary-like structure formation in desired patterns via LIST printing. The formed capillary-like constructs featured precise patterns and uniformity. The structures were analyzed by confocal microscopy, 3D image reconstruction and frozen section procedure. Though lumen development was incomplete, it possesses the potential to attain further stabilization and lumen development if recruiting a second cell type such as fibroblast or pericyte.

Le syndrome de Wernicke-Korsakoff (SWK) est un désordre neuropsychiatrique causé par la déficience en thiamine (DT). Dans la DT expérimentale comme dans le SWK, on observe une mort neuronale et des hémorragies dans certaines régions précises du diencéphale et du tronc cérébral. Les lésions diencéphaliques du SWK sont particulièrement sévères et entraînent souvent des séquelles amnésiques permanentes. Le lien entre la dysfonction métabolique induite par la DT et la mort neuronale n’est pas connu. Des rapports précédents ont démontré que la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) était altérée et ce, précédant l’apparition du dommage neuronal, suggérant un rôle critique de la dysfonction vasculaire. Les jonctions serrées (JS) interendothéliales, la base anatomique de la BHE, constituent un réseau moléculaire incluant l’occludin et les zonula occludens (ZOs). Cette thèse démontre une perte d’expression et une altération de la morphologie de ces protéines en relation avec la dysfonction de la BHE dans le thalamus de souris déficientes en thiamine, fournissant une explication pour la présence d’hémorragies. Le stress oxydatif peut entraîner des dommages directs aux protéines des JS et interférer avec leurs mécanismes de régulation. De plus, l’oxyde nitrique (NO) peut induire la métalloprotéinase matricielle-9 (MMP-9) impliquée dans la dégradation de ces protéines. L’endothélium vasculaire cérébral (EVC) semble être une source importante de NO dans la DT, l’expression de l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS) étant sélectivement induite dans les régions vulnérables. Le NO peut réagir avec les espèces réactives oxygénées et former du peroxynitrite, entraînant un stress oxydatif/nitrosatif endothélial. Les résultats présentés démontrent que la délétion du gène de eNOS prévient le stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, l’extravasation des immunoglobulins G (IgGs) et l’altération de l’occludin et des ZOs dans le thalamus de souris déficientes en thiamine. De plus, cette délétion prévient l’induction de l’expression de MMP-9 dans l’EVC. Des résultats similaires ont été obtenus avec l’antioxydant N-acétylcystéine (NAC). Les mécanismes précis par lesquels les espèces réactives altèrent les protéines des JS sont inconnus. Caveolin-1, une composante majeure du caveolæ de l’EVC, est impliquée dans la régulation de l’expression des protéines des JS, et celle-ci est modulée par le stress oxydatif/nitrosatif; l’altération de l’expression de caveolin-1 a été récemment associée à la rupture de la BHE. Les résultats présentés démontrent que l’expression de caveolin-1 est sélectivement altérée dans l’EVC du thalamus de souris déficientes en thiamine, coïcidant avec la rupture de la BHE, et démontrent que la normalisation de l’expression de caveolin-1 par le NAC est associée avec l’atténuation du dommage à la BHE. Pris ensemble, ces résultats démontrent un rôle central du stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, particulièrement celui provenant de eNOS, dans l’altération des JS de la BHE via des dommages directs et via l’induction de MMP-9 et de caveolin-1. Cette rupture de la BHE contribue par conséquent à la mort neuronale dans le thalamus, puisque la prévention des altérations cérébrovasculaires par la délétion du gène de eNOS et le NAC atténue significativement la mort neuronale. L’administration précoce d’antioxydants en combinaison avec la thiamine devrait donc être une considération importante pour le traitement du SWK. / Wernicke-Korsakoff syndrome (WKS) is a neuropsychiatric disorder caused by thiamine deficiency (TD). In experimental TD as in WKS, neuronal cell death and hemorrhages are observed in specific diencephalic and brainstem areas. Diencephalic lesions in WKS are especially severe and often lead to permanent amnesic symptoms. The link between TD-induced metabolic dysfunction and neuronal cell death is unknown. Previous reports have shown that blood-brain barrier (BBB) permeability was impaired and that this occurred prior to the onset of neuronal damage, suggesting a critical role for vascular dysfunction. Interendothelial tight junctions (TJs), the anatomical basis of the BBB, constitute a molecular network comprising occludin and zonula occludens (ZOs). This thesis shows a loss of expression and alterations in the morphology of these proteins in relation to BBB dysfunction in the thalamus of thiamine-deficient mice, providing an explanation for the presence of hemorrhages. Oxidative stress can lead to direct oxidative damage to TJ proteins and interfere with their regulation mechanisms. Also, nitric oxide (NO) can induce matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) involved in the degradation of these proteins. Cerebral vascular endothelium (CVE) seems to be an important source of NO in TD, since endothelial nitric oxide synthase (eNOS) expression is selectively induced in vulnerable areas. NO can react with reactive oxygen species and form peroxynitrite, leading to endothelial oxidative/nitrosative stress. Results have show that eNOS gene deletion prevents cerebrovascular oxidative/nitrosative stress, immunoglobulins G (IgGs) extravasation and occludin and ZOs alterations in the thalamus of thiamine-deficient mice. Also, eNOS gene deletion prevents the induction of MMP-9 in CVE. Similar results have been obtained with the antioxidant N-acetylcysteine (NAC). Precise mechanisms by which reactive species alter TJ proteins are unknown. Caveolin-1, a major component of CVE caveolæ, is involved in the regulation of TJ protein expression, and is modulated by oxidative/nitrosative stress; alteration in caveolin-1 expression has been recently associated with BBB breakdown. The present results show that caveolin-1 expression is selectively altered in CVE of the thalamus of thiamine-deficient mice, and show that normalization of caveolin-1 expression by NAC is associated with the attenuation of BBB damage. Taken together, these results demonstrate a central role for cerebrovascular oxidative/nitrosative stress, especially coming from eNOS, in BBB TJ protein alterations via direct damage and via induction of MMP-9 and caveolin-1. As a result, BBB breakdown contributes to neuronal cell death in the thalamus, since prevention of cerebrovascular alterations by eNOS gene deletion and NAC significantly attenuates neuronal cell death. Early administration of antioxidants combined with thiamine should therefore be an important consideration for the treatment of WKS.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) protège le système nerveux central (SNC) en contrôlant le passage des substances sanguines et des cellules immunitaires. La BHE est formée de cellules endothéliales liées ensemble par des jonctions serrées et ses fonctions sont maintenues par des astrocytes, celles ci sécrétant un nombre de facteurs essentiels. Une analyse protéomique de radeaux lipidiques de cellules endothéliales de la BHE humaine a identifié la présence de la voie de signalisation Hedgehog (Hh), une voie souvent liées à des processus de développement embryologique ainsi qu’au niveau des tissus adultes. Suite à nos expériences, j’ai déterminé que les astrocytes produisent et secrètent le ligand Sonic Hh (Shh) et que les cellules endothéliales humaines en cultures primaires expriment le récepteur Patched (Ptch)-1, le co-récepteur Smoothened (Smo) et le facteur de transcription Gli-1. De plus, l’activation de la voie Hh augmente l’étanchéité des cellules endothéliales de la BHE in vitro. Le blocage de l’activation de la voie Hh en utilisant l’antagoniste cyclopamine ainsi qu’en utilisant des souris Shh déficientes (-/-) diminue l’expression des protéines de jonctions serrées, claudin-5, occcludin, et ZO-1. La voie de signalisation s’est aussi montrée comme étant immunomodulatoire, puisque l’activation de la voie dans les cellules endothéliales de la BHE diminue l’expression de surface des molécules d’adhésion ICAM-1 et VCAM-1, ainsi que la sécrétion des chimiokines pro-inflammatoires IL-8/CXCL8 et MCP-1/CCL2, créant une diminution de la migration des lymphocytes CD4+ à travers une monocouche de cellules endothéliales de la BHE. Des traitements avec des cytokines pro-inflammatoires TNF-α and IFN-γ in vitro, augmente la production de Shh par les astrocytes ainsi que l’expression de surface de Ptch-1 et de Smo. Dans des lésions actives de la sclérose en plaques (SEP), où la BHE est plus perméable, les astrocytes hypertrophiques augmentent leur expression de Shh. Par contre, les cellules endothéliales de la BHE n’augmentent pas leur expression de Ptch-1 ou Smo, suggérant une dysfonction dans la voie de signalisation Hh. Ces résultats montrent que la voie de signalisation Hh promeut les propriétés de la BHE, et qu’un environnement d’inflammation pourrait potentiellement dérégler la BHE en affectant la voie de signalisation Hh des cellules endothéliales. / The blood-brain barrier (BBB), composed of tightly bound endothelial cells (ECs), regulates the entry of blood-borne molecules and immune cells into the CNS. Recent studies indicate that the Hedgehog (Hh) signaling pathway in adult tissues plays an important role in vascular proliferation, differentiation and tissue repair. Using a lipid membrane raft-based proteomic approach, I have identified the Hedgehog (Hh) pathway as a signaling cascade involved in preserving and upkeeping BBB functions. My study shows that human astrocytes express and secrete Sonic Hh (Shh) and conversely, that human BBB-ECs bear the Hh receptor Patched-1 (Ptch-1), the signal transducer Smoothened (Smo) as well as transcription factors of the Gli family. Furthermore, activation of the Hh pathway in BBB-ECs restricts the passage of soluble tracers in vitro. By blocking the Hh signaling in vitro and by using Shh knock-out (-/-) embryonic mice, I demonstrate a reduced expression of TJ molecules claudin-5, occludin and ZO-1. Hh activation also decreases the surface expression of cell adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1, and decreases BBB-ECs secretion of pro-inflammatory chemokines IL-8/CXCL8 and monocytes chemoattractant protein 1 MCP-1/CCL2, resulting in a reduction of migrating CD4+ lymphocytes across human BBB-EC monolayers. In vitro treatment with inflammatory cytokines TNF-α and IFN-γ, upregulates the production of astrocytic Shh and the BBB-EC surface expression of Ptch-1 and Smo. In active Multiple Sclerosis (MS) lesions, in which the BBB is disrupted, Shh expression is drastically upregulated in hypertrophic astrocytes, while Ptch-1 and Smo expression is down-regulated or left unchanged, suggesting that a deregulation in the Hh signaling pathway may prevent the barrier stabilizing properties of Hh. Our data demonstrate an anti-inflammatory and BBB-promoting effect of astrocyte-secreted Hh and suggest that a pro-inflammatory environment disrupt the BBB by impacting, at least in part, on Hh signaling in brain ECs.