L'ET-1, un peptide de 21 acides aminés, est un des plus puissants vasoconstricteurs isolés à date. Il est présent dans plusieurs tissus et est responsable de nombreuses actions biologiques. Chez l'humain, ces effets sont relayés par deux récepteurs couplés aux protéines G:ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B]. Précédemment, notre groupe a démontré que ces récepteurs sont présents au niveau de la membrane plasmique, du cytosol et du noyau incluant les membranes de l'enveloppe nucléaire des cellules endothéliales endocardiques isolées des ventricules gauche (CEEGs) et droit (CEEDs) du coeur foetal humain âgé de 20 semaines. De plus, notre groupe a montré que suite à l'activation des récepteurs à l'ET-1 situés au niveau de la membrane plasmique, l'ET-1 augmente le niveau de Ca[indices supérieurs 2+] intracellulaire libre des CEEs; les CEEGs étant plus sensibles à l'ET-1 que les CEEDs. Basé sur ces résultats, nous allons tester l'hypothèse que les récepteurs de l'ET-1, et en particulier le récepteur ET[indice inférieur B], présents au niveau des membranes de l'enveloppe nucléaire des CEEs augmentent le Ca[indices supérieurs 2+] nucléoplasmique et que la sensibilité de ces récepteurs nucléaires est différente de celle connue pour les récepteurs à l'ET-1 de la membrane plasmique. De plus, il est possible que l'activation des récepteurs ET[indice inférieur A] et/ou ET[indice inférieur B] de la membrane de surface induit leur internalisation, translocation ainsi que leur synthèse de novo. Nous proposons aussi que ces phénomènes peuvent être différents dans les CEEGs et les CEEDs. Dans la première partie de ce mémoire, nous avons étudié l'effet de concentrations croissantes d'ET-1 cytosolique sur le niveau de calcium nucléoplasmique des CEEGs et des CEEDs. Au niveau des noyaux des CEEDs, nous avons observé que la valeur de EC[indice inférieur 50] obtenue est plus élevée (1000 fois) que celle des noyaux des CEEGs suggérant que les récepteurs à l'ET-1 présents au niveau des membranes de l'enveloppe nucléaire sont plus sensibles à l'ET-1 au niveau des CEEGs par rapport aux CEEDs. Nos résultats montrent également que les récepteurs à l'ET-1 des membranes de l'enveloppe nucléaire des CEEDs et des CEEGs sont plus sensibles à l'ET-1 que ces mêmes récepteurs présents au niveau de la membrane plasmique et ce de 1000 fois pour les CEEGs et de 10 fois pour les CEEDs. De plus, nos résultats montrent qu'au niveau des CEEDs et des CEEGs, l'ET-1 cytosolique induit une augmentation du [Ca[indices supérieurs 2+]][indice inférieur n] qui est relayée par le récepteur ET[indice inférieur B]. Dans la deuxième partie de ce mémoire, nous avons démontré que le traitement des cellules avec l'ET-1 à différents temps pouvait induire la mobilisation des récepteurs ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B]. Nous avons observé une similarité dans le profil de mobilisation des récepteurs ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B] au niveau des CEEDs suggérant que la cinétique de l'internalisation, de la dégradation et de la synthèse de novo peut être la même indépendamment du type de récepteur activé. De plus, nos résultats montrent que la cinétique et le décours de la mobilisation des récepteurs ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B] est différent dans les CEEGs par rapport aux CEEDs suggérant qu'il est important de considérer l'origine anatomique des CEEs. Nos résultats montrent également que la plupart des augmentations dans les niveaux du récepteur ET[indice inférieur A] et ET[indice inférieur B] au niveau des CEEs sont dues à des synthèses de novo sensibles à la cycloheximide.

L’athérosclérose et ses complications demeurent une des causes majeures de décès dans les pays industrialisés. L’angioplastie coronarienne n’a pas cessé de progresser et atteint de hauts niveaux de réussite technique. Toutefois, des obstacles majeurs au succès à long terme de l'angioplastie persistent (Davies et Hagen, 1994). C’est le cas de la resténose. Plus de 30 à 60% des artères coronariennes ayant subies une angioplastie sont des cas de resténose, survenant durant la première année de la procédure (Kitazume et al, 1995). Plusieurs facteurs de risques menant vers la resténose post-angioplastie ont été relevés (Lau et Sigwart, 1993). L’hyperplasie intimale et le remodelage artériel sont identifiés comme les deux causes responsables de ce processus multifactoriel (Geary et al., 1998). Hypothèse de recherche : Des évidences suggèrent une implication de divers médiateurs vasoactifs et facteurs de croissances dans le processus resténotique. L’angiotensine II et les endothélines se présentent comme des éléments clés dans la prévention et l'atténuation de l'hyperplasie intimale dans les modèles expérimentaux. Objectif : Investiguer les rôles de ces deux familles de médiateurs dans l’hyperplasie intimale afin de mieux comprendre leurs mécanismes d’actions lors de la resténose post-angioplastie. Buts: 1) Vérifier les effets des bloqueurs de l'angiotensine II (antagonistes et inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l’angiotensine II) dans le modèle de la carotide de rat; 2) Vérifier les effets des bloqueurs des endothélines (antagonistes et inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endothéline) dans le modèle de la carotide de rat; 3) Tester les approches ayant montré une efficacité significative dans un nouveau modèle animal d’angioplastie: le modèle de la carotide de furet; 4) Développer de nouveaux outils et de nouvelles approches pharmacologiques (nouveaux composes, combinaisons, et formulations de microsphères); 5) Mettre au point un modèle intégré d’analyse pharmacotoxicologique chronique de moyenne durée chez le rat. Résultats: Les résultats révèlent un rôle des antagonistes du récepteur AT[indice inférieur 1], mais non ceux du récepteur AT[indice inférieur 2], de l'angiotensine II contre l'hyperplasie intimale dans le modèle d’angioplastie par ballonnet chez le rat mais pas chez le furet. L’inhibition limitée à 50% n’est pas améliorée, à dose égale, par une approche locale que procure l’utilisation des microsphères. Quant aux bloqueurs du système des endothélines, ils démontrent une efficacité similaire à atténuer l’hyperplasie intimale à celles des antagonistes de l’angiotensine II, dans le même modèle du rat. Le développement de la méthode d’administration continue a, de plus, permis de valider le prélèvement sanguin et les mesures hémodynamiques de façon chronique. Conclusions : Au moins deux systèmes sont impliqués dans l’hyperplasie intimale chez le rat. L’angiotensine II ne semble pas avoir un rôle dans l’hyperplasie intimale du furet même si ce modèle démontre une hyperplasie intimale bien évidente suite à la dilatation artérielle, telle qu’observée par d’autres équipes chez le porc. Le rat demeure un modèle utile mais limitée quant à l'interprétation et l'extrapolation que l'on peut en faire vers une application clinique, puisqu’une même approche thérapeutique est inefficace chez le furet. Une formulation permettant une action localisée, telle que l'application de microsphères contenant le médicament, n’a pas démontré une efficacité supérieure. Les effets anti-prolifératifs de bloqueurs des endothélines, dissociables de ceux relies aux bloqueurs de I’angiotensine II, suggèrent qu’une approche combinée pourrait mener à une efficacité supérieure contre l’hyperplasie intimale.

La chymase est une protéase à sérine issue des mastocytes des tissus conjonctifs, dont l’isoforme chez la souris est la protéase mastocytaire-4 (mMCP-4). Elle clive la Big endothéline 1 (Big ET-1) en ET-1 (1-31), qui doit ensuite être clivée en ET-1 par la néprilysine (NEP) pour être biologiquement active. L’inhibition de la chymase montre l’importance de cette voie dans l’activité de la Big ET-1 exogène chez la souris. La chymase est aussi impliquée dans le développement des lésions athérosclérotiques et de leur rupture dans les modèles animaux et dans l’infarctus du myocarde chez l’humain. Dans des modèles expérimentaux de cette complication, l’inhibition pharmacologique de la chymase améliore la survie, les paramètres hémodynamiques cardiaques et le remodelage ventriculaire. Le but de notre étude était de confirmer le rôle spécifique de la mMCP-4 dans la synthèse de l’ET-1, la progression de l’athérosclérose et les conséquences de l’infarctus du myocarde chez la souris. Nous avons donc évalué l’impact de la répression génétique de la mMCP-4 dans la souris C57BL/6 (souris mMCP-4[indice supérieur -/-]). Les souris mMCP-4[indice supérieur -/-] montrent une réponse hémodynamique diminuée à la Big ET-1 exogène. La production d’ET-1 et d’ET-1 (1-31) plasmatique est diminuée chez la souris mMCP-4[indice supérieur -/-]. Celle-ci exprime aussi des taux endogènes pulmonaires d’ET 1 réduits. Les souris mMCP-4[indice supérieur -/-] affichent également une réduction de l’étendue des lésions athérosclérotiques à un stade précoce de la pathologie dans l’aorte de la souris athérosclérotique, la souris déficiente pour l’apolipoprotéine E (ApoE[indice supérieur -/-]). L’antagoniste mixte des récepteurs de l’endothéline, le macitentan, réduit aussi l’étendue des lésions dans les stades plus avancés de la pathologie. La répression de la mMCP-4 améliore les signes de stabilité de l’athérome avancé dans l’artère brachiocéphalique plus efficacement que le macitentan. Enfin, les souris mMCP-4[indice supérieur -/-] soumises à une ligature permanente de l’artère coronaire antérieure descendante gauche montrent une survie nettement supérieure à celle leurs congénères de type sauvage. L’histochimie montre que le remodelage et l’amincissement aigus sont moins importants dans les ventricules de souris mMCP-4[indice supérieur -/-], les protégeant contre la rupture de la paroi libre du ventricule affectant toutes les souris WT qui n’ont pas complété l’étude de survie. L’imagerie par tomographie par émission de positrons (TEP) révèle que les ventricules gauches cardiaques des souris mMCP-4[indice supérieur -/-] sont moins dilatés, leur fraction d’éjection est mieux conservée et la zone infarcie est moins grande. L’analyse glycoprotéomique indique que l’apolipoprotéine A1 est augmentée par la répression de la mMCP 4, qui diminue aussi les niveaux pulmonaires d’ET-1 24 h après l’infarctus. En conclusion, nos résultats montrent un rôle important de la mMCP-4 dans la synthèse de l’ET-1, le développement des lésions athérosclérotiques et les dommages causés par l’infarctus du myocarde chez la souris.

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Le développement des anticorps monoclonaux thérapeutiques est en plein essor notamment à cause de leur bénéfice important pour le traitement des cancers. Cependant, à l’heure actuelle, aucun anticorps monoclonal sur le marché ou en phase III ne cible de RCPGs, en dépit de l’implication grandissante de ces récepteurs dans la carcinogenèse. Parmi les RCPGs les plus pertinents pour l’oncologie, souvent cités dans la littérature et dont certains inhibiteurs chimiques sont en phase clinique avancée, on trouve les deux sous-types de récepteurs des endothélines ETAR et ETBR. Dans ce contexte, mon projet de thèse a consisté à produire des anticorps monoclonaux capables de lier spécifiquement les récepteurs des endothélines, puis à les caractériser dans le but d’évaluer leur potentiel antitumoral. Grâce à une stratégie d’immunisation génique, un ensemble de 27 anticorps monoclonaux, tous spécifiques de la forme native d’ETBR, a été obtenu. Un de ces anticorps, nommé rendomab-B1, a fait l’objet d’une caractérisation précise et s’est révélé être un puissant inhibiteur allostérique d’ETBR. De plus, cette propriété antagoniste a permis de bloquer l’action autocrine antiapoptotique de l’ET-1 sur des cellules endothéliales vasculaires, suggérant ainsi que le rendomab-B1 pourrait être utilisé comme agent thérapeutique afin d’inhiber les effets tumorigènes liés à la suractivation de l’axe ET1/ETBR au niveau de l’endothélium vasculaire tumoral. Par ailleurs, le rendomab-B1 a également été testé sur des lignées de mélanomes humains ; l’absence de fixation de l’anticorps malgré la présence de récepteurs ETB fonctionnels à la surface de ces cellules suggère l’existence d’une forme moléculaire atypique du récepteur, potentiellement spécifique aux mélanomes. A la lumière de ces résultats, le rendomab-B1 apparaît comme un outil prometteur, à la fois pour l’étude structurale et fonctionnelle d’ETBR, mais aussi pour une éventuelle thérapie anticancéreuse. Enfin, les 26 autres anticorps monoclonaux anti-ETBR, actuellement en cours de caractérisation, constituent également des molécules potentiellement intéressantes pour un usage fondamental ou thérapeutique impliquant ETBR. Pour conclure, ces travaux ont démontré l’intérêt de la méthode d’immunisation génique pour la production d’anticorps monoclonaux anti-RCPGs à visée thérapeutique. / For a decade, monoclonal antibodies have become increasingly important for the biotherapeutic management of cancer. However, none of the monoclonal antibodies currently on the market or in late stage clinical trial do target a G-protein coupled receptor in spite of the emerging role of these receptors in tumor progression. Among the therapeutically relevant GPCRs for oncology, the endothelin receptors (ETAR and ETBR) are particularly attractive considering their overexpression in a wide range of tumors and their involvement in various stages of tumorigenesis. In this context, my PhD project consisted in producing and characterizing monoclonal antibodies directed against endothelin receptors with a view to use them as anti-tumor agents. Using an original DNA immunization strategy, we produced a panel of 27 monoclonal antibodies which selectively recognized ETBR expressed at the surface of transfected cells. One of these antibodies, named rendomab-B1, was extensively characterized and proved to be a potent allosteric antagonist of ETBR. Moreover, rendomab-B1 was able to disrupt the autocrine ET1-mediated survival loop on vascular endothelial cells, suggesting that this antibody could be used to prevent the pro-tumorigenic effect due to ET-1 and ETBR upregulation in the tumor-surrounding endothelium. Furthermore, rendomab-B1 binding onto ETBR was also assessed on melanoma cell lines and revealed that a tumor-specific form of ETBR may exist, as illustrated by the poor fixation of rendomab-B1 on these cells in spite of the presence of functional ETB receptors. Together, these results present rendomab-B1 as promising agent, not only for the structural and functional study of ETBR, but also for its therapeutic modulation in the case of cancer for instance. Finally, the other 26 monoclonal antibodies, whose characterization is still ongoing, also constitute potential tools for fundamental or therapeutic applications involving ETBR. To conclude, this work has highlighted the relevance of the DNA immunization approach to generate monoclonal antibodies against the native form of GPCRs.

Il est admis que l’axe endothéline (endothélines ET-1, -2 et -3 et leurs RCPG ETAR et ETBR), participe à la progression tumorale. Alors qu’ETAR est par exemple surexprimé dans le cancer de l’ovaire, ETBR l’est dans le mélanome. Cette surexpression, ainsi que l’implication d’ETA/BR dans la carcinogenèse, font de ces RCPG une cible tumorale pertinente. En raison de leurs forte spécificité, actions cytotoxiques variées, possibilités de couplage, les anticorps monoclonaux (AcM) sont des outils de choix en diagnostic et thérapie anti-cancéreuse. Cependant, on déplore actuellement l’absence d’AcM ciblant des RCPG sur le marché. Par une technique d’immunisation génique, 4 AcM anti-ETAR et 24 anti-ETBR ont été produits. Les résultats préliminaires obtenus avec les anti-ETAR sont prometteurs puisque ces AcM lient avec une haute affinité ETAR surexprimé dans des cellules CHO, l’un d’eux inhibant fortement la liaison du ligand. Mon travail de thèse s’est cependant concentré sur la caractérisation d’un anti-ETBR. Cet AcM reconnaît de façon spécifique et avec une forte affinité la conformation native d’ETBR surexprimé à la surface de cellules de mélanomes, suggérant l’existence d’une forme tumorale du récepteur. Suite à sa liaison aux cellules UACC-257 (lignée de mélanome), l’AcM se trouve internalisé. Dans ces cellules, malgré son incapacité à inhiber la liaison de l’ET, cet AcM inhibe l’activation de la voie PLC induite par le ligand et est également un fort inhibiteur de la migration due à l’activation de l’axe endothéline. Ces travaux soulignent l’intérêt de cet AcM comme outil diagnostique et thérapeutique dans le cas du mélanome. / It has been admitted that endothelin axis (endothelins ET-1, -2 and -3 and related GPCRs ETAR and ETBR) is involved in tumor progression. For instance, while ETAR is overexpressed in ovarian cancer, ETBR is in melanoma. This overexpression, as well as ETA/BR involvement in carcinogenesis, make these GPCRs a relevant tumor target. Because of their high specificity, various cytotoxic actions, possibilities of coupling, the monoclonal antibodies (mAbs) are useful tools in diagnosis and anti-cancer therapy. However, the absence of mAbs targeting GPCRs on the market is regrettable. Thanks to DNA immunization, 4 anti-ETAR mAbs and 24 anti-ETBR mAbs were produced. Preliminary results obtained with anti-ETAR are promising since these mAbs bind ETAR overexpressed in CHO cells with high affinity, one of them being a potent inhibitor of ligand binding. However, the aim of my PhD research works focused on the characterization of one anti-ETBR. This mAb specifically recognizes with high affinity the native conformation of ETBR overexpressed on the surface of melanoma cells, suggesting the existence of a tumor-specific receptor. Following its binding on UACC-257 cells (melanoma cell line), the mAb is internalized. In these cells, despite its inability to inhibit ET binding, this mAb is able to inhibit the ligand-induced activation of PLC pathway and display a potent inhibition of endothelin axis-induced migration. This work highlights the interest of this mAb as a tool for diagnosis and therapy in melanoma.

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