Mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é uma doença de depósito lisossômico, que possui herança ligada ao cromossomo X, causada pela deficiência da enzima iduronato-2-sulfatase envolvida na degradação dos glicosaminoglicanos (GAGs) dermatan e heparan sulfato. Os GAGs parcialmente degradados acumulam-se nos lisossomos, levando a disfunção celular, tecidual e orgânica. Os mecanismos envolvidos na fisiopatologia desta doença não estão completamente esclarecidos. Considerando que a geração de radicais livres está envolvida na patogênese de várias doenças, inclusive em alguns erros inatos do metabolismo, o objetivo deste trabalho foi avaliar parâmetros de estresse oxidativo em pacientes com MPS II, antes e durante os seis primeiros meses da terapia de reposição enzimática (TRE). Foram verificados níveis aumentados de malondialdeído (MDA) e de grupamentos carbonila plasmáticos assim como da atividade da catalase eritrocitária (CAT) em pacientes com MPS II antes do tratamento quando comparado com os controles. Por outro lado, o conteúdo de grupamentos sulfidrila e o estado antioxidante total (TAS) plasmáticos estavam significativamente diminuídos, enquanto a atividade da superóxido dismutase (SOD) eritrocitária não estava alterada antes do início do tratamento quando comparado com os controles. Durante a TRE, houve uma redução significativa nos níveis de MDA e um aumento significativo de grupamentos sulfidrila, quando comparados com o pré-tratamento. Ainda, foi analisado o dano ao DNA em leucócitos periféricos através do ensaio cometa em pacientes com MPS II no pré-tratamento e durante a TRE. Foi encontrado um aumento significativo no dano ao DNA antes do tratamento quando comparado com os controles e a TRE levou à significante diminuição desse dano quando comparado com o prétratamento. Além disso, foi verificada uma correlação positiva significativa entre o dano ao DNA e os níveis de MDA, assim como com o conteúdo de grupamentos carbonila. Nossos resultados mostram que pacientes com MPS II estão sujeitos a dano oxidativo a lipídios, proteínas e DNA e, pioneiramente, mostram que a TRE é capaz de protegê-los contra esses danos. / Mucopolysaccharidosis type II (MPS II) is a lysosomal storage disease, which has Xlinked inheritance, caused by deficiency of iduronate-2-sulfatase enzyme involved in degradation of glycosaminoglycans (GAGs) dermatan and heparan sulfate. The partially degraded GAGs accumulate in lysosomes, leading to cellular, tissue and organic dysfunction. The mechanisms involved in the pathophysiology of this disease are not completely understood. Considering that the generation of free radicals is involved in the pathogenesis of many diseases, including some inborn errors of metabolism, the aim of this study was to evaluate oxidative stress parameters in patients with MPS II, before and during the first six months of enzyme replacement therapy (ERT). It was veified significantly increased levels of malondialdehyde (MDA) and carbonyl group content in plasma as well as erythrocyte catalase (CAT) activity in patients with MPS II before treatment when compared with controls. On the other hand, plasma sulfhydryl group content and total antioxidant status (TAS) were significantly reduced, while erythrocyte superoxide dismutase (SOD) activity was not altered before the beginning of treatment when compared to controls. During ERT, there was a significant reduction in MDA levels and a significant increase in sulfhydryl groups, when compared to pretreatment. Also, it was analyzed the DNA damage in peripheral leukocytes by the comet assay in MPS II patients at pretreatment and during ERT. It was verified a significant increase in DNA damage before treatment when compared with controls and ERT induced a significant reduction of this damage compared to pretreatment. Furthermore, we observed a significant positive correlation between DNA damage and MDA levels as well as with carbonyl group content. Our results show that MPS II patients are subject to lipid, protein and DNA oxidative damage and, for the first time, show that ERT is able to protect them against such damage.

Esta dissertação de mestrado apresenta o estudo da utilização de enzimas na síntese de poliésteres, através do uso de catálise enzimática na transesterificação de diácidos carboxílicos com polióis. O objetivo principal foi estudar a viabilidade na síntese de poliésteres a partir de diácidos carboxílicos como o ácido adípico e o Pripol® e polióis como: glicerol, trimetilolpropano, pentaeritritol, 1,10-decanodiol e poliol vegetal (este oriundo da reação de alcoólise entre óleo de soja e glicerol). A enzima utilizada para o processo foi a Novozym 435, obtida comercialmente. Esta se enquadra na classificação como uma hidrolase do tipo EC 3.1.1.3, mais comumente chamadas de lipases. Como vantagens no emprego de tais enzimas podemos destacar o menor consumo de energia e sustentabilidade ambiental no processo. Também foi avaliada a toxicidade do sistema frente às reações enzimáticas. A mistura ciclohexano/THF se mostrou a mais efetiva. Nas reações de policondensação, foi avaliada a influência do monômero hidroxilado e do monômero carboxílico, sendo que reações com ácido adípico e Pripol® na presença de solventes como ciclohexano/THF e THF/5-hexen-1-ol propiciaram a formação de poliésteres com massa molar numérica média (Mn) superior a 4000 Da. / This works presents the synthesis of polyesters by enzymatic catalysis for the transesterification of carboxylic diacids with polyols. The main objective was to study the feasibility for the synthesis of polyesters from carboxylic diacids as adipic acid and PRIPOL®, and polyols such as glycerol, trimethylolpropane, pentaerythritol, 1.10-decanediol and polyol (from the enzymatic alcoholysis reaction between soybean oil and glycerol). The enzyme used in the process was the comercial Novozym 435, which is classified as hydrolase EC 3.1.1.3, more commonly called lipases. The advantages in the use of such enzymes are the lowest energy consumption and environmental sustainability in the process. We also evaluated the enzymatic toxicity in the presence of the reagents and solvents. The mixture cyclohexane / THF was the most effective. The influence of the hydroxylated and carboxylic acid monomers in the polycondensation reactions was investigated , and the reaction with adipic acid and PRIPOL® in the presence of solvents such as cyclohexane / THF and THF/5-hexen-1-ol enabled the formation of polyesters with mass molar number average (Mn) higher than 4000 Da.

Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-12T18:38:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_Maria_Carolina_Wanderley_2012.pdf: 3845036 bytes, checksum: e85ad41cc80ec46d80caa5de8491be19 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T18:38:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_Maria_Carolina_Wanderley_2012.pdf: 3845036 bytes, checksum: e85ad41cc80ec46d80caa5de8491be19 (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / FACEPE / A hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar foi realizada com bagaço prétratado por explosão a vapor, com e sem deslignificação com hidróxido de sódio. Após a deslignificação, o teor de celulose na fração sólida aumentou (74,98 %) e o de lignina diminuiu (83,35 %). A hidrólise do bagaço utilizando celulases (10 FPU/g de celulose) e b-glucosidase (5 % ou 10 % v/v do volume adicionado de Celluclast 1.5L), resultou na formação de 16,79 g/L e 40,58 g/L de glicose para o bagaço nãodeslignificado (ND) e deslignificado (D), respectivamente. Na hidrólise enzimática em batelada alimentada, foram iniciados experimentos com 8 g de bagaço, e 1 g de material foi adicionado periodicamente após 12, 24 ou 48 horas. Maiores concentrações de glicose foram obtidas quando foi utilizado o intervalo de alimentação de 12 horas, apesar da conversão ser a menor dentre os três casos. A concentração de glicose alcançou 59,69 g/L quando foi utilizado material pré-tratado e deslignificado, com 12 horas de intervalo de alimentação. Fermentações dos hidrolisados foram realizadas utilizando um inóculo padronizado contendo 8 g/L de Saccharomyces cerevisiae UFPEDA 1238. As produtividades volumétricas em etanol nas fermentações dos hidrolisados dos materiais ND e D foram: 0,42 g/L.h e 0,97 g/L.h, respectivamente, ambos com intervalo de 12 horas. Apesar da recuperação em massa após a deslignificação ter sido cerca de 50%, a produção de etanol por tonelada de bagaço foi superior na fermentação do material deslignificado para todos os diferentes intervalos de alimentação. A análise de variância mostrou que a utilização do bagaço D, com intervalo de alimentação de 12 horas, foi a que apresentou o melhor resultado na produção de etanol por tonelada de bagaço.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-07T12:46:03Z No. of bitstreams: 1 Tatiana Barros Ferreira Lira.pdf: 440885 bytes, checksum: cdf11c6935644d329907c03c11cbdce8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-07T12:46:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tatiana Barros Ferreira Lira.pdf: 440885 bytes, checksum: cdf11c6935644d329907c03c11cbdce8 (MD5) Previous issue date: 2010-02-22 / Goat’s milk is the product derived from the complete milking, uninterrupted, in conditions of hygiene, goat healthy, well fed and rested. Casein is the major protein component of milk, constituting about 80% of the total fraction of milk proteins. The control of hydrolytic parameters of milk casein is an important step for obtaining products with high nutritional quality, desirable functional properties, organoleptic characteristics appropriate to the consumer. Casein is the first choice as a protein source in the preparation of protein hydrolysates, was obtained by isoelectric precipitation and enzymatic hydrolysis was performed using trypsin, pepsin and papain. The effect of pH, temperature, time and enzyme:substrate ratio on the hydrolysis degree was evaluated according to the results obtained in the factorial statistical design (24). Electrophoresis in SDS-PAGE was performed to monitor the hydrolysis products. The best values of degree hydrolysis obtained for the enzymes papain, trypsin and pepsin were 28,17%, 29,55% and 38,27%, respectively . It was possible to establish the conditions for hydrolysis of goat’s milk Moxotó casein using proteolytic enzymes, but the pepsin, showed the best hydrolysis degree and was detected by SDS-PAGE peptides just molecular weight below 14,4kDa. / O leite de cabra é o produto oriundo da ordenha completa, ininterrupta, em condições de higiene, de animais da espécie caprina sadios, bem alimentados e descansados. A caseína é o principal componente protéico do leite, constituindo aproximadamente 80% da fração total de proteínas do leite. O controle dos parâmetros hidrolíticos da caseína do leite é uma etapa importante para se obter produtos com qualidade nutricional elevada, propriedades funcionais desejáveis e características organolépticas agradáveis ao consumidor. A caseína foi escolhida como fonte protéica na preparação de hidrolisados enzimáticos, obtida por precipitação isoelétrica e submetida à hidrólise enzimática usando-se tripsina, pepsina e papaína. O efeito do pH, temperatura, tempo e relação enzima: substrato sobre o grau de hidrólise foi avaliado de acordo com os resultados obtidos no planejamento fatorial completo (24). A eletroforese em SDS-PAGE foi realizada para avaliação dos produtos de hidrólise. Os melhores valores de grau de hidrólise obtidos para as enzimas papaína, tripsina e pepsina foram 28,17%, 29,55% e 38,27%, respectivamente. Os resultados possibilitaram estabelecer as melhores condições de hidrólise da caseína do leite de cabra Moxotó, com as enzimas proteolíticas utilizadas, porém a pepsina apresentou melhor grau de hidrólise e foi possível detectar pela eletroforese SDSPAGE apenas peptídeos com peso molecular abaixo de 14,4kDa.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-07-31T20:36:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Thiago Cavalcanti da Silva.pdf: 1792875 bytes, checksum: d52665aa636e788c30a40a8075c75c58 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-01T21:24:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Thiago Cavalcanti da Silva.pdf: 1792875 bytes, checksum: d52665aa636e788c30a40a8075c75c58 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-01T21:24:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Thiago Cavalcanti da Silva.pdf: 1792875 bytes, checksum: d52665aa636e788c30a40a8075c75c58 (MD5) Previous issue date: 2017-03-03 / O biodiesel é produzido a partir de óleos vegetais ou gorduras animais, álcool e um catalisador. O processo mais utilizado para a síntese do biodiesel é a transesterificação, gerando ésteres monoalquílicos. Durante a produção do biodiesel, há o surgimento de coprodutos indesejáveis e a presença de residuais de matérias primas não processadas que se encontram dissolvidas ao final da reação. Com isso, se faz necessário que ocorra um processo de tratamento dessas impurezas, constituídas por glicerol livre, sabão, além de conter álcool, catalisador e óleo emulsionado que não foram reagidos durante a produção do biodiesel. Este trabalho visa caracterizar o efluente gerado pelo processo de purificação do biodiesel, além de avaliar alternativas de tratamento deste efluente oleoso utilizando um método biotecnológico. O efluente foi caracterizado pelos parâmetros: pH, turbidez, condutividade, DQO, DBO₅, sólidos totais (fixos, voláteis), sólidos dissolvidos totais, temperatura e teor de óleos e graxas. A lipase utilizada no tratamento do efluente foi produzida originalmente a partir de otimização dos dados obtidos na literatura. O fungo utilizado para a produção da lipase foi o Rhizopus oryzae e os melhores resultados experimentais foram modelados com o emprego do planejamento fatorial, que conteve fonte de carbono (glicerina residual), fonte de nitrogênio (peptona e NaNO₃) e Tween 20 como variáveis do estudo estatístico. A etapa seguinte da pesquisa foi a realização de um novo planejamento fatorial destinado à aplicação dessa lipase visando o tratamento do efluente de biodiesel. Nesse processo, utilizaram-se pH, concentração de goma arábica (solução a 7% m/V) e concentração da lipase como variáveis deste estudo estatístico. Ressalta-se que a remoção do teor de óleos e graxas e DQO do efluente foram avaliadas nesta modelagem estatística. Experimentalmente, foi observado que o efluente coletado apresentava elevado teor de óleos e graxas, DQO e carga orgânica. O planejamento fatorial de produção da lipase constatou que todas as variáveis utilizadas no modelo foram significativas, entretanto, a fonte de carbono foi a que se mostrou a mais importante dentre as demais. A atividade enzimática máxima da lipase obtida foi de 389,62 U.L⁻¹. Com relação ao resultado obtido no planejamento fatorial de aplicação da lipase no tratamento do efluente, foi possível verificar que todas as variáveis foram significativas, porém o volume de solução de goma arábica aplicada foi o mais evidenciado, pelo fato de os ensaios que utilizaram a maior aplicação dessa variável terem obtido os menores resultados de TOG e de DQO em comparação a todo o planejamento, 60 mg.L⁻¹ e 207.783,6 mg.L⁻¹ respectivamente. A melhor condição obtida com o tratamento enzimático no efluente de biodiesel resultou numa eficiência de remoção de DQO e de TOG em 29,4% e 99,2% respectivamente. Esses resultados indicam que o tratamento proposto mesmo obtendo remoções consideráveis de DQO e TOG, ainda não permite o descarte deste efluente tratados no meio ambiente, de acordo com a resolução CONAMA 357/2005. / Biodiesel is produced from vegetable oils or animal fats, alcohol and a catalyst. The most used process for the synthesis of biodiesel is the transesterification, generating monoalkyl esters. During the production of biodiesel, occur the appearance of undesirable coproducts and the presence of residuals of raw materials that are dissolved with the product at the end of the reaction. Therefore, it is necessary to have a process of treatment of these impurities, constituted by free glycerol, soap, besides containing alcohol, catalyst and emulsified oil that were not reacted during the biodiesel production. This work aims to characterize the effluent generated by the biodiesel purification process, besides evaluating alternatives for treatment of this oily effluent using a biotechnological method. The effluent was characterized by: pH, turbidity, conductivity, COD, BOD5, total solids (fixed, volatile), total dissolved solids, temperature and content of oils and greases. The lipase used in the treatment of the effluent was originally produced from optimization of data obtained in the literature. The fungus used to produce lipase was Rhizopus oryzae and the best experimental results were modeled using DOE, using carbon source (residual glycerin), nitrogen source (peptone and NaNO3) and Tween 20 as variables for the Statistical study. The next stage of the research was the realization of a new experimental design for the application of this lipase for the treatment of the biodiesel effluent. In this process, pH, gum arabic concentration (7% w / v solution) and lipase concentration were used as variables in this Statistical study. It should be noted that the removal of the oils and grease content and COD of the effluent were evaluated in this statistical modeling. Experimentally, it was observed that the collected effluent presented high content of oils and greases, COD and organic load. The factorial design of lipase production found that all the variables used in the model were significant, however, the carbon source was the most important of the others. The maximum enzymatic activity of lipase obtained was 389.62 U.L⁻¹. Regarding the results obtained in the factorial design of lipase application in the treatment of the effluent, it was possible to verify that all the variables were significant, but the volume of solution of gum arabic applied was the most evidenced, since the tests that used the largest Application of this variable obtained the lowest TOG and COD results compared to the whole planning, 60 mg.L⁻¹ and 207,783.6 mg.L⁻¹, respectively. The best condition obtained with the enzymatic treatment in the biodiesel effluent resulted in a COD removal and TOG removal efficiency of 29.4% and 99.2%, respectively. These results indicate that the proposed treatment, even obtaining considerable removals of COD and TOG, still does not allow the disposal of this effluent treated in the environment, according to CONAMA Resolution 357/2005.

Orientador: Anita Jocelyne Marsaioli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T06:36:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Angolini_CelioFernandoFigueiredo_M.pdf: 1807918 bytes, checksum: 1025a83a0e328d289f9384739f1f7b1c (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O principal objetivo desse trabalho foi avaliar a biodegradação de petróleo e suas implicações nos parâmetros de correlação do óleo realizada por microrganismos isolados da Bacia de Campos (RJ) e de consórcios microbianos da Bacia Potiguar (RN). Os experimentos de biodegradação foram adaptados à escala laboratorial, a fim de mimetizar um reservatório de petróleo. O estudo das atividades enzimáticas com moléculas representantes de algumas classes de biomarcadores de petróleo revelou a existência de enzimas capazes de realizar algumas reações como as de: lipase, esterase, epóxido-hidrolase, mono e dioxidases, redutases e liases (reações de formação e/ou rompimento de ligações carbono-carbono). Atividades essas importantes na degradação do petróleo e de outras fontes de carbono. Nos experimentos com biodegradação de petróleo pôde-se perceber que os microrganismos isolados atuaram de forma diferente entre si sobre as diferentes classes de biomarcadores. De maneira geral a biodegradação dos microrganismos isolados com o óleo P1 apresentou uma preferência na seguinte ordem: hidrocarbonetos saturados > aromáticos leves > bicíclicos > terpanos tricíclicos e hopanos. Já para o consorcio avaliado, recuperado do óleo da bacia Potiguar, frente ao óleo PS1 observou-se a seguinte seqüência de biodegradação: hidrocarbonetos leves> aromáticos leves> terpanos tricíclicos. Sendo que os hidrocarbonetos mais pesados e hopanos não apresentaram uma biodegradação tão significativa. Os resultados obtidos foram importantes para concluir que alguns dos parâmetros de biodegradação utilizados em geoquímica orgânica variam muito em função do tipo de atuação da microbiota específica presente no reservatório. / Abstract: The main objective of this study was to evaluate the oil biodegradation of the Pampo Sul oil field (Campos Basin , RJ) isolated microorganisms and the Potiguar Basin (RN) microbial consortia and how they affected the geochemical parameters. The biodegradation experiments of selected molecules, chosen to represent some petroleum biomarker classes, were adapted to the laboratory scale trying to mimic an oil reservoir, revealed the presence of lipases, esterases, epoxide hydrolases, mono and dioxygenases, reductases and some C-C bond cleaving and bond making (liases) enzymes. These activities are important for oil degradation and of other carbon sources. In experiments of oil biodegradation these microorganisms had a different beaviour upon each biomarker class. In general the biodegradation of microorganisms with the oil P1 showed a preference for: hydrocarbons > light aromatic > bicyclic terpanes > tricyclic terpanes and hopanes. Microorganims from Potiguar Basin oil had a different preference in biodegradation: light hydrocarbons> light aromatic > tricyclic terpanea, and the heavier hydrocarbons and hopanes showed no significant biodegradation. In conclusion, these results reveal that the geochemical parameters that are proxies of biodegradation depend on the specific microbiota in the reservoir. / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Orientador: Elias Basile Tambourgi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T15:59:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moura_MarieleNairdeCampos_M.pdf: 414668 bytes, checksum: 15e538377d1bb0cb64d19192903c7b9e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Bromelina é o nome dado a um conjunto de enzimas proteolíticas encontradas nos vegetais da família Bromeliaceae, na qual abacaxi é o mais conhecido. A bromelina é encontrada na casca, no talo e no fruto do abacaxi. A enzima não está presente nos primeiros estágios de desenvolvimento do fruto, seu nível aumenta rapidamente, ficando alto até a maturação do fruto. A bromelina tem diversas aplicações nas indústrias alimentícias e farmacêuticas. Com o desenvolvimento de novas técnicas de extração e purificação da bromelina, tornou-se necessário um estudo de estabilidade desta enzima. É importante saber em que condições a bromelina se mantém estável, ou seja, ativa e por qual período de tempo. Este trabalho apresenta um estudo da condição do pH em que a Bromelina P.A e a da casca e talo do abacaxi, mantém se ativa, ou seja, não desnaturada e suas influências com o tempo. A atividade enzimática foi medida através da hidrólise da caseína. Foi observado que a bromelina P.A e a da casca e talo do abacaxi apresentam ótima atividade enzimática em pH neutro e mantém-se estável por aproximadamente quinze dias / Abstract: Bromelain is a set of proteolitics enzymes found in vegetables of the Bromeliaceae family, from which pineapple is known more. The bromelain is found in pineapple stem and fruit. The Enzyme are not presented in the early stages of fruit development, however, their levels increase quickly, remaining high until the maturation. Bromelain has several uses in food industry and pharmaceutical industry. The development of new extraction and purification processes of bromelain have been studied, however, its necessary a enzyme stabilization investigation. It is important to know the conditions and the time which bromelain remain stabilized, active. This work presents a study about pH condition which a bromelain aqueous solution and bromelain of a pineapple stem, remains with biological activity and its influences within time. The enzyme activity was tested across the casein hydrolysis. It was observed wich a bromelain aqueous solution and bromelain of a pineapple stem showed optimum activity at neutral pH and 37 °C and kept stable for around fifteen days / Mestrado / Sistemas de Processos Quimicos e Informatica / Mestre em Engenharia Química

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-07T15:47:07Z No. of bitstreams: 1 Tese - Marcos C. F. Pessoa.pdf: 8331018 bytes, checksum: c9298c837dfb2abd0efd60077484af31 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-07T15:47:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Marcos C. F. Pessoa.pdf: 8331018 bytes, checksum: c9298c837dfb2abd0efd60077484af31 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-07T15:47:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Marcos C. F. Pessoa.pdf: 8331018 bytes, checksum: c9298c837dfb2abd0efd60077484af31 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-07T15:47:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Marcos C. F. Pessoa.pdf: 8331018 bytes, checksum: c9298c837dfb2abd0efd60077484af31 (MD5) Previous issue date: 2014-06-06 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Human malaria being a tropical and parasitic disease of medical, social and economic relevance represents one of the most important public health problems in the world. Given of resistance of the insect vector to insecticides, research of new tools for vector control has been proposed. The most fascinating alternative is based on the use of enzyme inhibitors that play an important and fundamental role in the metabolism and physiology of the insect. One of this enzyme is trehalose-6- phosphate phosphatase that dephosphorylates trehalose-6-phosphate substrate, forming trehalose disaccharide and inorganic phosphate. Trehalose is a dimer of glucose found in plants, insects and microorganisms. In that organisms trehalose is important to different roles, of which is to serve as a site of glucose storage for energy and/or synthesis of cellular components, another role is to protect the cells against environmental stresses such as desiccation and freezing, and to stabilize proteins against denaturation. Therefore, this study aimed to clone and express trehalose-6-phosphate phosphatase (TPP) gene from Anopheles gambiae mosquito in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and to analyze recombinant enzyme expressed in this yeast. According to results, was demonstrated that TPP enzyme from A. gambiae has been efficiently expressed in P. pastoris and secreted into the cell culture supernatant as analyzed by Western blotting. By the electrophoretic profile in SDS-PAGE gel, after the purification procedure, has been revealed that recombinant TPP enzyme of TPP 61 clone has a molecular weight of ~ 36 kDa. The characterization of enzyme presented an optimum pH of 8.0 and optimum temperature of 38 °C. The kinetic constants of enzyme indicated a KM of 3.19 ± 0.10 mM and Vmax of 290.0 ± 3.78 μmol.min-1. The two-way ANOVA test revealed significant inhibition of recombinant TPP for EDTA (p <0.0001), NaF (p <0.0001), CaCl2 (p <0.001) and Ca(NO3)2 (p <0.0001) at 25 mM concentration, while CaCl2 (p <0.001) and Ca(NO3)2 (p <0.05) compounds were significant for inhibition enzyme at 5 mM concentration. / A malária humana por ser uma doença tropical e parasitária de relevância médica, social e econômica, representa um dos mais importantes problemas de saúde pública no mundo. Em vista à resistência do inseto-vetor aos inseticidas, a pesquisa de novas ferramentas para o controle do vetor tem sido proposta. Uma das alternativas mais fascinantes baseia-se no uso de inibidores de enzimas que desempenham papel importante e fundamental no metabolismo e fisiologia do inseto. Uma destas enzimas é a trealose-6-fosfato fosfatase atuante na rota metabólica da trealose que desfosforila a molécula de trealose-6-fosfato, formando como produtos o dissacarídeo trealose e fosfato inorgânico. A trealose é um dímero de glicose encontrado em plantas, insetos e micro-organismos. Nestes organismos acredita-se ser importante para diversos papéis, um dos quais é servir como sítio de armazenamento de glicose para energia e/ou para a síntese de componentes celulares, outro papel é proteger as células contra pressões ambientais, tais como dessecação e congelamento, e para estabilização de proteínas contra a desnaturação. Por esse motivo, este trabalho teve como objetivo clonar e expressar o gene da trealose-6-fosfato fosfatase (TPP) de Anopheles gambiae na levedura metilotrófica Pichia pastoris e analisar a enzima recombinante expressa na levedura. De acordo com os resultados obtidos, foi possível demonstrar que a enzima TPP de A. gambiae foi expressa eficazmente na levedura P. pastoris e secretada no sobrenadante da cultura celular, conforme análise por Western blotting. Pelo perfil eletroforético em gel SDS-PAGE, após procedimento de purificação, foi revelado que a enzima TPP recombinante do clone TPP 61 tem massa molecular de ~36 kDa. A caracterização da enzima apresentou pH ótimo de 8,0 e temperatura ótima de 38 ºC. As constantes cinéticas da enzima indicaram um KM de 3,19 ± 0,10 mM e Vmáx de 290,0 ± 3,78 μmol.min-1. A análise de variância (ANOVA) com dois fatores revelou inibição significativa da TPP recombinante para EDTA (p <0,0001), NaF (p <0,0001), CaCl2 (p <0,001) e Ca(NO3)2 (p <0,0001) na concentração de 25 mM, enquanto que na concentração de 5 mM os compostos CaCl2 (p <0,001) e Ca(NO3)2 (p <0,05) foram significativos na inibição da enzima.

Esta tese aborda quatro tópicos fundamentais para o desenvolvimento e aplicação de membranas eletroativas nanoestruturadas (MENs): (i) síntese e caracterização de nanopartículas (Nps) de prata, ouro e platina encapsuladas em moléculas de dendrímero poliamidoamina geração 4 (PAMAM); (ii) preparação de filmes automontados contendo PAMAM e Nps de ouro (PAMAM-Au); (iii) preparação de MENs utilizando sistema core-shell PAMAM-Au@Me, onde Me é um mediador redox; (iv) imobilização enzimática em MENs e estudos biocatalíticos associados a processos eletroquímicos. As Nps foram caracterizadas observando-se a banda plasmônica em espectros na região do UV-Vis. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão revelaram que PAMAM-Au e PAMAM-Pt possuem morfologias esféricas, enquanto o PAMAM-Ag forma grandes cristais com estruturas fractais. Estruturas cúbicas de face centrada caracterizaram os cristais formados de Au e Pt, sendo possível estimar os diâmetros (3,0 nm) das Nps pela equação de Scherrer em difratogramas de raios X, confirmados posteriormente por microscopia eletrônica por transmissão (TEM). Um indício de estabilização por encapsulamento do híbrido PAMAM-Au foi obtido de espectros de infravermelho (FTIR), a partir de modificações nas bandas das amidas. A cinética de reação para formação de PAMAM-Au também foi estudada. Filmes de PVS/PAMAM-Au (onde PVS é o poli(ácidovinilssulfônico)) foram preparados com 5 minutos de imersão, com a mesma quantidade de material sendo adsorvida em cada camada, segundo medidas de espectroscopia UV-Vis e voltametria cíclica (CV). No caso do eletrodo ITO-(PVS/PAMAM-Au), saltos de elétrons foram considerados o mecanismo de transporte de carga ao longo do filme. Um novo sistema core-shell Au@PB foi preparado, formando um sistema ITO-(PVS/PAMAM-Au)6@PB, em que a eletrodeposição de PB (azul da Prússia) foi monitorada medindo-se as correntes faradaicas durante os ciclos potenciodinâmicos. Outros mediadores de hexacianoferratos de metais de transição (Fe, Ni, Co e Cu) foram obtidos sobre eletrodos de ITO-(PVS/PAMAM-Au). De resultados de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS), verificou-se que a resistência de transporte de carga decresce na sequência CuHCF > FeHCF > NiHCF > CoHCF e todos os eletrodos apresentaram atividade catalítica para o peróxido de hidrogênio. Uma nova configuração de eletrodo, ITO-(PVS/PAMAM-Au)3@CoHCF-GOx, pôde ser aplicada como dispositivo enzimático, com a glicose oxidase (GOx) sendo imobilizada por drop-coating na superfície do eletrodo e aplicada em experimentos de biocatálise. A glicose pôde ser detectada a 0,0 V (Ag/AgCl), com resposta linear até 100 µmol L-1 de glicose, sensibilidade de 115 nA mmol L-1, limite de detecção de 5,5 µmol L-1 e KMapp de 0,24 mmol L-1, mostrando que o sistema aqui proposto cria um ambiente propício para a enzima operar com alta atividade catalítica. / This thesis addresses four fundamental topics for producing and applying electroactive nanostructured membranes (ENMs): (i) synthesis of Au, Pt and Ag nanoparticles (Nps) using polyamidoamine (PAMAM generation 4) dendrimers as template/stabilizers; (ii) fabrication of layer-by-layer (LbL) films comprising PAMAM with AuNps (PAMAM-Au) and poly(vinylsulfonic acid) (PVS); (iii) preparation of a new core-shell system with Prussian blue (PB) around the Au nanoparticles (PAMAM-Au@PB); (iv) enzyme immobilization on ENMs and bioelectrochemistry studies. The formation of the Nps inside PAMAM was monitored by measuring the plasmonic band of NPs via UV-Vis spectroscopy. Images from transmission electron microscopy (TEM) showed well-organized Au and Pt spherical particles, with average diameter of 3 nm and narrow size distribution. In addition, X-ray diffraction of Nps enabled easy identification of the Nps atomic planes (face-centered cubic arrangements). However, PAMAMAg growth showed fractals structures. In order to confirm Au NPs encapsulation inside the PAMAM dendrimer, FTIR spectra in the transmission mode for neat PAMAM and PAMAM-Au were compared. The kinetics of formation of PAMAM-Au was studied by UV-Vis spectroscopy. The deposition of individual PAMAM-Au layers was examined in detail: the adsorption kinetics was determined by CV to be first-order and that 5 min of adsorption was sufficient for maximum coverage. Formation of PVS/PAMAM-Au multilayers showed a linear increase in anodic and cathodic peak currents, indicating that the same amount of material was adsorbed in each deposition step. Electron-hopping was inferred as the charge transport mechanism between PAMAM-Au layers. Using hexacyanoferrate (III) to probe the electrochemical reaction at the electrode surface, the charge transport in the PAMAM-Au layers was shown to be faster than for non-modified electrodes. A new system based on PAMAM-Au@PB was prepared by simple potential cycling electrodeposition after ITO-PVS/PAMAM-Au LbL film preparation. New systems are described based on ENM membranes of ITOPVS/ PAMAM-Au LbL electrodes, with a redox mediator (Me) electrodeposited around Au nanoparticles. The resulting ITO-PVS/PAMAM-Au@Me system was then characterised electrochemically using cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy. We demonstrated that the concept of ENM can be generalized to a wider variety of redox mediators. All electrodes modified with hexacyanoferrates showed electrocatalytic activity towards hydrogen peroxide, which is promising for the preparation of nanodevices requiring redox mediators. An electrochemical enzyme device with glucose oxidase (GOx) immobilized at ITO-(PVS/PAMAM-Au)3@CoHCF ENM was developed. Using CoHCF as redox mediator, hydrogen peroxide (the enzymatic reaction product) was determined at 0.0 V (vs. SCE), with linear range up to 100 Zmol L-1 of glucose, sensitivity of 115 nA mmol L-1, detection limit of 5.5 Zmol L-1 and KM app of 0.24 mmol L-1. Such a performance indicates that this system promotes a friendly environment for enzyme immobilization.

Os compostos fenólicos, quando em altas concentrações na água, são poluentes de alta periculosidade, difíceis de serem eliminados até mesmo por métodos convencionais, como por exemplo, a biorremediação microbiológica dos lodos ativados e os métodos físico-químicos. Sabendo da presença dos fenóis em muitos efluentes industriais se faz necessário o estudo de novos processos para o tratamento desses efluentes que possuam aplicações eficazes e, sobretudo, ecologicamente corretas. A presente pesquisa visou a degradação de poluentes fenólicos em soluções aquosas através da oxidação enzimática com tirosinase imobilizada em quitosana. A contribuição tecnológica relaciona-se com a possibilidade de aplicação do estudo em escala industrial em processos de tratamento de efluentes industriais que contenham poluentes fenólicos. Fenóis como o 4-clorofenol, 4-cresol, 4-nitrofenol e o próprio fenol, foram utilizados em ensaios de oxidação enzimática em vaso agitado, em regime dinâmico, em processo de batelada, temperatura de 45°C e três faixas de concentração enzimática (40, 60 e 80 U/ml). Além disso, foram testadas três formas de quitosana utilizadas na imobilização enzimática e aplicadas nos processos de oxidação de fenol: esferas, flocos e micro partículas de quitosana. A enzima tirosinase foi eficiente na degradação de fenol, 4-cresol e 4-clorofenol, diminuindo consideravelmente a concentração destes poluentes nas soluções aquosas. Porém, a tirosinase não oxidou significativamente o 4-nitrofenol. Verificou-se que o efeito de alguns substituintes do anel aromático do fenol e a posição desse substituinte no anel aromático, exerce influência direta na atividade da enzima durante as reações oxidativas envolvendo os compostos fenólicos. Embora o presente estudo tenha apresentado bons resultados na remoção de alguns compostos fenólicos em soluções aquosas por meio da oxidação de tais poluentes pela enzima tirosinase imobilizada em quitosana, o complexo enzima-suporte não apresentou a mesma eficiência nos ensaios subseqüentes, nos quais foi estudada a reutilização da enzima imobilizada. / The phenolic compounds when in high concentrations in water are extremely dangerous pollutants and difficult to be eliminated even by conventional methods such as the microbiological bioremediation with activated sludge and physico-chemical methods. Phenols are present in many industrial effluents and is necessary to develop new and effective processes for the treatment of that effluents and, if possible, environmentally friendly. This research aimed the degradation of phenolic pollutants in aqueous solutions by enzymatic oxidation with tyrosinase immobilized in chitosan. Phenols such as 4-chlorophenol, 4-cresol, 4-nitrophenol and phenol, had been used in assays of enzymatic oxidation in an agitated reactor, in dynamic regime, in a batch process, temperature of 45°C and three values of enzymatic concentration ( 40, 60 and 80 U/ml). In addition, three forms of chitosan had been used in enzymatic immobilization and applied in the processes of oxidation of phenol: pellets, flakes and small particles of chitosan. Tyrosinase was efficient in the degradation of phenol, 4-cresol and 4-chlorophenol, reducing significantly the concentration of these pollutants in aqueous solutions. However, tyrosinase did not oxidized 4-nitrophenol. It was verified that the effect of some substitutes and their position in the aromatic ring has a direct influence on the activity of the enzyme during the oxidative reactions involving phenolic compounds. Although this study has shown good results in the removal of some phenolic compounds in aqueous solutions through the oxidation of such pollutants by the tyrosinase immobilized on chitosan, the enzyme-support did not present the same efficiency in subsequent assays, in which we studied the reuse of the immobilized enzyme.