Orientador: Paulo Inácio da Costa / Banca: Miriane da Costa Gileno / Banca: Vanderlei Rodrigues / Banca: Daniele Cardoso Geraldo Maia / Banca: Elisabeth Loshchagin Pizzolitto / Resumo: O vírus da hepatite C (VHC) é um vírus envelopado com cerca de 50 a 70 nm de diâmetro, fita positiva de RNA e pertence ao gênero do Hepacivirus e à família Flaviridae. A detecção e quantificação do antígeno do core, proteína do nucleocapsídeo do VHC tem obtido sucesso em muitos ensaios, sendo considerado um marcador da replicação viral, por apresentar uma sequencia de aminoácidos altamente conservada, o que lhe confere alta sensibilidade e especificidade. A proteína E2 é uma glicoproteína de envelope do VHC com 11 sítios de glicosilação e a maioria deles estão bem conservados, tornando-a um alvo antigênico. O objetivo deste estudo foi o de desenvolver métodos diagnósticos para o VHC de alta sensibilidade, baixo custo e que pudessem ser utilizados na triagem sorológica. As regiões genômicas que codificam as proteínas core (parcial 136 aa) e E2 do VHC foram expressas em E. coli da linhagem Rosetta e clonadas no vetor de expressão pET-42a e induzidas por IPTG 0,4mM, produzindo proteínas recombinantes fusionadas a proteína GST (glutationa S-transferase), que foram então purificadas por cromatografia de afinidade. A imunorreatividade foi avaliada por Western Blot, Slot Blot e os métodos diagnósticos (ensaio imunoenzimático (ELISA) de captura, indireto, imunoblotting e imunocromatográfico) desenvolvidos e aprimorados. Os métodos desenvolvidos foram mais sensíveis e específicos utilizando a mistura das proteínas recombinantes fusionadas a GST (core + E2) / Abstract: The hepatitis C virus (HCV) is an enveloped virus of about 50 to 70 nm in diameter, positive strand RNA, and belongs to the genus Hepacivirus and the family Flaviridae. The detection and quantification of the core antigen, HCV nucleocapsid protein, has been successful in many trials and is considered a marker of viral replication, since it presents a sequence of highly conserved amino acids, giving it high sensitivity and specificity. The E2 protein is an envelope glycoprotein of HCV with 11 glycosylation sites, most of these well-conserved, making it a target antigen. The aim of this study was to develop high sensitivity, low cost diagnostic methods for HCV which could be used for serological screening. The genomic regions encoding the core (part 136 aa) and E2 proteins of HCV were expressed in E. coli Rosetta strain, cloned in expression vector pET-42a, and induced with 0.4 mM IPTG, producing recombinant proteins fused to GST protein (glutathione S-transferase), which were then purified by affinity chromatography. The immunoreactivity was assessed by Western blot, Slot Blot and the developed and improved diagnostic methods (enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) capture and indirect, immunoblotting and immunochromatographic). The methods developed were more sensitive and specific using the mixture of the recombinant proteins fused to GST (core + E2) / Doutor

Orientador: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Alexandre Secorun Borges / Banca: Alice Fernandes Alfieri / Banca: Hélio Jose Montassier / Banca: Marcos Bryan Heinemann / Resumo: A quantificação de anticorpos é muito importante para monitoramento sorológico em granjas e associação com proteção contra o circovírus suíno tipo 2 (PCV2). Dessa forma este trabalho teve como objetivo padronizar e aplicar ELISA indireto com anticorpo de captura e utilizá-lo na quantificação de anticorpos contra o PCV2 em soros de suínos. Na padronização, os soros teste e os imunoreagentes básicos, incluindo, anticorpo de coelho anti-PCV2 purificado utilizado como captura e suspensão viral tiveram suas concentrações de uso ótimas determinadas. Aplicou-se o índice ELISA (IE) nos resultados dos soros de suínos para correção de variações entre testes. O teste mostrou-se específico do ponto de vista analítico e com alta reprodutibilidade podendo adequadamente ser utilizado na quantificação de anticorpos em soros de suínos contra o PCV2. Na aplicação, um total de 138 amostras de soros foi testado sendo cinco de porcas na gestação e 133 de leitões nascidos dessas porcas, acompanhados nas fases de maternidade ao crescimento em uma granja comercial com SMDS. Na avaliação da resposta de anticorpos contra o vírus, houve uma diminuição dos anticorpos da maternidade para a creche, coincidindo com o declínio dos anticorpos de origem materna e com a ocorrência da soroconversão simultaneamente com a detecção de PCV no sangue total pela PCR quantitativa. Em dois leitões com alta carga relativa de DNA viral e sinais clínicos sugestivos de SMDS, a quantidade de anticorpos detectada foi extremamente baixa / Abstract: Antibody quantification is important for serological monitoring in swine herds and association with protection against porcine circovirus type 2 (PCV2). The aim of this work was to standardize and apply indirect trapping ELISA and use it in the quantification of antibodies against PCV2 in sera from pigs. The immunoreagents, including rabbit antibody anti-purified PCV2 used as trapping antibody and viral suspension had their optimum use dilution previously determined. The absorbance index (ELISA Index, EI), was used to determine the antibody concentration in pig serum directed against PCV2. The test showed high analytical specificity and reproducibility. A total of 138 serum samples was tested including five sows in gestation and 133 piglets accompanied by phases from lactation to growth in a commercial swine herd where PCV2 was previously detected. In anti PCV2 antibody response it was observed a decreasing in the phases of lactation to nursery due to decline of maternal antibodies. The seroconversion was concurrent with PCV DNA detection by quantitative PCR in total blood. In two piglets with high relative DNA viral load and compatible clinical signs of PMWS, the anti PCV2 antibody concentration was very low / Doutor

Orientador: Valéria Marçal Félix de Lima / Banca:Gisele Fabrino Machado / Banca: Hélio José Montassier / Resumo: A leishmaniose visceral (LV) é causada por parasitas intracelulares do gênero Leishmania que afeta humanos e várias espécies de animais. Os cães são um dos principais reservatórios urbanos da Leishmania Infantum e desempenham um papel central no ciclo de transmissão para os seres humanos utilizando flebotomíneos. A apoptose de linfócitos está envolvida na regulação da resposta imune da LV, podendo contribuir para uma resposta imune ineficaz porque o mecanismo efetor não reduz a multiplicação do patógeno. Um importante regulador da apoptose é a proteína FAS (Cluster de diferenciação 95 CD95) e proteína ligante FAS-FASL (Cluster de diferenciação 178-CD178), sistema envolvido na baixa regulação de reações imunes mediadas por células T citotóxicas. A proteína FAS é um membro de receptor da superfamília fator de necrose tumoral (TNF) que pode ser expresso na forma transmembrana ou solúvel. Os níveis das proteínas solúvel FAS (sFAS), solúvel FASL (sFASL), e caspase 3 ativa, essa última relacionada a cascata apoptótica, foram determinados por ensaio de ELISA de captura nos extratos do baço de 19 cães sintomáticos apresentando LV moderada e em 6 cães saudáveis. A carga parasitária esplênica foi determinada por PCR em tempo real com amplificação do segmento intergênico espaçador transcrito interno 1 (ITS1) do gene de rRNA do parasita. Foi realizada a correlação entre os níveis de sFAS e sFAS-L com a carga parasitária explênica. Os cães com leishmaniose apresentaram menores níveis de sFAS (p<0,05) e elevados níveis de sFASL e caspase 3 ativa (p<0,05) no baço que os cães saudáveis. Além disso, foi observada correlação negativa entre a carga parasitária e os níveis de sFASL nos cães infectados. Conclui-se que o aumento do sFASL pode estar relacionado com o mecanismo envolvido na eliminação do parasita / Abstract: Visceral Leishmaniosis (VL) is caused by intracellular parasites of the genus Leishmania that affect humans and several animal species. Dogs are one of the main urban reservoirs of Leishmania infantum and play a central role in the transmission cycle to humans via sandflies. CD3+ cells apoptosis is involved in the immune response in VL. Dysregulation of apoptosis has been implicated in various disease states. An important regulator of apoptosis is the FAS-FAS-associated death domain protein (cluster of differentiation 95-CD95) and FASL-FAS ligand protein (cluster of differentiation 178-CD178) system involved in the down-regulation of immune reactions and in T cell-mediated cytotoxicity. FAS is a member of the tumor necrosis factor (TNF) receptor super family, which can be expressed in transmembrane or soluble forms. The soluble levels of FAS (sFAS), FASL (sFASL) and active Caspase-3, this last related to apoptotic cascade, were investigated in the spleen of 19 symptomatic dogs presenting moderate VL and 6 healthy dogs, determined by ELISA assay. The splenic parasite load was determined by real-time PCR monitoring of amplification of the intergenicinternal transcribed spacer (ITS1) gene of parasite rRNA. sFAS levels were lower (p <0.05) sFASL and active Caspase-3 levels were higher (p<0.05) in dogs with VL compared with controls. Negative correlation was observed between parasite burden and sFASL levels. The increase in sFASL could be related to the mechanism involved in the elimination of the parasite. / Mestre

Resumo: A angiogênese tem importante participação na patogênese das neoplasias malignas em seres humanos e animais de companhia. Estudos envolvendo a influência dos fatores pró-angiogênicos no crescimento e disseminação dos tumores sólidos têm sido amplamente realizados, porém os relacionados às neoplasias hematopoiéticas são extremamente limitados. O presente estudo objetivou investigar o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) nos linfomas caninos e sua relação com indicadores prognósticos da neoplasia. Foram avaliados 25 cães, sendo 10 sadios e 15 com linfoma. Os pacientes foram submetidos à coleta de sangue para mensuração da concentração sérica do VEGF, mediante ensaio imunoenzimático (ELISA), e biopsia de linfonodo ou de tecido neoplásico para avaliação da expressão do VEGF, pela técnica de imunoistoquímica. Embora a média das concentrações séricas do VEGF nos cães com linfoma (88,51±121,71) tenha sido superior à média dos cães sadios (17,93±23,34), estes valores não foram considerados significativos (p=0,10). A imunomarcação para VEGF foi maior (p<0,0001) em cães com linfoma (9,07±2,34) em comparação com os cães sadios (2,70±2,35). Não houve correlação significativa entre a concentração sérica e a marcação imunoistoquímica do VEGF com a localização anatômica, estádio e sub-estádio clínico, grau histológico, imunofenótipo e a sobrevida dos cães com linfoma. O sub-estádio clínico influenciou negativamente na sobrevida dos cães com linfoma. Os resultados obtidos permitem concluir que o VEGF possui grande importância no comportamento biológico dos linfomas caninos, seja mediante estímulo da angiogênese ou da linfangiogênese tumoral. São necessários estudos com maior número de animais para determinar o valor prognóstico do estímulo à angiogênese ou linfangiogênese nos linfomas caninos. / Abstract: Angiogenesis has a major role in the pathogenesis of malignancies in human beings and companion animals. Studies involving the role of pro-angiogenic factors in growing and dissemination of solid tumors are commonly performed, but studies involving hematological malignancies are relatively limited. The present report aims to investigate the role of the vascular endothelial growth factor (VEGF) in canine lymphomas and its relation with prognostic factors. Twenty five dogs were evaluated: ten healthy dogs and fifteen dogs with lymphoma. Patients were submitted to blood sample collection to VEGF serum concentration measure, by means of sandwich enzyme immunoassay. Lymph node or neoplastic tissue biopsy was accomplished in order to evaluate VEGF expression, through immunohistochemical technique. Although VEGF serum concentrations mean in dogs with lymphoma (88,51±121,71) was found to be greater than VEGF serum concentrations in healthy dogs (17,93±23,34), this values were not statistically significant (p=0,10). VEGF expression was significantly higher (p=0,0001) in dogs with lymphoma (9,07±2,34) than VEGF expression in healthy dogs (2,70±2,35). No significant relationship was found between VEGF serum concentration or expression and anatomical localization, clinical stage, histological grade, immunophenotype or overall survival of lymphoma affected dogs. The clinical sub-stage was the only negative prognostic factor in overall survival of dogs with lymphoma. We conclude that VEGF has an important role in biological behavior of canine lymphomas, once is involved in tumoral angiogenesis or lymphangiogenesis stimuli. Larger series of animals are needed to determine the prognostic value of angiogenesis and lymphangiogenesis in canine lymphomas. / Orientador: Carlos Roberto Daleck / Coorientadora: Renée Laufer Amorin / Banca: Duvaldo Eurides / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Mestre

Orientador: Marlos Gonçalves Sousa / Banca: Aparecido Antonio Camacho / Banca: Ronaldo Jun Yamato / Resumo: A doxorrubicina é um quimioterápico bastante utilizado em pacientes oncológicos e sua cardiotoxicidade está relacionada com vários mecanismos celulares, incluindo necrose e apoptose. Estudos têm aventado a participação das metaloproteinases da matriz e seus inibidores na cardiotoxicidade induzida pela doxorrubicina. Assim, esta pesquisa teve como objetivo avaliar as atividades plasmática e miocárdica das metaloproteinases da matriz 2 e 9 em coelhos com cardiomiopatia por doxorrubicina, correlacionando-as com o remodelamento cardíaco que acompanha tal enfermidade. Os animais foram divididos em dois grupos: controle (n=10) e doxorrubicina (n=15). As atividades plasmática e miocárdica foram analisadas através do método de zimografia. Foram evidenciadas apenas as formas inativas das MMPs (pro-MMP) nas amostras sanguíneas analisadas. A pro-MMP-2 foi documentada no plasma dos animais controle e daqueles com cardiomiopatia por doxorrubicina em todos os momentos de avaliação. Já a pro-MMP-9 foi encontrada em algumas amostras dos grupos controle e enfermo, principalmente nos momentos de valiação T30 e T45, porém em fraca marcação. Houve diferença significativa na atividade das pro-MMPs-2 e 9 ao longo dos tempos de estudo. Os testes de correlação entre as pro-MMPs plasmática e os parâmetros ecocardiográficos evidenciaram resultados significativos. Em T0 verificou-se correlação entre A'lat e pro-MMP-2; em T15 documentaram-se correlações entre a pro-MMP-2 e os parâmetros PPE e TEI; já em T30 constatou-se correlação entre pro-MMP-9 e PLVE%; em T45, finalmente, foram observadas correlações entre pro-MMP-2 e os parâmetros DIVEs, DIVEd, SIVs e Emitral/E'sep, assim como entre pro-MMP-9 e TEVE. No miocárdio evidenciou-se apenas a pro-MMP-2. A atividade plasmática das MMPs, em especial a pro-MMP 2, pôde ser relacionada às alterações morfofuncionais da cardiomiopatia induzida, sendo que não houve correlação ... / Abstract: Doxorubicin is a chemotherapy agent frequently used in oncology patients. Its cardiotoxicity is related to several cellular mechanisms, including necrosis and apoptosis. Some studies have ascribed a role to matrix metalloproteinases and their inhibitors in the cardiotoxicity induced by doxorubicin. Therefore, this research was aimed at evaluating the plasma and myocardial activities of matrix metalloproteinases 2 and 9 in rabbits with doxorubicin-induced cardiomyopathy, searching for a correlation between them and the cardiac remodeling attributable to such disease. The animals were assigned into two groups: control (n=10) and doxorubicin (n=15). The plasmatic and myocardial activities were analyzed through the method of zymography. Only the inactive MMPs (pro-MMP) have been identified in the blood samples. The plasma pro-MMP-2 was documented in both control and doxurubicin animals from T0 to T45. On the contrary, the pro-MMP-9 was found in some samples of control and doxurubicin groups, especially at T30 and T45, although only weak bands have been demonstrated. A significant difference was shown to occur in pro-MMPs-2 and 9 along time. Correlation tests between the plasma pro-MMPs and the echocardiographic data demonstrated significant results. At T0 a correlation was found between A'lat and pro-MMP-2; at T15 correlations were documented between pro-MMP-2 and the parameters PEP and TEI; at T30 a correlation was identified between pro-MMP-9 and PLVE%; lastly, at T45 correlations have been observed between pro-MMP-2 and the parameters LVIDs, LVIDd, IVSs e Emitral/E'sep, as well as between pro-MMP-9 and LVET. Only the pro-MMP-2 was documented at the myocardium, although no significant difference between groups could be demonstrated. The plasmatic activity of the MMPs, specially the pro-MMP2, could be related to the morphofunctional alterations of the induced cardiomyopathy, and that there was no correlation between the plasmatic ... / Mestre

Resumo: presente estudo teve por objetivo pesquisar a ocorrência de infecção por Leishmania spp. em 491 cães domiciliados no município de Florianópolis, Santa Catarina, região até então considerada indene para leishmaniose visceral, mas que apresenta notificação de casos autóctones da doença canina no ano de 2011. A soroprevalência na população avaliada foi de 0,4% (2/491) por ELISA indireto e 4,09% (24/491) por RIFI. A concordância entre as técnicas sorológicas foi fraca (k=0,069). Somente um cão apresentou sororeatividade em ambos os métodos sorológicos. No mesmo animal foi amplificado o DNA de Leishmania sp. no sangue total, por PCR convencional e PCR em Tempo Real. Não foi possível realizar o sequenciamento do material amplificado e, deste modo, determinar a espécie de Leishmania envolvida. Os resultados do presente estudo salientam a necessidade de uma investigação epidemiológica minuciosa no município / Abstract:The aim of the present study was to investigate the occurrence of Leishmania infantum chagasi infection in 491 dogs living in Florianópolis, Santa Catarina, a region considered non-endemic for visceral leishmaniasis, but with notification of autochthonous of canine cases in 2011. The seroprevalence in this population was 0.4% (2/491) by ELISA and 4.09% (24/491) by IFAT. There was a poor agreement between the serological techniques (k = 0.069). Only one dog presented seroreactivity in both serological methods. In the same animal Leishmania sp. DNA was amplified from whole a blood sample by conventional PCR and Real- Time PCR. It was not possible to sequence the amplicons and, thereby, to determine the Leishmania specie involved. The results of this study highlight the necessity of epidemiological investigation in the county / Orientador: Mary Marcondes / Banca: Wagner Luis Ferreira / Banca: Marcia Dalastra Laurenti / Mestre

Orientador: Gervasio Henrique Bechara / Banca: Rosangela Zacarias Machado / Banca: Jair Rodini Engracia Filho / Resumo: Resultados no Brasil demonstraram, ao contrário de laboratórios dos EUA e Japão, que o cão doméstico não desenvolve resistência ao carrapato Rhipicephalus sanguineus. Além disso, populações de R. sanguineus do Brasil e da Argentina apresentam diferenças biológicas, morfológicas e genéticas marcantes sendo a primeira mais próxima filogeneticamente do R. turanicus da África e a segunda do R. sanguineus da Europa, o que explicaria, em parte, as diferenças citadas acima. Objetivou-se investigar, de forma comparativa, possível aquisição de resistência em cães domésticos após três infestações sucessivas com R. sanguineus, linhagens Brasil e Argentina. Cães domésticos da raça Dachshund, machos e fêmeas, de três meses a um ano de idade, "naive", foram utilizados como hospedeiros. Os cães (n= 10) foram distribuídos em dois grupos (G1 e G2) com cinco animais cada e infestados três vezes com R. sanguineus: G1- linhagem brasileira, e G2- linhagem argentina. Avaliaram-se: parâmetros biológicos dos carrapatos, histopatologia dos sítios de fixação na 1a e 3a infestações e titulação de anticorpos séricos dos cães pelo teste ELISA. Resultados dos parâmetros biológicos indicaram melhor desempenho alimentar e reprodutivo das teleóginas após infestações sucessivas, em ambos os grupos. Biópsias do sitio de fixação dos carrapatos revelaram, em ambos os grupos, infiltrado inflamatório com predomínio de células mononucleares 24 horas pós- liberação dos carrapatos e predominantemente neutrofílico em todas as infestações na 48a, 72a e 144a horas pós-liberação. O teste ELISA revelou baixa produção de anticorpos séricos no G2, em infestações sucessivas, e maior produção pós-segunda e terceira infestações no G1. Também demonstrou... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Contrarily to that observed in U.S.A and Japan, previous results from Brazil have shown that domestic dogs do not develop resistance to the dog tick Rhipicephalus sanguineus. In addition, populations of R. sanguineus from Brazil and Argentina have biological, morphological and genetic differences, being the first phylogenetically closest to R. turanicus from Africa and the second to R. sanguineus from Europe, what could explain, at least in part, the differences reported above. The aim now was to investigate, in a comparative way, the possible acquisition of resistance in domestic dogs after three successive infestations with R. sanguineus ticks, Brazil and Argentina strains. For this, "naive" domestic dogs of the breed Dachshund, males and females, aged three months to one year were used. The hosts (n = 10) were divided into two groups with five animals each, infested thrice with R. sanguineus: G1- Brazil strain; G2- Argentina strain. It was evaluated: i. biological parameters of ticks in each infestation; ii. histopathology of their fixation sites in different times (24, 48, 72 and 144 hours) post-tick release in the 1st and 3rd infestations, including inflammatory cell counting; iii. titration of dog sera antibodies by ELISA. Results of the biological parameters indicated better engorged females feeding and reproductive performances after successive infestations in both groups. Biopsies of the ticks' attachment sites in the 1st and 3rd infestations revealed, in both groups, predominantly mononuclear inflammatory cells infiltrates 24 hours post-tick release and predominantly neutrophylic in all infestations at 48, 72 and 144 hours post-tick release. The ELISA revealed low antibody titers in G2, in successive infestations, and increased titers post second and third infestations, in G1. It also revealed cross-reactivity between the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Mauricio Boscolo / Banca: Vanildo Luiz Del Bianchi / Banca: George Jackson de Moraes Rocha / Resumo: Utilizando o bagaço de cana como matéria prima para a produção do etanol brasileiro pode-se aumentar a produção em 50% deste combustível sem o aumento de área cultivada com a cana de açúcar. A hidrólise química deste material demonstrou ser ineficiente à medida que gera um grande número de substâncias inibidoras do processo fermentativo alcoólico, como aldeídos furânicos e fenóis. A hidrólise enzimática vem se destacando como a forma mais viável de sacarificação do bagaço, em função de não gerar tais inibidores, mas a recalcitrância da fibra vegetal impede tal processo. A ação das enzimas hidrolíticas é muito dificultada pela forma como se encontra naturalmente a fibra vegetal: regiões de alta cristalinidade e a presença de lignina revestindo as fibras. O preparo do bagaço para a ação enzimática, normalmente denominado de pré-tratamento, utiliza condições extremas de temperatura e pressão que podem formar produtos tóxicos para a fermentação alcoólica e apresentam sérios riscos operacionais. O objetivo deste trabalho é avaliar o grau de desestruturação do bagaço após pré-tratamentos em soluções ácidas e alcalinas em glicerol e irradiadas com micro-ondas (MO) em dois modos: estático e rotativo. A melhor condição para a ação hidrolítica do complexo enzimático empregado foi obtida em meio não tamponado (água destilada) durante 24 horas. As maiores liberações de açúcares redutores totais (ART) após a hidrólise enzimática foram alcançadas quando o bagaço foi pré-tratado com irradiação de MO por dois minutos em modo rotativo em meio ácido (0,07 mol/L H2SO4) em 100% glicerol (617 ± 24 mg de ART/g de bagaço) e em meio alcalino (0,05 mol/L NaOH) em 100% glicerol... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The production of the Brazilian bioethanol can be increased in 50% without expanding the area cultivated with sugarcane by using sugarcane bagasse as raw material. Its recalcitrance is an obstacle to enzymatic hydrolysis, which can be overcome by physical-chemical treatments. Common pre-treatments using extreme conditions of temperature and pressure are dangerous, promote the generation of toxic compounds (phenols and aldehydes) besides being potentially inhibitory for yeast. The aim of this work is to assess the degree of disruption of the bagasse after pre-treatment in acidic and alkaline glycerol, irradiated with microwaves both in the static and rotational modes. The enzyme complex showed the best results with the reactions promoted in a non-buffered (distilled water) at 24 hours. The best results for the pre-treatment were found after inserting a rotation system in the microwave oven inasmuch as the samples were subjected to irradiation in a more homogeneous way. The best pre-treatment was obtained after enzymatic hydrolysis in sulfuric acid (0.07 mol/L), in pure glycerol, with the rotation of the balloon inside the microwave oven (617 ± 24 mg of ART/g bagasse). In alkaline medium, the best result was found in the absence of water in the reaction medium (0.05 mol/L NaOH) with the rotation of the balloon inside the microwave oven (601 ± 58 mg of ART/g of bagasse). Differential Scanning Calorimetry (DSC) allows to evaluate the degree of disruption of bagasse comparing the enthalpy change, which can be associated with disruption of bounds in pre-treated bagasse. Among the pre-treated bagasse, it is observed that the bagasse treated with NaOH 0.05 mol/L and 5% of water in glycerol had the lowest ΔH, suggesting greater breakdown of carbohydrates after pre-treatment / Mestre

Estudos vem mostrando resultados promissores na utilização da tecnologia de ultrassom para a produção enzimática de biodiesel. Estes são atribuídos ao fenômeno de cavitação gerado pelo equipamento de ultrassom, o qual promove um aumento da miscibilidade entre os reagentes, melhorando a transferência de massa e a taxa da reação, proporcionando reações mais rápidas, bem como um menor consumo de reagentes. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar as condições da reação de transesterificação do óleo de soja para a produção de biodiesel, utilizando o conceito de combi-lipase em um reator enzimático assistido por ultrassom. Foram otimizadas as condições do sistema de ultrassom: amplitude (30-70 %), pulso (30-70 %) e tempo de pulso (5-15 s), através de um delineamento composto central rotacional (DCCR). Os parâmetros reacionais: concentração de biocatalisador (5, 15 e 25 % em relação a massa de óleo) e razão molar do substrato (3:1, 6:1 e 9:1) foram estudados, assim como a influência do uso do solvente terc-butanol e de um sistema de agitação combinado ao ultrassom, na conversão de ésteres etílicos. Avaliou-se também a eficiência do combi-lipase (75 % Novozym 435 + 10 % Lipozyme TL-IM and 15 % Lipozyme RM-IM) frente ao uso dos biocatalisadores individualmente. Obteve-se como condições ótimas para o sistema de ultrassom: 30 % de amplitude, 50 % de pulso e 15 s de tempo de pulso, 15 % de enzima em relação a massa de óleo e uma razão molar de 3:1 etanol:óleo de soja Os rendimentos de conversão de ésteres etílicos na ausência do solvente terc-butanol foram similares aos resultados obtidos na presença deste reagente, sugerindo que a tecnologia de ultrassom é capaz de eliminar a necessidade do uso de solventes em reações de transesterificação enzimática. Entretanto, o uso combinado de um sistema de agitação com o ultrassom, reduziu o rendimento da reação. Em relação às enzimas, o combi-lipase mostrou melhores resultados para a síntese enzimática de ésteres etílicos, do que o uso das enzimas individualmente. Utilizando as condições ótimas avaliadas neste estudo e o conceito de combi-lipase em um reator assistido por ultrassom, obteve-se uma conversão de ésteres etílicos de aproximadamente 75 % em 5 horas de reação. / Studies have been showing promising results for the use of ultrasonic technology in enzymatic production of biodiesel, which are attributed to the cavitation phenomenon generated by the ultrasound equipment, that promotes increased miscibility between the reactants, improving mass transfer and reaction rate, providing faster reactions as well as a lower consumption of reagents. The aim of this work was to optimize ultrasonic (amplitude, pulse and time pulse) and reaction (molar ratio and enzyme concentration) parameters, as well as the influence of solvent (tert-butanol) and ultrasound combined with mechanical stirring, on the transesterification of soybean oil catalyzed by combi-lipase biocatalyst. It was also evaluated the efficiency of the combi-lipase (75 % Novozym 435 + 10 % Lipozyme TL-IM and 15 % Lipozyme RM-IM), compared to individual lipases. The optimum conditions for transesterification reaction, were observed being: enzyme concentration, 15 % (by oil mass); ethanol:oil molar ratio, 3:1; ultrasonic amplitude 30 %, pulse, 30 % and time pulse, 15 s. The yields of conversion of ethyl esters with and without solvent were very similar, indicating that ultrasonic technology is able to supply the need of solvents in enzymatic transesterification reactions. The combined use of a mechanical stirring system with ultrasound, reduced the yields of conversion of this reaction, while the combi-lipase showed better results than the use of individual lipases for soybean oil transesterification. Using the optimum conditions evaluated in this study and the concept of combi-lipase in an ultrasonic-assisted batch reactor, led to conversions of ethyl esters of about 75% in 5 hours.

Iron/Manganese superoxide dismutases (Fe/Mn-SODs) are metalloenzymes with highly conserved protein folds, active sites, and dimer interfaces. They protect cells against oxidative stress by catalyzing the conversion of the cytotoxic free radical superoxide to molecular oxygen and hydrogen peroxide. The majority are highly specific for the type of metal (iron or manganese) present within the active site. However, there are many key aspects of metal specificity and catalytic activity that lack a structural explanation. Computational analyses suggested that several residues are important for fine-tuning the redox potential of the metal in the active site and thereby the catalytic activity. The main objective of this thesis is to evaluate the influence of several point mutations (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G and Q172D) and one double mutation (Q149G+G74Q)) in terms of metal specificity, catalytic activity and three-dimensional structure using the superoxide dismutase from Trichoderma reesei (TrSOD) as a model system. The corresponding genes were cloned, expressed and the resulting proteins characterized by X-ray crystallography, electron paramagnetic resonance (EPR), atomic absorption spectroscopy (AAS), dynamic light scattering (DLS) and their enzymatic activity determined. The native protein was shown to be able to use either Mn or Fe (5000 units/mg and 500 units/mg, respectively) for catalysis suggesting it to be properly classified as cambialistic. Structures for native TrSOD and the Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G and Fe-M27V, Mn-M27V mutants were solved at 2.3 &Aring;, 2.0 &Aring;, 2.03 &Aring;, 2.0 &Aring;, 1.85 &Aring;, 1.4 &Aring; and 1.6 &Aring; resolution, respectively. The H75I, L80F and M27V mutations are easily accommodated by small local structural changes to the three-dimensional structure. On the other hand, the G73A mutation destabilize one of the dimer-dimer interfaces of the tetramer making it possible for two distorted tetramers to interact forming an octamer. This enzyme also lost all catalytic activity probably due to resulting exposure of the active site consistent with the observation of a sixth ligand (solvent molecule) bound to the metal in one subunit. The D150G mutant remained tetrameric but with reduced symmetry related to the rearrangement of the last helix (H9). Our results show that a large impact on activity and oligomerization of TrSOD can be generated by a single amino acids substitution in some cases and provide some insights into our understanding of the structural details associated with the metal ion specificity and oligomerization in superoxide dismutases. / Superóxido dismutases de ferro e manganês (Fe/Mn-SODs) são metaloenzimas com enovelamentos, sítios ativos e interfaces diméricas altamente conservados. Estas enzimas protegem as células contra o estresse oxidativo pela conversão do ânion superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. A maioria são altamente específicas pelo tipo de metal (ferro ou manganês) presente no sítio ativo. Entretanto, existem vários aspectos críticos sobre a especificidade pelo metal e da atividade catalítica que ainda não foram explicados em termos estruturais. Análises computacionais sugerem que vários resíduos são importantes para o ajuste do potencial redox do metal no sitio ativo e, portanto, a atividade catalítica. O objetivo principal deste trabalho é avaliar a influência de mutações simples (TrSOD) (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G e Q172D) e dupla (Q149G + G74Q) em superóxido dismutases de Trichoderma reesei em termos de especificidade pelo metal, atividade catalítica e estrutura. Os genes correspondentes foram clonados, expressos e as proteínas resultantes caracterizadas por cristalografia de raios-X, ressonância paramagnética electrónica (EPR), espectroscopia de absorção atómica (AAS), dispersão de luz dinâmica (DLS), e a atividade enzimática foi determinada. Foi mostrado que a proteína nativa é capaz de usar tanto Mn quanto Fe (5000units/mg e 500units/mg, respectivamente) para catálise sugerindo que deveria ser a classificada como enzima cambialistica. Estruturas da enzima nativa e mutantes (Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G, Fe-M27V e Mn-M27V) foram resolvidas a resoluções de 2.3 &Aring;, 2.0 &Aring;, 2.03 &Aring;, 2.0 &Aring;, 1.85 &Aring;, 1.4 &Aring; e 1.6 &Aring; respetivamente. As mutações H75I, L80F e M27V são acomodadas facilmente por reajustes locais na estrutura tridimensional. Por outro lado, a mutação G73A desestabiliza uma das interfaces dímero-dímero do tetrâmero levando à formação de um octâmero feito por dois tetrâmeros distorcidos. Esta enzima também perde atividade provavelmente devido a um aumento na acessibilidade do sítio ativo, coerente com a observação de um sexto ligante (molécula de solvente) coordenando o metal em uma das subunidades. O mutante D150G continuou tetramérica mas com simetria reduzida relacionado com o rearranjo da última hélice (H9). Estes resultados mostram que, em alguns casos, uma mutação simples pode ter um impacto significativo no estado oligomérico e atividade catalítica da proteína TrSOD e fornece conhecimentos para a nossa compreensão dos detalhes estruturais associados com a especificidade de íons metálicos e oligomerização em superóxido dismutases.