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Enzima purina nucleosideo fosforilase de Schistosoma Mansoni: estruturas cristalográficas, estudos cinéticos e descoberta de novos ligantes / Purine nucleoside fosforilase from Schistosoma Mansoni: crystal structure, knetics, studies and ligands searchHumberto D\'Muniz Pereira 22 December 2003 (has links)
O parasita Schistosoma mansoni não possui a via de síntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação de purinas para o seu requerimento de purinas. Uma das enzimas participantes desta via é a Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). A PNP catalisa a fosforólise reversível de nucleosídeos de purina para gerar a base correspondente e ribose-1-fosfato. No Projeto Genoma de Schistosoma mansoni, o gene para esta enzima foi identificado.O cDNA para a PNP de S. mansoni (SmPNP), possui 1055pb e codifica para uma proteína de 287 aminoácidos, que possui 49% de identidade quando comparada a PNP de eritrócitos humana ou de Baco bovino. O gene foi clonado no vetor de expressão pMAL C2G, e expresso na forma de uma proteína de fusão, com MBP (80mg/L). Após a purificação da proteína de fusão, a clivagem proteolítica das duas proteínas foi realizada utilizando-se o Factor Xa. A SmPNP foi então purificada utilizando uma coluna de troca catiônica. Foram determinadas as constantes catalíticas para a fosforólise de inosina pela SmPNP, as quais são 3?M para o KM e 222 s-1para o kcat. O valor para o KM é O menor já descrito para uma PNP de baixa massa molecular. Foram obtidos cristais da SmPNP utilizando 18-24 % de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Quando utilizado o aditivo NDSB195 na cristalização da SmPNP a solução de cristalização foi 28-30% de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Cinco conjuntos de dados de difração de raios X foram obtidos tanto na presença como na ausência de ligantes. A resolução deste conjuntos de dados variou de 2,75? a 1,75 ?. Todas estas estruturas foram resolvidas pelo método da substituição molecular, sendo que na primeira estrutura resolvida (a 2,75?) foi utilizado a estrutura da PNP bovina como modelo de busca, e na resolução das estruturas subsequentes foi utilizado a estrutura da SmPNP como modelo de busca. A estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução foi obtida a partir de um cristal crescido na presença de NDSB 195, e após sua resolução foi encontrado este composto ligado em todos os sítios ativos da SmPNP via a sítio de ligação do fosfato. Foram também obtidas as estruturas da SmPNP na forma apo a 1,9? de resolução e em complexo com fosfato a 2,0? de resolução. Todas as estruturas foram utilizadas na comparação com outras PNPs de baixa massa molecular. Utilizando a estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução, foi realizada uma busca por compostos (Virtual Screening) que ligassem a SmPNP. Nesta busca foi utilizando o programa GOLD, utilizando uma base de dados de cerca de 36000 compostos com peso molecular inferior a 280 Da. Vinte e dois compostos foram selecionados com base no escore de docking e pelas interações (pontes de hidrogênio) com os resíduos chave do sítio ativo. Utilizando PNP bovina e a mesma abordagem de docking foram selecionados 19 compostos. Estes compostos foram ensaiados contra a SmPNP e 12 compostos se mostraram capazes de inibir a SmPNP. Um complexo entre a SmPNP e o composto AT2169 (oriundo do VS) foi obtido e refinado. Esta abordagem foi validada utilizando ligantes conhecidos das PNPs. / The parasite Schistosoma mansoni, unlike its mammalian hosts, lacks the \"de novo\" pathway for purine biosynthesis and depends on the salvage pathways for its purine requirements. One component of this pathway is Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). PNP catalyzes the reversible phosphorolysis of purine nucleosides to generate the corresponding purine base and ribose 1-phosphate. In the Schistosoma mansoni Genome Project the gene for this enzyme was isolated. The SmPNP cDNA was sequenced, corresponding to 1055 bases that code for a 287 amino acid protein with 49% sequence identity to its human erythrocyte homologue. The SmPNP gene was cloned into the pMAL C2G expression vector and the recombinant fusion protein was produced and purified using an amylose affinity column (approx. 80mg/mL). The fusion protein is composed of a Maltose Binding Protein adjoined to the SmPNP. After cleavage with Factor Xa, the cleavage product was purified using a cation exchange column. The KM and kcat of SmPNP for inosine phosphorolisis was determined to be 3?M and 222 s-1 respectively. This corresponds to the lowest value for KM yet described for a low molecular mass PNP. SmPNP crystals were obtained by the hanging drop method, using 18-24% PEG 1500, 20% glycerol in the presence of 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.0). When NDSB195 was used as an additive in the SmPNP crystallization the solution used was 28-30% PEG 1500, 20% glycerol and 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.O).Five datasets were obtained in the presence and absence of ligands, varying in resolution from 2,75 to 1,75?. All structures were solved by the molecular replacement method. The first structure (at 2,75?) was solved using the bovine PNP as the search model and in the remaining structures the search model was the SmPNP structure itself. The 1,75? structure was obtained from a crystal grow in the presence of the additive NDSB195, and after its determination NDSB195 was observed bound to the SmPNP active site via its phosphate binding site. Structures were also obtained for the apo SmPNP at 1,9? and its complex with phosphate at 2,0? resolution. All structures were used in the comparison with other low molecular mass PNPs. The SmPNP structure at 1,75A resolution was used in the search small molecule ligands, which potentially bind to SmPNP via virtual screening. For this purpose the program Gold together with a database of 36000 compounds with MW lower than 280Da was used. As a result 22 compounds were selected using the docking score and the H-bonding interaction with the key residues of the SmPNP active site. Using the bovine PNP and same docking approach 19 compounds were selected. These 41 compounds were assayed against SmPNP enzyme and 12 compounds were active against the SmPNP. One complex between SmPNP and one of these compound (AT2 169) was obtained and refined. This virtual screening approach was validated using known ligands of PNPs including inosine, guanosine, immucilins, etc.
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Otimização de estratégias de pré-tratamento de bagaço de cana-de-açúcar para produção de etanol de segunda geração via hidrólise enzimática / Sugarcane bagasse pretreatment optimization strategies for the production of second generation ethanol via enzymatic hydrolysisMelissa Cristina do Espirito Santo 19 February 2015 (has links)
Atualmente, o aumento da preocupação com a sustentabilidade ambiental, alinhado às perspectivas de esgotamento das reservas de petróleo, tem direcionado às buscas por fontes renováveis de energia. O emprego de resíduos agroindustriais, principalmente de usinas sucroalcooleiras destaca-se como sendo uma alternativa para a produção de etanol de segunda geração. Dentre as metodologias aplicadas para disponibilização dos açúcares fermentescíveis está a hidrólise enzimática. Ainda, para facilitar esta etapa e torná-la mais acessível, submete-se, previamente, o material lignocelulósico a um pré-tratamento, com o objetivo de contribuir com a susceptibilidade da celulose a ataques enzimáticos. No entanto, devido à complexidade das estruturas lignocelulósicas, os processos de hidrólise e pré-tratamento precisam se tornar mais eficientes e economicamente viáveis. Desta forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar e caracterizar os pré-tratamentos hidrotérmico e organossolve (etanol 50%), isoladamente, e estes combinados em diferentes condições, assim como a influência destes procedimentos na estrutura e composição da biomassa, bem como na hidrólise enzimática. Os resultados demonstraram que os pré-tratamentos hidrotérmicos a 160 ºC nas condições analisadas foram pouco efetivos na melhora do acesso enzimático durante a etapa de hidrólise, pois atuaram de maneira branda na parede celular, pouco solubilizando a hemicelulose e lignina, conforme as análises físicas comprovaram. Os tratamentos combinados hidrotérmico 30 min e 60 min a 160 ºC seguidos pelo organossolve por 150 min apresentaram semelhança morfológica e alta solublização da lignina e hemicelulose, justificando os valores de hidrólise. Nossos resultados abrem perspectivas de novos estudos que visam a otimização dos pré-tratamentos hidrotérmicos e organossolve, além da compreensão das alterações composicionais e morfológicas que levam à melhoria da hidrólise enzimática na biomassa lignocelulósica. / The concerns with environmental sustainability and perspectives of petroleum reserves depletion motivated exploration of new and sustainable energy sources. In this context, renewable energies start to receive significant attention in the world´s energy matrix, with biofuels playing a special role. The use of agro-industrial residues, mainly from the sugarcane industry, stands out as a viable alternative for the production of second-generation ethanol. The enzymatic hydrolysis of the biomass has a number of advantages for polysaccharides depolimerization, such as high substrate specificity, low environmental impact and lack of corrosion issues. To further facilitate this procedure and to make biomass more accessible, the lignocellulosic material has to be previously submitted to a pretreatment in order to increase the cellulose accessibility and susceptibility to the enzymatic action. This process aims at the disorganization of the chemical structure of the lignocellulosic matter, facilitating the further steps of hydrolysis and fermentation. Due to the complexity of the lignocelluloses structures, their pretreatment and hydrolysis processes have to become more efficient and economically viable to be efficiently applied at an industrial scale. Therefore, the objective of this work is to evaluate the hydrothermal and organosolv (50% ethanol) pretreatments, separately and combined in different conditions, and the influence of these procedures on the structure and composition of the biomass and on the efficiency of enzymatic hydrolyses. Our results demonstrated that the hydrothermal pretreatments at 160ºC within the analyzed reaction conditions had minor effects on improving the enzymatic efficiency, being not harsh enough to introduce significant modifications of the cell wall composition and structure, as demonstrated by our physical and chemical analyses. The combined hydrothermal treatments lasting 30 min and 60 min at 160ºC followed by the organosolv step for 150 min resulted in significant morphological changes and high lignin and hemicelluloses solubilization, resulting in an efficient enzymatic hydrolysis. Our results open perspectives of further studies aimed at optimization of hydrothermal and organosolv pretreatments and comprehension of compositional and morphological changes which lead to improved enzymatic hydrolysis of the lignocelulosic biomass.
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Avaliações bioquímicas e fisiológicas para previsão de desordens nutricionais de macronutrientes no desenvolvimento inicial do pinhão-manso / Physiological and biochemical assessments for prediction of nutritional macronutrient disorders in the initial development on physic nutElcio Ferreira dos Santos 21 February 2014 (has links)
No Brasil, vários trabalhos com pinhão-manso (Jatropha curcas L.) têm estudado a avaliação do estado nutricional, porém são poucas as investigações objetivando caracterizar a marcha de absorção, bem como as respostas bioquímicas e fisiológicas desta espécie ao manejo nutricional. antecipadamente o estado nutricional das plantas. Desse modo, o objetivou-se com este estudo avaliar a marcha de absorção no desenvolvimento inicial do pinhão-manso (Jatropha curcas L.), bem como as omissões de N, P, K, Ca, Mg e de S no crescimento inicial e no comportamento bioquímico e fisiológico dessa espécie e, por fim, prever os quadros sintomatológicos das deficiências. Para alcançar os objetivos propostos foram realizados dois experimentos simultâneos, conduzidos em casa de vegetação, sendo que as plantas foram cultivadas individualmente em vasos contendo solução nutritiva. No primeiro experimento - referente à marcha de absorção - a plantas foram cultivadas em solução nutritiva completa, sendo que as plantas eram retiradas a cada 14 dias para a determinação do acúmulo de massa seca e macronutrientes. No segundo experimento as plantas foram cultivadas em solução completa (controle) e omissão individual de N, P, K, Ca, Mg e de S. Neste experimento foram realizados testes bioquímicos e fisiológicas para a previsão de desordens nutricionais aos 20, 30, 40 e 120 dias após o inicio dos tratamentos. As primeiras manifestações de deficiência foram observadas para o Ca e N, seguidas das de Mg e K, contudo não foram observados sintomas de carência de P e S. As atividades das enzimas redutase do nitrato, da fosfatase ácida e da peroxidase, bem como a avaliação das concentrações de poliaminas, efetuadas no início do desenvolvimento das plantas, demonstraram ser indicadores para previsão das desordens nutricionais de N, P e K, respectivamente. As omissões individuais dos macronutrientes limitaram o desenvolvimento inicial do pinhão-manso, reduziram os teores de clorofila e a taxa fotossintética de forma distinta. Porém, a omissão de Ca foi a que mais limitou o desenvolvimento dessa espécie para todas as variáveis avaliadas / In Brazil, several studies with physic nut (Jatropha curcas L.) have studied the assessment of nutritional status, but there are few investigations aiming to characterize the uptake and the biochemical and physiological responses to nutritional management of this species, for the purpose of prediction the nutritional status of plants. Thus, the objective with this study was to evaluate the uptake in the initial development of physic nut (Jatropha curcas L.), as well as the omission of N, P, K, Ca, Mg and S, to physiological and biochemical assessments, and finally, predicting symptomatology frames deficiencies. To achieve the proposed objectives two experiments were conducted in a greenhouse. The plants were grown individually in pots containing nutrient solution. In the first experiment - uptake of macronutrients - the plants were grown in complete nutrient solution, whereas plants were taken every 14 days for the determination of dry matter and macronutrients accumulation. In the second experiment, the plants were grown in complete solution (control) and the omission of N, P , K , Ca , Mg and S. In this experiment biochemical and physiological tests were performed for predicting nutritional disorders at 20, 30, 40 and 120 days after initiation of treatment. The first manifestations of deficiency were observed for Ca and N, followed by Mg and K, but don\'t were observed symptoms of P and S deficiency. The activities of nitrate reductase, acid phosphatase and peroxidase, as well as the assessment of concentrations of polyamines, made in the early development of the plant, proved to forecast indicators of nutritional disorders of N, P and K, respectively. The individual macronutrients omissions limited the initial development of physic nut, in addition, reduced chlorophyll content and photosynthetic rate differently. However, the omission of Ca was the most limited growth of this species for all variables
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Estudo da obtenção de açúcares redutores a partir de casca de coco verde utilizando CO2 supercrítico / Study of the reducing sugars obtainment from coconut fiber using supercritical CO2Fernando Marques Putrino 25 May 2016 (has links)
A casca de coco verde (Cocos Nucifera L.) é um resíduo lignocelulósico amplamente disponível na região Nordeste do Brasil e de grande preocupação ambiental devido ao seu volume elevado. Mas, os materiais lignocelulósicos podem ser recursos renováveis e abundantes para obtenção de açúcares após passarem por hidrólise enzimática da celulose e hemicelulose. Para uma eficiente hidrólise é necessário romper a rede lignocelulósica que circunda fisicamente as fibras de celulose dificultando contato entre celulose e enzima. Os tratamentos tradicionais de deslignificação que empregam condições drásticas de temperatura e pH levam à formação de alguns compostos que limitam o uso desses hidrolisados em processos biotecnológios pois inibem a ação microbiana. O tratamento com CO2 supercrítico pode ser operado em condições amenas de pH e temperatura evitando o problema da formação destes inibidores. Portanto, o objetivo geral desse trabalho foi a obtenção de açúcares redutores a partir da fibra da casca do coco verde por meio de hidrólise enzimática da fibra prétratada com CO2 em condições supercríticas. Foram estudadas sete condições de extração em que se variou o tempo de contato do CO2 com a fibra de coco (3 e 5 horas), modificador de polaridade (NaOH, NaHSO4 e etanol) e manteve-se constante a extração dinâmica por 1 hora seguida de despressurização rápida no final do processo. A eficiência da extração com CO2 supercrítico para deslignificação da fibra de coco verde foi baseada na caracterização da fibra pela composição lignocelulósica, imagens de microscopia eletrônica de varredura e análise qualitativa da composição lignocelulósica por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier e a quantificação de açúcares redutores. A fibra de coco apresentou teores de lignina, celulose e hemicelulose de 26,66, 46,37 e 16,18 g/100g de fibra de coco verde seca, respectivamente. Para hidrólise enzimática utilizou-se uma enzima comercial composta de três enzimas principais: celulases, hemicelulases e β-glucosidases em dois tempos de hidrólise (24 e 72 h) e duas concentrações enzimáticas (6 e 30g de enzima/g de celulose total no substrato) para que fossem avaliadas as situações de aplicação comercial e condições de rendimento máximo. O tratamento com CO2 supercrítico provocou alterações na estrutura física e química da fibra, aumentando a porosidade e diminuindo o teor de compostos fenólicos e ceras e também afrouxamento das ligações de hidrogênio caracterizando a deslignificação da fibra de coco verde. No entanto, a extração com CO2 supercrítico não causou aumento significativo da obtenção de açúcares redutores após hidrólise enzimática da fibra de coco. A hidrólise enzimática realizada em 72h gerou aumento em até 134% no teor de açúcares redutores em relação a hidrólise com 24h de reação para a mesma concentração enzimática (30%). A hidrólise enzimática (72h e 30% de enzima) da fibra de coco verde in natura apresentou bons valores de açúcares redutores (532,27 µmol de glicose/g de fibra de coco seca), podendo ser uma nova utilização para o material lignocelulósico do coco verde que é subaproveitado. Os açúcares redutores obtidos da fibra de coco verde in natura podem passar por processo de purificação e isolamento de algum açúcar de interesse econômico ou ser utilizado em processos que açúcares redutores são necessários como substrato para fermentação por Saccharomyces cerevisiae na produção de álcool, por exemplo. / The coconut husk (Cocos nucifera L.) is a lignocellulosic byproduct widely available in the Brazilian Northeast region and due its high volume is a reason of huge environmental concern. But the lignocellulosic materials are renewable and abundant resources of sugars after submitted to enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose. For efficient hydrolysis is necessary to break the lignocellulosic netting that physically surrounds the cellulose fibers hindering contact between the enzyme and cellulose. The traditional delignification treatment employing drastic conditions of temperature and pH lead to the formation and release of some compounds that limit the hydrolysates use in biotechnological processes since it inhibits microbial action. The treatment with supercritical CO2 can be operated at lower temperatures avoiding inhibitors formation. Therefore, the aim of this study was to obtain reducing sugars from the husk coconut fiber through enzymatic hydrolysis of pretreated fiber with CO2 in supercritical conditions. Seven extraction conditions were studied varying the CO2 contact time with the coconut fiber (3 and 5 hours), polarity modifier (NaOH, NaHSO4 and ethanol) and maintaining as constants the dynamic extraction time (1 hour) and rapid depressurization at the end of process. The efficiency of extraction with supercritical CO2 to green coconut fiber delignification was based on the characterization of the fiber by the lignocellulosic composition, images of scanning electron microscopy and qualitative analysis of lignocellulosic composition spectroscopy infrared with Fourier transform and quantification of reducing sugars. Green coconut fiber presents lignin, cellulose and hemicellulose contents of 26.66, 46.37 and 16.18 g/100 g of dry coconut fiber, respectively. For enzymatic hydrolysis used a commercial enzyme composed of three major enzymes: cellulase, hemicellulase and β-glucosidases in two hydrolysis time (24 h and 72) and two enzymatic concentrations (6 and 30 g enzyme / g cellulose in total substrate) to be evaluated situations of commercial application and conditions de maximum yield. Treatment with supercritical CO2 caused changes in the physical and chemical structure of the fiber, increasing the porosity and decreasing the level of phenolic compounds, waxes and hydrogen bonds attenuation causing the delignification of coconut fiber. However, extraction with supercritical CO2 didn\'t significant increase reducing sugars fiber contents after enzymatic hydrolysis. Enzymatic hydrolysis performed in 72h caused up to 134% increase in reducing sugars compared to smaller hydrolysis time (24) for enzyme concentration of 30%. In general, enzymatic hydrolysis (72 hours and 30% of enzyme) of natural coconut fiber showed good values of reducing sugars (532,27 µmol glucose/g de dry coconut fiber) and may be used as a new lignocellulosic material from coconut which is underused. Reducing sugars obtained from natural coconut fiber can pass through purification process of purification of some sugar of interest economic or be used in processes that reducing sugars are necessary as a substrate for fermentation by Saccharomyces cerevisiae, as example in alcohol production.
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Busca por compostos de Trichilia pallida Swartz, Trichilia pallens C. DC. e Toona ciliata M. Roemer com bioatividade sobre Spodoptera frugiperda (J. E. Smith, 1797) / Search for Trichilia pallida Swartz, Trichilia pallens C.DC. and Toona ciliata M. Roemer compounds with bioactivity on Spodoptera frugiperda (JE Smith, 1797)Angelina Maria Marcomini Giongo 22 April 2014 (has links)
Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar o efeito de frações (em hexano, diclorometano, acetato de etila e hidroalcoólica) de extratos etanólicos de Trichilia pallida Swartz, Trichilia pallens C.DC. e Toona ciliata M. Roemer sobre Spodoptera frugiperda (J. E. Smith), e isolar, identificar e avaliar o efeito dos compostos dessas três meliáceas sobre o desenvolvimento e o metabolismo do inseto, com ênfase para o limonoide cedrelona. As frações causaram baixa mortalidade, mas houve grande redução de peso das lagartas com as frações em diclorometano de folhas e de ramos de T. pallida, de ramos de T. pallens e de folhas e de frutos de T. ciliata, além de maior duração da fase larval, redução do peso de pupas e alteração dos índices nutricionais, sendo a fração de ramos de T. pallida a de maior efeito tóxico e com fagodeterrência secundária, e a fração de folhas de T. ciliata sem efeito tóxico, mas apresentando fagodeterrência possivelmente primária. A partir da fração em diclorometano de frutos de T. ciliata obteve-se um triglicerídeo; da fração em acetato de etila de ramos de T. ciliata obteve-se o flavonoide (+/-)-catequina; da fração em hexano de folhas de T. pallida obteve-se o triterpeno damaradienol e da fração em diclorometano de ramos de T. pallens obteve-se a cumarina escopoletina. O triglicerídeo e a escopoletina causaram pequena mortalidade e redução de peso das lagartas por ingestão, enquanto a catequina causou apenas redução de peso. Por contato, a escopoletina também afetou a sobrevivência. O limonoide cedrelona, isolado do extrato bruto em hexano de caules de T. ciliata, apresentou o maior efeito, tanto por ingestão quanto por contato. Por ingestão, os valores estimados de CL50, CL90 e CE50 para a cedrelona aplicada sobre a dieta foram 365,33, 659,62 e 95,02 ppm, respectivamente, e após incorporação na dieta, os valores foram 119,05, 491,14 e 45,13 ppm, respectivamente. A cedrelona causou fagodeterrência em teste com chance de escolha e redução no consumo foliar no teste sem chance de escolha. A ingestão de cedrelona causou menor peso de lagartas e de pupas, aumento da duração da fase larval e da mortalidade de modo dose dependente, com efeitos subletais observados a partir de 24 ppm. Lagartas de quarto ínstar que ingeriram dieta contendo cedrelona a 300 ppm tiveram redução na eficiência de conversão do alimento ingerido (ECI) e digerido (ECD) e na taxa de crescimento relativo (RGR), enquanto o custo metabólico (MC), a taxa metabólica relativa (RMR) e a digestibilidade aproximada (AD) aumentaram, e a taxa de consumo relativo (RCR) não foi alterada, indicando efeitos tóxicos pós-ingestão e efeito fagodeterrente secundário, com a maior parte do alimento assimilado sendo utilizada no metabolismo. A atividade de proteases no mesêntero das lagartas que ingeriram dieta contendo cedrelona foi reduzida, assim como a quantidade de grupos heme, relacionados às monoxigenases do citocromo P450, enquanto a atividade de glutationa-S-transferases não foi alterada. A atividade de acetilcolinesterase no extrato enzimático de lagartas inteiras aumentou. A bioatividade da cedrelona e os possíveis modos de ação são discutidos. / This work was carried out to evaluate the effect of fractions (in hexane, dichloromethane, ethyl acetate and hydroalcoholic) of ethanolic extracts of Trichilia pallida Swartz, Trichilia pallens C.DC. and Toona ciliata M. Roemer to Spodoptera frugiperda (J.E. Smith ), and to isolate, identify and evaluate the effect of the compounds from the three Meliaceae on the larvae development and metabolism, with emphasis on the cedrelone limonoid. The fractions caused low mortality, but there was a great reduction in weight of larvae with dichloromethane leaves and stems fractions of T. pallida, stems of T. pallens and leaves and fruits of T. ciliata, in addition to longer duration of the larval stage, pupae weight reduction and changes on nutritional indices. The fraction of T. pallida stems caused the highest toxic effects and secondary phagodeterence, and the fraction of T. ciliata leaves showed probably primary phagodeterrence, but no toxic effect. From the dichloromethane fraction of T. ciliata fruits was obtained a triglyceride (unidentified), from the ethyl acetate fraction of T. ciliata stems was obtained the flavonoid (+/-)-catechin, from the hexane fraction of T. pallida leaves was obtained the triterpene dammaradienol and from the dichloromethane fraction of T. pallens stems was obtained the coumarin scopoletin. Scopoletin and triglyceride caused low mortality and larval weight reduction after ingestion, catechin caused only larval weight reduction. Scopoletin either affect survival by contact. The limonoid cedrelone, isolated from the crude hexane extract of stems of T. ciliata, was the most effective compound, either by ingestion or by contact. After ingestion, the estimated LC50, LC90 and EC50 values for cedrelone applied onto the diet were 365.33, 659.62 and 95,02 ppm, respectively, and after diet incorporation, the values were119.05, 491.14 and 45.13 ppm, respectively. Cedrelone caused feeding deterrence on choice test and reduced leaf consumption in the no-choice test. Cedrelone intake caused low weight gain by larvae and pupae, increased mortality and duration of larval stage in a dose-dependent manner, with sublethal effects observed at 24 ppm. Fourth instar larvae that ingested diet containing 300 ppm cedrelone showed reduced efficiency conversion of ingested (ECI) and digested food (ECD), reduced relative growth rate (RGR), increased metabolic cost (MC), relative metabolic rate (RMR) and approximatte digestibility (AD), but no change in relative consumption rate (RCR), suggesting toxic effects post ingestion and secondary phagodeterrence, in which most of the assimilated food was used in metabolism. The protease activity in the midgut of the larvae that ingested diet containing 300 ppm of cedrelone was reduced, as well the amount of heme groups related to cytochrome P450 monoxygenases in the midgut, but there was no change in the glutathione S-transferases activity. , There was an increase of acetylcholinesterase activity in the larvae bodies. Cedrelone bioactivity and the possible modes of action are discussed.
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Filmes de polipirrol como matrizes para a imobilização das enzimas fitase e polifenol oxidase e aplicados como biossensores / Polypyrrole films as matrices for the immobilization of phytase and polyphenol oxidase enzymes and applied as biosensorsValquiria da Cruz Rodrigues Barioto 17 March 2014 (has links)
Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de biossensores eletroquímicos baseados na imobilização de duas enzimas diferentes em filmes de polipirrol (PPI) eletrodepositados, a fitase e a polifenol oxidase (PFO), esta última na forma de extrato bruto do fruto de abacate. Como a fitase hidrolisa cataliticamente ácido fítico (AF) em íons fosfatos, foram preparados biossensores por imobilização da enzima sobre filmes de PPI para a detecção indireta de ácido fítico via íons fosfatos. Foram utilizados dois métodos de imobilização; no primeiro, a enzima, fitase, foi imobilizada ao filme de PPI por imersão do filme em uma solução contendo a enzima por um período de 2 h, no segundo, a fitase foi encapsulada em lipossomos de dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e depois foi imobilizada nos filmes de PPI depositados em eletrodos impressos. O segundo método se mostrou melhor para a detecção de ácido fítico, pois levou a um maior alcance linear e um baixo valor de limite de detecção. Neste caso, verificou-se que o DPPG preservou a integridade enzimática e levou a biossensores mais estáveis e sensíveis. Já para a PFO, que catalisa a oxidação de compostos fenólicos a quinonas, foram preparados biossensores para a detecção indireta de catecol. Para esta enzima, foram utilizados três métodos de imobilização: adsorção, ligação cruzada e confinamento, sendo o último que levou a melhores respostas. O método de confinamento consiste na adição da enzima, juntamente com o monômero, à solução de eletropolimerização, quando se procede com a metodologia normal de preparo dos filmes de PPI, que foram caracterizados por: microscopia de força atômica (AFM), microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e espectroscopia de reflexão e absorção no infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS). Estas técnicas de caracterização permitiram com que a presença da enzima fosse associada às modificações das características estruturais e morfológicas dos filmes de PPI. / This doctoral thesis reports on the development of electrochemical biosensors based on the immobilization of enzymes phytase and polyphenol oxidase (PPO) (the latter in the form of crude extract of avocado fruit) on electrodeposited polypyrrole films (PPY). As phytase catalytically hydrolyzes phytic acid (PA) in phosphate ions, biosensors were prepared by its immobilization on PPY films for the indirect detection of PA via phosphate ions. In the first method the enzyme was maintained on the PPY film for a period of 2 h, whereas in the second, it was encapsulated in Dipalmitoyl Phosphatidyl glycerol (DPPG) and immobilized on printed electrodes. The second system proved more viable for the detection of PA and showed broader linear range and low detection limit because DPPG preserved the integrity of the enzyme and produced more stable and sensitive biosensors. Regarding PPO, which catalyzes the oxidation of phenolic compounds to quinones, biosensors for the indirect detection of catechol via the formation of quinone in solution were prepared. Three methods of immobilization were used: adsorption, cross-linking and confinement. The latter yielded favorable results in comparison to other methods. The films were characterized by atomic force microscopy (AFM), scanning electron microscopy (SEM) spectroscopy, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and reflection absorption and infrared polarization modulation (PM-IRRAS) techniques and revealed the presence of the enzyme and a modification in the structural characteristics and morphology of the films.
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Investigação da hidrólise enzimática de derivados da quinizarina por espectroscopia e microscopia de fluorescência / Enzymatic hydrolysis of quinizarin diester investigated by spectroscopy and microscopy fluorescenceCarolina Aparecida Sabatini 13 September 2012 (has links)
A cinética enzimática dos derivados de quinizarina com cadeias homólogas por lipases imobilizadas foi investigada por espectroscopia de fluorescência. Este estudo foi realizado em nível macroscópico e microscópico. Para o estudo macroscópico, foi utilizada a lipase suportada CALB (Novozyme® 435) e para o estudo microscópico a lipase Rhizopus niveus imobilizada em nanopartículas de sílica. Os derivados de quinizarina são espécies que não apresentam fluorescência, porém, quando são hidrolisados, tornam-se fluorescentes (quinizarina). Com um modelo cinético considerando um mecanismo de dois processos sequenciais do tipo Michaelis-Menten, foi possível fazer uma descrição adequada da evolução temporal da formação da quinizarina. O tempo médio de reação da hidrólise enzimática, em nível macroscópico, foi determinado para os derivados diacetato, dibutirato, dihexanoato e dioctanoato de quinizarina nos solventes hexano, ciclo-hexano e decalina saturados com água. No estudo microscópico, a lipase de Rhizopus niveus foi incorporada em nanopartículas de sílica de 200nm. A hidrólise enzimática foi monitorada por imagens e pela flutuação da intensidade de fluorescência com o tempo, por meio da microscopia de fluorescência confocal. Os resultados mostraram que, após a adição do substrato (derivados da quinizarina), começam a aparecer regiões fluorescentes devido ao trabalho enzimático (formação da quinizarina). As imagens de microscopia de fluorescência confocal não mostraram uma nítida diferença entre os substratos avaliados. Entretanto, o estudo da flutuação da intensidade de fluorescência mostrou que há uma diferença entre os substratos e que é possível estimar constantes de tempo de relaxação da atividade enzimática. Além disso, a atividade da lipase depende da forma em que a mesma está distribuída nas nanopartículas (ligada ou adsorvida) e também do tamanho da cadeia de alquílica que compões os derivados. O decaimento de fluorescência da quinizarina produzida pela hidrólise dos derivados pela lipase foi adquirido por microscopia de fluorescência confocal usando excitação de 2-fótons. / The kinetics of enzymatic hydrolysis of quinizarin diester by supported lipase dispersed beads in organic solvents was investigated by fluorescence spectroscopy. This study was performed on macroscopic and microscopic levels. For the macroscopic study was used CALB immobilized lipase (Novozyme ® 435) on acrylate beads, and for microscopic study Rhizopus niveus lipase immobilized on silica nanoparticles. The quinizarin derivatives (substrates) are non-fluorescent species, and only the end product quinizarin has fluorescence. A kinetic model considering two sequential Michaelis-Menten mechanisms provides a suitable description of the time evolution of the quinizarin formation monitored by emission spectroscopy and photon counting measurements. The average reaction time of the enzymatic hydrolysis was determined for quinizarin diacetate, dibutirate, dihexanoate and dioctanoate in hexane, cyclohexane and decaline water saturated solvents. In the microscopic study, the Rhizopus niveus lipase was dispersed into and bound silica mesoporous 200nm particles. In both systems, dispersed silica nanoparticles and a small fraction of aggregates are found in thin film. The enzyme activity was monitored by images and fluctuations of fluorescence intensity over time using confocal fluorescence microscopy. The results showed that after addition of substrate fluorescent spots due to enzyme activity start to appear. Confocal fluorescence images showed no clear difference among substrates. However, the study of fluorescence intensity fluctuations showed that enzyme activity depends on the type of substrate and enzyme support. In addition, the lipase activity depends on the form in which it is distributed in the nanoparticles (bound or entrapped) and the size of the alkyl diester derivatives. The fluorescence decay of quinizarin produced by lipase hydrolysis of diester was measured by confocal fluorescence microscopy using 2-photon pulse excitation.
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Síntese de resinas alquídicas via catálise enzimáticaBarrios, Silmar Balsamo January 2008 (has links)
Esta dissertação de mestrado apresenta um estudo da aplicação da biotecnologia na fabricação de resinas alquídicas, através do uso de catálise enzimática na transesterificação de diversos óleos (principalmente óleo de soja) com glicerol. O objetivo principal foi estudar a viabilidade técnica da substituição do processo de alcóolise alcalina atualmente utilizado em uma das etapas do processo de síntese/fabricação de resinas alquídicas por um processo enzimático com hidrolases tipo EC 3.1.1.3, mais comumente chamadas de lipases, alcançando menor consumo de energia e sustentabilidade ambiental no processo. Os melhores resultados foram obtidos com as enzimas dos organismos Pseudomonas sp e Candida antarctica. A temperatura de processo utilizada foi de 40ºC, em comparação aos 220ºC utilizados no processo alcalino. Alta conversão do óleo e alto teor de monoacilgliceróis foram alcançados. Em razão disso, a resina obtida apresentou menor tempo de processamento na etapa da policondensação, devido à maior funcionalidade na polimerização, levando a uma diminuição do consumo global de energia. Algumas propriedades da resina foram melhoradas, como dureza e resistência química do filme. A reutilização das enzimas sem perda de atividade foi demonstrada, o que viabiliza seu uso comercialmente, além de gerar menos resíduo. Um processo produtivo contínuo foi proposto e avaliado. A condição mais amena de reação garantiu um maior controle do produto gerado, devido a uma diminuição de reações paralelas, além de maior versatilidade da formulação, abrindo novas possibilidades no design destas resinas. Portanto, através da catálise enzimática, melhor desempenho e adequação aos padrões internacionais podem ser alcançados para as resinas alquídicas, agregando valor para esta classe de polímeros, favorecendo o uso de óleos vegetais e maximizando a utilização de recursos renováveis (eco eficiência). / This work presents a biotechnology application in the manufacturing of alkyd resin, through the use of enzymatic catalysis in the transesterification reaction of some oils (mainly soybean oil) with glycerol. The main objective was to study the technical feasibility to substitute the current alkaline process that has been used in a step of the resin synthesis by a enzymatic process with hydrolases class EC 3.1.1.3, most called lipases, achieving lower energy consumption and environmental process sustainability. The best results were obtained with the enzymes Pseudomonas sp and Candida antarctica. The process temperature was 40ºC, lower than the current temperature (220ºC). It was found higher oil conversion and higher monoacylglycerol amounts. For that reason, the resin synthesis showed lower polymerization time in the polycondensation step, leading to lower overall energy consumption. Some resin properties were improved, as hardness and chemical resistance. The reuse of the enzymes without high activity loss was demonstrated, which enable its use commercially, and generate less waste. A continuous process has been proposed and evaluated. The mild reaction conditions ensured greater control of the generated product due to a decrease in parallel reactions, thus it resulted in greater formulation versatility, opening new possibilities in the design of these resins. Therefore, by enzymatic catalysis, better performance and suitability to international standards can be achieve for alkyd resins, adding value to this class of polymers, favoring the use of vegetable oils and maximizing use of renewable resources (eco-efficiency).
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Pré-tratamentos Hidrotérmico e Com Ácido Fosfórico Diluído de Bagaço de Cana-de-açúcar Para Aplicação Em BiorrefinariasVasconcelos, Solange Maria de 21 December 2012 (has links)
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Previous issue date: 2012-12-21 / Devido à natureza recalcitrante da biomassa, uma etapa normalmente essencial em uma biorrefinaria lignocelulósica, por rota bioquímica, é o pré-tratamento da matéria-prima. O presente trabalho teve como principal objetivo o estudo do pré-tratamento de bagaço de cana-de-açúcar com ácido fosfórico diluído de forma a encontrar as melhores condições em termos de solubilização de hemicelulose o que, por sua vez, facilita o acesso das enzimas à celulose, na etapa de hidrólise enzimática. Melhores condições de tratamento ácido foram comparadas com tratamento hidrotérmico. Realizou-se, também, a produção de enzimas celulolíticas através da utilização do micro-organismo Trichoderma reesei RUT C30 e hidrólise enzimática dos bagaços pré-tratados em diferentes condições, com as enzimas produzidas no laboratório e com enzimas comerciais (Celluclast® 1,5 L e Novozym® 188). Por fim, foi verificada a fermentabilidade do hidrolisado enzimático que apresentou o melhor resultado em termos de conversão de celulose em glicose. Na primeira etapa, o pré-tratamento foi realizado de acordo com um planejamento experimental 23, cujas variáveis estudadas foram: tempo (8–24 minutos), temperatura (144–186 ºC) e concentração de ácido fosfórico (0,05–0,20%, m/v). Pré-tratamentos adicionais foram realizados, a 186 ºC e 195 ºC, na ausência e na presença de ácido fosfórico (1%, m/v), por 8 minutos. Todos os pré-tratamentos foram realizados em uma reator batelada de 20 L (Regmed AU/E-20), com volume de trabalho de 10 L e carga de sólidos de 5% (m/v). A eficiência dos pré-tratamentos foi verificada através da comparação de análises físicoquímicas dos bagaços in natura e pré-tratados e da conversão de celulose em glicose por hidrólise enzimática. As hidrólises foram realizadas a 50 ºC e pH 4,8. A produção de enzimas se deu em meio de lactose (10 g/L) solubilizado em hidrolisado hemicelulósico, sendo conduzida em biorreator de bancada com volume útil de 2 L, agitação de 500 rpm, aeração de 2 vvm, temperatura de 28 ºC, pH 5,0, durante 48 horas. A fermentação alcoólica do hidrolisado enzimático foi realizada em biorreator de bancada, com volume
útil de 1 L, a 35 ºC, pH 4,8, 300 rpm, utilizando-se a levedura industrial Saccharomyces
cerevisiae UFPEDA 1238. Em relação ao planejamento experimental, os pré-tratamentos com H3PO4 0,20% a 186 ºC, durante 8 e 24 minutos, mostraram-se eficientes na remoção de hemicelulose, alcançando solubilizações de 96% e 98%, respectivamente. Modelos, preditivos e significativos, foram obtidos para as concentrações de celulose, hemicelulose e lignina, na fração sólida de bagaço, assim como para a hemicelulose solubilizada. Nos prétratamentos adicionais, as maiores solubilizações de hemicelulose foram de 97% e 98%, para os bagaços pré-tratados a 186 ºC e 195 ºC, com H3PO4 1% (m/v), respectivamente. A enzima produzida no laboratório apresentou-se eficiente na hidrólise dos bagaços prétratados, quando comparada às enzimas comerciais. Para ambos os tipos de enzimas, as maiores conversões de celulose em glicose foram obtidas a partir dos bagaços pré-tratados nas condições mais drásticas.
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Derivados de furano e tiofeno 2-substituídos: síntese, resolução cinética enzimática e aplicação na síntese de lactonas bioativasFERREIRA, Dartagnan de Sá Pires 13 December 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013-12-13 / CNPq / Derivados de furano e tiofeno 2-substituídos são compostos bastante difundidos no meio ambiente e desempenham papel importante em processos bioquímicos. Além disso, estes compostos podem ser utilizados como building blocks na preparação de diversas moléculas bioativas. No entanto, reagentes prejudiciais ao meio ambiente e muitas etapas reacionais, são geralmente atribuídos às metodologias sintéticas que empregam estes derivados. Atualmente, poucos trabalhos têm reportado a utilização de enzimas para este tipo de sistema. Dessa forma, nosso grupo demonstrou interesse em propor uma metodologia quimioenzimática para preparação de derivados de furano e tiofeno 2-substituídos em suas formas enantiomericamente pura, e aplicá-los na preparação de moléculas bioativas enantiodependentes. A metodologia proposta emprega um número reduzido de etapas sintéticas e utiliza a enzima CAL-B na etapa chave para obtenção dos respectivos enantiômeros separadamente. Inicialmente, uma série de alcoóis secundários racêmicos contendo grupos heterocíclicos foi sintetizada em rendimentos que variaram de moderados a excelentes (40-98%) e submetidos à resolução cinética enzimática catalisada por lipase (RCE). Adicionalmente, um derivado dibromo vinilfurano 2-substituído foi empregado em estudos visando à síntese total da modiolida A, uma macrolactona de origem natural contendo 10 membros em seu anel. Este fragmento foi utilizado em uma reação do tipo Corey-Fuchs para obtenção de um intermediário avançado na síntese desta molécula. / Furan and Tiophene derivatives are widespread compounds in the environment and they also play important role on biochemical process. In addition these compounds can be employed as building blocks in the synthesis of bioactive molecules. However, environmentally harmful reagents and many reaction steps are generally assigned to synthetic methodologies that employ it. Nowadays, few works have been reported enzyme applications in this type of system. Here, we propose a chemoenzymatic methodology to prepare enantioenriched secondary alcohols containing furan and tiophene heterocyclic group and apply them in the preparation of bioactive enantiodependent molecules. The proposed methodology employs a reduced number of synthetic steps and CAL-B enzyme at the key step of deracemization. Initially, the racemic secundary alcohols containing heterocyclic groups were synthesized from moderate to good yields (40-98%) and each of them was submitted to lipase-catalyzed enzymatic kinetic resolution (EKR). Furthermore, a dibromovinylfuran 2-substituted has been employed in studies forward the total synthesis of Modiolide A, a 10-membered ring of natural lactone. This fragment has been used on Corey-Fuchs reaction in order to prepare an advanced intermediate to obtain the Modiolida A.
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