A cultura do guaranazeiro, (Paullinia cupana var. sorbilis) espécie nativa da região amazônica, é de grande importância para o Brasil, tanto do ponto de vista econômico quanto social. Atualmente, a comercialização do guaraná em rama (sementes torradas) é a maneira mais comumente utilizada na produção de xaropes e extratos de guaraná utilizados principalmente pelas indústrias de bebidas. O Brasil é o único produtor de guaraná no mundo, com destaque para o Estado do Amazonas e a Bahia. Entretanto, a produção de guaraná na região amazônica, centro de origem da planta, vem sendo cada vez mais afetada por condições fitossanitárias desfavoráveis, como a presença da antracnose, doença causada pelo fungo Colletotrichum spp.., que não se constitui um problema na Bahia. A finalidade da presente pesquisa foi de comparar microbiota endofítica de sementes dos dois estados na detecção de possíveis causas que poderiam explicar as diferenças de sanidade, além de procurar uma alternativa sustentável para a utilização de microrganismos endofíticos, que vivem no interior dos tecidos vegetais, e tem sido descritos como agentes de controle biológico de doenças através de vários mecanismos, dentre eles a produção de enzimas líticas. Assim, o presente estudo teve por objetivo isolar e identificar bactérias e fungos endofíticos associados à sementes de guaranazeiros provenientes do Amazonas e da Bahia. Esses microrganismos foram também avaliados quanto ao potencial biotecnológico na produção de enzimas e controle da antracnose. Para o isolamento, as sementes passaram por um processo de desinfecção. A análise da produção enzimática foi detectada por meios de culturas específicos e para o estudo da atividade antagonística contra o Colletotrichum sp. (L1) foram realizados ensaios in vitro por meio de cultura pareada. A identificação dos isolados foi realizada por sequenciamento parcial do gene 16S rDNA para isolados bacterianos, e da região ITS do rDNA para isolados fúngicos. Não foram encontradas diferenças significativas no número de isolados bacterianos em sementes das duas procedências. Fungos em pequeno número (6) foram isolados apenas de sementes da Bahia. Desses isolados foram selecionadas 102 bactérias, sendo 48 provenientes do Amazonas e 54 da Bahia. Nos testes de antagonismo houve redução de 32% a 64% do crescimento do fungo patogênico Colletotrichum por bactérias endofíticas e 8% a 52% pelos fungos endofíticos. Com relação à atividade enzimática, 13 bactérias apresentaram atividade amilolítica, 5 celulolítica, 11 pectinolítica, e 24 proteolítica. Em relação aos fungos endofíticos, todos apresentaram pelo menos uma atividade das enzimas testadas, com exceção de atividade proteolítica. Bactérias dos gêneros Bacillus, Paenibacillus, Ochrobacterium, Rhizobium e Microbacterium foram isolados como endofíticos de sementes de guaraná. Em relação a isolados fúngicos foram encontrados representantes dos gêneros Lasiodiplodia e Fusarium. Embora não tenham sido encontradas diferenças substanciais com relação aos endófitos isolados, para explicar a incidência de antracnose no Amazonas em relação à Bahia, os resultados demonstram o potencial biotecnológico de microrganismos endofíticos de sementes de guaraná na produção de enzimas e para o controle biológico da antracnose / Guarana (Paullinia cupana var. sorbilis) a plant from the Amazon region is of great importance mainly from the Amazonas state both from economic and social points of view. Currently roast seed extracts have been used for the production of soft drinks and medicinal purposes. Brazil is the only guarana producer in the world, being the states of Amazonas and Bahia the main producers in the country. However, guarana production in Amazonas state has been increasingly affected by unfavorable conditions due the plant disease anthracnose caused by fungi from the genus Colletotrichum, which is not a problem in Bahia state. The aim of the present research was to compare the endophytic microbiota from seeds derived from the two states, to detect possible causes which could explain plant sanity differences in both regions and also to use endophytic microorganisms as biological controllers, a sustainable alternative to chemical products to control the disease. Endophytic bacteria and fungi from guarana seeds obtained from Bahia and Amazonas regions were isolated and studied as antagonists against Colletotrichum sp. strain L1 and also for enzymes production. The isolates identification was performed by partial sequencing the 16S rDNA region for bacterial isolates and rDNA ITS region for fungal isolates. Fungal morphological characterization was also done. We detect few differences between the number of bacteria isolated from Bahia and Amazonas seeds. Although only reduced number of seeds were analyzed, only six fungal isolates were obtained, all from Bahia. A total of 102 bacteria isolates, 48 from Amazonas and 54 from Bahia were selected. Antagonistic tests and enzymatic activities showed that from bacteria tested, 13, 5, 11 and 24 isolates were able to produce amylolytic, cellulolytic, pectinolytic and proteolytic activities respectively. All the six fungal isolates produced the tested enzymes with exception of proteases. From the positive tests, Bacillus, Paenibacillus, Ochrobacterium, Rhizobium and Microbacterium were the genera isolated from guarana seeds and the genera Lasiodiplodia and Fusarium were found among the endophytic fungi. Although no clear distinctions among isolated endophytes were found to explain anthracnose differences in Amazonas and Bahia, the results demonstrated the biotechnological potential of selected endophytic microbiota from guarana seeds for enzyme production and in vitro control of Colletotricum, the causal agent of guarana anthracnose

Submitted by LUZ MARIA RUIZ MACHUCA (luzmy_rm@hotmail.com) on 2019-01-30T02:24:26Z No. of bitstreams: 1 TESE MACHUCA-LMR 2018.pdf: 2581969 bytes, checksum: c24f7e0a1623abf87965a575431111f4 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Lucia Martins Frederico null (mlucia@fca.unesp.br) on 2019-01-30T12:15:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 machuca_lmr_dr_botfca.pdf: 2581969 bytes, checksum: c24f7e0a1623abf87965a575431111f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2019-01-30T12:15:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 machuca_lmr_dr_botfca.pdf: 2581969 bytes, checksum: c24f7e0a1623abf87965a575431111f4 (MD5) Previous issue date: 2018-11-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O pimentão é uma cultura de grande interesse agrícola e econômico para o Brasil. Como hortaliça, demanda práticas de irrigação, para garantir a produção e qualidade de frutos. Devido à dependência direta da água para seu manejo, este recurso pode ser fator limitante para o desenvolvimento da cultura. Neste contexto, este estudo teve como objetivo avaliar as diferenças na morfologia e fisiologia em plantas de pimentão, submetidas a diferentes lâminas de irrigação nas estações inverno e verão. As plantas foram cultivadas em vasos de 22 Kg de solo, utilizando o sistema de irrigação por gotejamento. O desenho experimental foi organizado em delineamento inteiramente casualizado (DIC) com três tratamentos e cinco repetições. Os tratamentos foram divididos em controle (C; Ψm do solo= 10 a 15 KPa); Deficiência Hídrica Moderada (DHM; Ψm do solo= 34- 40 KPa) e Deficiência Hídrica Severa (DHS; Ψm do solo= 54 a 60 KPa). As plantas se mantiveram sem restrição hídrica até os 50 dias após transplantio (DAT). Foram realizadas quatro avaliações aos 50, 65, 80 e 95 DAT em que as plantas foram coletadas e separadas para avaliar o potencial hídrico foliar (ψhf), conteúdo relativo de água, perda de eletrólitos, biometria, avaliação nutricional da folha, variáveis fisiológicas, discriminação isotópica do δ13C e δ15N e análises bioquímicas. Finalmente coletou-se frutos para determinação da produtividade. A deficiência hídrica (DH) provocou redução no potencial hídrico foliar, ocasionando diminuição geral dos parâmetros avaliados o que resultou em perdas consideráveis na produção de frutos. No entanto, o tratamento DHS ocasionou danos mais marcantes no crescimento e produtividade da cultura de pimentão. Os resultados obtidos confirmaram a hipótese da dependência da água no crescimento e produtividade da cultura do pimentão em ambiente protegido. / Bell pepper is a crop of great agricultural and economic interest to Brazil. As a vegetable, it demands irrigation practices, to guarantee the production and quality of fruits. Due to the direct dependence of water for its management, this resource can be a limiting factor for the development of the crop. In this context, this study had as objective to evaluate the differences in morphology and physiology in Bell pepper plants, submitted to different irrigation depths in winter and summer seasons. The plants were cultivated in pots of 22 kg of soil, using the drip irrigation system. The experimental design was arranged in a completely randomized design (CRD) with three treatments and five replicates. The treatments were divided in control (C; Ψm of soil = 10 to 15 KPa); Moderate Water Deficiency (MWD; Ψm of soil = 34-40 KPa) and Severe Water Deficiency (SWD; Ψm of soil = 54 to 60 KPa). The plants were maintained without water restriction until 50 days after transplanting (DAT). Four evaluations were performed at 50, 65, 80 and 95 DAT in which the plants were collected and separated to evaluate leaf water potential (ψlw), relative water content, electrolyte loss, biometry, leaf nutrient evaluation, physiological variables, isotopic discrimination of δ13C and δ15N and biochemical analyzes. Fruits were finally collected for yield determination. The water deficit (WD) caused a reduction in the leaf water potential, causing a general decrease of the evaluated parameters, which resulted in considerable losses in the fruit production. However, the SWD treatment caused more marked damages in the growth and productivity of the Bell pepper crop. The results confirmed the hypothesis of water dependence on the growth and productivity of the pepper crop in a protected environment. / CNPq: 141414/2015-4

O envenenamento por aranhas Loxosceles pode resultar dois tipos de manifestações clínicas: o loxoscelismo cutâneo e o sistêmico. Hemólise, agregação plaquetária, inflamação persistente, falência renal e morte podem ser observados em pacientes com manifestações sistêmicas. Apesar da pouca incidência de vítimas com falência renal, esta é a principal causa de óbito, ocorrendo principalmente em crianças. O principal fator do veneno da aranha Loxosceles, responsável pelas manifestações locais e sistêmicas, é a esfingomielinase D. O presente estudo teve como objetivo investigar a ação tóxica do veneno de L. intermedia e das SMases D sobre células renais humanas, o possível envolvimento de metaloproteases endógenas e do sistema complemento neste processo. Os resultados obtidos mostram que tanto o veneno, como a SMase D, foram capazes de provocar morte celular, a qual foi relacionada a ativação de metaloproteases de matriz extracelular, MMP-2 e MMP-9 e, ainda, por ação lítica do complemento, após clivagem do MCP, por ação de metaloproteases da família das adamlisinas. A remoção de MCP permitiu ativação do Complemento, como determinado pelo aumento da deposição de C3 e C4 e da morte celular. Também foi observado um aumento na deposição do fator H e da properdina, mas não de C4bp após a tratamento das células com veneno/ SMase D. Diminuição na expressão das moléculas de superfície MHC-I, <font face=\"Symbol\">b2 microglobulina, EPCR e EGFR foi observada e está relacionada com a ativação de metaloproteases da família das adamlisinas. A expressão de outros reguladores do complemento, como DAF e CD59, não foi afetada pelo tratamento. Em conjunto, tais resultados mostram que o veneno e a SMase D induzem aumento na expressão/ativação de metaloproteases endógenas, operantes nos eventos de morte celular por apoptose e necrose, os quais podem ter um papel relevante para os danos renais presentes no loxoscelismo sistêmico humano. / Envenomation by Loxosceles spider can result two forms of clinical manifestations: cutaneous and systemic loxoscelism. Haemolysis, platelet aggregation, inflammation persistent, renal failure and death can be observed in patients with systemic manifestations. Despite the low incidence of renal failure victims, this is the main cause of death, occurring mainly in children. The sphingomyelinase D is the main factor in Loxosceles spider venom responsible for local and systemic manifestations This study aimed to investigate the toxicity of the L. intermedia venom and SMase D on human kidney cells and the possible involvement of endogenous metalloproteinases and complement this process. Results showed that venom and SMase D were able to cause cell death, which was related to activation of extracellular matrix metalloproteases, MMP-2 and MMP-9 and also by lytic action of complement, after MCP cleavage by the action of the family of metalloproteases adamlisins. The removal of MCP, by action of the venom/ SMase D, allowes activation of complement, as determined by increases deposition of C3 and C4 and cell death. There was also an increases in deposition of properdin and factor H, but not C4bp, after treatment of cells with venom/ SMase D. decreased expression of surface molecules MHC-I, <font face=\"Symbol\">b2 microglobulin, EPCR and EGFR was observed after incubation of the renal cells with venom or SMase D and is related to activation of metalloproteinases family adamlisins. The expression of others complement regulators such as DAF and CD59 was not affected by treatment. Together, theses results show that the venom and SMase D induce increased expression/ activation of endogenous metalloproteases, operating in the event of cell death by apoptosis and necrosis, which may have an important role for the kidney injury loxoscelism in the human system.

Orientador: Frank Nelson Crespilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Nanociências e Materiais Avançados, 2013

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-12-22Bitstream added on 2014-06-13T19:01:15Z : No. of bitstreams: 1 vidal_aa_dr_jabo.pdf: 708737 bytes, checksum: 1d8e6612add4783d418abf8e35c0a234 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A escória de aciaria como um material corretivo, fonte de silício e sua interação com a adubação nitrogenada poderá beneficiar a nutrição e a produção da cultura do arroz. Entretanto, poderá afetar a atividade biológica do solo, devido à presença de metais pesados na sua composição química. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a escória de aciaria como material corretivo e como fonte de silício e a sua interação com a adubação nitrogenada na nutrição e na produção da cultura do arroz. Para isso instalou-se experimento em casa de vegetação na UNESP/Campus Jaboticabal, com a cultura do arroz (cv IAC 202) em vasos, preenchidos com um Latossolo Vermelho distrófico. Os tratamentos foram constituídos por duas fontes de material corretivo (calcário dolomítico e escória de aciaria), três doses em ECaCO3 (1,3; 2,6 e 5,2 g dm-3) e três doses de N (80, 160 e 320 mg dm-3). O delineamento experimental foi em blocos casualizados, analisado em esquema fatorial 2x3x3+1, com quatro repetições. Após 90 dias de incubação do solo avaliaram-se as características químicas do solo e após 120 dias do transplantio das plântulas de arroz, a atividade enzimática e teor de Si do solo, o estado nutricional (teores de nutrientes e de silício na planta) e o crescimento e a produção do arroz. Os resultados indicaram que a maior produção de grãos ocorreu com a aplicação de calcário na dose de 2,6 ECaCO3 (V= 50%) e de nitrogênio na dose de 160 mg dm-3. O uso da escória de aciaria foi semelhante ao do calcário na neutralização da acidez do solo e, ainda, aumentou a disponibilidade de silício no solo. As doses de nitrogênio diminuíram o teor de Si na parte aérea (colmo+folhas) do arroz. A adubação nitrogenada aumentou a absorção de nitrogênio, favoreceu o acúmulo de silício e nitrogênio na planta e promoveu maior produção de massa seca... / Slag as a corrective material and silicon source could benefit the nutrition and yield in rice cultivation due to its interaction with nitrogen fertilization. However, the slag could affect the biologic activity of the soil because of the presence of heavy metals in its chemical composition. Thus, the objective of this work was to evaluate slag as a corrective material and as silicon source as well as its interaction with nitrogen fertilization in the nutrition and the production of rice crops. For this reason an experiment with the culture of rice (cv IAC 202) in pots filled with acid dystrophic Red Latosol was carried out in a greenhouse in UNESP/Jaboticabal. The treatments which were applied were constituted of two corrective sources (dolomitic limestone and slag), three doses of correctives in ECaCO3 (1,3; 2,6 and 5,2 g dm-3) and three doses of nitrogen (80, 160 e 320 mg dm-3). The experimental design was in randomized blocks with a factorial scheme 2x3x3+1 with four replications. Ninety days after incubation, the characteristics of the fertility of the soil were evaluated and one hundred and twenty (120) days after planting the rice, the enzymatic activity and the silicon content of the soil, the nutritional status (content of the nutrients and silicon in plants) and the growth and the production of the rice were also evaluated. The results show that the greatest production of grains occurred with the application of limestone in the dose of 2,6 ECaCO3 (V= 50%) and of nitrogen in the 160 doses of mg dm-3. The result of the application of the slag was similar to that of the limestone in the neutralization of the acidity of the soil, moreover, it increased silicon availability. The doses of nitrogen diminished the content of Si in the rice (stem and leaf). Nitrogen fertilization also increased the absorption of nitrogen, favored the accumulation of silicon and nitrogen in the plants... (Complete abstract click electronic access below)

Por se tratar de um elemento essencial às plantas e um metal pesado ao mesmo tempo, o níquel requer atenção quanto aos aspectos da fisiologia de plantas e ambiental. Além disso, existe um intervalo estreito entre as exigências nutricionais e os teores tóxicos às plantas. Neste contexto, objetivou-se avaliar o efeito do Ni no sistema solo-planta, com foco no ciclo do N e a disponibilidade do elemento no solo, por meio de experimento em condições controladas, utilizando vasos distribuídos inteiramente ao acaso, utilizando-se esquema fatorial 2 x 5, com sete repetições cada tratamento. O primeiro fator foi constituído de duas saturações por base (50 e 70%) e o segundo de cinco doses de Ni (0; 0,1; 0,5; 1,0 e 10,0 mg dm-3 de solo). Os vasos foram preenchidos com 8 dm3 de terra e cultivados com soja [Glycine max (L.) Merrill] sucedida por girassol (Helianthus annuus L.). Os parâmetros qualitativos e quantitativos: altura de plantas (AP), diâmetro do caule (DC), número de nós (NN), estádio fenológico (EF), índice SPAD e, diâmetro do capítulo (DCap) (para girassol) foram avaliadas aos 30 e 60 dias após a emergência (d.a.e.) de cada cultivo. Plantas inteiras de soja, amostradas em quatro vasos de cada tratamento, foram coletadas no estádio R1. Na mesma ocasião foram coletadas amostras de solo da rizosfera. Em seguida, as plantas coletadas foram divididas em: folhas; raízes (nódulos na soja) e parte aérea. Foram determinados nas folhas utilizadas para diagnose em soja e girassol: os teores de macro e micronutrientes, as atividades da redutase do nitrato e da urease e as concentrações dos ácidos orgânicos: oxálico, malônico, succínico, málico, tartárico, fumárico, oxaloacético, cítrico e lático. Os mesmos ácidos orgânicos foram determinados em raízes secundárias de girassol e nódulos de soja. Foram realizadas avaliações ultraestruturais por meio de microscopia eletrônica de transmissão (MET) em raízes de girassol, e estruturais e de tonalidade em nódulos de soja, por meio de microscopia de luz. No solo, foram determinadas: atividade urease, desidrogenase, Ni total e fitodisponível pelos métodos: Mehlich-1, Mehlich-3 e DTPA. No período de maturidade fisiológica de cada cultura foi realizada a colheita das plantas dos vasos restantes para determinação de produção de grãos, teores de Ni na planta inteira e Ni e N nos grãos. Ao final dos dois experimentos foi realizada nova coleta de solo para extração sequencial de Ni. O índice SPAD em soja aos 60 d.a.e., a produção de massa seca da parte aérea da soja e da raiz de girassol foram influenciados pela saturação por bases, doses de níquel e pela a interação destes. Foram influenciados pelas saturações por base e doses de níquel (fatores isolados): para soja: AP aos 60 d.a.e., NN aos 30 e 60 d.a.e., SPAD aos 30 d.a.e.; para girassol: AP e NN aos 30 e 60 d.a.e., DC e SPAD aos 30 d.a.e. As demais variáveis avaliadas aos 30 e 60 d.a.e. foram influenciadas apenas pela saturação por bases, ou doses de Ni separadamente. As plantas de soja e girassol apresentaram maiores teores de Ni nos diferentes tecidos avaliados (exceto grãos) quando cultivadas sob V50%. A produção de grãos de soja e girassol não foi influenciada pelos tratamentos, porém o teor de N dos grãos de soja influenciado pelas doses de Ni na V70%. A atividade da enzima urease nas folhas de soja e girassol foi responsiva positivamente ao aumento das doses de Ni. Quatro dos ácidos orgânicos avaliados e o teor de N nas folhas e nos grãos foram maiores nas plantas cultivadas sob V70% com a dose de 0,5 mg dm-3 de Ni. As doses de Ni bem com as saturações por bases influenciaram diretamente o balanço de nutrientes das plantas. Os extratores Mehlich-1, Mehlich-3 e DTPA apresentaram elevado coefienciente de correlação entre a fração de Ni disponível no solo e a concentração do elemento nas plantas de soja e girassol, sendo o extrator DTPA o que apresentou maior coeficiente de correlação. O Ni apresentou distribuição variável entre as diferentes frações do solo em função dos tratamentos. Os solos dos tratamentos com saturação por bases de 70% apresentaram maior concentração de Ni ligado a carbonato, comparado aos tratamentos sob saturação por bases de 50%. A distribuição do Ni entre as frações do solo seguiu a seguinte orgem: ligado a carbonato < trocável < ligado a óxidos < matéria orgânica < residual. A saturação por bases exerceu efeito diferenciado para a atividade da urease no solo em função da cultura avaliada. Por sua vez, o Ni exerceu efeito diferenciado sobre a atividade de desidrogenase em função da cultura estudada / As an essential element for plants and a heavy metal at the same time, nickel requires attention on the aspects of the physiology of plants and environmental. Furthermore, there is a narrow range between nutritional requirements and toxic levels to plants. In this context, the aim was to evaluate the effect of Ni in soil-plant system through experiment under controlled conditions, using soil pots distributed entirely at random, using a factorial 2 x 5, with seven repetitions each treatment. The first factor was formed of two saturations base (50 and 70%) and the second of five Ni rates (0, 0.1, 0.5, 1.0 and 10.0 mg dm-3 of soil). The pots were filled with 8 dm3 of soil and sown with soybean [Glycine max (L.) Merrill] succeeded by sunflower (Helianthus annuus L.). The agronomic traits: plant height (PH), stem diameter (SD), number of nodes (NN), phenological stage (PS), SPAD index, head diameter (HD) (Sunflower) were evaluated at 30 and 60 days after emergence (dae) of each crop. Whole soybean plants, sampled in four pots of each treatment were collected at the R1 stage for analysis of soil samples from the rhizosphere. Then, the collected plants were divided into: sheets; roots (nodules on soybean) and shoot. Were determined in the leaves used for diagnosis in soybean and sunflower: macro and micronutrients, activities of nitrate reductase, and urease and concentrations of organic acids: oxalic, malonic, succinic, malic, tartaric, fumaric, oxaloacetic, citric and lactic. The same organic acids were determined in secondary roots of sunflower and nodules of soybean. They were conducted ultrastructural evaluations by means of transmission electron microscopy (TEM) in sunflower roots, and color in soybean nodules, using light microscopy. In the soil were determined: urease activity dehydrogenase, the total Ni and available by methods: Mehlich-1, Mehlich-3 and DTPA. At physiological maturity period of each culture was performed to harvest the plants of other pots in order to determine grain dry matter yield, Ni content in the whole plant and Ni and N content in grains. At the end of the two experiments it were carried out new soil sampling for Ni sequential extraction. The SPAD index taken on soybean leaves at 60 d.a.e., the dry matter production of the aerial part of soybean and sunflower root were influenced by the base saturation, nickel doses and the interaction among them. They were influenced by the saturation for base and nickel doses (single factor): soybean: HP d.a.e. to 60, NN at 30 and 60 d.a.e., SPAD to 30 d.a.e.; Sunflower: PH and NN at 30 and 60 d.a.e., HD and SPAD to 30 d.a.e. The other variables assessed at 30 and 60 d.a.e. They were influenced only by base saturation, or Ni doses separately. Sunflower soybean plants had higher Ni contents at the different tissues (except grain) when grown under V50%. The production of soybean and sunflower grains was not affected by the treatments, but the N content of the soybeans was changed by Ni rates V70%. The urease enzyme activity in soybean and sunflower leaves was responsive to increased doses of Ni. Four of the organic acids and the N content in leaves and grains were higher in plants grown under V70% at the dose of 0.5 mg dm-3 Ni. Ni rates as well as the cation base saturation directly influenced the balance of plant nutrients. The Mehlich-1, Mehlich-3 and DTPA presented higher coefiencient correlation between available Ni soil fraction with nutrient concentrations in both soybean and sunflower, with the DTPA solution showing the highest correlation coefficient in this analysis. Ni showed variable distribution among different soil fractions in the treatments. The treatments presented soil under cation bases saturation of 70% showed higher Ni concentration linked to carbonate, as compared to treatments under cation base saturation of 50%. The distribution of Ni between the soil fractions followed the following order: bound to carbonate <exchangeable < bound to oxides <organic matter <residual. The cation base saturation showed different effects on the urease activity according to the plant evaluated. Ni exerted on the differential effect dehydrogenase activity according to the plant specie

O diguanilato cíclico (c-di-GMP) é uma molécula de sinalização intracelular que atua na regulação de importantes processos bacterianos como motilidade, formação de biofilme e virulência. As diguanilato ciclases (DGCs), contendo um domínio GGDEF ativo, catalisam a formação de c-di-GMP a partir de duas moléculas de GTP. A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xanthomonas axonopodis pv citri; Xac) é o agente causal do cancro cítrico, uma doença que ataca todas as variedades e espécies de citros. O genoma de Xac codifica 31 proteínas contendo domínios GGDEF. Treze destas proteínas possuem também domínios PAS e/ou GAF, que são ubíquos domínios sensores e de sinalização. Para tentar entender melhor o papel na sinalização por c-di-GMP das interações entre domínios GGDEF e domínios PAS e/ou GAF, estudos bioquímicos e funcionais foram realizados com as proteínas XAC0610 e XAC2446. XAC0610 contém um domínio GAF, quatro domínios PAS e um domínio GGDEF conservado. Análises fenotípicas com a linhagem nocaute Xac&#916;0610 mostraram que XAC0610 atua na regulação da motilidade e sobrevivência de Xac ao tratamento com H2O2. Ensaios de atividade enzimática demonstraram que XAC0610 é uma DGC cataliticamente ativa, e que a mutação sítio-dirigida de um resíduo conservado de lisina (Lys759) provoca uma grande redução na atividade de DGC. Os domínios GAF e PAS de XAC0610 aparentemente não atuam como domínios sensores, entretanto são importantes para a dimerização da proteína, necessária para a obtenção de altos níveis de atividade de DGC. Além disso, várias observações sugerem que XAC0610 não é submetida à inibição alostérica pelo produto, um mecanismo regulatório comumente utilizado para o controle da atividade de DGC. Por outro lado, os dados de cinética enzimática de XAC0610HIS-35-880 revelaram um efeito de cooperatividade positiva para a ligação dos substratos, com uma constante de dissociação para a ligação da primeira molécula de GTP (K1) cerca de 3-5 vezes maior que a constante de dissociação para a ligação da segunda molécula de GTP (K2). A partir deste estudo, nós apresentamos um esquema cinético geral mais apropriado para as análises dos dados cinéticos de enzimas DGCs e propomos que a ligação cooperativa do substrato talvez possa desempenhar um importante papel na regulação in vivo da atividade de algumas DGCs, aumentando sua sensibilidade a pequenas variações nos níveis celulares de GTP. Outra proteína caracterizada neste trabalho, XAC2446 possui um domínio GAF e um domínio GGDEF que, ao contrário do domínio GGDEF de XAC0610, não deve apresentar atividade de DGC. Mesmo assim, análises funcionais mostraram que XAC2446 regula negativamente a formação de biofilme e positivamente a motilidade de Xac. Ensaios de duplo híbrido em leveduras identificaram que XAC2446 interage com XAC2897, contendo um domínio GGDEF potencialmente ativo, e XAC1185, contendo um domínio HD fosfohidrolase de (p)ppGpp. Alguns estudos indicam que altos níveis celulares de c-di-GMP e baixos níveis de (p)ppGpp podem ser necessários durante a formação de biofilme. XAC2446 talvez possa atuar como um inibidor da atividade enzimática de XAC2897 e XAC1185 e influenciar, indiretamente e antagonicamente, tanto os níveis celulares de c-di-GMP quanto de (p)ppGpp. / Cyclic di-GMP is a bacterial second messenger that regulates a range of functions, including cellular motility, biofilm formation and virulence. This molecule is produced from two GTP substrates by the activity of diguanylate cyclases (DGCs) containing a GGDEF domain. The phytopathogenic bacteria Xanthomonas citri subsp. citri (Xanthomonas axonopodis pv citri; Xac) causes citrus canker in a wide variety of citrus species. The Xac genome codes for 31 proteins with GGDEF domains. Thirteen of the 31 Xac GGDEF domain-containing proteins also possess PAS (Per-Arnt-Sim) or GAF (cGMP-specific phosphodiesterases, adenylyl cyclases and FhlA) domains that are ubiquitous signaling and sensory domains. In order to better understand the relationship between these commonly associated domains, biochemical and functional studies were carried out with the XAC0610 and XAC2446 proteins. XAC0610 is a large multi-domain protein containing one GAF domain, four PAS domains and one GGDEF domain. This protein has a demonstrable in vivo and in vitro diguanylate cyclase (DGC) activity. Analysis of a Xac&#916;0610 knockout strain revealed that XAC0610 plays a role in the regulation of Xac motility and resistance to H2O2. Site-directed mutagenesis of a conserved DGC lysine residue (Lys759 in XAC0610) resulted in a severe reduction in XAC0610 DGC activity. XAC0610 DGC activity was also impaired by removal of the N-terminal GAF and PAS domains, which are probably needed for proper protein dimerization. Furthermore, experimental and in silico analysis suggest that XAC0610 is not subject to allosteric product inhibition, a common regulatory mechanism for DGC activity control. Instead, steady-state kinetics of XAC0610 DGC activity revealed a positive cooperative effect of the GTP substrate with a dissociation constant for the binding of the first GTP molecule (K1) approximately three to five times greater than the dissociation constant for the binding of the second GTP molecule (K2). We present a general kinetics scheme that should be used when analyzing DGC kinetics data and propose that cooperative GTP binding could be a common, though up to now overlooked, feature of these enzymes that may in some cases offer a physiologically relevant mechanism for regulation of DGC activity in vivo. The other characterized protein, XAC2446, has a GAF domain and a degenerated GGDEF domain. Unlike XAC0610, XAC2446 should not present DGC activity. Nevertheless, functional analysis of XAC2446 demonstrated that it plays a role in the regulation of Xac motility and biofilm formation. A yeast two-hybrid screen identifies XAC2897 (a potentially active GGDEF domain-containing protein) and XAC1185 (a (p)ppGpp hydrolase) as specific binding partners of the XAC2446 protein. As indicated by studies in other bacteria, high cellular levels of c-di-GMP and low levels of (p)ppGpp may be both required for biofilm formation. It is possible that XAC2446 might have a role in the antagonistic regulation of c-di-GMP and (p)ppGpp cellular levels by acting as an inhibitor of both XAC2897 and XAC1185 enzymatic activities.

Fungos de decomposição branca atuam eficientemente na biodegradação de substratos altamente lignificados, como a madeira. Tal característica permite supor que esses organismos apresentem um sistema celulolítico com atividade diferenciada em substratos ricos em lignina. O presente trabalho avaliou o efeito da adição de enzimas derivadas do fungo de decomposição branca Pleurotus ostreatus em preparações de celulases comerciais durante a hidrólise enzimática do bagaço de cana previamente submetido a tratamento quimiotermomecânico com sulfito alcalino. Duas cargas de sulfito alcalino foram empregadas nos pré-tratamentos: uma mais elevada de 10 g de Na2SO3 e 5 g de NaOH para cada 100g de bagaço, que gerou um substrato de baixa recalcitrância; e uma carga diminuída à metade da anterior, que originou um substrato de elevada recalcitrância. Primeiramente, a produção de endoglucanases (EG) em cultivos submersos de P.ostreatus foi avaliada em diferentes fontes de carbono, sendo a maior produção de EG (342 UI L-1) verificada após 20 dias de cultivo em meio contendo bagaço de cana moído e carboximetilcelulose (CMC). Contudo, devido a CMC ser considerada um interferente nos ensaios de hidrólise do bagaço, optou-se por utilizar enzimas derivadas dos cultivos que empregaram somente bagaço de cana como fonte de carbono. Os experimentos de hidrólise empregaram cargas de enzimas correspondentes a 10FPU (carga alta) e 5FPU (carga média) de celulases derivadas de Trichoderma reesei ATCC 26921, misturadas com uma carga de 15 UI.g-1 de ?-glicosidase (BGL) derivadas de Aspergillus niger, para cada grama de bagaço. Para os experimentos de hidrólise que empregaram enzimas derivadas de P. ostreatus ajustou-se a carga de endoglucanase para que 50% da atividade fosse derivada de T. reesei, e 50% proveniente de P. ostreatus. A suplementação com enzimas de P. ostreatus causou uma alteração no teor das demais enzimas hidrolíticas, verificando-se valores de atividades de xilanases e celulases, com exceção das celobiohidrolases, superiores aos observados com o emprego da carga alta de enzimas comerciais. A conversão da celulose obtida durante a hidrólise dos bagaços pré-tratados mostraram que as enzimas de P. ostreatus proporcionaram valores de velocidade inicial de hidrólise equivalentes aos obtidos nos ensaios com carga alta de enzimas comerciais. Esse resultado foi atingido mesmo com uma carga de celobiohidrolases duas vezes inferior a existente nos ensaios com alta carga de enzimas comerciais, o que levou a considerar que as enzimas derivadas de P. ostreatus possam apresentar atividade celulolítica diferenciada. Além disso, o maior teor de enzimas xilanolíticas nos extratos de P. ostreatus resultou em maiores valores de conversão da xilana. A maior remoção de xilana também pode ter favorecido a maior conversão de celulose obtida mesmo com baixa carga de celobiohidrolases nas misturas reacionais, visto que a remoção da xilana associada à celulose aumentaria a disponibilidade do substrato às celulases. Contudo, a conversão de celulose a partir de 8-24h de hidrólise suplementada com enzimas de P. ostreatus foi ligeiramente inferior ao obtido na hidrólise com carga alta de celulases de T. reesei. / White-rot fungi are able to degrade highly lignified substrates, such as wood. This characteristic allows us to assume that these organisms possess a cellulolytic system with differentiated activity on lignin-rich substrates. This study evaluates how cellulolytic enzymes produced by the white-rot fungus Pleurotus ostreatus perform in the hydrolysis of pretreated sugarcane bagasse. The sugar cane bagasse was initially pretreated with two chemical loadings of alkaline sulphite: 10 g of Na2SO3 and 5 g of NaOH per 100g of pulp (high chemical load), generating a substrate with low recalcitrance; and a load decreased to half of the previous one, which gave a more recalcitrant substrate. The production of endoglucanases (EG) in submerged cultures of P.ostreatus was evaluated using different carbon sources in the culture media. The highest EG production (342 IU L-1) was observed after fungal growth for 20 days in the culture medium that contained sugarcane bagasse and carboxymethylcellulose (CMC) as carbon sources. However, residual CMC present in the culture extracts was considered to interfere in subsequent hydrolysis assays and we decided to use enzymes derived from the cultures that used only sugarcane bagasse as carbon source. The reference hydrolysis experiments were performed with enzyme loadings of 10 FPU (high loading) and 5 FPU (medium loading) from cellulases derived from Trichoderma reesei ATCC 26921 mixed with 15 UI of ?-glucosidase (BGL) from Aspergillus niger (enzyme loadings expressed in units per gram of pretreated bagasse). For the hydrolysis experiments that used enzymes from P. ostreatus, the enzyme loading was adjusted in order to have 50% of original endoglucanase activity from T. reesei enzymes replaced by enzymes from P. ostreatus enzymes. The addition of P. ostreatus enzymes caused a change in the overall levels of hydrolytic enzymes present in the reaction medium. Xylanase and beta-glucosidase activities were higher than those observed in the commercial enzymes mixture. However, the cellobiohydrolase levels were the half of the original values from the commercial enzymes. The cellulose conversion during the hydrolysis of pretreated bagasses showed that the enzymes from P. ostreatus provided initial hydrolysis rate values similar to those obtained in tests with the high loading of commercial enzymes. This result was achieved even with a cellobiohydrolase loading twice lower than in the assays with high loading of commercial enzymes, which led to the conclusion that the enzymes derived from P. ostreatus can show differentiated cellulolytic activity. In addition, the higher content of xylanolytic enzymes in P. ostreatus extracts resulted in higher xylan conversion. The higher removal of xylan may have also resulted in the higher conversion of cellulose, even with low cellobiohydrolases in the reaction mixtures, since removal of xylan increases the accessibility of the cellulases to the substrate. However, the cellulose conversion after 8-24h hydrolysis supplemented with enzymes from P. ostreatus was slightly lower than that obtained in the hydrolysis with high loading of cellulases from T. reesei.

No presente trabalho, avaliou-se o efeito limitante da lignina residual de bagaço de cana submetido a diferentes pré-tratamentos na hidrólise da celulose. O bagaço foi submetido a cinco pré-tratamentos: NaOH (5%), Na2SO3/NaOH (10%/5%), H2SO4 (0,75%), NaHSO3/H2SO4 (5%/0,75%) e explosão a vapor catalisada por SO2 (3%). Os pré-tratamentos resultaram em bagaços com diferentes composições químicas, sendo que os tratamentos alcalinos favoreceram a solubilização de lignina e os tratamentos ácidos favoreceram a solubilização de hemicelulose. Os bagaços tratados com Na2SO3/NaOH e por explosão a vapor resultaram em rendimentos de hidrólise de celulose superiores a 80% ao utilizar altas cargas de enzima (Celluclast), indicando a maior acessibilidade da celulose desses materiais. Isso foi confirmado pela técnica de coloração de Simons, que mostrou que a área superficial acessível da celulose desses dois bagaços foi maior que a dos demais. Boas correlações (R2>0,8) entre o rendimento de hidrólise da celulose em 72 h e a celulose superficial acessível só foram obtidos com altas cargas de enzima, evidenciando que fatores além da acessibilidade limitaram a hidrólise da celulose com quantidade menor de enzimas. As ligninas dos bagaços pré-tratados foram isoladas e a capacidade adsortiva de proteínas foi determinada. A lignina de bagaço tratado por explosão a vapor apresentou maior capacidade adsortiva, seguida da lignina de bagaço tratado com NaOH. Os pré-tratamentos com íons sulfito (Na2SO3/NaOH e NaHSO3/H2SO4) resultaram em ligninas com capacidades adsortivas inferiores quando comparado aos seus análogos sem sulfito (NaOH e H2SO4), possivelmente pela sulfonação da lignina residual, confirmada pela presença de grupos ácidos fortes nesses bagaços. A adição de BSA prévia à adição de celulases confirmou o forte efeito da adsorção improdutiva causada pela lignina nos bagaços tratados com NaOH e por explosão a vapor, materiais cujas ligninas apresentaram maiores capacidades adsortivas. A adsorção improdutiva foi menor ao utilizar o extrato enzimático Cellic CTec3, evidenciando que as enzimas desse coquetel são menos sensíveis à presença da lignina. Do extrato Celluclast, a enzima que mais adsorveu nas ligninas de bagaço tratado com NaOH e por explosão a vapor foi a ?-glicosidase, seguida da endoglucanase. As enzimas purificadas CBHI e EGII de T. longibrachiatum adsorveram menos à lignina de bagaço tratado por explosão a vapor que as mesmas enzimas de T. reesei. A ?-glicosidade de A. niger não adsorveu a essa lignina. Independentemente do pré-tratamento, a presença de fenóis solubilizados a partir da lignina, em baixas concentrações, resultou em aumento no rendimento de conversão de celulose ao utilizar baixas cargas de enzima, possivelmente pelo efeito positivo causado por esses na atividade de enzimas oxidativas, ou pela presença de lignossulfonatos. Em concentrações mais elevadas, independente da carga enzimática, os fenóis liberados foram inibitórios em todos os pré-tratamentos. A atividade de CBHI foi mais sensível à presença dos compostos fenólicos que a atividade de ?-glicosidase. A partir dos resultados, conclui-se o aumento da acessibilidade, seja pela remoção ou pela relocalização da lignina, é o fator que mais influencia a hidrólise eficiente da celulose do bagaço. A adsorção improdutiva foi dependente do pré-tratamento, e resultou em diminuição significativa dos rendimentos de hidrólise da celulose com baixas cargas de enzima. / The present work evaluated the limiting effect of the residual lignin of sugarcane bagasse submitted to different pretreatments: NaOH (5%), Na2SO3/NaOH (10%/5%), H2SO4 (0.75%), NaHSO3/H2SO4 (5%/0.75%) and SO2-catalyzed steam explosion (3%). The pretreatment resulted in bagasses with different chemical compositions, wherein the alkaline treatments resulted in a more efficient solubilization of lignin, and the acidic treatments solubilized the hemicellulose. The bagasses treated with Na2SO3/NaOH and by steam explosion resulted in cellulose hydrolysis yields above 80% using higher enzyme loadings (Celluclast), indicating the increased accessibility of the cellulose in these materials. This was confirmed by Simons\' Stain, which showed that the accessible surface area of the cellulose in these bagasses was higher than in the others. Good correlations (R2>0.80) between the 72 h hydrolysis yields and the accessible surface area of cellulose were only observed at higher enzyme loadings, indicating that other factors than accessibility, limit the hydrolysis at lower enzyme loadings. The lignins were isolated from the pretreated bagasses and the protein binding capacity was determined. The lignin from steam exploded bagasse showed the highest binding capacity, followed by the lignin extracted from NaOH-treated bagasse. The sulfite pretreatments (Na2SO3/NaOH e NaHSO3/H2SO4) resulted in lignins with lower binding capacities, when compared to their analogues without sulfite (NaOH e H2SO4), possibly because of the sulfonation of the residual lignin, confirmed by the presence of strong acid groups in these bagasses. BSA addition prior to the cellulases confirmed the strong effect of unproductive binding caused by the lignin in the NaOH-treated and steam exploded bagasses, materials with the highest binding capacity lignins. Less unproductive binding was observed using the enzyme extract Cellic CTec3, showing that the enzymes in this cocktail are less sensitive to the presence of lignin. From the extract Celluclast, the enzyme that most adsorbed to the lignins isolated from NaOH-treated and steam exploded bagasses was ?-glucosidase, followed by the endoglucases. The purified CBHI and EGII from T. longibrachiatum were less adsorbed to steam exploded bagasse lignin that the same enzymes from T. reesei. ?-glucosidase from A. niger did not bind to this lignin. Despite of the pretreatment, the presence of phenols solubilized from lignin, at lower concentrations, increased the cellulose hydrolysis yields with lower enzyme loading, possibly because of the positive effect of these compounds in the activity of oxidative enzymes, or because of the presence of lignosulfonates. At higher concentrations, despite of the enzyme loading, the phenols were inhibitory in all the pretreatments. The CBHI activity was more sensitive to the presence of phenolic compounds than the ?-glucosidase activity. From these results, it is possible to conclude that the increase in the accessibility, due to the lignin removal or relocation, influences the most the efficient hydrolysis of bagasse cellulose. The unproductive binding was pretreatment dependent and resulted in a significant decrease in the hydrolysis yields of the cellulose at lower enzyme loadings.

A utilização de resíduos agroindustriais como fontes lignocelulósicas para a obtenção de diversos insumos químicos é uma alternativa para contribuir para a valorização destes subprodutos. Neste contexto, o etanol produzido a partir de materiais lignocelulósicos torna-se uma opção interessante para aumentar a produção deste combustível sem aumentar a área plantada das colheitas utilizadas para sua produção, já que a demanda de etanol vem aumentando cada vez mais nos últimos anos, com o objetivo de substituir o petróleo e seus derivados, contribuindo significativamente para a redução dos impactos negativos ao meio ambiente, tais como o aquecimento global provocado pela queima dos combustíveis fósseis. Para que a produção de etanol celulósico seja economicamente viável é necessário que estas fontes lignocelulósicas sejam fracionadas de forma a disponibilizar a maior quantidade de carboidratos possível para o processo de fermentação alcoólica. Neste trabalho propôs-se avaliar a sacarificação enzimática dos materiais, palha de cana-de-açúcar, bagaço de cana-deaçúcar e pseudocaule de bananeira, nas formas -in natura?, pré-tratada e deslignificada de forma a verificar o efeito do pré-tratamento e da deslignificação no aumento da conversão enzimática da celulose de cada biomassa vegetal. Todos os materiais lignocelulósicos foram caracterizados quimicamente nas formas -in natura?, pré-tratada e deslignificada. Análises de FTIR para cada biomassa comprovaram a alteração na estrutura química proporcionada pelo pré-tratamento e deslignificação destes materiais. O pré-tratamento com H2SO4 1,0% (m/v) a 120 °C por 10 min, seguido de deslignificação com NaOH 1,0% (m/v) a 100 °C por 1h, ambos em reator piloto agitado de 350 L promoveu uma solubilização de 88,8 % de hemicelulose e 77,9% de lignina para a palha de cana, e uma solubilização de 79,3% de hemicelulose e 62,3% de lignina para o pseudocaule de bananeira. Já o bagaço de cana foi pré-tratado hidrotermicamente em reator de 20 L, nas condições, 180 °C/10 min, 185 °C/10 min, 190 °C/10 min e 195 °C/10 min, sendo que esta última condição, seguida de deslignificação com NaOH a 1,0% (m/v) a 100 °C por 1h proporcionou uma solubilização de 95,8% de hemicelulose e 80,9% de lignina para este material. Os ensaios de conversão enzimática dos materiais lignocelulósicos mostraram que a conversão celulósica aumentou consideravelmente, para todos os materiais, após o pré-tratamento seguido de deslignificação, atingindo 85% de conversão para a palha de cana, 89,2% de conversão para o bagaço de cana e 61,0% de conversão para o pseudocaule de bananeira. Após as etapas de pré-tratamento e deslignificação alcalina, os materiais lignocelulósicos apresentaram uma estrutura morfológica modificada, com as células vegetais livres de células de parênquima, conforme verificado pelas análises de MEV, e com redução da cristalinidade da celulose remanescente, conforme mostrado pelas análises de Difratometria de Raios X. Ensaios de fermentabilidade dos hidrolisados celulósicos de bagaço de cana utilizando a levedura Candida guilliermondii mostraram uma boa resposta da levedura à produção de etanol alcançando uma concentração máxima de 20 g/L. / The use of agroindustrials residues about lignocellulosics sources to obtain many chemicals products it\'s an alternative to contribute for the valuation of these subproducts. In this context, the ethanol produced by lignocellulosic materials it´s an interesting option for increase the production of this fuel without increase the agriculture area for production of biofuels, since the ethanol demand has increasing even more in the last years, with the objective of substitute the oil and his derivates, contribute significatively for reduce of negative impacts for environment, about the greenhouse gas impacts produced by burning of fossil fuels. For that production of cellulosic ethanol will be economic favorable it´s necessary that lignocellulosics sources will be fractionates for to make it available many carbohydrates possible for alcohol fermentation processes. This work had objective to evaluate enzymatic saccharification of materials, sugar cane straw, sugar cane bagasse and pseudosteam of banana, in this raw, pretreated and delignificated forms, for analyze the effect of pretreatment and delignification on the increase of enzymatic saccharification of cellulose wich biomass. Every lignocellulosic materials went submitted a chemical characterization in this raw, pretreated and delignificated forms. FTIR analysis for each biomass confirmed the change of chemical structure challenge for pretreatment and delignification of this materials. The pretreatment with H2SO4 1.0% (m/v), 120 °C, 10 min, followed of delignification with NaOH 1.0% (m/v), 100 °C, 1h, both in 350 L agitated reactor, promoted a solubilization of 88.8% for hemicellulose and 77.9% of lignin for sugar cane straw, and a solubilization of 79.3% for hemicellulose and 62.3% of lignin for pseudosteam of banana. The sugar cane bagasse went carried hydrothermal processing pretreatment on reactor of 20 L, in this conditions, 180 °C/10 min, 185 °C/10 min, 190 °C/10 min e 195 °C/10 min, although in this last condition, followed of delignification with NaOH 1,0% (m/v), 100 °C for 1h to affored a solubilization of 95.8% for hemicellulose and 80.9% of lignin for this material. The experiments of enzymatic saccharification of lignocellulosic materials showed that cellulosic conversion increased considerably, for all materials, after pretreatment followed of delignification, attaining 85% of conversion for the sugar cane straw, 89.2% of conversion for the sugar cane bagasse and 61% of conversion for the pseudosteam of banana. After pretreatments steps and alkaline delignification, the lignocellulosic materials showed changed morphologic estrutural, with vegetable cells lived of parenchyme cells, according to the SEM analysis, and with reduce of cellulose cristallinity remaining, according to the X Ray diffraction analysis. Experiments of fermentation of cellulosics hydrolysates of sugar cane bagasse using Candida guilliermondii it has showed a good reply of yeast for the ethanol production aimed the máxime concentration of 20 g/L.