THI1 é provavelmente uma proteína bifuncional, uma vez que está envolvida na biossíntese de tiamina e na estabilidade do DNA organelar, notadamente o mitocondrial. Interessantemente, a biossíntese de tiamina ocorre em compartimentos distintos em plantas (cloroplastos) e em leveduras (mitocôndrias). Ensaios de complementação funcional mostraram que o gene thi1 de Arabidopsis thaliana é capaz de complementar uma cepa mutante de levedura para o gene ortólogo. A proteína THI1 de Arabidopsis thaliana é codificada por um único gene. Uma análise detalhada da região N-terminal da proteína, responsável pela sua localização na células, revelou a presença de duas sequências de direcionamento adjacentes. Na extremidade N-terminal encontra-se um peptídeo de trânsito cloroplástico seguida por uma região capaz de formar uma α-hélice anfifílica, tipicamente encontrada em pré-sequências de direcionamento mitocondriais. Com o objetivo de avaliar se a localização final de THI1 pode apresentar um tipo de regulação temporal ou espacial, foram obtidas plantas transgênicas expressando a proteína THI1 fundida a GFP ("green fluorescent protein"). Análises dessas plantas por meio de microscopia confocal revelaram que THI1 está presente majoritariamente em cloroplastos e raramente em mitocôndrias. Ao contrário do que acontece em Arabidopsis thaliana, em cana de açúcar foram encontrados pelo menos três isoformas/parálogos de thi1. O alinhamento da seqüência de aminoácidos dessas isoformas com a THI1 de Arabidopsis thaliana revelou alta similaridade, inclusive na seqüência de direcionamento. Com o intuito de avaliar o padrão de direcionamento dessas isoformas de cana de açúcar foram obtidas construções gênicas contendo ou a seqüência de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito cloroplástico ou a pré-seqüência mitocondrial, fundidas a GFP sob o comando do promotor 35S. A expressão transiente dessas construções em epiderme de cebola, revelou que no caso das construções contendo a seqüência de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito, o direcionamento ocorreu apenas para os cloroplastos. No caso das construções contendo somente a seqüência de direcionamento mitocondrial a GFP permaneceu difundida no citoplasma. Além do aspecto do direcionamento, THI1 foi avaliada sob o ponto de vista filogenético. As análises filogenéticas mostram que thi1 é raramente encontrado em bactérias mas é amplamente distribuído em Archaea. As distâncias genéticas indicam que provavelmente os eucariontes herdaram thi1 de Archaea. As poucas bactérias que possuem esse gene provavelmente obtiveram-no por meio de herança horizontal. / THI1 is probably a bifunctional protein, since it is involved in thiamin biosynthesis and organelar genome stability mainly the mitochondrial. Interestingly, the thiamin biosynthesis occurs at different compartments in plants (chloroplasts) and yeasts (mitochondria). Functional complementation assays showed that Arabidopsis thaliana thi1 gene is able to complement a yeast mutant strain for the hortolog gene. The Arabidopsis thaliana THI1 is encoded by a single copy gene. A detailed analysis of the THI1 N-terminal region, that is responsible for its targeting in cells, reveled the presence of two in tanden directing sequences. At N-terminal region there is a chloroplastic transit peptide followed by a region able to form an anfifilic α-helix frequently present in mitochondrial presequences. Aiming to evaluate if the THI1 final localization could present a temporal or spacial regulation, transgenic plants expressing THI1 fused to GFP ("green fluorescent protein") where obtained. Confocal microscopy analysis of these transgenic plants showed that THI1 is mainly found in chloroplasts and barely found in mitochondrias. Different from what happens in Arabidopsis thaliana, in sugar cane where founded at least three thi1 isoforms/paralogs. The amino acids sequence alignment of these isoforms with the thi1 one, reveled high similarity including the targeting sequence. To evaluate the directing standard of these sugarcane isoforms, gene constructions made by the complete targeting sequence or the chloroplastic transit peptide or the mitochondrial presequence, fused to GFP under the guidance of 35S promotor, where obtained. A transient expression of these gene constructios in epidermal onion cells prove that in the case of the constructions containing either the complete targeting sequence or the chloroplastic transit peptide the directing occurred only to chloroplasts. On the other hand, the constructions containing the mitochondrial pre sequence, GFP were kept defused in the citoplasm. Besides the directing aspect, THI1 were evaluated under the filogenetic point of view. Filogenetic analysis showed that thi1 is rarely found in bacteria but is widely distributed in Archaea. The genetic distances pointed out that probably eucaryotes THI1 came from Archaea. This gene in a few bacterias probably were inherited by lateral transference.

Orientador: Áureo Evangelista Santana / Banca: Antonio Carlos Alessi / Banca: Marileda Bonafim Carvalho / Banca: Márcia Ferreira da Rosa Sobreira / Banca: Maria Angélica Dias / Resumo: A análise do líquido cerebrospinal demonstra ser uma ferramenta complementar viável e eficaz ao exame clínico-patológico do sistema nervoso, especialmente auxiliando no diagnóstico e prognóstico das suas inúmeras enfermidades. Porém, as variáveis apreciadas ao exame de rotina do liquor, nem sempre propiciam a detecção de anormalidades sutis frente a algumas situações neuropatológicas agudas, como por exemplo, nas viroses. Sendo assim, se faz necessário o aprofundamento do estudo do liquor com o escopo de se buscar técnicas mais sensíveis à identificação de alterações estruturais do tecido nervoso, bem como à avaliação do prognóstico do quadro clínico. E, recentemente, tem sido utilizada com sucesso em humanos a avaliação de marcadores bioquímicos, dentre os quais as atividades enzimáticas liquóricas da creatina quinase, lactato desidrogenase e aspartato aminotransferase. Sendo assim, idealizou-se o projeto de pesquisa, em tela, com o objetivo de se avaliar amostras liquóricas de cães acometidos por cinomose, com atenção especial às atividades enzimáticas, e sua correlação com achados histopatológicos do sistema nervoso central. Para tanto, foram colhidas amostras de LCR de 10 cães neurologicamente sadios e de 20 cães na fase neurológica da cinomose, as quais foram analisadas segundo a coloração, o aspecto, o pH, a densidade, a taxa de proteínas liquóricas totais e as atividades enzimáticas da lactato desidrogenase, da aspartato aminotransferase e da creatina quinase total e sua isoenzima CK-BB. Ademais fragmentos do encéfalo e medula espinhal também foram colhidos para posterior avaliação histopatológica. Os resultados obtidos foram capazes de demonstrar, principalmente a origem neurológica do aumento das atividades enzimáticas liquóricas, principalmente da CK e, ainda, a correlação entre o grau... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Evaluation of the cerebrospinal fluid is an important and efficient tool in the clinical-pathologic examination of the central nervous system, helping in the diagnosis and prognosis of several disorders. However, the variables presented in the cerebrospinal fluid not always allow the detection of acute neuropathology, such as viruses. It is necessary more studies with the purpose to obtain more sensitive techniques to identify structural changes in the nervous system, as well as the evaluation and prognosis of clinical signs. Recently, the evaluation of biochemical ma rkers , such as cerebrospinal enzyme activity, lactate dehidrogenase and aspartate aminotransferase, has been used in humans. Thus, the aim of the present study is to evaluate cerebrospinal samples of dogs with canine distemper, with focus on enzymatic activity and its correlation with histopathological finding of the central nervous system. For that purpose, samples of the CSF were collected from 10 dogs clinically healthy and 20 dos presenting neurological signs of canine distemper. The samples were evaluated for color, aspect, pH, density, total protein in CSF and enzyme activities (Iactate dehidrogenase, aspartate aminotransferase and total creatine kinase and its isoenzyme CK-BB). Moreover, fragments of the brain and spinal marrow were collected for histopathological evaluation. The results were capable to demonstrate the neurological origin of the increase in CSF enzyme activities, especially of CK and also the correlation between the degree of enzyme activities and the extent of desmielinizing injury found in the central nervous system. / Doutor

Um enfoque analítico, envolvendo centrifugação diferencial de homogeneizados de cecos gástricos de Rhynchosciara americana preparados em condições brandas e vigorosas, suporta a asserção de que existe uma classe principal de aril-α- e β -glicosidases, aril-α- e β-galactosidases e celobiases que é ligada à membrana plasmática, e duas classes de maltases, aminopeptidases, carboxipeptidases e dipeptidases. Maltases ocorrem na membrana plasmática e no interior de lisossomos na forma solúvel, enquanto que as peptidases (amino-carboxi- e dipeptidase) são encontradas na membrana plasmática e citossol. A ocorrência das enzimas citadas acima na membrana plasmática das células cecais, foi confirmada por resultados obtidos em preparações de microvilosidades realizadas com técnica desenvolvida para enterocito de mamíferos. O tratamento de microvilosidades com solução hiperosmótica de Tris, seguido de centrifugação em gradiente de densidade, permitiu a separação de quatro frações de membrana e de uma fração que contém microvilosidades intactas e, provavelmente, microfilamentos isolados. Eletroferogramas do material recolhido do gradiente mostrou diferenças entre as frações de membrana e sugeriu a ocorrência de actina como componente majoritário dos microfilamentos das microvilosidades. Ensaios enzimáticos nas diferentes frações do gradiente confirmaram a ocorrência de celobiase e carboxipeptidase ligadas à membrana plasmática. Os resultados de distribuição intracelular de hidrolases nos cecos de R. americana permitiram propor que a digestão terminal de proteínas ocorre na membrana plasmática e no citossol, por ação de amino-, carboxi- e dipeptidases, enquanto que a digestão de carboidratos, com exceção da trealose, ocorre somente na superfície das microvilosidades. / An analytical approach involving differencial centrifugation of Rhynchosciara Americana midgut caeca homogenates prepared in mild and in vigorous conditions support the assumption there are one main class of aryl-α- e β-glucosidases, aryl-α - e β-galactosidases and cellobiases, which are plasma membrane bound, and two classes of maltases, aminopeptidades, carboxypeptidases and dipeptidases. Maltases, occur in plasma membrane and in lysosomes (as a soluble enzyme) and the others are found in plasma membrane and cytosol. A succeful purification of caeca cells brush-borders by tecniques used for mammal enterocytes confirmed the assumptions based on differential centrifugation data. Treatment of purified microvilli with a hyperosmotic solution of Tris, followed by density gradient centrifugation, resulted in the separation of four membrane fractions and one fraction containing intact microvilli and, probably, isolated microfilaments. Electropherograms of the material recovered from the gradient showed differences among the membrane fractions, and they permitted to propose that actin is a major component of microvilli microfilaments. Enzymatic assays in the different fractions from the gradient confirmed the occurrence of cellobiase and carboxypeptidase plasma membrana bound. The results permite to propose that the majority of the terminal digestion of proteins and carbohydrates, with the exception of trehalose, occurs on the surface of the insect midgut caeca cells microvilli.

THI1 é provavelmente uma proteína bifuncional, uma vez que está envolvida na biossíntese de tiamina e na estabilidade do DNA organelar, notadamente o mitocondrial. Interessantemente, a biossíntese de tiamina ocorre em compartimentos distintos em plantas (cloroplastos) e em leveduras (mitocôndrias). Ensaios de complementação funcional mostraram que o gene thi1 de Arabidopsis thaliana é capaz de complementar uma cepa mutante de levedura para o gene ortólogo. A proteína THI1 de Arabidopsis thaliana é codificada por um único gene. Uma análise detalhada da região N-terminal da proteína, responsável pela sua localização na células, revelou a presença de duas sequências de direcionamento adjacentes. Na extremidade N-terminal encontra-se um peptídeo de trânsito cloroplástico seguida por uma região capaz de formar uma α-hélice anfifílica, tipicamente encontrada em pré-sequências de direcionamento mitocondriais. Com o objetivo de avaliar se a localização final de THI1 pode apresentar um tipo de regulação temporal ou espacial, foram obtidas plantas transgênicas expressando a proteína THI1 fundida a GFP ("green fluorescent protein"). Análises dessas plantas por meio de microscopia confocal revelaram que THI1 está presente majoritariamente em cloroplastos e raramente em mitocôndrias. Ao contrário do que acontece em Arabidopsis thaliana, em cana de açúcar foram encontrados pelo menos três isoformas/parálogos de thi1. O alinhamento da seqüência de aminoácidos dessas isoformas com a THI1 de Arabidopsis thaliana revelou alta similaridade, inclusive na seqüência de direcionamento. Com o intuito de avaliar o padrão de direcionamento dessas isoformas de cana de açúcar foram obtidas construções gênicas contendo ou a seqüência de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito cloroplástico ou a pré-seqüência mitocondrial, fundidas a GFP sob o comando do promotor 35S. A expressão transiente dessas construções em epiderme de cebola, revelou que no caso das construções contendo a seqüência de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito, o direcionamento ocorreu apenas para os cloroplastos. No caso das construções contendo somente a seqüência de direcionamento mitocondrial a GFP permaneceu difundida no citoplasma. Além do aspecto do direcionamento, THI1 foi avaliada sob o ponto de vista filogenético. As análises filogenéticas mostram que thi1 é raramente encontrado em bactérias mas é amplamente distribuído em Archaea. As distâncias genéticas indicam que provavelmente os eucariontes herdaram thi1 de Archaea. As poucas bactérias que possuem esse gene provavelmente obtiveram-no por meio de herança horizontal. / THI1 is probably a bifunctional protein, since it is involved in thiamin biosynthesis and organelar genome stability mainly the mitochondrial. Interestingly, the thiamin biosynthesis occurs at different compartments in plants (chloroplasts) and yeasts (mitochondria). Functional complementation assays showed that Arabidopsis thaliana thi1 gene is able to complement a yeast mutant strain for the hortolog gene. The Arabidopsis thaliana THI1 is encoded by a single copy gene. A detailed analysis of the THI1 N-terminal region, that is responsible for its targeting in cells, reveled the presence of two in tanden directing sequences. At N-terminal region there is a chloroplastic transit peptide followed by a region able to form an anfifilic α-helix frequently present in mitochondrial presequences. Aiming to evaluate if the THI1 final localization could present a temporal or spacial regulation, transgenic plants expressing THI1 fused to GFP ("green fluorescent protein") where obtained. Confocal microscopy analysis of these transgenic plants showed that THI1 is mainly found in chloroplasts and barely found in mitochondrias. Different from what happens in Arabidopsis thaliana, in sugar cane where founded at least three thi1 isoforms/paralogs. The amino acids sequence alignment of these isoforms with the thi1 one, reveled high similarity including the targeting sequence. To evaluate the directing standard of these sugarcane isoforms, gene constructions made by the complete targeting sequence or the chloroplastic transit peptide or the mitochondrial presequence, fused to GFP under the guidance of 35S promotor, where obtained. A transient expression of these gene constructios in epidermal onion cells prove that in the case of the constructions containing either the complete targeting sequence or the chloroplastic transit peptide the directing occurred only to chloroplasts. On the other hand, the constructions containing the mitochondrial pre sequence, GFP were kept defused in the citoplasm. Besides the directing aspect, THI1 were evaluated under the filogenetic point of view. Filogenetic analysis showed that thi1 is rarely found in bacteria but is widely distributed in Archaea. The genetic distances pointed out that probably eucaryotes THI1 came from Archaea. This gene in a few bacterias probably were inherited by lateral transference.

Este trabalho tem como finalidade estudar e estabelecer alguns parâmetros no processo fermentativo descontínuo alimentado de uma levedura recombinante Saccharomyces cerevisiae W303-181, visando aumentar a obtenção da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Foram feitas a padronização e otimização do preparo de inóculo de S. cerevisiae recombinante. Foram três as condições estudadas. Reduziu-se o tempo de preparo do inóculo de 114 h, da primeira condição, para e 64 e 48 h para a segunda e terceira condições, respectivamente. Essas duas últimas condições mostraram-se adequados para dar continuidade com os processos fermentativos. Foi feito um estudo de otimização da concentração de micronutrientes (adenina, histidina, triptofano e uracila) no meio de cultivo usando a metodologia de superfície de resposta. Concluiu-se que, ao empregar o meio de cultivo cujas concentrações dos micronutrientes tenham sido otimizadas, a atividade específica de G6PDH atingiu 7927 U/L, 3,2 vezes maior que para o meio controle. Estudou-se a influência da constante de tempo (K), na síntese de G6PDH em processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e decrescente, utilizando meio de cultivo otimizado e não otimizado. Os valores estudados de K para vazão de alimentação exponencialmente crescente foram 0,2, 0,3, 0,5, 0,7 e 0,8 h-1 e, para a decrescente, foram 0,2, 0,5 e 0,8 h-1. Dentre os cultivos com vazão exponencialmente crescente e com meio de cultivo não otimizado, encontrou-se para K=0,2 h-1 uma atividade enzimática (558 U/L) 4,1 vezes maior que para a levedura selvagem. Dentre os cultivos nas vazões exponencialmente crescente e decrescente, encontrou-se para a vazão crescente e K=0,2 h-1 os maiores níveis de produção de G6PDH (847 U/L). Foram estudados a influência da concentração inicial de glicose e o tempo de alimentação do processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e K=0,2h-1. Verificou-se que a concentração inicial de glicose não favoreceu a formação de biomassa ou a produção de enzimas. Contudo, determina e as máximas velocidades específicas de crescimento celular e de produção de G6PDH, com as maiores velocidades correspondendo às menores concentrações iniciais. Por fim, foi estudada a influência da concentração de leucina na síntese da G6PDH e verificou-se que teores de leucina entre 0-240 mg/L não influenciaram o crescimento celular ou a produção de enzima nos cultivos estudados. / The purpose of this work is to study and to establish some parameters in the fed-batch process of a recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae, aiming to increase the production the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). The recombinant S. cerevisiae inoculum preparation was standardized and optimized. Tree methods were studied. The inoculum preparation time was reduced to 114 h, from first method, to 64 and 48 h to second and third methods, respectively. These two last methods were adequate in order to proceed with the fermentation process. It was evaluated the best micronutrients (adenine, histidine, tryptophan and uracil) concentration in the cultivation medium to produce G6PDH, using a response surface methodology. We concluded that using cultivation medium witch optimized micronutrients concentration, the G6PDH activity reach 7927 U/L, 3.2 fold higher than to not optimized medium. The influence of time constant (K) on the G6PDH synthesis was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing and decreasing feeding rates, using optimized medium cultivation and not optimized medium. The values for K at increasing rates were 0.2, 0.3, 0.5, 0.7 and 0.8 h-1, and for decreasing rates were 0.2, 0.5 and 0.8 h-1. Among K values for exponentially increasing rates with not optimized cultivation medium, K=02 h-1 shows higher G6PDH production (558U/L), 4.1 fold higher than wild yeast. Among cultivations proceeded with exponentially increasing and decreasing feeding rates and using a optimized medium, increasing rate and k=0.2 h-1 shows the higher G6PDH production (847 U/L) too. The initial glucose concentration and feeding time was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing feeding rate with K=0.2 h-1. It was verified that initial glucose concentration do not favored mass or G6PDH production. Although, it determines the maximum G6PDH production and the maximum growth rates, with higher rates at lowest initial glucose concentration. At the end, the influence of leucin at G6PDH production was evaluated. It was verified that concentrations values between 0-240 mg/L did not showed influence at cell growth or G6PDH production, at the studied cultivations.

Este trabalho tem como finalidade estudar e estabelecer alguns parâmetros no processo fermentativo descontínuo alimentado de uma levedura recombinante Saccharomyces cerevisiae W303-181, visando aumentar a obtenção da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Foram feitas a padronização e otimização do preparo de inóculo de S. cerevisiae recombinante. Foram três as condições estudadas. Reduziu-se o tempo de preparo do inóculo de 114 h, da primeira condição, para e 64 e 48 h para a segunda e terceira condições, respectivamente. Essas duas últimas condições mostraram-se adequados para dar continuidade com os processos fermentativos. Foi feito um estudo de otimização da concentração de micronutrientes (adenina, histidina, triptofano e uracila) no meio de cultivo usando a metodologia de superfície de resposta. Concluiu-se que, ao empregar o meio de cultivo cujas concentrações dos micronutrientes tenham sido otimizadas, a atividade específica de G6PDH atingiu 7927 U/L, 3,2 vezes maior que para o meio controle. Estudou-se a influência da constante de tempo (K), na síntese de G6PDH em processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e decrescente, utilizando meio de cultivo otimizado e não otimizado. Os valores estudados de K para vazão de alimentação exponencialmente crescente foram 0,2, 0,3, 0,5, 0,7 e 0,8 h-1 e, para a decrescente, foram 0,2, 0,5 e 0,8 h-1. Dentre os cultivos com vazão exponencialmente crescente e com meio de cultivo não otimizado, encontrou-se para K=0,2 h-1 uma atividade enzimática (558 U/L) 4,1 vezes maior que para a levedura selvagem. Dentre os cultivos nas vazões exponencialmente crescente e decrescente, encontrou-se para a vazão crescente e K=0,2 h-1 os maiores níveis de produção de G6PDH (847 U/L). Foram estudados a influência da concentração inicial de glicose e o tempo de alimentação do processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e K=0,2h-1. Verificou-se que a concentração inicial de glicose não favoreceu a formação de biomassa ou a produção de enzimas. Contudo, determina e as máximas velocidades específicas de crescimento celular e de produção de G6PDH, com as maiores velocidades correspondendo às menores concentrações iniciais. Por fim, foi estudada a influência da concentração de leucina na síntese da G6PDH e verificou-se que teores de leucina entre 0-240 mg/L não influenciaram o crescimento celular ou a produção de enzima nos cultivos estudados. / The purpose of this work is to study and to establish some parameters in the fed-batch process of a recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae, aiming to increase the production the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). The recombinant S. cerevisiae inoculum preparation was standardized and optimized. Tree methods were studied. The inoculum preparation time was reduced to 114 h, from first method, to 64 and 48 h to second and third methods, respectively. These two last methods were adequate in order to proceed with the fermentation process. It was evaluated the best micronutrients (adenine, histidine, tryptophan and uracil) concentration in the cultivation medium to produce G6PDH, using a response surface methodology. We concluded that using cultivation medium witch optimized micronutrients concentration, the G6PDH activity reach 7927 U/L, 3.2 fold higher than to not optimized medium. The influence of time constant (K) on the G6PDH synthesis was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing and decreasing feeding rates, using optimized medium cultivation and not optimized medium. The values for K at increasing rates were 0.2, 0.3, 0.5, 0.7 and 0.8 h-1, and for decreasing rates were 0.2, 0.5 and 0.8 h-1. Among K values for exponentially increasing rates with not optimized cultivation medium, K=02 h-1 shows higher G6PDH production (558U/L), 4.1 fold higher than wild yeast. Among cultivations proceeded with exponentially increasing and decreasing feeding rates and using a optimized medium, increasing rate and k=0.2 h-1 shows the higher G6PDH production (847 U/L) too. The initial glucose concentration and feeding time was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing feeding rate with K=0.2 h-1. It was verified that initial glucose concentration do not favored mass or G6PDH production. Although, it determines the maximum G6PDH production and the maximum growth rates, with higher rates at lowest initial glucose concentration. At the end, the influence of leucin at G6PDH production was evaluated. It was verified that concentrations values between 0-240 mg/L did not showed influence at cell growth or G6PDH production, at the studied cultivations.