Resumo: Entre agosto de 2005 e dezembro de 2006, foram obtidas 245 estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de amostras de leite de vacas com mastite, de óstios papilares da glândula mamária e de insufladores da ordenhadeira, procedentes de um rebanho bovino produtor de leite tipo B. Com a finalidade de monitorar as estirpes de S. aureus envolvidas em casos de mastite bovina por meio da verificação da relação epidemiológica existente entre as estirpes isoladas, especialmente com vistas aos sítios de localização e vias de transmissão, as estirpes foram submetidas à Eletroforese de Campo Pulsado (PFGE), à amplificação das seqüências codificadoras (sea, seb, sec, sed e tst), por intermédio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), e suas sensibilidades in vitro a 12 antimicrobianos foram determinadas. Os resultados obtidos revelaram 51 diferentes perfis, sendo que a resistência à penicilina foi a predominante entre as 179 (73,1%) estirpes de S. aureus, quando considerada de forma particular (54,8%) ou em conjunto (29,4%). As 66 (26,9%) estirpes restantes foram sensíveis aos 12 antimicrobianos testados e a vancomicina foi o único princípio ativo que se mostrou eficiente a 100% das estirpes testadas. A PFGE revelou 39 pulsotipos distintos, dos quais 25 (64,1%) encontraram-se distribuídos nas 137 (55,9%) estirpes obtidas do leite. Dentre estas, 92 (67,1%) estirpes apresentaram resistência a um ou mais antimicrobianos e foram agrupadas em 22 (88,0%) pulsotipos distintos. Foi observado, também, por meio da PFGE, que nenhum pulsotipo foi isolado por mais de três colheitas consecutivas e que somente o pulsotipo 29 foi identificado em 5 (31,2%) colheitas...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Two hundred and forty five Staphylococcus aureus strains were isolated between August of 2005 and December of 2006 from samples collected from a type-B milk-producing herd. Samples encompassed milk collected directly from mastitic cows, papillas osteuns of mammary glands, and milking machine cups. Samples were subjected to Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) to monitor for the strains of S. aureus and to determine epidemiologic relationships between the isolated strains, taking into account the different precedence of strains. PFGE was used to monitor the presence of specific coding sequences (i.e., sea, seb, sec, sed, and tst) in the milk samples using polymerase chain reaction (PCR) amplification. Moreover, sensitivity of strains to 12 different antibiotics was determined in vitro. Results revealed the presence of 51 different PFGE profiles of S. aureus in the samples, and highlighted 179 (73.1%) penicillin resistant strains. Nonetheless, the 66 (26.9%) other strains were sensitive to all 12 antibiotics tested, and vancomycin was the only antibiotic effective against all tested strains. PFGE also revealed 39 distinct peaks with 25 of them (64.1%) being present in 137 (55.9%) strains obtained from milk. Of these strains, 92 (67.1%) were resistant to one or more antibiotics, and were further grouped in 22 (88.0%) distinct peaks. Additionally, PFGE revealed the presence of no distinct peaks in samples from three consecutive collection times, and that peak 29 was the only one identified in 5 collection times (31.2%). Importantly, PGFE also indicated that in the periods A and H, which corresponded to 12.5% of the total time points, the isolated strains from one collection day (samples from all 3 sources) all had the peaks 2 and 12, respectively...(Complete abstract, click electronic access below) / Orientador: Antonio Nader Filho / Coorientador: Luiz Francisco Zafalon / Banca: Carlos Augusto Fernande de Oliveira / Banca: Naiá Carla Marchi de Rezende Lago / Banca: Paulo Francisco Domingues / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Doutor

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-04-29T22:13:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EstudoEpidemiologicoRaiva.pdf: 3260682 bytes, checksum: a2d12dc75b62cf4e5fe5835a33be65dd (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-05-02T14:33:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EstudoEpidemiologicoRaiva.pdf: 3260682 bytes, checksum: a2d12dc75b62cf4e5fe5835a33be65dd (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-02T14:33:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EstudoEpidemiologicoRaiva.pdf: 3260682 bytes, checksum: a2d12dc75b62cf4e5fe5835a33be65dd (MD5) Previous issue date: 2009 / Com o objetivo de avaliar a epidemiologia da raiva, procedimentos complementares ao diagnóstico - caracterização antigênica e genética - foram incluídos neste estudo para investigar o perfil epidemiológico da raiva animal na Amazônia brasileira, entre janeiro de 2000 e julho de 2009. Foi realizada uma revisão cuidadosa das informações de amostras do sistema nervoso central (SNC) recebidas e analisadas no Laboratório de Raiva do Instituto Evandro Chagas. Um total de 265 cepas de vírus rábico isoladas de amostras do SNC de seres humanos (n=33) e animais domésticos/silvestres (n=232) foram caracterizadas antigenicamente por imunofluorescência indireta (IFI), utilizando um painel de oito anticorpos monoclonais preparados pelo CDC contra a nucleoproteína do vírus da raiva; Além disso, 21 delas tiveram a nucleoproteína (gene N) caracterizada geneticamente por sequenciamento nucleotídico parcial seguida de análise filogenética. As sequências obtidas foram comparadas entre si e com outras sequências de vírus da raiva do Brasil e outros países das Américas, utilizando os métodos de máxima verossimilhança e bayesiano. Foi observada uma menor transmissão do vírus da raiva em áreas urbanas; detecção do ciclo rural da raiva em quase todos os estados da Amazônia; ocorrência do ciclo aéreo nos estados do Pará e Amapá; identificação da variante antigênica 2 (AgV2) do vírus da raiva, entre cães e gatos domésticos como o principal mecanismo de transmissão viral, detecção de circulação de variantes antigênicas AgV3, AgV4 e variante "Eptesicus" entre animais silvestres e, finalmente, a redução da transmissão cão-homem do vírus da raiva, que foi substituído por um aumento da transmissão morcego-homem, especialmente no estado de Pará. Em conclusão, a associação de técnicas antigênica e moleculares permitiu uma melhor compreensão da epidemiologia molecular do vírus da raiva na Amazônia Brasileira. / Aiming to evaluate the epidemiology of rabies, new diagnostic procedures – antigenic and genetic characterization - were included in this study to investigate the epidemiologic profile of animal rabies in the Brazilian Amazon region, between January 2000 and July 2009. A careful revision of information of Central Nervous System (CNS) samples received and examined at Rabies Laboratory of Instituto Evandro Chagas was performed. A total of 265 rabies virus strains isolated from CNS samples of humans (33) and domestic/sylvatic animals (232) were antigenically characterized by indirect immunofluorescent assay (IFA) using a panel of eight monoclonal antibodies against the rabies virus nucleoprotein produces by the CDC; moreover, from 21 of them the nucleoprotein (gene N) was partially characterized by nucleotide sequencing followed by phylogenetic analyzes. Obtained sequences were compared internally and with other rabies virus sequences from Brazil and other American countries, using the Bayesian and maximum likelihood methods. It was observed a lower transmission of rabies virus in urban areas; the detection of the rural cycle of rabies in almost all Amazonian states; the occurrence of aerial rabies cycle in Pará and Amapá states; identification of rabies virus variant 2 (AgV2) among domestic dogs and cats as the main viral transmission mechanism; detection of circulating antigenic variants AgV3, AgV4 and “Eptesicus” variant in sylvan animals; and finally, reduction of dog-to-man transmission of rabies virus which was replaced by an increasing of bat-to-man transmission cycle, especially in Pará state. In conclusion, the association of antigenic and molecular techniques resulted in a better understanding of rabies molecular epidemiology in the Amazon region.

O gênero Pestivirus da família Flaviviridae, compreende vírus de genoma RNA fita simples e polaridade positiva que comumente estão associados a infecções em ruminantes e suídeos. Possui quatro espécies reconhecidas: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2, o vírus da doença da fronteira (BDV) e o vírus da peste suína clássica (CSFV). Além disso, possui possíveis espécies atípicas, sendo o vírus ‘HoBi’-like a mais reconhecida na literatura. Com o objetivo de gerar mais informações acerca da epidemiologia molecular de pestivírus no País e dos mecanismos na evolução de vírus do gênero, o presente trabalho será apresentado sob a forma de seis artigos científicos. Os trabalhos visam a caracterização de pestivírus detectados em bovinos e javalis no Rio Grande do Sul, a identificação de cepas resultantes de provável recombinação homóloga, a análise das variantes virais intrahospedeiro (quasispécies) de animais infectados pelo vírus ‘HoBi’-like, e a comparação da multiplicação in vitro de diferentes cepas de pestivírus em cultivos celulares oriundos de diferentes raças bovinas. No primeiro trabalho, amostras de soro bovino de animais do Rio Grande do Sul foram obtidas junto ao serviço veterinário oficial e submetidas a RT-PCR para detecção de pestivírus seguida de sequenciamento e análise filogenética das amostras positivas, onde 57,6% foram classificadas como BVDV-1 e 42,4% como BVDV-2, sendo constada frequência elevada de BVDV-2 quando comparada a outras regiões no mundo. No segundo trabalho, 40 amostras de javalis cativos obtidas de abatedouro foram testadas utilizando metodologia semelhante a anteriormente mencionada, e foi possível a detecção de uma amostra positiva, que foi classificada como BVDV-2, sendo a primeira evidência molecular do BVDV em javalis na literatura. No terceiro artigo científico, foi pesquisado a ocorrência de recombinação homóloga, utilizando metodologia in silico, em sequências de pestivírus presentes em banco de dados públicos, onde foram descritos novos possíveis eventos de recombinação entre BVDV-1a e BVDV-1b, BVDV-2a e BVDV-2b e CSFV-2.2 com outro genogrupo indefinido. No quarto e quinto trabalhos, animais persistentemente infectados com o vírus ‘HoBi’-like foram gerados experimentalmente e, utilizando RT-PCR seguida de clonagem, sequenciamento e análises in silico, a composição e variações intrahospedeiro das quasispécies virais em circulação foram avaliadas, onde foi possível observar que características individuais do hospedeiro são importantes na seleção de variantes virais e que a nuvem de mutantes aumenta com o passar do tempo, não havando quasispécie dominante. Por fim, no sexto artigo científico, a multiplicação de cepas de BVDV-1a e 1b, BVDV-2a e vírus ‘HoBi’-like foram avaliadas in vitro em células de cultivo primário obtidas de gado europeu, zebuíno e raça mista e comparadas utilizando modelos estatísticos, onde foi possível a observação de ausência de diferenças entre as raças (P=0,88), mas presença de diferença entre indivíduos da mesma raça (P˂0,05). Os resultados aqui apresentados somam informações acerca da epidemiologia molecular, biologia e evolução dos pestivírus, sendo importantes para embasar futuras campanhas de controle e erradicação das doenças causadas por pestivírus. / The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, comprises single stranded RNA-viruses that are commonly associated with infections in ruminants and swine. It has four recognized species: bovine viral diarrhea virus 1 (BVDV-1), BVDV-2, border disease virus (BDV) and classical swine fever virus (CSFV). It also has putative atypical species where the ‘HoBi’-like virus is the most highlighted in the literature. In order to generate more information about molecular epidemiology of pestiviruses and important mechanisms in the evolution of the virus genus, this work will be presented in six scientific articles form. The works aimed in the characterization of pestivirus detected in cattle and wild boar in Rio Grande do Sul state, identification of strains resulting from putative homologous recombination, analysis of intrahost viral variants (quasispecies) of animals infected with ‘HoBi’-like viruses, and the comparison of in vitro growth of different pestivirus strains in cell cultures derived from different cattle breeds. In the first study, bovine serum samples of cattle from Rio Grande do Sul state were collected by the official veterinary service and submitted to RT-PCR for detection of pestivirus followed by DNA sequencing and phylogenetic analysis of the positive samples, where 57.6% were classified as BVDV-1 and 42.4% as BVDV-2, which revealed high frequency of BVDV- 2 when compared to other regions worldwide. In the second work, 40 captive wild boar lung samples obtained from slaughterhouse were tested using similar methodology described above, and one sample resulted positive and was classified as BVDV-2, which represented the first molecular evidence of BVDV in wild boars. In the third scientific article, the occurrence of homologous recombination was investigated using in silico methods applied to sequences available in public databases, which are described putative new events between BVDV-1a and BVDV-1b, BVDV-2a and 2b and CSFV-2.2 and undetermined genogroup. In the fourth and fifth studies, animals persistently infected with the ‘HoBi’-like viruses were experimentally generated and using RT-PCR followed by cloning, sequencing and in silico analysis, the composition and intrahost variations of viral quasispecies in circulation were evaluated, where it was observed that individual characteristics of the host are important in the selection of viral variants and the mutant clouds increased overtime. Finally, in the sixth scientific article, the growth of BVDV-1a and 1b, and BVDV-2b, ‘HoBi’-like virus strains were evaluated in vitro using primary cell cultures obtained by taurine, indicine and mixed breed cattle using statistical models, it was possible to observe the absence of differences between cattle breeds (P=0.88), but presence of difference between individuals within the breed (P˂0.05). The results presented herein add information about the molecular epidemiology, biology and evolution of pestiviruses, being important to support future control and eradication programs of diseases caused by pestiviruses.

O Herpesvírus 8 humano (HHV-8) é endêmico em populações africanas e indígenas da região Amazônica. A infecção nestas populações acontece durante a infância e, na África, envolve o contato íntimo no ambiente intrafamiliar. Diversos estudos confirmam a distribuição geográfica dos diferentes subtipos de HHV-8, sendo que o subtipo E é típico das populações indígenas. Objetivos: 1. Caracterizar o(s) subtipo(s) de HHV-8 que circula(m) em população indígena da Amazônia brasileira baseado na análise da região ORF K1 do vírus; 2. Construir a árvore filogenética dos subtipos virais encontrados; 3. Comparar filogeneticamente os subtipos encontrados com os subtipos prevalentes em outras populações indígenas do Brasil e de outros países da América do Sul; 4. Calcular a taxa de substituição para a região VR1 do HHV-8 para as amostras estudadas; 5. Estimar a data de entrada do vírus na população do estudo; 6. Investigar a dinâmica de transmissão do vírus no ambiente intrafamiliar; 7. Averiguar se há correlação entre os alelos de HLA classe I (A e B) e II (DQB1 e DRB1) e suscetibilidade à infecção por HHV-8. Casuística e métodos: Estudo de soroprevalência da infecção por HHV-8 em amostra de população indígena da Amazônia brasileira utilizando IFI para detecção de antígenos da fase latente (LANA) e lítica (Lítico) do vírus. Análise filogenética da amostras encontradas utilizando-se o DNA/HHV-8 extraído de amostras de saliva, submetidas à reação de nested PCR para amplificar as regiões hipervariáveis VR1 e VR2. Cálculo da taxa de substituição do HHV-8, utilizando-se os métodos de distância e técnica bayesiana. Estimar a data do ancestral comum mais recente para as amostras em estudo, utilizando-se o programa BEAST. Tipagem de HLA de indivíduos positivos e negativos para a infecção por HHV-8, utilizando-se a técnica de PCR-SSO. Resultados: A soroprevalência geral da infecção por HHV-8 na população em estudo foi de 75,3% (399/530). Observou-se que a soropositividade dos filhos está correlecionada com a soropositividade materna. O único subtipo viral encontrado foi o subtipo E. A taxa de substituição de nucleotídeos do HHV-8 utilizando a região VR1 foi da ordem de 6x10-4 substituições por sítio por ano (s/s/a). Ao analisar todas as seqüências estudadas o ancestral comum mais recente está em torno de 138 anos. Não houve correlação entre a susceptibilidade à infecção por HHV-8 e alelos de HLA classe I ou II. Conclusões: A população estudada é endêmica para a infecção por HHV-8. A infecção ocorre principalmente na infância, por via horizontal não-sexual, e a transmissão se dá provavelmente pela saliva. Assim como em outras populações endêmicas da África, a soropositvidade dos filhos está correlacionada com a soropositividade das mães. Confirmando achados anteriores, o único subtipo do HHV-8 circulante na população estudada, foi o subtipo E. Nossos dados sugerem que a região do gene VR1 do HHV-8 evolui com uma taxa de 6x10-4 substituições por sítio por ano (s/s/a), e que o ancestral comum mais recente do vírus, a partir das amostras analisadas está em torno de 138 anos. Os dados sugerem, também, que não há correlação entre a susceptibilidade à infecção por HHV-8 e os alelos de HLA classe I ou II. / The human herpesvirus 8 (HHV-8) is endemic in Africa and Amerindian populations from Amazon region. The infection in those populations occurs during childhood and, in Africa, involves a close contact in intrafamilial environment. Several studies confirm the geographical distribution of different subtypes of HHV-8, and the subtype E is typical of the Amerindian population. Objectives: 1. To characterize the HHV-8 subtypes circulating in Amerindian population from Brazilian Amazon, based on the analysis of ORF K1 region of the virus. 2. To construct a phylogenetic tree of viral subtypes found among Amerindians 3. To compare by phylogenetic methods the subtypes found in Mapuera Amerindians with the subtypes prevalent in others Amerindians populations of Brazil and South America 4. To determine the substitution rate of VR1 region of HHV-8 for the sequences obtained in the present study 5. To estimate the date of entry of the viruses in the Mapuera population 6. To investigate the dynamic of transmission of the virus in the intrafamilial environment 7. To investigate if there is a correlation between susceptibility to HHV-8-infection and HLA class I (A and B) and II (DQB1 and DRB1) alleles. Patients and methods: The seroprevalence of HHV-8 infection in a sample of the indigenous population of the Brazilian Amazon was carried out using IFA to detect antibodies to latent (LANA) and lytic phase antigens of HHV-8. Phylogenetic analysis of the sequences was performed by using the DNA extracted from samples of saliva, using a nested PCR to amplify the hypervariable regions VR1/ VR2 of HHV-8. Estimation of the substitution rate of HHV-8 nucleotides was performed by using the method of distance and the Bayesian technique. Estimates of the time of the most recent common ancestor (TMRCA) for all samples studied were done by using the BEAST program. HLA typing of positive and negative subjects for HHV-8 infection was performed by using the PCR-SSO technique. Results: The overall HHV-8 seroprevalence was 75.3% (399/530). There was a positive correlation between soropositivity of children and maternal seropositivity. The only viral subtype found was subtype E. The substitution rate of HHV-8 using the VR1 region was estimated around 6x10-4 substitutions per site per year (s / s / y). By using this rate of substitution, the TMRCA of the Mapuera viruses sequences was estimated to be around 138 years. There was no correlation between susceptibility to HHV-8-infection and HLA class I or II alleles. Conclusions: The population studied is endemic for HHV-8 infection. The infection occurs mainly in childhood, by horizontal, nonsexual transmission, probably by saliva. As in endemic populations of Africa, the soropositvity of children is positively correlated with the seropositivity of the mothers. In agreement with previous reports, the subtype E was the only HHV-8 subtype found in Mapuera Amerindians. Our data suggest that the VR1 gene region of HHV-8 evolves with a rate of 6x10-4 substitutions per site per year (s / s / y), which results in a time of the most recent common ancestor for Mapuera HHV-8 sequences of 138 years. There was no correlation between susceptibility to HHV-8-infection and HLA class I or II alleles.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-12-03T17:48:36Z No. of bitstreams: 1 frederico_m_r_silva_ioc_bcm_0032_2005.pdf: 983631 bytes, checksum: c53725cd06ca616bc0df79ce5088aa9f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-03T17:48:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 frederico_m_r_silva_ioc_bcm_0032_2005.pdf: 983631 bytes, checksum: c53725cd06ca616bc0df79ce5088aa9f (MD5) Previous issue date: 2005 / Universidade Estácio de Sá. Campus Arcos da Lapa. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / No Brasil, apenas uma cepa disseminada, o clone epidêmico brasileiro (BEC) de MRSA, foi amplamente caracterizada, apresentando o cassete estafilocócico de resistência à meticilina (SCCmec) IIIA de 67 Kb e multirresistência antibiótica. Entretanto, novos clones de MRSA não-multirresistentes com alta virulência têm sido descritos em infecções comunitárias e hospitalares em vários países. Estes clones abrigam SCCmec curtos, com cerca de 24 Kb, portanto mais eficiente na transferência, replicação e tradução. Este estudo objetiva descrever o background genético dos clones de S. aureus envolvidos em infecções no Rio de Janeiro/RJ. Foram coletadas 139 amostras de S. aureus (54 MRSA), isoladas de pacientes de sete hospitais e de um laboratório de patologia clínica. As amostras foram submetidas a análises moleculares por diversos métodos. Com a análise por Multilocus Restriction Fragment Typing (MLRFT), caracterização do tipo de SCCmec e a presença de genes para leucocidina Panton-Valentine (PVL), juntamente com o perfil de resistência antimicrobiana, definiu-se 37 cepas representativas que foram posteriormente submetidos ao sequenciamento por Multilocus Sequence Typing (MLST) e caracterizados por Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). A combinação de todas as abordagens permitiu o agrupamento dos isolados em 22 grupos clonais. O genótipo prevalente correspondeu à cepa nosocomial MRSA/BEC e foi caracterizada pelo RTF-BAAACAC / Sequence Type (ST) 239/SCCmec IIIA / Pulsotipo A / PVL negativo / multirresistência antibiótica. Outros 5 grupos clonais apresentaram cepas de MSSA e MRSA não-MDR com SCCmecs curtos. Quinze RFTs apresentaram somente cepas de MSSA com grande diversidade genotípica entre si, sendo 27,4% dessas PVL-positivas. Algumas cepas MRSA não-MDR PVL-positivas foram agrupadas em dois genótipos: RFT-AAAAAAA (ST-1) e RFT–BBBBBAB (ST-30), com SCCmec IVa e IV, respectivamente. Essas são características de clones comunitários disseminados pelo mundo, porém foram encontradas em MRSA hospitalares. De forma interessante, amostras pertencentes ao ST-30 foram identificadas como de origem hospitalar. Entretanto, um isolado foi derivado de infecção comunitária, demonstrando compartilhamento de cepas entre comunidade e hospital. A presença de SCCmecs curtos em cepas MRSA não-MDR direciona à possível emergência de novos clones resistentes. Os perfis heterogêneos de MRSA encontrados no Brasil reforçam a dinâmica da estrutura genética populacional deste patógeno e a importância de procedimentos de tipagem molecular para definir as relações entre isolados nosocomiais e comunitários. / In Brazil, a solely strain has been found disseminated, the Brazilian Epidemic Clone (BEC) of MRSA, was detected, characterized by the presence of a 67Kb staphylococcal chromosomal cassette of methicillin resistance (SCCmec) IIIA and antibiotic multiresistance. However, new non-multiresistant highly virulent MRSA strains have been described in community and nosocomial infections in several countries. These clones harbor a smaller SCCmec of around 24Kb and therefore more efficient in transferring, replication and translation. This study aim to describe the genetic background of S. aureus clones associated to infections in Rio de Janeiro/RJ. One hundred and thirty nine S. aureus samples were collected (54 MRSA isolates) from patients from seven hospitals and from a clinical pathology laboratory. These samples were submitted to molecular analyses by several methods. Multilocus Restriction Fragment Typing (MLRFT), SCCmec typing and the presence of the Panton-Valentine Leucocidin (PVL) genes, in association with the antimicrobial resistance profile, defined 37 representative isolates that were further submitted to DNA sequencing by Multilocus Sequence Typing (MLST) and also characterized by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). The combination of all approaches allowed the clustering of the isolates into 22 clonal groups. The most prevalent genotype corresponded to MRSA/BEC nosocomial strain and was characterized as RFT-BAAACAC, Sequence Type (ST) 239, SCCmec IIIA, Pulsotype A, PVL-negative and antibiotic multiresistance. The other 5 clonal groups presented MSSA and non-MDR MRSA strains with smaller SCCmecs. Fifteen RFTs presented only MSSA strains with large genotypic diversity being 27,4% of the MSSA samples PVL-positives. Some PVL-positive non-MDR MRSA strains were clustered into two genotypes: RFT-AAAAAAA (ST-1) and RFT–BBBBBAB (ST-30), with SCCmec IVa and IV, respectively. These are characteristics of community isolates worldwide disseminated, however they are found in nosocomial MRSA strains. Notably, in this study, samples characterized as ST-30 was identified, in its majority, from hospital origin. However, an isolate was derived from community infection, depicting sharing among community and hospital settings. The presence of shorter SCCmecs in non-MDR MRSA strains leads to the posible emergence of new resistant clones. The heterogeneous MRSA profiles found in Brazil reinforce the dynamics of the genetic population structure of this pathogen and the importance of molecular typing procedures to define the relationship among nosocomial and community strains.

Made available in DSpace on 2014-08-26T17:15:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 137.pdf: 791646 bytes, checksum: 39acf8b8b6ba9b68e5a239ea71e51227 (MD5) Previous issue date: 2006 / A raiva é uma das doenças mais temidas entre as diferentes zoonoses que ameaçam o Homem, pois evolui sempre para o êxito letal, sendo, na prática, sua morbidade igual à mortalidade. Acrescem-se ainda os prejuízos econômicos, causados ao rebanho bovino nos focos de raiva epizoótica, seu impacto geral na economia pecuária, reduzindo a produção de leite e carne, e suas implicações na área de Saúde Pública. Através da utilização de técnicas clássicas e moleculares, o presente estudo, visou estudar a diversidade molecular das amostras de vírus da raiva provenientes de animais domésticos e silvestres que atualmente são identificadas nas diferentes regiões do Brasil (Norte, Nordeste, Sudeste, Sul e Centro-Oeste), comparando-as entre si e entre amostras originárias de um município do Estado do Rio de Janeiro (Porciúncula), com base em seqüenciamento do gene codificador da nucleoproteína. A técnica de RT-PCR foi aplicada em 32 amostras de tecido nervoso oriundo de animais suspeitos de estarem acometidos pela raiva, demonstrando 100% de concordância com os resultados apresentados pelas provas clássicas, permitindo diagnóstico positivo inclusive em amostras que se apresentam em estado de putrefação. Treze das amostras de vírus isoladas foram parcialmente seqüenciadas, tendo sido encontrado formação dos principais grupos esperados de amostras de vírus da raiva, ou seja, variante antigênica 2,3, amostras fixas e variante de vírus de raiva de sagüi. Foi evidenciado, ainda, um padrão regional de distribuição de vírus da raiva associado à variante antigênica 3. A obtenção de dados derivados do seqüenciamento vem a permitir um melhor entendimento da diversidade molecular das amostras de vírus da raiva circulantes nas regiões em estudo, representando um passo fundamental para a geração de informações a serem utilizadas na epidemiologia molecular da raiva, determinando fontes de infecção, origens de surtos e relações genéticas geográficas entre os vírus da raiva detectados a partir de diferentes espécies animais. / Rabies is one of the most feared zoonosis, once it always results in the death of the affected patient, what makes rabies morbidity equal to its mortality. Furthermore, economic losses due to rabies epidemics in cattle, the economic impact in agrobusiness derived from decreased milk and meat production and implications in public health must also to be taken into account. Using classic and traditional techniques, the present research aimed to study the molecular diversity of rabies virus strains from domestic and wild animals that circulate in different Brazilian regions (North, Northeastern, Southeastern, South and Center-Western) comparing the strains amongst them and with strains from a municipality from Rio de Janeiro State (Porciúncula) based on the gene coding for the nucleoprotein. The RT-PCR was applied to 32 samples of central nervous system tissue of rabies-suspected animals, showing an agreement of 100% with the classic tests, allowing a positive diagnosis even in decomposed samples. Thirteen out of these 32 samples were submitted to partial sequencing resulting in the expected groups of rabies virus variants, i. e., antigenic variants 2, 3, fixed strains and marmoset strains. A regional pattern was found regarding the variant 3 of rabies virus. Data obtained from DNA sequencing allow a better understanding of the molecular diversity of the rabies virus strains circulating in the regions under study, a fundamental step for the generation of information to be used in the molecular epidemiology of rabies, as the determination of sources of infection, origins of outbreaks and phylogeographic relationships among rabies virus strains from different species.

O gênero Pestivirus da família Flaviviridae, compreende vírus de genoma RNA fita simples e polaridade positiva que comumente estão associados a infecções em ruminantes e suídeos. Possui quatro espécies reconhecidas: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2, o vírus da doença da fronteira (BDV) e o vírus da peste suína clássica (CSFV). Além disso, possui possíveis espécies atípicas, sendo o vírus ‘HoBi’-like a mais reconhecida na literatura. Com o objetivo de gerar mais informações acerca da epidemiologia molecular de pestivírus no País e dos mecanismos na evolução de vírus do gênero, o presente trabalho será apresentado sob a forma de seis artigos científicos. Os trabalhos visam a caracterização de pestivírus detectados em bovinos e javalis no Rio Grande do Sul, a identificação de cepas resultantes de provável recombinação homóloga, a análise das variantes virais intrahospedeiro (quasispécies) de animais infectados pelo vírus ‘HoBi’-like, e a comparação da multiplicação in vitro de diferentes cepas de pestivírus em cultivos celulares oriundos de diferentes raças bovinas. No primeiro trabalho, amostras de soro bovino de animais do Rio Grande do Sul foram obtidas junto ao serviço veterinário oficial e submetidas a RT-PCR para detecção de pestivírus seguida de sequenciamento e análise filogenética das amostras positivas, onde 57,6% foram classificadas como BVDV-1 e 42,4% como BVDV-2, sendo constada frequência elevada de BVDV-2 quando comparada a outras regiões no mundo. No segundo trabalho, 40 amostras de javalis cativos obtidas de abatedouro foram testadas utilizando metodologia semelhante a anteriormente mencionada, e foi possível a detecção de uma amostra positiva, que foi classificada como BVDV-2, sendo a primeira evidência molecular do BVDV em javalis na literatura. No terceiro artigo científico, foi pesquisado a ocorrência de recombinação homóloga, utilizando metodologia in silico, em sequências de pestivírus presentes em banco de dados públicos, onde foram descritos novos possíveis eventos de recombinação entre BVDV-1a e BVDV-1b, BVDV-2a e BVDV-2b e CSFV-2.2 com outro genogrupo indefinido. No quarto e quinto trabalhos, animais persistentemente infectados com o vírus ‘HoBi’-like foram gerados experimentalmente e, utilizando RT-PCR seguida de clonagem, sequenciamento e análises in silico, a composição e variações intrahospedeiro das quasispécies virais em circulação foram avaliadas, onde foi possível observar que características individuais do hospedeiro são importantes na seleção de variantes virais e que a nuvem de mutantes aumenta com o passar do tempo, não havando quasispécie dominante. Por fim, no sexto artigo científico, a multiplicação de cepas de BVDV-1a e 1b, BVDV-2a e vírus ‘HoBi’-like foram avaliadas in vitro em células de cultivo primário obtidas de gado europeu, zebuíno e raça mista e comparadas utilizando modelos estatísticos, onde foi possível a observação de ausência de diferenças entre as raças (P=0,88), mas presença de diferença entre indivíduos da mesma raça (P˂0,05). Os resultados aqui apresentados somam informações acerca da epidemiologia molecular, biologia e evolução dos pestivírus, sendo importantes para embasar futuras campanhas de controle e erradicação das doenças causadas por pestivírus. / The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, comprises single stranded RNA-viruses that are commonly associated with infections in ruminants and swine. It has four recognized species: bovine viral diarrhea virus 1 (BVDV-1), BVDV-2, border disease virus (BDV) and classical swine fever virus (CSFV). It also has putative atypical species where the ‘HoBi’-like virus is the most highlighted in the literature. In order to generate more information about molecular epidemiology of pestiviruses and important mechanisms in the evolution of the virus genus, this work will be presented in six scientific articles form. The works aimed in the characterization of pestivirus detected in cattle and wild boar in Rio Grande do Sul state, identification of strains resulting from putative homologous recombination, analysis of intrahost viral variants (quasispecies) of animals infected with ‘HoBi’-like viruses, and the comparison of in vitro growth of different pestivirus strains in cell cultures derived from different cattle breeds. In the first study, bovine serum samples of cattle from Rio Grande do Sul state were collected by the official veterinary service and submitted to RT-PCR for detection of pestivirus followed by DNA sequencing and phylogenetic analysis of the positive samples, where 57.6% were classified as BVDV-1 and 42.4% as BVDV-2, which revealed high frequency of BVDV- 2 when compared to other regions worldwide. In the second work, 40 captive wild boar lung samples obtained from slaughterhouse were tested using similar methodology described above, and one sample resulted positive and was classified as BVDV-2, which represented the first molecular evidence of BVDV in wild boars. In the third scientific article, the occurrence of homologous recombination was investigated using in silico methods applied to sequences available in public databases, which are described putative new events between BVDV-1a and BVDV-1b, BVDV-2a and 2b and CSFV-2.2 and undetermined genogroup. In the fourth and fifth studies, animals persistently infected with the ‘HoBi’-like viruses were experimentally generated and using RT-PCR followed by cloning, sequencing and in silico analysis, the composition and intrahost variations of viral quasispecies in circulation were evaluated, where it was observed that individual characteristics of the host are important in the selection of viral variants and the mutant clouds increased overtime. Finally, in the sixth scientific article, the growth of BVDV-1a and 1b, and BVDV-2b, ‘HoBi’-like virus strains were evaluated in vitro using primary cell cultures obtained by taurine, indicine and mixed breed cattle using statistical models, it was possible to observe the absence of differences between cattle breeds (P=0.88), but presence of difference between individuals within the breed (P˂0.05). The results presented herein add information about the molecular epidemiology, biology and evolution of pestiviruses, being important to support future control and eradication programs of diseases caused by pestiviruses.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O Cryptosporidium é um parasito coccídeo reconhecido por causar diarréia em humanos e animais em todo o mundo. O gênero compreende pelo menos 20 espécies confirmadas, sendo o C. hominis e C. parvum as principais espécies causadoras de criptosporidiose em humanos. Ferramentas moleculares têm sido desenvolvidas para detectar e diferenciar espécies/genótipos e subgenótipos de Cryptosporidium. O objetivo do trabalho foi avaliar a heterogeidade molecular de Cryptosporidium sp. obtidos de amostras clínicas provenientes dos municípios do Rio de Janeiro e de Salvador, através da PCR em tempo real e seqüenciamento automático. Foram analisadas 85 amostras, distribuídas em 3 grupos distintos, sendo 45 delas do município do Rio de Janeiro e 40 amostras provenientes de Salvador, Bahia. Todas as amostras foram positivas para Cryptosporidium sp. pelo método de coloração de Kinyoun a frio. O ensaio da PCR em tempo real combinou uma reação multiplex para a detecção do gênero Cryptosporidium e da espécie C. parvum e uma reação simples para a detecção de C. hominis. Na detecção do gênero Cryptosporidium foram utilizados par de primers e uma sonda TaqMan desenhados a partir do alinhamento de seqüências conservadas do gene 18S rRNA de várias espécies de Cryptosporidium disponíveis no GenBank. Para a detecção das espécies C. parvum e C. hominis foram utilizados primers e sondas específicos obtidos a partir de seqüências de cada espécie disponíveis no GenBank. A detecção do gênero Cryptosporidium através da sonda 18S rRNA, na reação duplex, foi visualizada em 63 de 85 amostras totais. Destas, a sonda TaqMan específica para C. parvum detectou 6 amostras e a sonda TaqMan específica para C. hominis detectou 42 amostras. Quinze amostras não puderam ser detectadas pelas sondas C. hominis ou C. parvum. Nos ensaios da PCR para o gene 18S, 31 amostras foram positivas e 27 delas sequenciadas. As análises filogenéticas confirmaram a presença de C. hominis, C. parvum e C. felis nas amostras estudadas. Na análise da topologia da árvore filogenética obtida por Neighbor Joining, observou-se-se que as sequências obtidas neste estudo se agruparam com espécies do gênero Cryptosporidium já descritas, com 99% ou 100% de similaridade. Conclui-se que os dois métodos utilizados são importantes ferramentas para o diagnóstico da criptosporidiose e diferenciação de C. hominis e C. parvum em investigações epidemiológicas, assim como avaliação da heterogeneidade molecular de Cryptosporidium sp / Cryptosporidium is a coccidia parasite known to cause diarrhea in humans and animals worldwide. The genus comprises at least 20 confirmed species, with C. hominis and C.parvum major species that cause cryptosporidiosis in humans. Molecular tools have been developed to detect and differentiate Cryptosporidium at the species/genotypes and subtype levels. The objective of this study was to evaluate the molecular heterogeneity of Cryptosporidium sp. clinical samples obtained from Rio de Janeiro and Salvador (Bahia), through real-time PCR and automatic sequencing. We analyzed 85 samples, distributed in three distinct groups, 45 of them in the city of Rio de Janeiro and 40 samples from Salvador. All samples were positive for Cryptosporidium sp. by modified Kinyoun acid-fast staining technique. The real-time PCR procedure combined a duplex reaction for the detection of Cryptosporidium species and C. parvum and a simple reaction for the detection of C. hominis. The detection of the genus Cryptosporidium have been used a pair of primers and TaqMan probe designed from the alignment of conserved sequences of the 18S rRNA gene of several species of Cryptosporidium available in GenBank. For the detection of species C. parvum and C. hominis were used specific primers and probes derived from sequences of each species available in the GenBank. Detection of Cryptosporidium sp. by 18S rRNA probe, in the duplex reaction, was visualized in 63 of 85 total samples. Of these, the C. parvum TaqMan probe detected 6 samples and the C. hominis TaqMan probe detected 42 samples. Fifteen samples could not be detected by C. hominis or C. parvum probes. In the 18S PCR assays, 31 samples were positive and 27 of them sequenced. Phylogenetic analysis confirmed the presence of C. hominis, C. parvum and C. felis. The analysis of the phylogenetic tree obtained by Neighbor Joining showed that the sequences obtained in this study were grouped with Cryptosporidium species described in the GenBank, with 99% or 100% similarity. Both methods are important tools for the diagnosis of cryptosporidiosis and differentiation of C. hominis and C. parvum in epidemiological investigations, as well as evaluation of Cryptosporidium sp. molecular heterogeneity

Leprosy is an important health problem in Brazil, with a high detection rate despite the application of the multidrug therapy. The nasal mucosa is considered the preferential site of entry and exit of the Mycobacterium leprae, although some lesions have been found in the buccal mucosa. However, the buccal mucosa involvement in bacilli transmission has never been investigated. We have shown the presence of the M. leprae DNA in buccal swabs of leprosy patients (334) and household contacts (1288) through conventional polymerase chain reaction (PCR), and results were correlated with clinical and other laboratorial evaluations. The overall positivity for patients was 18.26%, divided into 12.03% and 21.23% for paucibacillary and multibacillary forms, respectively. Among contacts, the positivity reached 6.83%, which were considered either as healthy carriers or sub-clinically infected, when the ELISA test presented a positive anti-PGL-1 result. This study showed important evidences that the buccal mucosa may be a secondary site of M. leprae transmission and infection. Furthermore, contacts with positive PCR may be actively involved in the transmission. Our findings have great epidemiological relevance, especially for the leprosy control programs and for the dentistry clinics, and must be considered in the new strategies of control and prevention. / A hanseníase é um importante problema de saúde pública no Brasil, com elevada taxa de detecção, apesar da aplicação da poliquimioterapia. A mucosa nasal é considerada o local preferencial de entrada e saída do Mycobacterium leprae, embora algumas lesões tenham sido encontradas na mucosa bucal. No entanto, o envolvimento da mucosa oral na transmissão do bacilo nunca foi investigado. Nós mostramos a presença do DNA do M. leprae em swab bucal de pacientes com hanseníase (334) e contatos domiciliares (1288) por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional, e os resultados foram correlacionados com outras avaliações clínica e laboratorial. A positividade geral de pacientes foi de 18,26%, dividida em 12,03% e 21,23% para as formas paucibacilares e multibacilares, respectivamente. Entre os contatos, a positividade alcançou 6,83%, que foram considerados como portadores sadios ou infectados subclínicos, quando o teste ELISA anti-PGL-1 apresentou resultado positivo. Este estudo mostrou evidências importantes de que a mucosa bucal pode ser um sítio secundário de infecção e transmissão do M. leprae. Além disso, contatos com PCR positivo podem estar envolvidos ativamente na transmissão. Nossos resultados têm grande relevância epidemiológica, especialmente para os programas de controle da hanseníase e para as clínicas de odontologia, e devem ser considerados em novas estratégias de controle e prevenção. / Mestre em Ciências da Saúde

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O Cryptosporidium é um parasito coccídeo reconhecido por causar diarréia em humanos e animais em todo o mundo. O gênero compreende pelo menos 20 espécies confirmadas, sendo o C. hominis e C. parvum as principais espécies causadoras de criptosporidiose em humanos. Ferramentas moleculares têm sido desenvolvidas para detectar e diferenciar espécies/genótipos e subgenótipos de Cryptosporidium. O objetivo do trabalho foi avaliar a heterogeidade molecular de Cryptosporidium sp. obtidos de amostras clínicas provenientes dos municípios do Rio de Janeiro e de Salvador, através da PCR em tempo real e seqüenciamento automático. Foram analisadas 85 amostras, distribuídas em 3 grupos distintos, sendo 45 delas do município do Rio de Janeiro e 40 amostras provenientes de Salvador, Bahia. Todas as amostras foram positivas para Cryptosporidium sp. pelo método de coloração de Kinyoun a frio. O ensaio da PCR em tempo real combinou uma reação multiplex para a detecção do gênero Cryptosporidium e da espécie C. parvum e uma reação simples para a detecção de C. hominis. Na detecção do gênero Cryptosporidium foram utilizados par de primers e uma sonda TaqMan desenhados a partir do alinhamento de seqüências conservadas do gene 18S rRNA de várias espécies de Cryptosporidium disponíveis no GenBank. Para a detecção das espécies C. parvum e C. hominis foram utilizados primers e sondas específicos obtidos a partir de seqüências de cada espécie disponíveis no GenBank. A detecção do gênero Cryptosporidium através da sonda 18S rRNA, na reação duplex, foi visualizada em 63 de 85 amostras totais. Destas, a sonda TaqMan específica para C. parvum detectou 6 amostras e a sonda TaqMan específica para C. hominis detectou 42 amostras. Quinze amostras não puderam ser detectadas pelas sondas C. hominis ou C. parvum. Nos ensaios da PCR para o gene 18S, 31 amostras foram positivas e 27 delas sequenciadas. As análises filogenéticas confirmaram a presença de C. hominis, C. parvum e C. felis nas amostras estudadas. Na análise da topologia da árvore filogenética obtida por Neighbor Joining, observou-se-se que as sequências obtidas neste estudo se agruparam com espécies do gênero Cryptosporidium já descritas, com 99% ou 100% de similaridade. Conclui-se que os dois métodos utilizados são importantes ferramentas para o diagnóstico da criptosporidiose e diferenciação de C. hominis e C. parvum em investigações epidemiológicas, assim como avaliação da heterogeneidade molecular de Cryptosporidium sp / Cryptosporidium is a coccidia parasite known to cause diarrhea in humans and animals worldwide. The genus comprises at least 20 confirmed species, with C. hominis and C.parvum major species that cause cryptosporidiosis in humans. Molecular tools have been developed to detect and differentiate Cryptosporidium at the species/genotypes and subtype levels. The objective of this study was to evaluate the molecular heterogeneity of Cryptosporidium sp. clinical samples obtained from Rio de Janeiro and Salvador (Bahia), through real-time PCR and automatic sequencing. We analyzed 85 samples, distributed in three distinct groups, 45 of them in the city of Rio de Janeiro and 40 samples from Salvador. All samples were positive for Cryptosporidium sp. by modified Kinyoun acid-fast staining technique. The real-time PCR procedure combined a duplex reaction for the detection of Cryptosporidium species and C. parvum and a simple reaction for the detection of C. hominis. The detection of the genus Cryptosporidium have been used a pair of primers and TaqMan probe designed from the alignment of conserved sequences of the 18S rRNA gene of several species of Cryptosporidium available in GenBank. For the detection of species C. parvum and C. hominis were used specific primers and probes derived from sequences of each species available in the GenBank. Detection of Cryptosporidium sp. by 18S rRNA probe, in the duplex reaction, was visualized in 63 of 85 total samples. Of these, the C. parvum TaqMan probe detected 6 samples and the C. hominis TaqMan probe detected 42 samples. Fifteen samples could not be detected by C. hominis or C. parvum probes. In the 18S PCR assays, 31 samples were positive and 27 of them sequenced. Phylogenetic analysis confirmed the presence of C. hominis, C. parvum and C. felis. The analysis of the phylogenetic tree obtained by Neighbor Joining showed that the sequences obtained in this study were grouped with Cryptosporidium species described in the GenBank, with 99% or 100% similarity. Both methods are important tools for the diagnosis of cryptosporidiosis and differentiation of C. hominis and C. parvum in epidemiological investigations, as well as evaluation of Cryptosporidium sp. molecular heterogeneity