Fatores dietéticos como o selênio (Se) são apontados como importantes moduladores do risco de desenvolvimento do câncer de mama. Essa neoplasia pode apresentar sua origem no início do desenvolvimento e, assim, a alimentação materna poderia ter importantes repercussões na programação fetal da doença. A fim de verificar se diferentes concentração de selênio na dieta materna poderiam programar o risco da progênie feminina ao câncer de mama, ratas foram alimentadas com ração contendo 0,15 (CO), 1,0 (SUP) ou 0,05 (DEF) ppm de Se durante a gestação e sua progênie feminina iniciada com DMBA. A progênie do grupo SUP apresentou menor suscetibilidade à carcinogênese, indicado pelo menor número médio e multiplicidade de adenocarcinomas mamários (p< 0,05), enquanto a do grupo DEF apresentou maior suscetibilidade à carcinogênese, indicado pela maior incidência dos mesmos (p< 0,05). Mães do grupo DEF apresentaram menor concentração de Se no sangue (p< 0,05) e sua prole apresentou menor atividade da enzima GPx1 (p< 0,05). Além disso, observou-se na glândula mamária da progênie de 50 dias menor expressão (western blot e qPCR) de ER&#945;, Her-2, EGFR e Ras no grupo SUP em comparação aos grupos CO e DEF (p< 0,05). Analisou-se, ainda, o padrão de metilação global do DNA (HPLC-DAD), expressão das enzimas DNMT1, 3a e 3b (qPCR), o padrão global de modificações pós traducionais em histonas (western blot) e o padrão de metilação da região promotora do gene Er&#945; (modificação com bissulfito e pirossequenciamento) na glândula mamária da progênie de 50 dias. Não houve diferença no padrão de metilação global do DNA e expressão das enzimas DNMTs (p>0,05). Houve aumento na expressão de H4K16 acetilada nos grupos SUP e DEF (p< 0,05). Finalmente, em comparação a progênie do grupo DEF, a do grupo SUP apresentou região promotora de Er&#945; com aumento marginal (p=0,07) na metilação de dois dinucleotídeos CpG. Conclui-se que o consumo de diferentes concentrações de Se na dieta materna tem impacto sobre a suscetibilidade da progênie ao câncer de mama na vida adulta através da modulação da expressão de receptores e oncogenes relacionados ao desenvolvimeto dessa neoplasia, além da influência em processos epigenéticos. Tais resultados apontam para a existência de uma \"janela de programação\" no início do desenvolvimento sensível a ação do Se, resultando em diminuição do risco de câncer de mama quando suplementado na dieta materna e o inverso quando de sua deficiencia. / Based on epidemiological studies and animal models, the essential micronutrient selenium has been highlighted as a promising dietary factor associated to breast cancer risk reduction. Breast cancer may have its origin in early development and thus the maternal diet could have important implications in the fetal programming of the disease. In order to ascertain whether differences in selenium concentration in maternal diet could modulate the susceptibility of female offspring to breast cancer, a biological assay was conducted in which female rats were fed a diet with 0.15 (CO), 1.0 (SUP) or 0.05 (DEF) ppm of selenium during gestational period and the female offspring subjected to a mammary carcinogenesis model induced by DMBA. SUP group offspring presented decreased susceptibility to mammary carcinogenesis, as indicated by lower (p< 0,05) average number and multiplicity od adenocarcinomas, while the DEF group offspring had a greater susceptibility, as indicated by the increase (p< 0,05) in adenocarcinomas incidency. Mothers of the DEF group pesented lower (p< 0,05) Se blood concetrations and their offspring presented lower (p<0,05).GPx1 activity. In addition, there was a decrease (p< 0,05) in ER&#945;, Her-2, EGFR and Ras expression (western blot and qPCR) in the mammary gland of 7 weeks old female SUP group offspring when compared to CO and DEF groups offspring. DNA global methylation pattern (HPLC-DAD), DNMT1, 3a e 3b expression (qPCR), global pattern of post-translational modification in histones (western blot) and methylation status of Er&#945; promoter region (bisulfite modification and pyrosequencing) were also evaluated in the mammary gland of 7 weeks old offspring. There was no diffrence (p>0,05) in DNA global methylation pattern and DNMTs expression. There was an increase in acetilated H4K16 expression in groups SUP and DEF (p< 0,05). Lastly, when compared to DEF offspring, the SUP offspring presented a marginal increase in the methylation of two CpG dinucleotides in the Er&#945; promoter region. In conclusion, the consumption of different selenium concentration in maternal diet plays a role in the progeny\'s breast cancer susceptibility through the modulation of receptors and oncogenes expression, in addition to modifications in epigenetic patterns. These results indicate the presence of a \"programming window\" in the beggining of development susceptible to selenium effects, resulting in decreased breast cancer risk when supplemented and the opposite when deficient.

Em fêmeas de mamíferos, um dos cromossomos X é inativado proporcionando compensação de dose entre os produtos gênicos de machos e fêmeas. A inativação do cromossomo X (ICX) ocorre no embrião em desenvolvimento, e se caracteriza pela aquisição de marcas heterocromáticas no cromossomo X inativado (Xi), que são mantidas nas células somáticas ao longo das divisões celulares. O melhor modelo para estudo do início da ICX são as células-tronco embrionárias femininas. Provenientes da massa celular interna de blastocistos, elas representam um embrião em desenvolvimento e possuem os dois X ativos; a diferenciação das células promove a ICX in vitro, o que permite a identificação dos fatores e mecanismos moleculares envolvidos. A derivação de linhagens de célulastronco embrionárias humanas (human embryonic stem cells - hESCs) em 1998 permitiu novas possibilidades de estudo da ICX, pois a maioria dos trabalhos procurou esclarecer o mecanismo da ICX no modelo murino. Tradicionalmente, a manutenção da ICX em humanos tem sido investigada em células somáticas híbridas ou transformadas; porém, sabe-se que estas não representam um contexto celular natural. Assim, o presente trabalho teve como objetivos principais explorar a potencialidade de hESCs no estudo do início da ICX, e ainda investigar a função de três fatores na manutenção da ICX em células humanas imortalizadas: DNMT1 (enzima responsável pela manutenção da metilação do DNA), SMCHD1 (proteína da família de coesinas/condensinas), e XIST (um RNA não-codificador que inicia o processo de heterocromatinização do futuro Xi) foram selecionados para este estudo, uma vez que todos participam da manutenção da ICX em camundongos. Até o momento foram derivadas em nosso laboratório quatro linhagens de hESCs, as primeiras da América Latina. A caracterização das linhagens mostrou que, apesar de se manterem indiferenciadas, as hESCs femininas encontram-se em estágio pós-ICX, pois mesmo indiferenciadas já apresentam um dos X inativado. Nossos dados indicam que, submetidas às atuais condições de cultivo, as hESCs não são bons modelos para o estudo do início da ICX, e é possível que a inativação de um cromossomo X durante o cultivo confira alguma vantagem seletiva às células. A estratégia utilizada no estudo da manutenção da ICX foi o silenciamento dos três genes por interferência de RNA (RNAi). Não foi possível diminuir significativamente a expressão dos genes XIST e SMCHD1. Porém, o silenciamento de DNMT1 foi expressivo, e em resposta foi observada reativação do gene MAOA, localizado no cromossomo X e submetido à inativação. Apesar de nossas análises mostrarem que os efeitos da diminuição de DNMT1 foram restritos ao gene MAOA, estes resultados sugerem a existência de diferentes hierarquias de controle epigenético dos genes submetidos à ICX em células humanas / In female mammals, one of the X chromosomes is inactivated to achieve dosage compensation between males and females. The X chromosome inactivation (XCI) occurs early during embryogenesis and is characterized by the acquisition of heterochromatic features on the inactive X (Xi), which are maintained during all the subsequent cell divisions. Embryonic stem cells are the most suitable cells to study the establishment of XCI. They are obtained from the inner cell mass (ICM) of blastocysts, and can represent a developing female embryo, possessing two active X-chromosomes; when differentiated, these cells recapitulate XCI in vitro, and thus one can identify XCI regulators and factors involved. The derivation of human embryonic stem cells (hESCs) in 1998 offered new possibilities to study XCI, since most of the mechanistic studies of XCI have so far been investigated in the mouse model system. Traditionally, maintenance of XCI in humans has been addressed in somatic cell hybrids or transformed cells; however, they do not represent a natural cellular context. The main goals of the present work were to verify the potential of hESCs as models of XCI, and also to study the function of three important factors in XCI maintenance in immortalized human cells. DNMT1 (DNA-methyltransferase 1), SMCHD1 (a cohesin/condensin protein family member) and the XIST gene (a non-coding RNA which triggers XCI and promotes X heterochromatin formation on the future Xi) were selected, as they are key factors in XCI maintenance in the mouse. Until now four hESCs lines were derived in our lab. Their characterization showed that, in spite of been undifferentiated, the female hESCs have already undergone XCI. Our data suggest that, under the actual culture conditions, hESCs are not good models to study XCI, and it is also possible that X inactivation confers selective advantage to hESCs. Knockdown by RNA interference was used to study the roles of three genes in XCI maintenance. We could not efficiently knockdown XIST or SMCHD1. However, the DNMT1 silencing was substantial, and led to the reactivation of MAOA, an X-linked gene subjected to XCI. Although the effect of DNMT1 silencing was restricted to MAOA, our data suggest that there are different epigenetic hierarchies to control the expression of the genes subjected to XCI in human cells.

A leucemia linfóide aguda (LLA) é a neoplasia hematológica mais comum na infância e representa uma doença heterogênea em relação à biologia e ao prognóstico e seu tratamento consiste principalmente em quimioterapia. Apesar dos avanços no tratamento, cerca de 20% dos pacientes apresentam recaída da doença e/ou óbito indicando a necessidade de terapias diferenciadas para esse grupo. Recentemente, drogas epigenéticas como inibidores de DNA metiltransferases (iDNMTs) tem mostrado efeitos anti-neoplásicos promissores para o tratamento de diversos tipos de neoplasias incluindo a LLA. Nos tumores, a hipermetilação gênica é encontrada em vários genes, incluindo genes de reparo do DNA, reguladores do ciclo celular e apoptose. Sendo assim, drogas desmetilantes estão sendo apontadas como promissores agentes para o tratamento do câncer. A Zebularina (ZB) é um iDNMT análogo de citidina que inibe a metilação do DNA. Esta droga tem mostrado resultados animadores para o tratamento de diversas neoplasias, incluindo glioblastoma, leucemia mielóide aguda, câncer de mama, próstata e outros. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do tratamento com a ZB, associada ou não à quimioterápicos, em linhagens celulares pediátricas de LLA, por meio de ensaios funcionais como proliferação celular, capacidade clonogênica, apoptose e ciclo celular. Além disso, foi analisada a capacidade desmetilante da droga e a expressão dos genes DNMT1, DNMT3a e DNMT3b após o tratamento com a ZB. A ZB inibiu a proliferação celular de maneira dose e tempo-dependente e agiu sinergicamente quando combinada com o MTX em ambas as linhagens. Ela também diminuiu a capacidade clonogênica e aumentou a taxa de apoptose nas duas linhagens estudadas. Além disso, o tratamento com ZB causou uma parada na fase S do ciclo celular na linhagem ReH. A ZB foi capaz de desmetilar parcialmente o gene AhR e reduzir a expressão dos genes DNMT1, DNMT3a e DNMT3b. Todos os dados encontrados no presente trabalho sugerem que as drogas desmetilantes podem ser interessantes agentes para o tratamento da LLA pediátrica. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common hematologic malignancy in childhood and represents a heterogeneous disease regarding its biology and prognosis. Its treatment consists mainly of chemotherapy. Despite advances in treatment, about 20% of patients experience disease recurrence and/or death indicating the need for differentiated therapies for this group. Recently, epigenetic drugs such as DNA methyltransferases inhibitors (iDNMTs) has shown antineoplastic and promising results for several types of tumors including ALL. Gene hypermethylation is found in several genes in tumors cells, including genes responsible for DNA repair, cell cycle and apoptosis regulators. Therefore, demethylating agents may be promising agents for cancer treatment. Zebularine (ZB) an iDNMT is a cytidine analogue that inhibits DNA methylation. This drug has shown promising results for the treatment of many cancers, including glioblastoma, acute myeloid leukemia, breast and prostate cancer and others. The aim of this study was to evaluate the effects of ZB treatment, associated or not with chemotherapeutic agents, in childhood ALL cell lines through functional tests such as cell proliferation, clonogenic capacity, apoptosis and cell cycle. In addition, we examined the demethylating ability of ZB and the expression of DNMT1, DNMT3a and DNMT3b genes after treatment with this agent. ZB inhibited cell proliferation in a dose- and time-dependent manner and showed synergistic effects when combined with MTX in both cell lines. ZB treatment also reduced clonogenic capacity and increased the number of apoptotic cells in both cell lines studied. Furthermore, treatment with ZB caused an S phase cell cycle arrest in ReH cell line. ZB was able to partially demethylate AhR gene and reduce the expression of genes DNMT1, DNMT3a and DNMT3b. These results suggest that demethylating drugs may be interesting agents for the treatment of childhood ALL.

Orientador: Fabíola Traina / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T22:39:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scopim-Ribeiro_Renata_M.pdf: 3643524 bytes, checksum: fec865c6ccea452efda050e40c6f1aa1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As neoplasias mieloides compreendem um grupo heterogêneo de doenças hematológicas que se originam de um precursor mieloide comum, em diferentes fases de diferenciação. As alterações celulares que levam ao desenvolvimento de neoplasias podem ocorrer através de mecanismos epigenéticos ou de alterações genéticas. DNMT3A codifica metiltransferases que adicionam grupamentos metil a resíduos de citosina do DNA e TET2 promove a hidroxilação da citosina metilada, o que os caracteriza como elementos importantes no controle epigenético. DNMT3A e TET2 encontram-se frequentemente mutados em neoplasias mieloides, mas o impacto prognóstico destas mutações ainda é controverso. A consequência funcional da mutação de DNMT3A em neoplasias mieloides ainda não foi definida, mas o silenciamento da proteína em células progenitoras murinas favorece a autorrenovação e compromete a diferenciação celular. A mutação de TET2 tem como consequência a perda de função do gene e participa da transformação neoplásica das células mieloides, favorecendo a proliferação da série mielomonocítica. Entretanto, a expressão de TET2 e DNMT3A nestas doenças ainda é pouco elucidada. Assim, os objetivos deste estudo foram (1) investigar a expressão de TET2 e DNMT3A em células hematopoéticas de indivíduos normais e pacientes com síndrome mielodisplásica (SMD) e leucemia mieloide aguda (LMA), (2) correlacionar a expressão de TET2 e DNMT3A com o fenótipo clínico e sobrevida de pacientes com SMD; (3) investigar a expressão de TET2 e DNMT3A durante a diferenciação celular hematopoética e (4) avaliar o efeito do silenciamento de DNMT3A no fenótipo de linhagens celulares leucêmicas. No presente estudo, verificamos redução na expressão de TET2 em células provenientes de pacientes com SMD e LMA quando comparada à expressão em controles normais (p<.001), e redução em SMD alto risco quando comparada à SMD baixo risco (p=.02). Os resultados em amostras sequenciais de cinco pacientes com SMD indicaram redução da expressão de TET2 no momento da progressão da doença. A análise univariada evidenciou que fatores clínicos tiveram impacto tanto na sobrevida livre de evento como sobrevida global, incluindo a classificação de risco pela OMS 2008 (alto vs. baixo, p<.0001), IPSS (int-2/alto vs. baixo/int-1, p<.0001), hemoglobina (<10 vs. ? 10, p<.05), contagem de leucócitos (< 3 vs. ? 3 x109/L, p<.05), contagem absoluta de neutrófilos (< 1.5 vs. ? 1.5, p<.05) e porcentagem de blastos na medula óssea (? 5 vs. <5 ou ? 10 vs. <10, p<.0004). Além disso, a baixa expressão de TET2 teve impacto negativo na sobrevida livre de evento (HR: 6.51 [2.42-17.49], p=.0002) e na sobrevida global (HR: 7.25 [2.77-18.99], p<.0001). A análise multivariada indicou que a baixa expressão de TET2 (p <.0001), IPSS alto/intermediate-2 (p <.0001), e hemoglobina <10 g/dL (P<.03) são fatores prognósticos para menor sobrevida livre de evento e sobrevida global. Durante a diferenciação eritroide de células CD34+ de indivíduos normais e pacientes com SMD, observamos um aumento significativo da expressão de TET2 (p=. 03). Na avaliação da diferenciação celular de linhagens leucêmicas, observamos aumento significativo na expressão de TET2 durante as diferenciações granulocítica (p=.04) e megacariocítica (p=.03); e um aumento não significativo durante a diferenciação eritrocítica. A expressão de DNMT3A foi semelhante entre pacientes com LMA, SMD e controles normais, e não teve impacto significativo na sobrevida dos pacientes com SMD. A expressão de DNMT3A não foi modulada durante a diferenciação eritroide de células CD34+ de indivíduos normais e pacientes com SMD. Nos modelos de diferenciação celular de linhagens leucêmicas, observamos aumento significativo da expressão de DNMT3A durante a diferenciação granulocítica, mas não durante a diferenciação eritrocítica e megacariocítica. A redução na expressão de DNMT3A não resultou em alteração significativa na apoptose, na proliferação e no ciclo celular em linhagens leucêmicas HL60 e U937. A expressão gênica e proteica de PTEN não foi modulada em células leucêmicas submetidas à inibição de DNMT3A. Os achados aqui descritos sugerem que, similarmente à presença de mutação no TET2, a baixa expressão de TET2 pode participar do processo de transformação celular em SMD de alto risco e LMA; estudos clínicos deveriam considerar a investigação da expressão gênica de TET2 em conjunto com a pesquisa de mutação TET2 na definição de prognóstico. Os resultados de expressão e função de DNMT3A sugerem que a mutação, e não a expressão, deva ser o principal mecanismo pelo qual o DNMT3A participa da transformação neoplásica e que a função de DNMT3A pode depender da linhagem celular estudada / Abstract: Myeloid neoplasms comprise a heterogeneous group of hematologic malignancies that originate from a common myeloid precursor at different stages of differentiation. Cellular changes that lead to development of malignancies may occur through epigenetic mechanisms or genetic alterations. DNMT3A encodes methyltransferases that add methyl groups to cytosine residues in DNA, TET2 promotes hydroxylation of methylated cytosine, and both proteins are important elements in epigenetic control. TET2 and DNMT3A are recurrently mutated in myeloid malignancies, but the prognostic consequence of TET2 and DNMT3A mutation is still controversial. The functional consequences of DNMT3A mutation has not been defined, but the protein silencing in murine progenitor cells promotes self-renewal and reduces cell differentiation. TET2 mutation results in loss of function and participates in the neoplastic transformation of myeloid cells, favoring the proliferation of granulomonocytic cells. However, the expression of TET2 and DNMT3A in these diseases has been rarely addressed. Then, the aims of this study were (1) to evaluate TET2 and DNMT3A gene expression in hematopoietic cells from healthy individuals and from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) and acute myeloid leukemia (AML); (2) to correlate TET2 and DNMT3A expression with clinical phenotype and outcomes of MDS patients; (3) to investigate TET2 and DNMT3A expression during hematopoietic cell differentiation; and (4) to evaluate the effect of DNMT3A silencing in the phenotype of leukemia cell lines. In this study, the expression of TET2 was decreased in cells from patients with MDS and AML compared to healthy donors (p<.001) and reduced high-risk MDS compared to low risk MDS (p=.02). The results in sequential samples from five patients with MDS indicate reduced expression of TET2 at the time of disease progression. By univariate analysis, clinical factors that significantly affected both event free survival (EFS) and overall survival (OS) included risk stratification by WHO 2008 (high vs. low, p<.0001), IPSS (int-2/high vs. low/int-1, p <.0001), hemoglobin (<10 vs. ? 10, p<.05), white blood cell counts (< 3 vs. ? 3 x109/L, p<.05), absolute neutrophil counts (< 1.5 vs. ? 1.5, p<.05) and bone marrow blast percentage (? 5 vs. <5 or ? 10 vs. <10, p<.0004). Furthermore, low TET2 expression negatively impacted both EFS (HR: 6.51 [2.42-17.49], p=.0002) and OS (HR: 7.25 [2.77-18.99], p<.0001). Multivariate analyses indicated that low TET2 expression (p <.0001), along with IPSS high/intermediate-2 risk group (p <.0001), and hemoglobin <10 g/dL (p<.03) were independently prognostic for worse EFS and OS. During erythroid differentiation of CD34+ cells from normal individuals and patients with low-risk MDS, we observed an increased expression of TET2 (p=.03). During cell differentiation of leukemic cell lines, we observed a significantly increase in the expression of TET2 during granulocytic and megakaryocytic differentiation (p=.04 and p=.03, respectively); there was also an increased expression during erythrocytic differentiation, but this was not statistically significant. The expression of DNMT3A was similar between patients with AML, MDS and healthy donors, and it did not impact survival outcomes in MDS patients. DNMT3A expression was not modulated during erythroid differentiation of CD34+ cells from normal individuals and patients with MDS. In leukemic cell lines models of differentiation, we observed a significantly increase in the DNMT3A expression during granulocytic differentiation, but not in erythrocytic and megakaryocytic differentiation. The DNMT3A silencing did not result in significant changes in apoptosis, proliferation and cell cycle in leukemic cell lines HL60 and U937. PTEN gene and protein expression was not modulated in leukemic cell lines submitted to inhibition of DNMT3A. The findings reported here suggest that, similarly to the presence of TET2 mutations, the low expression of TET2 can participate in the process of cell transformation in high risk MDS and AML. Clinical studies should consider the investigation of TET2 expression together with the studies of TET2 mutation to defining prognosis. Our results of expression and function suggest that DNMT3A mutation, instead of the expression, should be the main mechanism by which DNMT3A participates in neoplastic transformation and that DNMT3A function may vary according to the cell line studied / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Ciências

Técnicas de reprodução assistida (TRAs) são utilizadas tanto na medicina humana quanto na medicina veterinária com o objetivo principal de corrigir infertilidades adquiridas ou herdadas. A transferência nuclear de célula somática (TNCS) ocupa um lugar de destaque na veterinária pela possibilidade de geração de indivíduos geneticamente idênticos, permitindo a produção de rebanhos homogêneos de alto mérito genético e servindo como modelo de estudo para técnicas de reprogramação. Porém, a utilização de TRAs, e em especial da TNCS, é considerada responsável pelo aumento na geração de conceptos portadores de alterações durante e após o desenvolvimento embrionário e fetal. A provável causa principal é a alteração na regulação da reprogramação epigenética devido à manipulação de gametas e embriões no período inicial do desenvolvimento, levando a alterações na regulação epigenética de genes imprinted. O presente estudo teve como objetivo principal avaliar marcas epigenéticas e expressão de genes imprinted no desenvolvimento de conceptos bovinos produzidos por TNCS ou inseminação artificial (IA). Para tal, foram coletadas amostras de tecido muscular e membranas corioalantoideana e amniótica de animais na fase pré natal (fetal) e tecidos muscular, nervoso e hepático na fase pós natal (animais nascidos saudáveis adultos ou não) de animais derivados de IA ou TNCS. Foi analisada a expressão dos genes imprinted H19, IGF2, IGF2R e Airn quando possível, assim como a metilação do DNA no locus H19/IGF2 na fase pós natal. Foi observado que na fase pré natal não foi detectada expressão do IGF2, enquanto que a expressão de H19 é aumentada em relação ao IGF2R, porém, sem diferenças entre os grupos nos tecidos estudados. Na fase pós natal, o padrão de expressão dos genes IGF2, H19 e IGF2R indica diminuição da expressão gênica relativa no fígado de animais TNCS e no aumento da expressão gênica do H19 na musculatura de animais adultos (saudáveis) bovinos produzidos por TNCS, apesar de o padrão de metilação dos genes imprinted IGF2/H19 não ser diferente entre organismos considerados saudáveis e não saudáveis. Os resultados deste projeto contribuem para o entendimento dos mecanismos epigenéticos relacionados ao desenvolvimento embrionário e fetal, em especial aqueles relacionados à dinâmica das alterações epigenéticas envolvidas no imprinting genômico / Assisted reproductive technologies (ARTs) are usually used in both human and veterinary medicine aiming the correction of heritable or acquired infertilities. The somatic cell nuclear transfer technique (SCNT) is of particular importance in veterinary as it enables the generation of genetically identical organisms, allowing the production of homogeneous genetically improved herds, and also serving as a model for reprogramming studies. However, the use of TRAs, SCNT in special, may be responsible for the increase of developmental-related abnormalities in the conceptuses. Such phenotypes are probably caused by a disruption during the epigenetic reprogramming due to the manipulation of gametes and embryos during the early development period, and therefore leading to disturbances in the epigenetic regulation of imprinted genes. The present study aimed to evaluate epigenetic marks and expression of imprinted genes in different developmental periods of cattle generated by SCNT or artificial insemination (AI). For that, corionic/alantoic and amniotic membranes from fetuses and muscular, nervous and hepatic tissues from born animals, healthy (adult) or not, produced by SCNT or AI were collected. The expression of the imprinted genes H19, IGF2, IGF2R and Airn was analyzed as well as the DNA methylation at locus H19/IGF2 in post-natal period. It was observed that IGF2 was not detected during pre-natal period, whereas H19 expression is increased when compared to IGF2R in the groups studied herein. At post-natal period the IGF2, H19 and IGF2R expression patterns infers the decrease of relative gene expression in the liver and the increase of H19 expression in the muscle of SCNT adult animals. The methylation pattern of IGF2/H19 locus, however, did not differ between healthy or not animals. The results described herein may contribute to the understanding of the epigenetic mechanisms related to embryonic and fetal development, and in special, to those related to the epigenetic dynamics during genomic imprinting

Orientador: Ana Paula de Souza Pardo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-27T07:52:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Portinho_Danielle_D.pdf: 3218538 bytes, checksum: 09966eb0179669b7c0b2ceee93e7f695 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A associação entre inflamação e câncer vem sendo há tempo estudada, havendo atualmente fortes evidências que mostram o microambiente inflamatório como fator de risco para tumorigênese. Dentre os tipos de câncer mais frequentes, o câncer de boca ocupa a sexta colocação como maior causa de óbitos em todo o mundo. Os fatores que levam ao aparecimento do câncer oral são variados, entretanto existe dependência de um acúmulo de mutações as quais levam a alterações genéticas e epigenéticas das células afetadas, sendo que estas alterações influenciam diretamente no prognóstico da doença. Nos últimos anos, o estudo das alterações epigenéticas relacionadas aos diversos tipos de câncers vem se destacando, havendo marcadores epigenéticos já descritos para diferentes tipos de tumores. Dentre as alterações epigenéticas mais estudadas está a metilação do DNA que acontecem normalmente em regiões com grandes concentrações de citocina que precedem guanina (CpG). Estas regiões ricas em dinucleotídeos CpGs são denominadas ilhas CG. Ilhas CG são frequentes em regiões promotoras dos genes, sendo a metilação um mecanismo de controle do nível transcricional. Ilhas CGs metiladas na região promotora são esperadas em genes pouco expressos, podendo haver até mesmo o completo silenciamento da expressão do gene. No caso de genes supressores de tumor, pode provocar o aparecimento e o descontrole no crescimento tumoral. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar o padrão de metilação do DNA em sequências LINE1 e nos genes supressores tumorais: SFRP1, SFRP2 e TP73, em amostras de gengiva coletadas de pacientes, pacientes com periodontite crônica e pacientes diagnosticados com carcioma espinocelular (CEC). A metilação do DNA foi analisada utilizando-se a metodologia COmbined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) em tecidos homogeneizados e microdissecados. A análise de expressão gênica dos genes foi realizada pela técnica qPCR amostras de tecido gengival e CEC. Os resultados obtidos pelas análises COBRA evidenciaram um desequilíbrio no estado de metilação todo DNA anto nos tecidos inflamados quanto nos tumorais. Entretanto, as regiões CpG analisadas não demonstraram estar diretamente relacionadas com o nível de expressão gênica. Adicionalmente, os resultados das análises da metilação global (LINE1) do tecido homogeneizado em comparação com as amostras microdissecadas indicam que os dados obtidos podem ser contraditórios aos reais podendo interferir no prognóstico do paciente. Esta contradição possivelmente se deve a contaminação do tecido tumoral por tecidos adjacentes a ele. As análises estatísticas dos resultados foram realizadas pelos testes Kruskall-Wallis e correlação de Pearson ao nível de significância de 5%. Alterações no padrão de metilação do DNA dos genes estudados são encontradas tanto em tecidos inflamados quanto em amostras de câncer bucal. A metodologia de escolha para análise destes tecidos pode influenciar nos resultados obtidos, gerando falsos negativos e consequentemente comprometendo o tratamento da doença / Abstract: The association between inflammation and cancer has always been sought by researchers. Nowadays, there are evidences of the role of the inflammatory microenvironment in tumorigenesis. Among the most common types of cancer, oral cancer is the sixth type that causes more deaths worldwide. The factors that lead to the development of an oral cancer are varied, depending on an accumulation of mutations that lead to genetic and epigenetic alterations of the affected cells, and these changes directly influence the prognosis of the disease. In recent years epigenetic have been widely studied in this field of researchs, and several genes have been described as markers for different types of tumors. Among the most studied epigenetic changes there is the DNA methylation in areas with large concentrations of the cytokine that precedes guanine (CpG), these regions are called CpG islands. GpC islands are fairly common in the promoter regions of the genes, being the methylation a control mechanism of gene level transcripts and it can even silence the expression of a gene. In the case of tumor suppressor genes this silencing can lead to uncontrolled tumor growth. The aim of this study was to analyse the DNA methylation status of LINE1 sequences and specific genes (SFRP1, SFRP2 e TP73) from human tissue collected from gingival normal tissue from patients underwent aesthetic surgery, patients with cronic periodontitis and patients with oral squamous cell carcinoma (OSCC). The extracted DNA was analysed by Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) submitting the DNA to bisulfite conversion by MethylSEQrBisulfiteConversion Kit from homogenized and microdissected tissues. Through qPCR technique, samples from gingival tissue and OSCC were subjected to RNA expression analysis of candidate genes. The results of COBRA analysis of genes exhibited an imbalance in methylation state of inflamed and tumor tissues. However, the CpG regions analyzed have not shown to be directly related to the level of expression of these genes. The results of the analysis of the global methylation (LINE1) of the homogenized tissue compared with microdissected samples showed that the obtained data may be contradictory to the real one and may interfere in the prognosis of the patient. This inconsistency is probably due to contamination of tumor tissue by adjacent tissues. Statistical analysis of results was performed by Kruskal-Wallis test and Pearson correlation at the 5% confidence level. Changes in DNA methylation pattern of the genes studied are found in both inflamed tissues as oral cancer samples. The choice of methodology for the analysis of these tissues can influence results, and consequently generating false negative results affecting the treatment of disease / Doutorado / Histologia e Embriologia / Doutora em Biologia Buco-Dental

Orientadores: Adriana Souza Torsoni, Marciane Milanski / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas / Made available in DSpace on 2018-08-27T16:45:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fante_Thaisde_M.pdf: 3029616 bytes, checksum: 5e68ab17d3076784e4f20c127d76838f (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O estilo de vida moderno tem levado ao aumento na prevalência de obesidade e suas co-morbidades em gestantes e na população cada vez mais jovem. Muitos dos efeitos do consumo direto de dieta hiperlipídica (DH) no metabolismo de glicose e lipídios já são bem estabelecidos. No entanto, considera-se importante avaliar se o consumo de DH durante períodos críticos do desenvolvimento seria capaz de ativar mecanismos epigenéticos, perpetuando mudanças no metabolismo da prole e criando um ciclo vicioso que não poderia ser interrompido. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito potencial da programação metabólica em prejudicar a sinalização de insulina na prole recém desmamada de mães alimentadas com dieta hiperlipídica durante a gestação e lactação. Além disso, investigamos se a exposição precoce a um ambiente obesogênico seria capaz de exacerbar o prejuízo no metabolismo de glicose na vida adulta de animais reexpostos à dieta hiperlipídica. Para isso, camundongos fêmeas da linhagem Swiss foram alimentados com dieta controle ou DH durante os períodos de adaptação, gestação e lactação, e os tecidos da prole macho foram analisados nos dias 28 e 82. Os resultados mostram que a prole de mães obesas (HC-O) apresentou maior ganho de peso, adiposidade e ingestão alimentar que a prole de mães controle (CC-O). Além do mais, apresentou prejuízos na sinalização de insulina em tecidos periféricos como fígado, adiposo e músculo, e centrais, como o hipotálamo, provavelmente devido à maior ativação de vias inflamatórias. A reexposição à DH parece agir como um fator agravante para o desenvolvimento do fenótipo obeso, levando a resistência sistêmica à insulina e hiperleptinemia. É válido ressaltar que o tecido adiposo parece ser o tecido mais afetado na prole adulta após a reexposição da dieta (HH-O), o que pode contribuir para a desregulação metabólica observada. Em conjunto, nossos resultados sugerem que o consumo materno de dieta hiperlipídica durante a gestação e lactação pode ocasionar alterações no metabolismo glicídico da prole tanto em animais recém desmamados quanto adultos. Por fim, a obesidade materna leva à maior susceptibilidade ao desenvolvimento de obesidade e prejuízos na sinalização de insulina na prole que não podem ser revertidos pelo consumo de uma dieta controle, no entanto, podem ser agravados especialmente quando os animais são reexpostos à DH / Abstract: Modern lifestyle has resulted in an increase in the prevalence of obesity and its comorbidities in pregnancy and young population. Many effects from direct consumption of a high-fat diet (HFD) on glucose and lipid metabolism are well established. However, it is important to assess whether maternal consumption of HFD during critical periods of development can trigger epigenetic mechanisms, perpetuating changes in offspring metabolism and creating a vicious circle that cannot be broken. This study evaluated the potential effect of metabolic programming in impairing the insulin signaling in recently weaned offspring of obese dams. In addition, we investigated if early exposure to obesogenic environment is able to exacerbate the impairment of glucose metabolism in adult life in response to a high-fat diet. For this, Swiss female mice were fed with Stardard chow (SC) or HFD before and during mating, gestation and lactation. Tissues from male offspring were obtained at d28 and d82 to analyze activation of key proteins of inflammatory and insulin signaling pathways by Western Blot. Offspring of obese dams (HC-O) showed greater weight gain, adiposity and food intake than offspring of control dams (CC-O). Furthermore, they showed impairment in insulin signaling in central and peripheral tissues, associated to increased activation of inflammatory pathways. The HFD re-exposure seems to be an aggravating factor in development of obese phenotype leading to systemic insulin resistance and hyperleptinaemia. Moreover, adipose tissue was ultimately the most affected tissue in adult offspring after HFD rechallenged (HH-O) which may have contributed to the metabolic deregulation observed. Together our results suggest that maternal consumption of high-fat diet during pregnancy and lactation can cause changes in glucose metabolism of offspring in both weaned and adult animals. Additionally, maternal obesity leads to increase susceptibility to the development of obesity and impairment in insulin signaling in offspring that cannot be reversed by SC consumption, but can be aggravated especially when re-exposed to HFD / Mestrado / Metabolismo e Biologia Molecular / Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo

A descondensação da cromatina exerce um papel central nas diversas etapas do processo de carcinogênese abrindo o genoma para a ação de fatores de transcrição, exercendo papel na progressão e resistência tumoral. Bromodomínios e proteínas com terminal extra, como o BRD4, são leitores epigenéticos que regulam a expressão gênica e, portanto, também estão envolvidos na patogênese do câncer. O objetivo do presente estudo foi estudar o efeito da inibição do BRD4 no carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP). Para esse propósito, foi utilizado JQ1, inibidor de BRD4, em concentração de 1uM, nas linhagens de carcinoma de cabeça e pescoço HN6, HN12 e HN13. Foi analisado os níveis de BRD4, H4 acetilada e SIRT1 fosforilado através de reações de imunofluorecência e p16ink4 por imunohistoquímica. Foi realizado western blot para checar os níveis de p53 e p53 acetilado. Ensaio de formação de colônias e câmera de invasão foram realizados para testar o efeito do inibidor na proliferação e invasão celular. Através da citometria de fluxo foi analisado o efeito da apoptose com a marcação de caspase-3 clivada, do ciclo celular através da reação por iodeto de propídio e ainda da população de células tronco tumorais pela análise de ALDH e CD44. Por fim, foi realizado modelo xenográfico subcutâneo para analisar o efeito do JQ1. Os resultados mostraram diminuição significativa da expressão de BRD4 e H4ac após tratamento com JQ1. As linhagens celulares mostraram redução na capacidade de invasão e de formação de colônias quando submetidas ao JQ1. Não foram encontradas diferenças em relação ao número de células caspase-3 clivada positivas. Por outro lado, foi encontrado um maior número de células na fase G1 do ciclo celular após o uso do inibidor estudado. As células tratadas com JQ1 mostraram menor expressão de p-SIRT1 o que levou a uma diminuição da acetilação do p53 e um aumento na expressão de p16ink4. Paralelamente, foi encontrado uma diminuição na população de células positivas para ALDH e CD44. Houve diminuição do crescimento do tumor no modelo xenográfico tratado com JQ1 quando comparado ao veículo. Nos tecidos derivados do ensaio in vivo, houve uma diminuição nos marcadores p16ink4, pSIRT1 além de acúmulo de H2AX. Conclui-se que o uso de JQ1 resulta na disrupção do crescimento do CECP associado a ativação de senescência, indução de dano de DNA além de reduzir a população de células tronco tumorais. Esses novos achados indicam que o BRD4 é um importante modificador epigenético nos CECP sendo um viável alvo terapêutico. / Chromatin descondensation plays a central step in the various stages of the carcinogenesis process opening the genome for transcription factors playing a role in tumor progress and resistance. Bromodomains and extra terminal family, as BRD4, are epigenetics readers that regulate gene expression thus they are also involved in cancer pathogenesis. The objective of this project was studied the effect of BRD4 in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). For this purpose, JQ1, a BRD4 inhibitor, was used in 1uM concentration, in HN6, HN12 and HN13 head and neck carcinoma cell lines. The levels of BRD4, acetylates h4 and phosphorylated SIRT1 were analyzed by immunofluorescence and p16ink4 labeling by immunohistochemistry. Western blot was performed to check the levels of p53 and acetylated p53. Colony assay and invasion chamber were performed to test the inhibitory effect on cell proliferation and invasion. The effect of apoptosis with the cleaved caspase-3 labeling, the cell cycle by propidium iodide and of the population of tumor stem cells by the analysis of ALDH and CD44 was analyzed through flow cytometry. Finally, a subcutaneous xerographic model was performed to analyze the effect of JQ1. A significant decrease in the expression of BRD4 and H4ac was found after application of JQ1. The cell lines results showed a reduction in the capacity of invasion and also formation of colonies when submitted to JQ1. No differences were found in relation to the number of cells caspase-3 cleaved positives. On the other hand, a large number of cells were found in G1 arrest of cell cycle after use of the BRD4 inhibitor studied. Cells treated with JQ1 showed lower expression of p-SIRT1 which led to a decrease in p53 acetylation and an increase in p16ink4 expression. In parallel, a decrease of ALDH and CD44 positive cells population was found. A decrease in tumor growth was discovered when treated by JQ1 if compared to the vehicle. In tissues samples derived from the in vivo assay, there was a decrease in p16ink4, pSIRT1 markers in addition to -H2Ax accumulation. In conclusion JQ1 causes HNSSC tumor growth disruption associated a senescence activation, DNA damage and a reduce number of cancer stem cells. These new findings indicate that BRD4 is an important genetic modifier in HNSSC and is a viable therapeutic target.

El desarrollo neural ocurre mediante el proceso de neurulación originando el sistema nervioso central y la médula espinal. Durante este proceso las células de la cresta neural (CCN) son especificadas en la región más dorsal del tubo neural; posteriormente, las CCN delaminan del epitelio neural, migran a diferentes regiones del embrión y se diferencian en diversos tipos celulares. Defectos en el desarrollo del tubo neural y de las CCN generan desórdenes congénitos como espina bífida, encefalocelia, y neurocristopatías (paladar-labio hendido, albinismo, entre otras). Una vitamina importante durante el desarrollo embrionario temprano es el folato, el cual se encuentra en el sistema circulatorio en forma de 5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF) e ingresa a la célula por medio del receptor de membrana FOLR1 y el transportador RFC1. El 5-MTHF participa en la síntesis de nucleótidos y en la generación de Sadenosilmetionina (SAM) para la metilación de ácidos nucleicos y proteínas. La metilación de ácidos nucleicos y proteínas son importantes mecanismos de regulación epigenética durante el normal desarrollo embrionario de los vertebrados. Considerando lo dicho se plantea determinar el efecto epigenético de la deficiencia del folato en el desarrollo del tubo neural y de las CCN. Para esto realizamos la pérdida de función del receptor FOLR1 y transportador RFC1 mediante el uso de los morfolinos FolR1spMO y RFC1spMO en embriones de pollo. Posteriormente se evalúan los niveles de 5mC en el ADN y 6mA en el ARN mediante dot blots, observando una clara disminución en ambas marcas epigenéticas. El análisis de expresión del marcador de CCN Sox10 en embriones inyectados evidenció una disminución en el número de CCN. Adicionalmente, el marcador neural Sox2 presentó una expresión ectópica en el territorio de las CCN. Estos resultados muestran que la deficiencia de folato afecta la metilación global del ADN y ARN generando un cambio en el destino celular de los progenitores de las CCN hacia un destino neural. Los resultados obtenidos pueden sentar las bases para un mejor entendimiento y desarrollo de tratamientos capaces de prevenir o disminuir las anomalías ocasionadas por la deficiencia de folato en mujeres embarazadas. / Tesis

Orientador: Lourdes Campaner dos Santos / Resumo: Este trabalho apresenta o estudo dos efeitos de modificadores epigenéticos e eliciadores químicos na diversificação metabólica de Curvularia lunata e Fusarium fujikuroi, fungos isolados de Paepalanthus chiquitensis (Eriocaulaceae). Os fungos foram cultivados em PDB (caldo batata dextrose), e as seguintes condições foram investigadas: (PDB + SAHA) ácido hidroxâmico suberoilanilida, (PDB + AZA) 5-azacitidina, (PDB + AA) ácido anacárdico, PDB + Cu2+ e PDB + Mg2+. Essas condições foram comparadas com o controle PDB. O estudo químico de C. lunata, resultou no isolamento das novas γ-lactamas espirocíclicas C3 e C4, e outros cinco compostos conhecidos: triticonas E (C1) e F (C2), ácido 5-O-metilcurvulínico (C5), ácido curvulínico (C6) e curvulina (C7). As estruturas foram elucidadas por análises espectroscópicas e pela comparação com dados da literatura. Além disso, um estudo computacional foi realizado para determinar a configuração absoluta do C‒3' de C3 e C4. As triticonas C1 e C2 apresentaram boa atividade antibacteriana para Escherichia coli, com CIM de 62,5 μg/mL. Dos eliciadores químicos utilizados, a suplementação com Mg2+ foi a condição que apresentou as diferenças mais significativas no perfil metabólico de F. fujikuroi. O extrato PDB + Mg2+ preparado do cultivo em escala ampliada foi purificado por métodos cromatográficos e resultou no isolamento e identificação das substâncias: ácido indolacético (F3) e seus derivados F4, F8 e F17, assim como a auxina ácido fenilacético ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Eriocaulaceae, Paepalanthus chiquitensis, Fusarium fujikuroi, Curvularia lunata, fungo endofítico, epigenética / Doutor