Stroke is one of the most common, and damaging, neurological afflictions. Stroke causes widespread and variable chronic effects, due to the limited regenerative ability of the adult brain. Altered gene expression induces neuronal changes necessary for plasticity-dependent recovery, effects which can be enhanced by growth hormone-based pharmaceuticals. These processes are driven by alterations in the informational capacity of the genome – changes driven by epigenetic regulators. Following experimental strokes, and treatment with EGF and EPO, this study shows that two epigenetic regulatory mechanisms, DNA methylation and microRNA regulation, are significantly altered, both in treated and untreated animals. Specifically, treatment induces a net global suppression of miRNA activity, which appears to modify the physical behaviour of neurons in domains ranging from plasticity and memory formation, growth and replication, and potentially even to neurological disease signalling. The confirmation of epigenetic alterations following a stroke indicates a future role for epigenetic neuro-pharmacology in stroke management. / x, [99] leaves : ill. (some col.) ; 29 cm

Thesis (Ph. D.)--University of Alabama at Birmingham, 2007. / Additional advisors: Vithal K. Ghanta, J. Michael Ruppert, Theresa V. Strong, R. Douglas Watson. Description based on contents viewed Oct. 3, 2008; title from PDF t.p. Includes bibliographical references.

Schizophrenia is a neurodevelopmental disorder affecting 1% of the general population. Dysfunction of the prefrontal cortex (PFC) is associated with the etiology of schizophrenia. Moreover, a substantial deficit of GAD1mRNA in schizophrenic PFC has been reported by different groups. However, the underlying molecular mechanisms are still unclear. Interestingly, epigenetic factors such as histone modifications and DNA methylation could be involved in the pathogenesis of schizophrenia during the maturation of the PFC. In my work, I identified potential epigenetic changes in schizophrenic PFC and developmental changes of epigenetic marks in normal human PFC. Furthermore, mouse and neuronal precursor cell models were used to confirm and investigate the molecular mechanisms of the epigenetic changes in human PFC. My initial work examined whether chromatin immunoprecipitation can be applied to human postmortem brain. I used micrococcal nuclease (MNase)-digested chromatin instead of cross-linked and sonicated chromatin for further immunoprecipitation with specific anti-methyl histone antibodies. Surprisingly, the integrity of mono-nucleosomes was still maintained at least 30 hrs after death. Moreover, differences of histone methylation at different genomic loci were detectable and were preserved within a wide range of autolysis times and tissue pH values. Interestingly, MNase-treated chromatin is more efficient for subsequent immunoprecipitation than crosslinked and sonicated chromatin. During the second part of my dissertation work, I profiled histone methylation at GABAergic gene loci during human prefrontal development. Moreover, a microarray analysis was used to screen which histone methyltransferase (HMT) could be involved in histone methylation during human prefrontal development. Mixed-lineage leukemia 1 (MLL1), an HMT for methylation at histone H3 lysine 4 (H3K4), appears to be the best candidate after interpreting microarray results. Indeed, decreased methylation of histone H3 lysine 4 at a subset of GABAergic gene loci occurred in Mll1 mutant mice. Interestingly, clozapine, but not haloperidol, increased levels of trimethyl H3K4 (H3K4me3) and Mll1 occupancy at the GAD1 promoter. I profiled histone methylation and gene expression for GAD1 in schizophrenics and their matched controls. Interestingly, there are deficits of GAD1 mRNA levels and GAD1 H3K4me3 in female schizophrenics. Furthermore, I was also interested in whether the changes of GAD1 chromatin structure could contribute to cortical pathology in schizophrenics with GAD1 SNPs. Remarkably, homozygous risk alleles for schizophrenia at the 5’ end of the GAD1 gene are associated with a deficit of GAD1 mRNA levels together with decreased GAD1 H3K4me3 and increased GAD1H3K27me3 in schizophrenics. Finally, I shifted focus on whether DNA methylation at the GAD1 promoter could contribute to a deficit of GAD1 mRNA in schizophrenia. However, no reproducible techniques are available for extracting genomic DNA specifically from GABAergic neurons in human brain. Therefore, I used an alternative approach that is based on immunoprecipitation of mononucleosomes with anti-methyl-histone antibodies differentiating between sites of active and silenced gene expression. The methylation frequencies of CpG dinucleotides at the GAD1 proximal promoter and intron 2 were determined from two chromatin fractions (H3K4me3 and H3K27me3) separately. Consistently, the proximal promoter region of GAD1 is more resistant to methylation in comparison to intron 2 of GAD1 in either open or repressive chromatin fractions. Interestingly, overall higher levels of DNA methylation were seen in repressive chromatin than in open chromatin. Surprisingly, schizophrenic subjects showed a significant decrease of DNA methylation at the GAD1proximal promoter from repressive chromatin. Taken together, my work has advanced our knowledge of epigenetic mechanisms in human prefrontal development and the potential link to the etiology of schizophrenia. It could eventually provide a new approach for the treatment of schizophrenia, especially in the regulation of methylation at histone H3 lysine 4.

Aspectos heterocrônicos encontrados na evolução do crânio dos Rhynchosauria foram estudados como uma contribuição ao melhor entendimento da evolução deste grupo, bem como dos vertebrados em geral; para o que partiu-se do material Triássico do estado Rio Grande do Sul. A Análise dos Componentes Principais incluiu 22 crânios e foi utilizada para estabelecer classes de idades; a Equação de Alometria para estabelecer as modificações alométricas durante a ontogenia. Uma análise incluiu espécimes de Hyperodapedon sp., Scaphonyx sulcognathus e o "Rincossauro de Mariante"; e outra apenas espécimes de Hyperodapedon sp. A Análise Estatística Multivariada indicou que a alteração da forma craniana depende fortemente do tamanho. As alterações nas diferentes regiões do crânio, refletidas nos coeficientes alométricos, são uma consequência da alteração do tamanho dos indivíduos. Na primeira análise, 73% das medidas apresentaram crescimento alométrico negativo em relação à medida comparativa padrão, enquanto que apenas 27% das medidas apresentaram crescimento alométrico positivo (em nenhuma foi isométrico). Na segunda análise, 91% das medidas apresentaram crescimento alométrico negativo, enquanto que apenas 9% do crescimento alométrico foi positivo (em nenhuma foi isométrico). Encontrou-se um mosaico heterocrônico nos caracteres cranianos, com processos pedomórficos e peramórficos. A análise que inclui o "Rincossauro de Mariante" e Scaphonyx sulcognathus permite concluir que durante a ontogenia dos espécimes, o crânio apresentava um crescimento alométrico positivo do rostro e do teto da região craniana propriamente dita, quando comparados com o comprimento total do crânio; indicando uma peramorfoclinal. Exceto as do rostro e do teto da região craniana, todas as demais medidas apresentaram alometria negativa quando comparadas ao comprimento total do crânio, refletindo uma pedomorfoclinal. A análise que exclui o "Rincossauro de Mariante" e Scaphonyx sulcognathus indica que, durante a ontogenia, o crânio apresentava um crescimento alométrico positivo apenas no rostro, evidenciado pelo aumento na pré-maxila. Duas das heterocronoclinais encontradas na evolução dos rincossauros são as mais usuais nos vertebrados como um todo, e devidas à progênese por um lado e à hipermorfose por outro. A neotenia no rostro, associada a uma provável progênese na mandíbula levou à formação do aspecto mais característico dos rincossauros, a pré-maxila curvada ventralmente e verticalizada. A peramorfoclinal por hipermorfose pode ter contribuído para a extinção do grupo. Nos vertebrados provavelmente estão sempre associados dois processos (progênese e hipermorfose), ou mais, como neotenia e aceleração no caso dos rincossauros. Os processos não são fenômenos isolados, mas sempre parte de heterocronoclinais; as quais podem resultar de respostas a diferentes solicitações ambientais, possibilitadas pela flexibilidade genotípica. As respostas podem ser aprofundadas, canalizadas e fixadas, levando ou ao surgimento de grupos novos (pedomorfoclinais por progênese) ou à extinção de outros (peramorfoclinais por hipermorfose). Processos heterocrônicos podem originar mudanças graduais, mas não necessariamente; o que permite concluir que nem sempre o registro fóssil é realmente "incompleto", mas sim por vezes reflexo de algum tipo de evolução não gradual. Heterocronia não é uma teoria científica, mas uma metodologia que permite reconhecer padrões fenotípicos complexos resultantes da ontogenia. / Heterochronic aspects in the evolution of the Rhynchosauria skull were studied as a contribution to a better understanding of the evolution of this group, as well as of vertebrates as a whole; for what Triassic material from Rio Grande do Sul State was used. The Principal Components Analysis on 22 skulls sample was accomplished to establish age classes; and Allometry Equation to establish alometric changes during ontogeny. One analysis included Hyperodapedon sp., Scaphonyx sulcognathus and the "Rincossauro de Mariante" specimens, and the other only Hyperodapedon sp. Specimens. Multivariate Statistic Analysis showed that the skull shape changes was in accordance with size. The morphologic changes in the different skull regions reflected in the alometric coefficients are a consequence of individual size changes. In the first analysis, 73% of measurements showed a negative alometric growth when compared to the total skull length, whereas only 27% showed positive alometric growth (no one was isometric). In the second analysis, 91% of the measurements showed negative alometric growth when compared to the total skull length, whereas only 9% showed positive alometric growth (no one was isometric). The study showed a heterochronic mosaic of skull characters due to the association of paedomorphic and peramorphic heterochronic processes. The data taken from the analysis including the "Rincossauro de Mariante" and Scaphonyx sulcognathus, led to conclude that during ontogeny the skull presented a positive alometric growth of the rostrum and superior skull region compared to total skull length. This morphologic pattern, when analyzed in phylogenetic terms, reflects a peramorphocline. Excepting from rostrum and the superior skull region, every measurement showed negative alometric growth when compared to total length skull. This pattern reflects a paedomorphocline. The data taken on the analysis excluding "Rincossauro de Mariante" and Scaphonyx sulcognathus, allowed to conclude that during ontogeny the skull has had a positive alometric growth only in the rostrum, as showed mostly by the increasing of the premaxilla. Two of the heterochronoclines recognized in the evolution of rhynchosaurs are as well the most frequent among vertebrates as a whole; and due to progenesis for one hand, and hypermorphosis for the other. Neoteny in the rostrum, associated to a probable progenesis in mandible has led to the formation of the most characteristic aspect of upper Triassic rhynchosaurs, a premaxilla verticalized and ventrally bent. The peramorphocline due to hypermorphosis may have contributed to the extinction of the group. In vertebrates probably there are always associated at least two processes (progenesis and hypermorphosis), or even more; such as neoteny and acceleration in the case of rhynchosaurs. Processes are not isolated phenomena but always part of heterochronoclines, which may result of environmental solicitations, made possible thanks to the genotypic flexibility. Responses may be deepened, canalized and fixed, leading sometimes to the origin of new groups (paedomorphoclines due to progenesis); whereas in others may lead to extinction (peramorphoclines due to hypermorphosis). Heterochronic processes may give rise to gradual changes but not necessarily; so that the fossil record not always is "incomplete", but actually may reflect some kind of not gradual evolution. Heterochrony should be understood not as a scientific theory, but as a methodology permitting to recognize complex phenotypic patterns resulting from ontogeny.

Aspectos heterocrônicos encontrados na evolução do crânio dos Rhynchosauria foram estudados como uma contribuição ao melhor entendimento da evolução deste grupo, bem como dos vertebrados em geral; para o que partiu-se do material Triássico do estado Rio Grande do Sul. A Análise dos Componentes Principais incluiu 22 crânios e foi utilizada para estabelecer classes de idades; a Equação de Alometria para estabelecer as modificações alométricas durante a ontogenia. Uma análise incluiu espécimes de Hyperodapedon sp., Scaphonyx sulcognathus e o "Rincossauro de Mariante"; e outra apenas espécimes de Hyperodapedon sp. A Análise Estatística Multivariada indicou que a alteração da forma craniana depende fortemente do tamanho. As alterações nas diferentes regiões do crânio, refletidas nos coeficientes alométricos, são uma consequência da alteração do tamanho dos indivíduos. Na primeira análise, 73% das medidas apresentaram crescimento alométrico negativo em relação à medida comparativa padrão, enquanto que apenas 27% das medidas apresentaram crescimento alométrico positivo (em nenhuma foi isométrico). Na segunda análise, 91% das medidas apresentaram crescimento alométrico negativo, enquanto que apenas 9% do crescimento alométrico foi positivo (em nenhuma foi isométrico). Encontrou-se um mosaico heterocrônico nos caracteres cranianos, com processos pedomórficos e peramórficos. A análise que inclui o "Rincossauro de Mariante" e Scaphonyx sulcognathus permite concluir que durante a ontogenia dos espécimes, o crânio apresentava um crescimento alométrico positivo do rostro e do teto da região craniana propriamente dita, quando comparados com o comprimento total do crânio; indicando uma peramorfoclinal. Exceto as do rostro e do teto da região craniana, todas as demais medidas apresentaram alometria negativa quando comparadas ao comprimento total do crânio, refletindo uma pedomorfoclinal. A análise que exclui o "Rincossauro de Mariante" e Scaphonyx sulcognathus indica que, durante a ontogenia, o crânio apresentava um crescimento alométrico positivo apenas no rostro, evidenciado pelo aumento na pré-maxila. Duas das heterocronoclinais encontradas na evolução dos rincossauros são as mais usuais nos vertebrados como um todo, e devidas à progênese por um lado e à hipermorfose por outro. A neotenia no rostro, associada a uma provável progênese na mandíbula levou à formação do aspecto mais característico dos rincossauros, a pré-maxila curvada ventralmente e verticalizada. A peramorfoclinal por hipermorfose pode ter contribuído para a extinção do grupo. Nos vertebrados provavelmente estão sempre associados dois processos (progênese e hipermorfose), ou mais, como neotenia e aceleração no caso dos rincossauros. Os processos não são fenômenos isolados, mas sempre parte de heterocronoclinais; as quais podem resultar de respostas a diferentes solicitações ambientais, possibilitadas pela flexibilidade genotípica. As respostas podem ser aprofundadas, canalizadas e fixadas, levando ou ao surgimento de grupos novos (pedomorfoclinais por progênese) ou à extinção de outros (peramorfoclinais por hipermorfose). Processos heterocrônicos podem originar mudanças graduais, mas não necessariamente; o que permite concluir que nem sempre o registro fóssil é realmente "incompleto", mas sim por vezes reflexo de algum tipo de evolução não gradual. Heterocronia não é uma teoria científica, mas uma metodologia que permite reconhecer padrões fenotípicos complexos resultantes da ontogenia. / Heterochronic aspects in the evolution of the Rhynchosauria skull were studied as a contribution to a better understanding of the evolution of this group, as well as of vertebrates as a whole; for what Triassic material from Rio Grande do Sul State was used. The Principal Components Analysis on 22 skulls sample was accomplished to establish age classes; and Allometry Equation to establish alometric changes during ontogeny. One analysis included Hyperodapedon sp., Scaphonyx sulcognathus and the "Rincossauro de Mariante" specimens, and the other only Hyperodapedon sp. Specimens. Multivariate Statistic Analysis showed that the skull shape changes was in accordance with size. The morphologic changes in the different skull regions reflected in the alometric coefficients are a consequence of individual size changes. In the first analysis, 73% of measurements showed a negative alometric growth when compared to the total skull length, whereas only 27% showed positive alometric growth (no one was isometric). In the second analysis, 91% of the measurements showed negative alometric growth when compared to the total skull length, whereas only 9% showed positive alometric growth (no one was isometric). The study showed a heterochronic mosaic of skull characters due to the association of paedomorphic and peramorphic heterochronic processes. The data taken from the analysis including the "Rincossauro de Mariante" and Scaphonyx sulcognathus, led to conclude that during ontogeny the skull presented a positive alometric growth of the rostrum and superior skull region compared to total skull length. This morphologic pattern, when analyzed in phylogenetic terms, reflects a peramorphocline. Excepting from rostrum and the superior skull region, every measurement showed negative alometric growth when compared to total length skull. This pattern reflects a paedomorphocline. The data taken on the analysis excluding "Rincossauro de Mariante" and Scaphonyx sulcognathus, allowed to conclude that during ontogeny the skull has had a positive alometric growth only in the rostrum, as showed mostly by the increasing of the premaxilla. Two of the heterochronoclines recognized in the evolution of rhynchosaurs are as well the most frequent among vertebrates as a whole; and due to progenesis for one hand, and hypermorphosis for the other. Neoteny in the rostrum, associated to a probable progenesis in mandible has led to the formation of the most characteristic aspect of upper Triassic rhynchosaurs, a premaxilla verticalized and ventrally bent. The peramorphocline due to hypermorphosis may have contributed to the extinction of the group. In vertebrates probably there are always associated at least two processes (progenesis and hypermorphosis), or even more; such as neoteny and acceleration in the case of rhynchosaurs. Processes are not isolated phenomena but always part of heterochronoclines, which may result of environmental solicitations, made possible thanks to the genotypic flexibility. Responses may be deepened, canalized and fixed, leading sometimes to the origin of new groups (paedomorphoclines due to progenesis); whereas in others may lead to extinction (peramorphoclines due to hypermorphosis). Heterochronic processes may give rise to gradual changes but not necessarily; so that the fossil record not always is "incomplete", but actually may reflect some kind of not gradual evolution. Heterochrony should be understood not as a scientific theory, but as a methodology permitting to recognize complex phenotypic patterns resulting from ontogeny.

Aspectos heterocrônicos encontrados na evolução do crânio dos Rhynchosauria foram estudados como uma contribuição ao melhor entendimento da evolução deste grupo, bem como dos vertebrados em geral; para o que partiu-se do material Triássico do estado Rio Grande do Sul. A Análise dos Componentes Principais incluiu 22 crânios e foi utilizada para estabelecer classes de idades; a Equação de Alometria para estabelecer as modificações alométricas durante a ontogenia. Uma análise incluiu espécimes de Hyperodapedon sp., Scaphonyx sulcognathus e o "Rincossauro de Mariante"; e outra apenas espécimes de Hyperodapedon sp. A Análise Estatística Multivariada indicou que a alteração da forma craniana depende fortemente do tamanho. As alterações nas diferentes regiões do crânio, refletidas nos coeficientes alométricos, são uma consequência da alteração do tamanho dos indivíduos. Na primeira análise, 73% das medidas apresentaram crescimento alométrico negativo em relação à medida comparativa padrão, enquanto que apenas 27% das medidas apresentaram crescimento alométrico positivo (em nenhuma foi isométrico). Na segunda análise, 91% das medidas apresentaram crescimento alométrico negativo, enquanto que apenas 9% do crescimento alométrico foi positivo (em nenhuma foi isométrico). Encontrou-se um mosaico heterocrônico nos caracteres cranianos, com processos pedomórficos e peramórficos. A análise que inclui o "Rincossauro de Mariante" e Scaphonyx sulcognathus permite concluir que durante a ontogenia dos espécimes, o crânio apresentava um crescimento alométrico positivo do rostro e do teto da região craniana propriamente dita, quando comparados com o comprimento total do crânio; indicando uma peramorfoclinal. Exceto as do rostro e do teto da região craniana, todas as demais medidas apresentaram alometria negativa quando comparadas ao comprimento total do crânio, refletindo uma pedomorfoclinal. A análise que exclui o "Rincossauro de Mariante" e Scaphonyx sulcognathus indica que, durante a ontogenia, o crânio apresentava um crescimento alométrico positivo apenas no rostro, evidenciado pelo aumento na pré-maxila. Duas das heterocronoclinais encontradas na evolução dos rincossauros são as mais usuais nos vertebrados como um todo, e devidas à progênese por um lado e à hipermorfose por outro. A neotenia no rostro, associada a uma provável progênese na mandíbula levou à formação do aspecto mais característico dos rincossauros, a pré-maxila curvada ventralmente e verticalizada. A peramorfoclinal por hipermorfose pode ter contribuído para a extinção do grupo. Nos vertebrados provavelmente estão sempre associados dois processos (progênese e hipermorfose), ou mais, como neotenia e aceleração no caso dos rincossauros. Os processos não são fenômenos isolados, mas sempre parte de heterocronoclinais; as quais podem resultar de respostas a diferentes solicitações ambientais, possibilitadas pela flexibilidade genotípica. As respostas podem ser aprofundadas, canalizadas e fixadas, levando ou ao surgimento de grupos novos (pedomorfoclinais por progênese) ou à extinção de outros (peramorfoclinais por hipermorfose). Processos heterocrônicos podem originar mudanças graduais, mas não necessariamente; o que permite concluir que nem sempre o registro fóssil é realmente "incompleto", mas sim por vezes reflexo de algum tipo de evolução não gradual. Heterocronia não é uma teoria científica, mas uma metodologia que permite reconhecer padrões fenotípicos complexos resultantes da ontogenia. / Heterochronic aspects in the evolution of the Rhynchosauria skull were studied as a contribution to a better understanding of the evolution of this group, as well as of vertebrates as a whole; for what Triassic material from Rio Grande do Sul State was used. The Principal Components Analysis on 22 skulls sample was accomplished to establish age classes; and Allometry Equation to establish alometric changes during ontogeny. One analysis included Hyperodapedon sp., Scaphonyx sulcognathus and the "Rincossauro de Mariante" specimens, and the other only Hyperodapedon sp. Specimens. Multivariate Statistic Analysis showed that the skull shape changes was in accordance with size. The morphologic changes in the different skull regions reflected in the alometric coefficients are a consequence of individual size changes. In the first analysis, 73% of measurements showed a negative alometric growth when compared to the total skull length, whereas only 27% showed positive alometric growth (no one was isometric). In the second analysis, 91% of the measurements showed negative alometric growth when compared to the total skull length, whereas only 9% showed positive alometric growth (no one was isometric). The study showed a heterochronic mosaic of skull characters due to the association of paedomorphic and peramorphic heterochronic processes. The data taken from the analysis including the "Rincossauro de Mariante" and Scaphonyx sulcognathus, led to conclude that during ontogeny the skull presented a positive alometric growth of the rostrum and superior skull region compared to total skull length. This morphologic pattern, when analyzed in phylogenetic terms, reflects a peramorphocline. Excepting from rostrum and the superior skull region, every measurement showed negative alometric growth when compared to total length skull. This pattern reflects a paedomorphocline. The data taken on the analysis excluding "Rincossauro de Mariante" and Scaphonyx sulcognathus, allowed to conclude that during ontogeny the skull has had a positive alometric growth only in the rostrum, as showed mostly by the increasing of the premaxilla. Two of the heterochronoclines recognized in the evolution of rhynchosaurs are as well the most frequent among vertebrates as a whole; and due to progenesis for one hand, and hypermorphosis for the other. Neoteny in the rostrum, associated to a probable progenesis in mandible has led to the formation of the most characteristic aspect of upper Triassic rhynchosaurs, a premaxilla verticalized and ventrally bent. The peramorphocline due to hypermorphosis may have contributed to the extinction of the group. In vertebrates probably there are always associated at least two processes (progenesis and hypermorphosis), or even more; such as neoteny and acceleration in the case of rhynchosaurs. Processes are not isolated phenomena but always part of heterochronoclines, which may result of environmental solicitations, made possible thanks to the genotypic flexibility. Responses may be deepened, canalized and fixed, leading sometimes to the origin of new groups (paedomorphoclines due to progenesis); whereas in others may lead to extinction (peramorphoclines due to hypermorphosis). Heterochronic processes may give rise to gradual changes but not necessarily; so that the fossil record not always is "incomplete", but actually may reflect some kind of not gradual evolution. Heterochrony should be understood not as a scientific theory, but as a methodology permitting to recognize complex phenotypic patterns resulting from ontogeny.

Orientador: Maria Luiza Silveira Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T21:08:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_AlbertodaSilva_D.pdf: 18240611 bytes, checksum: 0c094268046690a939c185449986f74f (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Envelhecimento pode ser definido como as mudanças sofridas por um organismo ao longo do tempo. Esse processo, em biologia, é denominado senescência. A senescência celular é um fenômeno observado em células isoladas, e tem sido estudada tipicamente em células em cultura. Sua ocorrência in vivo foi observada em alguns tecidos de mamíferos. As mudanças na estrutura e organização da cromatina que ocorrem em células senescentes incluem, aumento na resistência da cromatina à digestão por nucleases e acúmulo de modificações de histonas e proteínas associadas à heterocromatina. Embora nem todas as células em um organismo envelhecido estejam em estado de senescência, espera-se que mudanças na estrutura e organização da cromatina ocorram. A restrição calórica é a única intervenção conhecida que tem a capacidade de estender o tempo de vida em mamíferos. Após uma dieta de restrição calórica ou jejum muitos genes, cuja expressão encontra-se alterada em animais idosos, têm sua expressão restabelecida aos níveis observados em animais jovens. Acredita-se que mudanças na cromatina também possam ocorrer durante o jejum, e que induzam mudanças no nível de expressão de diversos genes. No presente trabalho, buscando-se alterações na organização da cromatina em hepatócitos de camundongo ao longo do envelhecimento ou submetidos ao jejum, observou-se um aumento das propriedades viscoelásticas da cromatina ao longo do envelhecimento, de acordo com as mudanças na habilidade dessa cromatina em formar fibras estendidas de cromatina. Essas diferenças foram acompanhadas por um desempacotamento da cromatina. Observou-se também que essa viscoelasticidade da cromatina era dependente principalmente de interações desta com a matriz nuclear, e que cópias de genes cuja atividade transcricional não é mais requerida, ou requerida em um nível menor em animais idosos, podem desligar-se temporariamente da matriz nuclear. Mudanças nas propriedades viscoelásticas da cromatina e no seu grau de compactação já haviam sido observadas previamente em animais em jejum. Apesar disso, no presente trabalho, nenhuma diferença com relação à interação dos genes rDNA com a matriz nuclear foi encontrada em animais em jejum. Contudo, independente da condição fisiológica, o DNA aderido à matriz nuclear parece ser rico em genes, enquanto as seqüências heterocromáticas, pobres em genes, geralmente são encontradas tanto associadas com a matriz nuclear quanto dissociadas desta (cuidado com essa conclusão. Está forte). Em hepatócitos de animais idosos foi observado acúmulo de marcadores heterocromáticos (modificações de histonas) e de outras proteínas (proteínas formadoras de heterocromatina e glicoproteínas presentes principalmente nos cromocentros), assim como diminuição das modificações de histonas associadas com transcrição ativa. Todas essas modificações estão relacionadas com alterações na síntese de RNA já relatadas para animais idosos, e são uma evidência de que o controle da expressão gênica, a organização e a composição da cromatina estão intimamente relacionados. Em um outro tipo celular como espermatozóides de camundongo, uma diferente organização nuclear levou a propriedades diferenciadas de sua cromatina com relação às suas propriedades viscoelásticas (aumentadas). Tais diferenças possivelmente estejam relacionadas com um padrão modificado de expressão gênica, uma vez que em espermatozóides, a atividade transcricional é nula ou quase ausente / Abstract: Aging may be defined as the changes that take place in an organism with time. This process, in biology, is called senescence. Cellular senescence is observed in isolated cells, and has been studied typically in cultured cells, but its occurrence in vivo has been shown only in some mammalian tissues. Chromatin changes that take place with cellular senescence include increase in the resistance of chromatin to nuclease digestion and accumulation of histone modifications and non-histone proteins associated with heterochromatin. Although not all cells in an aged organism are subjected to cellular senescence, it is expected that changes in the chromatin structure and organization still occur. Caloric restriction is the only intervention known to extend life span in mammals. It has been shown that many genes whose expression pattern is altered in aged animals can be reverted to the levels observed in young animals after a caloric restriction diet or complete food withdrawal. Changes in chromatin structure may occur during the starvation period to induce changes in the expression level of several genes. With the aim of screening for alterations in the chromatin organization in mouse hepatocyte nuclei with aging or following starvation, we observed an increase in the viscoelastic properties of chromatin with aging, in terms of changes in the ability of this chromatin to form extended chromatin fibers after a lysis treatment in liver imprints on histological slides. These differences were accompanied by chromatin unpackage. Most of the viscoelasticity of the chromatin were dependent on its interactions with the nuclear matrix, and copies of genes whose transcription are no longer required in aged animals, tended to detach from the nuclear matrix. Changes in the viscoelastic properties and packing degree of chromatin had been shown previously in starved animals. However, no differences regarding this feature were seen in the present work. Nevertheless, regardless the physiological condition, DNA attached to the nuclear matrix seems to be gene-rich, while heterochromatic gene-poor regions were found both attached and detached from the nuclear matrix. We observed accumulation of heterochromatic marks (histone modifications) and non-histone proteins (heterochromatin proteins and glycoproteins present mainly in the chromocenters), as well as decreased histone modifications associated with transcription in hepatocyte nuclei of aged mice. All these changes are related to altered RNA synthesis observed in aged animals and are an evidence of the strong relationship between chromatin organization, composition, and control of gene expression. In another cell type, mouse sperm cells, its nuclear organization lead to different chromatin properties regarding its viscoelastic properties (increased). These differences are possibly related to a modified pattern of gene expression since gene transcription is almost or completely absent in sperm cells / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Maria Luiza Silveira Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T03:24:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alvarenga_EleniceMonte_M.pdf: 2829254 bytes, checksum: 964b17aaf1c7f50d4471a7be569aaa6d (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A cromatina pode existir em núcleos interfásicos em dois estados distintos: como eucromatina e como heterocromatina, podendo ser esta constitutiva ou facultativa. Em células somáticas do final da fase ninfal dos hemípteros reduviídeos Triatoma infestans e Panstrongylus megistus há núcleos grandes, poliploides, nos quais a heterocromatina apresenta-se como corpos conspícuos (cromocentros), daí tais células apresentarem-se como um bom modelo para investigação de características morfológicas e funcionais da cromatina. Em estudos sobre a constituição cromatínica, a composição em bases do DNA é algo muito explorado, dado o conteúdo informativo dos achados. Já quando se objetiva a investigação da funcionalidade da cromatina, mais recentemente, tem-se feito uso da abordagem epigenética. Neste trabalho buscou-se investigar a composição em bases do DNA destas células, associando-a aos domínios cromatínicos aí existentes e também à presença das NORs. Por meio de colorações fluorescentes com Cromomicina A3 (CMA3)/Distamicina e 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)/Actinomicina D concluiuse que o DNA dos cromocentros de T. infestans e P. megistus são ricos em sequências AT e pobres em GC. Isto foi ainda confirmado por imunodetecção de 5-metilcitosina, que ocorreu somente na eucromatina, e tratamento de ninfas de T. infestans com 5-aza-2'-deoxicitidina (agente demetilante), seguido da análise dos fenótipos nucleares e análise de imagem, em que se observou expansão somente da área eucromática. Com o método de AgNOR evidenciou-se que a região rica em bases GC ao redor do cromocentro coincide com um acúmulo de proteínas argirofílicas, o que sugere associação com NORs. A presença de modificações epigenéticas nas caudas das histonas na cromatina destes insetos foi investigada por meio do uso de anticorpos contra marcadores epigenéticos específicos, permitindo identificar a participação diferencial dos mesmos na composição e na estrutura dos territórios heterocromáticos. Assim, observou-se hipoacetilação e hipermetilação de histonas na região do corpo heterocromático, o que indicaria uma possível ação da modificação de histonas na manutenção da estrutura heterocromática nas células somáticas de ambas as espécies de reduviídeos. Por meio da avaliação da ação de drogas inibidoras de deacetilases de histonas sobre a cromatina dos insetos percebeu-se que, quando ninfas de T. infestans e P. megistus foram tratadas com as drogas, houve aumento na frequência de necroses e, no caso específico do tratamento com tricostatina A (TSA) e butirato de sódio (NaBt), ocorreu descompactação da heterocromatina. Sugere-se que o tratamento com TSA e NaBt afete o processo de deacetilação de histonas, o qual seria, então, um fator importante na estruturação dos cromocentros. A observação da ocorrência de mudas e da sobrevivência de ninfas de T. infestans, realizada a fim de se avaliar a ação do ácido valproico (VPA) sobre o desenvolvimento dos insetos, mostrou que a droga, assim como a injeção de solução salina, reduziu seu período de sobrevivência, além de afetar a ocorrência de mudas / Abstract: Chromatin in interphase cell nuclei can be present in two distinct states: euchromatin and heterochromatin, which may be constitutive or facultative. In somatic cells at the end of the nymphal stage of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus there are large nuclei, in which heterochromatin is presented as conspicuous bodies (chromocenters). These cells are an appropriate model for investigation of morphological and functional characteristics of the chromatin. In studies about chromatin constitution, the base DNA composition is explored due to the informational content of the findings. If the objective is to investigate the chromatin functionality, recently has been used the epigenetic approach. In the current study, the aim was to investigate the DNA base composition in these cells, associating with the chromatin domains therein and also the presence of NORs. Through fluorescent stains with Chromomycin A3 (CMA3)/Distamycin and 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI)/Actinomycin D was found that the chromocenters DNA of T. infestans and P. megistus were AT-rich and GC-poor. This was also confirmed by immunodetection of 5-methylcytidine, which occurred only in the euchromatin, and by T. infestans nymphs treatment with 5-aza-2'- deoxycytidine (demethylating agent), followed by nuclear phenotypes analysis and image analysis, in which expansion was observed only in the euchromatic area. AgNOR test evidenced that the GC-rich region around the chromocenter coincides with an accumulation of argyrophilic proteins, suggesting association with NORs. Epigenetic modifications on histone tails in chromatin of these insects were investigated by using antibodies against specific epigenetic markers, in order to identify their differential participation in the composition and structure of these heterochromatic regions. It was observed hypoacetylation and hypermethylation in heterochromatic body area, suggesting a possible action of histones modification in the maintenance of the heterochromatic structure in somatic cells of both species of reduviids. Through evaluation of histones deacetylases inhibitors action on the chromatin, it was observed that when T. infestans and P. megistus nymphs were treated with these drugs there was an increase in the frequencies of necrosis, and in the specific case of Trichostatin A (TSA) and sodium butyrate (NaBt), occurred heterochromatin decondensation. It is suggested that treatments with TSA and NaBt could affect the histones deacetilation process, which would be an important factor in chromocenters structuring. Observations of the molting occurrence and survival of T. infestans nymphs, carried out in order to evaluate the action of valproic acid (VPA) on the development of insects, showed that this drug, as well as injection of saline, reduced the survival period, besides affecting the molting occurrence / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Marcelo Rocha Marques / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba. / Made available in DSpace on 2018-08-20T06:47:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camargo_Glauciade1985-_M.pdf: 1041410 bytes, checksum: aba09e2e49414c9f9f0be4938f591a70 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A periodontite crônica é uma doença inflamatória que leva à perda de inserção de elementos dentários, e é desencadeada e mantida por um biofilme subgengival periodontopatogênico. A presença de alguns tipos de lipopolissacarídeos (LPS), derivados de bactérias no sítio periodontal doente, pode iniciar uma sinalização por meio das células do tecido gengival, que culminará com um microambiente com diferentes células do sistema imune e com uma alteração no padrão de expressão de citocinas inflamatórias. Já foi evidenciado que no tecido gengival de pacientes com periodontite crônica, genes que codificam receptores celulares para o LPS, podem sofrer alterações epigenéticas. O objetivo deste estudo foi avaliar se a periodontite crônica e o LPS bacteriano derivado de P. gingivalis podem modular a expressão gênica de alguns fatores reguladores de eventos epigenéticos. Biópsias de tecido gengival inflamado e sem inflamação foram coleados de pacientes com periodontite crônica e de pacientes saudáveis respectivamente, o RNA total foi extraído e a expressão dos genes DNMT1 (DNA metiltransferase 1), DNAMT3a (DNA metiltransferase 3a), histona demetilase JMJD3 e histona demetilase UTX foram analisadas por meio de RT-PCR quantitativo. Fibroblastos gengivais humanos derivados de cultura primária, e queratinócitos (HaCaT) foram expostos a LPS de P. gingivalis ou ao veículo do LPS, e foram avaliadas a viabilidade celular por meio do teste MTT e a expressão gênica de DNMT1, DNMT3a, JMJD3 e UTX por meio de RT-PCR quantitativo. As análises dos resultados demonstraram que nem a periodontite e nem o LPS exposto a fibroblastos gengivais foram capazes de modular a expressão dos genes estudados. Contudo, o LPS promoveu a diminuição da expressão de DNMT1, DNMT3a e JMJD3 nas células HaCaT. Pode-se concluir que LPS derivado P. gingivalis pode modular, em queratinócitos, a expressão gênica de algumas enzimas promotoras de eventos epigenéticos / Abstract: The aim of this study was to assess whether P. gingivalis LPS can modulate, in culture of the human keratinocytes and human gingival fibroblasts, gene expression levels of the some enzymes that promote epigenetic events. In addition, the same enzymes were evaluated in sample from healthy and periodontitis affected individuals. Primary gingival fibroblast culture and keratinocytes (HaCaT) were treated with medium containing P. gingivalis LPS or P. gingivalis LPS vehicle for 24hs. After this period, cell viability were assessed by MTT test, and total RNA were extracted to evaluate gene expression levels of the enzymes: DNMT1 (DNA methyltransferase 1), DNMT3a (DNA methyltransferase 3a), histone demethylases JMJD3 and UTX, by qRT-PCR. To evaluate the gene expression in healthy and periodontitis affected individuals, total RNA was extracted from biopsies of gingival tissue from sites with (periodontitis) or without periodontitis (healthy), and gene expression of DNMT1, DNAMT3a, JMJD3 and UTX were evaluated by qRT-PCR. No significant differences were found in the gene expression analysis between healthy gingival tissues and gingival tissue from periodontitis sites. The results showed that LPS downregulated DNMT1 (p<0.05), DNMT3a (p<0.05) and JMJD3 (p<0.01) gene expression in HaCaT cells, but no modulation was found to gingival fibroblasts. P. gingivalis LPS exposure to keratinocytes, downregulates gene expression of the enzymes that promote epigenetic events / Mestrado / Histologia e Embriologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

During each life cycle, gametes must preserve and pass on both genetic and epigenetic information, making the germline both immortal and totipotent. In the male germline the dramatic morphological transformation of a germ cell through meiosis, into a sperm competent for fertilization, while retaining this information is an incredible example of cellular differentiation. This process of spermatogenesis is inherently thermosensitive in numerous metazoa ranging from worms to man. Here, I describe the role of two redundant AGO-class paralogs, ALG-3/4, and their small RNA cofactors, in promoting thermotolerant male fertility in Caenorhabditis elegans. alg-3/4 double mutants exhibit temperature dependent sterility resulting from defective spermiogenesis, the postmeiotic differentiation of haploid spermatids into spermatozoa competent for fertilization. The essential Argonaute CSR-1 functions with ALG-3/4 to positively regulate target genes required for spermiogenesis by promoting transcription via a small RNA positive feedback loop. Our findings suggest that ALG-3/4 functions during spermatogenesis to amplify a small-RNA signal loaded into CSR-1 to maintain transcriptionally active chromatin at genes required for spermiogenesis and to provide an epigenetic memory of male-specific gene expression. CSR-1, which is abundant in mature sperm, appears to transmit this memory to offspring. Surprisingly, in addition to small RNAs targeting male-specific genes, we show that males also harbor an extensive repertoire of CSR-1 small RNAs targeting oogenesis-specific mRNAs. The ALG-3/4 small RNA pathway also initiates silencing small RNA signals loaded into WAGO vii Argonautes, which function to posttranscripitonally silence their target mRNAs. Silencing WAGO/small RNA-complexes are present in sperm and presumably transmitted to offspring upon fertilization. Together these findings suggest that C. elegans sperm transmit not only the genome but also epigenetic activating and silencing signals in the form of Argonaute/small-RNA complexes, constituting a memory of gene expression in preceding generations.