Au cours de l'endocytose, les cargos de membrane plasmique (PM) sont internalisés puis dirigés vers l'endosome précoce (EE), les corps multivésiculaires (MVBs), puis le lysosome/vacuole pour dégradation. Le ciblage des protéines vers les zones invaginées des MVBs requiert l'action des complexes ESCRTs. Chez la levure comme chez les mammifères, les mutants déficients pour ces complexes présentent un compartiment endosomal anormal (Cl E) et une accumulation à la PM de diverses protéines. Nous avons montré que chez S. cerevisiae la stabilisation de la perméase à uracile (Fur4p) à la PM dans les mutants ESCRTs résulte de son recyclage vers la PM après internalisation. Fur4p ne traverse pas les compartiments Golgiens lors de son recyclage depuis le compartiment Cl E. Cette voie de recyclage est distincte de celle empruntée par la v-SNARE Snc1p. Fur4p est également capable de recycler depuis l'EE et suit alors la même voie de recyclage que Snc1p. Ceci suggère une complexité inattendue des voies de recyclage chez la levure.<br />Nous nous sommes aussi intéressés à Irs4p et Tax4p, 2 protéines à domaine EH, un domaine trouvé jusqu'alors dans des protéines impliquées dans l'endocytose ou le recyclage. Irs4p et Tax4p ne sont pas impliquées dans ces processus mais interviennent de façon redondante au cours de l'autophagie, un transport catabolique vésiculaire de fractions de cytoplasme ou d'organelles vers le lysosome/vacuole. Irs4p et Tax4p interagissent physiquement avec la machinerie d'autophagie et sont partiellement localisées à la structure Pré-autophagosomale, d'où émanent les vésicules d'autophagie. Ces résultats étendent donc la panoplie des fonctions des protéines à domaine EH.

Viruses are infectious agents that must infect the cells of living organisms in order to reproduce. They have relatively simple genomes which encode few proteins but can compensate for their simplicity by hijacking components of their cellular hosts. Arenaviruses, a family of zoonotic viruses carried by rodents, encode only 4 proteins. One of these proteins, Z, is responsible for several functions during the virus life cycle including driving the formation and release of new virus particles at the plasma membrane of infected cells. Relatively little is known about how this viral protein is regulated or the complement of host proteins it engages in order to produce new virus particles or augment Z's other functions. To address this gap in knowledge, mass spectrometry was used to identify phosphorylation sites in the Old World arenavirus, lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) Z protein. Phosphorylation sites were identified at serine 41 (S41) and tyrosine 88 (Y88). Functional studies using recombinant (r)LCMV containing mutations at these phosphorylation sites revealed that both were important for the production of defective interfering (DI) particles. DI particles are replication-incompetent virus particles that interfere with the production of infectious virus and mitigate its cytopathic effect. While a mutation that mimics phosphorylation at S41 reduced LCMV's ability to produce both infectious and DI particles, this mutation had a much stronger impact on DI particles. Production of DI particles in Y88-mutant rLCMV was drastically reduced while the impact on infectious virus was minimal. Y88 lies within a type of viral late domain (PPXY) also found in matrix proteins of several disparate virus families where it has been shown to drive infectious virus release by recruiting the membrane scission machinery of the cellular endosomal sorting complex required for transport (ESCRT). Inhibition of the ESCRT pathway drastically reduced LCMV DI particle but not infectious virus release indicating that Z's PPXY late domain and the cellular ESCRT complex are required specifically for the production of DI particles. Mass spectrometry was also used to identify host protein partners of Z as well as the host proteins recruited into virus particles for the New World arenavirus, Junin (JUNV). ESCRT complex proteins were enriched in JUNV virus-like particles (VLPs) and bona fide virions. In contrast to LCMV, inhibition of the ESCRT complex resulted in significantly less infectious JUNV release. This indicates that the ultimate role of ESCRT engagement by the Old World arenavirus, LCMV, differs from that of New World, JUNV. This work represents the first demonstration that a viral protein motif and the host machinery it engages selectively drive DI particle production independently of infectious virus. It also suggests that host cell kinases can dynamically regulate the production of DI particles through phosphorylation of Z. Finally, the late domain-mutant rLCMV generated in these studies represents the first LCMV strain known to produce undetectable levels of DI particles which provides the opportunity to assess the impact that a loss of DI particles has on the ability of LCMV to establish or maintain a persistent infection.

Alix est une protéine adaptatrice impliquée dans plusieurs processus intracellulaires, dont l'apoptose, l'endocytose et le trafic membranaire, le bourgeonnement de certains rétrovirus (ex. HIV-1, EIAV) à travers la membrane plasmique ou encore la cytokinèse. Alix est constituée de trois domaines majeurs: un domaine BRO N-terminal, un domaine spécifique « en V » central (Alix-V) et un domaine C-terminal riche en prolines (PRD). Nous avons montré que la forme tronquée en C-terminal au niveau du domaine PRD (Alix-∃PRD) formait des monomères et des dimères en solution, et que le domaine Alix-V était suffisant pour permettre cette dimérisation. La diffraction de rayons X aux petits angles (SAXS) a montré que Alix-∃PRD se structurait en une forme incurvée et allongée qui rappelle les domaines BAR impliqués dans les phénomènes d'incurvation de membrane. Bien que l'interaction d'Alix avec la membrane ait été mise en évidence in vitro, sa capacité à déformer la membrane doit encore être confirmée. En outre, nous avons déterminé lors d'expériences de microcalorimétrie que les formes monomériques et dimériques de Alix-V interagissent avec un peptide dérivé de la protéine p9 EIAV Gag avec une affinité de l'ordre du micromolaire. Des cristaux de la forme dimérique de Alix-V ont été obtenus. Ces cristaux présentaient un faible pouvoir de diffraction (10Å). En revanche, des cristaux diffractant à 3Å ont été obtenus à partir d'une forme mutante de Alix-V (Mut1) incapable de dimériser et qui se structure en une forme monomérique ouverte et allongée ; la résolution de cette structure est en cours. De plus, nous avons montré que l'absence de relarguage des particules virales (VLP) après surexpression de la forme humaine de Alix-∃Bro (résidus 358-868) pouvait être rétablie à partir de la version Mut1 de cette forme, ce qui suggère donc un rôle de cette dimérisation dans le relarguage des VLP. La protéine Alix-V dimérique a également été utilisée pour produire un antisérum Alix, qui a montré que la protéine endogène Alix pouvait être co-localiser avec les endosomes de recyclage. Enfin, nous avons montré que CHMP4B formant des structures polymériques en anneaux, pouvait interagir avec Alix. L'ensemble de ces résultats donne de nouvelles informations sur la flexibilité conformationnelle d'Alix et, associée avec CHMP4, sur son implication dans les processus de bourgeonnement membranaire. Ce travail définit également le cadre des futures analyses fonctionnelles visant à définir le rôle de la protéine dimérique Alix dans les cellules infectées par le virus HIV-1.

CE TRAVAIL A PORTE SUR L'ETUDE DE LA PROTEINE MULTIMODULAIRE ALIX CHEZ DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM, UN ORGANISME EUCARYOTE Où DEVELOPPEMENT MULTICELLULAIRE ET PROGRAMME DE MORT CELLULAIRE SONT ETROITEMENT LIES. L'INVALIDATION D'ALX MONTRE QUE CETTE PROTEINE EST ESSENTIELLE A LA DIFFERENCIATION CELLULAIRE ET A LA MORPHOGENESE AU COURS DU DEVELOPPEMENT MULTICELLULAIRE MAIS PAS AU PROGRAMME DE MORT. UNE APPROCHE STRUCTURE/FONCTION A REVELE QUE LE DOMAINE SUSCEPTIBLE DE PARTICIPER A DES TORSADES D'HELICES DE CETTE PROTEINE EST INDISPENSABLE A SA FONCTION DEVELOPPEMENTALE. DE PLUS, SA DISTRIBUTION CELLULAIRE INDIQUE QU'ALIX EST LOCALISE DANS LA VOIE ENDOCYTAIRE EN ASSOCIATION AVEC LA MACHINERIE ESCRT (ENDOSOMAL SORTING COMPLEX REQUIRED FOR TRANSPORT), IMPLIQUEE DANS LE TRI ET LA FORMATION DU CORPS MULTIVESICULAIRE (MVB). CEPENDANT, L'INVALIDATION DES GENES CODANTS POUR DIFFERENTS COMPOSANTS DES COMPLEXES ESCRT INDUIT DES PHENOTYPES DISSEMBLABLES. CECI SUGGERE QUE SOIT CES PROTEINES ONT DES ROLES DANS D'AUTRES PROCESSUS CELLULAIRES SOIT QUE CETTE VOIE N'EST PAS PERTURBEE DE LA MEME FAÇON DANS LES DIFFERENTS MUTANTS.

La cellule remodèle sa membrane en permanence, ce qui entraîne la formation de tubes de membrane façonnés par des protéines. Nous étudions trois cas impliquant de tels tubes. Le premier est le polymère hélicoïdal de dynamine, qui enveloppe les tubes de membrane puis les coupe en hydrolysant le GTP. Nous montrons que le recrutement de la dynamine dépend de la courbure de la membrane. Nous formulons des hypothèses et proposons des expériences pour comprendre la nucléation du polymère de dynamine et ses interactions avec la membrane. Nous donnons une description hydrodynamique généralisée du changement de conformation coopératif de la dynamine induit par le GTP et réconcilions des résultats expérimentaux apparemment contradictoires par des arguments mécaniques. La dynamique aux temps longs de l'assemblage dynamine-membrane est diffusive et dominée par une friction effective entre dynamine et membrane, ce qui est confirmé expérimentalement. Notre second sujet est le complexe ESCRT-III, qui tubule les membranes planes de l'intérieur. Nous expliquons cette déformation par une instabilité de flambage inédite se produisant lorsque des filaments courbés qui s'attirent se lient à la membrane. Cette hypothèse peut être vérifiée expérimentalement. Un régime métastable pour la membrane plane est mis en évidence, et pourrait être utilisé par la cellule pour former des tubes rapidement. Troisièment, nous nous tournons vers les stéréocils, des protrusions cellulaires à base d'actine essentielles pour l'audition. Nous expliquons leur forme par la dynamique de détachement de protéines liant l'actine, et rendons compte de résultats expérimentaux. Si ces protéines sont autorisées à se réattacher, notre modèle prévoit une transition de phase dynamique vers un état de croissance non-bornée, et des simulations numériques suggèrent que la longueur des protrusions diverge en loi de puissance avec un exposant anormal.

La dernière étape de la cytocinèse, l'abscission, consiste en la coupure du pont intercellulaire reliant les deux cellules filles à la suite de la contraction de l'anneau acto-myosique. Comme toutes les étapes de la division cellulaire, l'abscission doit être régulée dans l'espace et dans le temps afin qu'elle intervienne au bon endroit et au bon moment. Mon travail de doctorat a porté sur l'étude de la régulation dans le temps de l'abscission par l'environnement des cellules filles, en particulier par les forces de traction exercées par les cellules sur le pont intercellulaire. En utilisant une combinaison d'approches permettant de contrôler le confinement spatial 2D des cellules filles, de mesurer les forces exercées par les cellules au cours de la cytocinèse et de micro-manipuler le pont intercellulaire, j'ai montré que, de façon contre-intuitive, une tension exercée au niveau du pont retardait l'abscission et qu'au contraire la relâche de cette tension induisait l'abscission. De plus, la régulation temporelle de l'abscission par les facteurs environnementaux des cellules filles implique les protéines des " Endosomal Sorting Complex Required for Transport III " (ESCRT-III), machinerie centrale de l'abscission. Enfin, des expériences préliminaires suggèrent que cette régulation serait importante pour le maintien de l'intégrité tissulaire et la morphogenèse au cours du développement.

L'intégrité des membranes cellulaires est essentielle à la survie et au bon fonctionnement de la cellule. Or, ces membranes sont constamment endommagées. La première partie de cette étude porte sur la réparation de la membrane plasmique perforée suite à l'exposition à des contraintes physiques, chimiques ou biochimiques. Nous décrivons un nouveau mécanisme de réparation de la membrane plasmique qui met en jeu le complexe III de la machinerie des ESCRT (endosomal sorting complex required for transport). Nos observations suggèrent que les ESCRTs seraient impliquées dans l'élimination de portions endommagées de membrane plasmique par bourgeonnement. Nos résultats portent une information novatrice dans le domaine des ESCRTs et pourrait aider à comprendre plus en détail le mode de fonctionnement des ESCRTs. La deuxième partie de cette étude porte sur la réponse cellulaire à l'endommagement physique (laser) ou chimique (par pontage chimique) d'organites de trafic. Nous montrons l'implication des mécanismes d'autophagie dans la réponse à l'endommagement des endosomes et de l'appareil de Golgi. Cette réponse comprend un recrutement rapide de la protéine LC3 (une des seules protéines détectables sur les membranes des autophagosomes matures). Nous avons montré également l'implication d'une ubiquitination rapide ainsi que du recrutement des protéines p62 et NBR1 (capables de lier à la fois l'ubiquitine et la protéine LC3). Le mécanisme observé présente de nombreux points communs avec d'autres mécanismes d'autophagie sélective mais révèle néanmoins des particularités comme le recrutement direct de LC3 sur les membranes de l'appareil de Golgi endommagé. Notre étude comprend donc l'étude de deux mécanismes cellulaires de réponse aux endommagements de membrane qui mettent en évidence l'existence de mécanismes de surveillance systématique de l'homéostasie des organelles et de la membrane plasmique. Ces mécanismes sont adaptés à la nature des membranes endommagées

Carnation Italian ringspot virus (CIRV) is a positive-strand RNA virus that assembles its membrane-bound replication complexes at mitochondria in plant cells. This process is accompanied by extensive inward invagination of the mitochondrial outer membrane, leading to the formation of cytosol-filled spherules, wherein viral RNA synthesis occurs. The mechanism by which CIRV is able to induce spherule formation is unknown, however growing evidence suggests that the host-cell ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport) machinery – a multi-protein complex normally involved in late endosome maturation – may be involved. ESCRT consists of ~30 soluble proteins that form sub-complexes assembled at the late endosomal surface, and function in multivesicular body (MVB) biogenesis. While ESCRT is relatively well characterized in yeasts and mammals, comparably little is known about ESCRT in plants. Hence, as an initial step towards understanding the potential role of ESCRT in CIRV replication, we examined the protein-protein interaction network, subcellular localization, and gene expression profiles of the Arabidopsis thaliana ESCRT components. Overall, the results from these studies suggest that ESCRT organization and function is relatively well conserved in plants compared to other eukaryotes. We also observed that ESCRT is important for CIRV replication, as expression of dominant-negative versions of several key ESCRT components reduced CIRV replication efficiency in plant cells. Moreover, the Arabidopsis ESCRT-I component, Vps23A is recruited from late endosomes to mitochondria in plant cells expressing the CIRV replicase protein, p36, and recruitment of Vps23A was shown to be mediated by sequences located at the N terminus of p36. It was also shown that recruitment of Vp23A to mitochondria by p36 does not require the Ubiquitin E2 Variant domain of Vps23A, which is in contrast to recruitment of ESCRT by retroviruses during viral budding in mammalian cells. Taken together, these results support the hypothesis that CIRV recruits ESCRT by a novel mechanism in order to carry out its replication, a finding that may lend important insight to aspects of normal ESCRT function in plants.

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