Le mélanome est la forme la plus rare et la plus grave des cancers de la peau. Il présente un fort pouvoir métastatique et à l'heure d'aujourd’hui, il n'y a pas de traitement efficace contre le mélanome disséminé. Le travail présenté dans ce mémoire s'inscrit dans la continuité d'une stratégie de d'adressage spécifique de pro-drogues vers le mélanome initiée au sein de notre laboratoire. Notre concept repose sur la conjugaison d'ICF01012, vecteur à fort tropisme pour les mélanines, avec un principe actif modèle (IUdR) sous forme de pro-drogues à espaceurs clivables de type disulfure d'éthyle carbonate ou pnitrobenzylcarbonate pour une double spécificité (i.e. distribution tumorale et libération spécifique de la tumeur). Un premier travail de fonctionnalisation d'ICF01012 a abouti à la synthèse de sept nouveaux vecteurs qui ont été radio-marqués à l'iode 125 afin d'évaluer leur comportement in vivo chez des souris C57Bl/6J porteuses de mélanome B16F0 par scintigraphie plane gamma et biodistribution ex vivo. Le vecteur radio-iodé présentant le profil pharmacocinétique le plus favorable (fixation tumorale forte, spécifique et durable) a été ensuite sélectionné en vue d'une première validation de notre concept de prodrogues vectorisées. Les entités "IUdR-espaceurs clivables" et leurs analogues non clivables à base d'espaceurs de type mercaptoéthylcarbonate ou benzylcarbonate ont également été synthétisés. L'étude de leur comportement au contact de 2S,3S-dithiothreitol et d'hydrosulfite de sodium (mimant l'action du glutathion et de conditions hypoxiques, respectivement) a montré que la libération de l'IUdR est quasitotale et qu'elle est bien induite par la présence du pont disulfure et du groupement nitré. Sur la base de ces résultats, deux pro-drogues ainsi que leurs analogues non clivables ont été synthétisés par association de la partie vectrice avec l'IUdR et les espaceurs clivables ou non clivables. Les études de biodistribution in vivo de l'IUdR et de la pro-drogue à espaceur disulfure radio-marquées à l'iode 125 ont démontré une absence de vectorisation, imputable à une métabolisation très rapide de la pro-drogue par la suite d'un clivage extrêmement rapide de l'espaceur disulfure in vivo provoquant la libération instantanée de l'IUdR dès les premières minutes qui suivent l'injection de la pro-drogue. Néanmoins, des voies de synthèse et des méthodes de suivi de clivages chimiques transposables ont été mises au point et peuvent être utilisées dans les futures études s'inscrivant dans le cadre d'une chimiothérapie vectorisée du mélanome. / Melanoma is the rarest and the most serious form of skin cancer. It has a high metastatic potential and in today's time, there is no effective treatment against disseminated melanoma. The present work is a continuation of a melanoma targeted prodrug therapy approach initiated in our laboratory. Our concept is based on the combination of ICF01012, vector that displays a high tropism for melanin, with IUdR, a drug model, as cleavable prodrugs containing a disulfide ethyl carbonate or a pnitrobenzylcarbonatespacer type for a dual specificity (i.e. tumoral distribution and specific delivery to the tumor). Functionalization of ICF01012 led to the synthesis of seven new vectors that were 125Iradiolabeled in order to evaluate their behavior in vivo (planar gamma scintigraphy and ex vivo biodistribution) in B16F0 melanoma-bearing mice. The radioiodinated vector having the most favorable pharmacokinetic profile (high, specific and long lasting tumoural uptake) was then selected for a first validation of our targeted prodrugs concept. Entities "IUdR-cleavable spacers" and their analogs with noncleavable spacers (mercaptoéthylcarbonate or benzylcarbonate kind) were also synthesized. The study of their behavior in contact with 2S,3S-dithiothreitol and sodium hydrosulfite (mimicking glutathione and hypoxic conditions actions, respectively) showed that the release of IUdR is almost complete and it is induced by the presence of the disulfide bridge and the nitro group. Based on these results, two prodrugs and their non-cleavable analogs were synthesized by combining the vector part with IUdR and cleavable or non-cleavable spacers. The in vivo biodistribution studies of 125I-radiolabeled IUdR and disulfide spacer based-prodrug showed no vectorization due to a very rapid metabolism of the prodrug following extremely rapid cleavage of the disulfide spacer in vivo causing instantaneous IUdR release in the firstminutes after prodrug injection. However, transposable synthetic routes and cleavage studies have been developed and can be used in future studies within the framework of melanoma targeted prodrug therapy

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Cette thèse traite de la conception et mise en œuvre d’espaceurs auto-effondrables novateurs pour une utilisation dans des sondes d’activité enzymatique in vivo.La première partie détaille la synthèse et la validation in vitro d’espaceurs cyclisant, couplant l’activité d’un aminopeptidase à la libération d’un phénol. Les sondes fluorogènes modulaires basées sur ces espaceurs 1,2-diamine sont très robustes (demi-vie > 560 h), mais sont rapidement enzymatiquement hydrolysées, et puis relâchent rapidement (demi-temps ~ 3 min) un fluorophore ESIPT insoluble et exceptionnellement photostable.Ces sondes ont une excellente sensibilité (rapport signal:contrôle > 3000:1), et fournissent la première démonstration d’un système macroscopiquement binaire éteint–ALLUMÉ, pour la libération de phénols sous activité d’aminopeptidases. Ce système pourrait permettre de faire de l’imagerie moléculaire ultra-sensible d’une gamme d’exopeptidases. Ces espaceurs pourraient également servir dans des sondes comportant d’autres fluorophores phénoliques, dans des promédicaments de phénols/alcools activés par des peptidases spécifiques (thérapies ciblées), ou comme adaptateurs chimiques en générale.La deuxième partie détaille les synthèses de deux familles d’espaceurs tautomérisant/éliminant pour utilisation dans des sondes magnétogènes d’activité de glycosidases. Les premières architectures substrat-espaceur basées sur des 2-furanols et des carbimidates cycliques ont été explorées. Notamment, des glycosides 2-furanoliques ont été abordés comme espaceurs énergétiques alternatifs aux quinone méthydes, et des carbimidates ont été explorés comme espaceurs pour ligands modèles des sondes promagnétiques. / This thesis concerns the design and implementation of novel auto-immolative spacers for use in probes for enzymatic activity in vivo.The first part relates the development and in vitro validation of cyclisation spacers which couple the action of an aminopeptidase to the release of a phenol. The modular three-component fluorogenic probes based on these 1,2-diamine spacers are very robust (halflife > 560 h), but are also rapidly enzymatically processed, and quickly (halftime ~3 min) release an exceptionally photostable, insoluble ESIPT fluorophore. The probes have excellent detection sensitivity relative to current methods (signal to control ratio > 3000:1), and provide the first demonstration of a macroscopically binary off–ON system for phenol-releasing probes of aminopeptidase activity. The probe system may allow the exceptionally sensitive, ESIPT-based molecular imaging of a range of exopeptidases. The spacers may also be applied in off ON peptidase probes of other phenolic fluorophores, to peptidase-specific phenol/alcohol prodrugs for targeted therapy, or more generally in chemical adapter technologies.In the second part, two novel families of auto-immolative elimination/tautomerisation spacers were designed for use in three-component off ON magnetogenic probes sensing glycosidase activity. The first known substrate-spacer designs based on 2-hydroxyfurans and on carbimidates were explored. Notably, 2 furanol glycosides were synthesised in pursuit of high-energy alternatives to quinone methides, and a general method for preparing model carbimidate-bearing ligands for pro-magnetic probes was elaborated.

Malgré les efforts extrêmement importants réalisés pour la recherche de nouveaux agents anticancéreux, les traitements par chimiothérapie ne permettent toujours pas de traiter efficacement un grand nombre de tumeurs. En effet, les molécules utilisées cliniquement ne sont généralement pas sélectives des tissus cancéreux et la destruction des tissus sains qu'elles engendrent provoque de lourds effets secondaires. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques plus sélectives représente donc un intérêt majeur en chimie médicinale. Dans ce cadre, nous avons développé plusieurs vecteurs non toxiques conçus pour reconnaître des spécificités liées à la malignité puis libérer de manière contrôlée des agents cytotoxiques exclusivement au niveau de la tumeur. Dans le cadre de cette thèse, le concept de vecteur glucuronylé a été adapté à la MMAE et à la cyclopamine. Ces vecteurs pourront être sélectivement activé par la B-glucuronidase présente en concentration importante dans les zones nécrotiques de nombreuses tumeurs solides et ainsi libérer ces agents anticancéreux au niveau des tissus cancéreux. Des études préliminaires visant à évaluer l'efficacité de ces composés in-vitro et in-vivo ont montré la validité de cette approche. Dans un deuxième temps, un vecteur glucuronylé de la doxorubicine pouvant se lier à l'albumine plasmatique a été conçu. Une étude réalisée chez la souris a montré que ce composé possède une efficacité thérapeutique similaire à celle de la doxorubicine et ne provoque pas les effets secondaires constatés lors du traitement avec la drogue seule. La troisième partie est consacrée au développement du premier vecteur activable par la B-galactosidase ut / Despite several years of intensive research devoted to the discovery of novel anticancer agents, chemotherapy is still not entirely effective for the treatment of many solid tumors. Most of the drugs used clinically act by anti-proliferative mechanisms and lack any intrinsic selectivity, leading to severe adverse effects due to the destruction of normal tissues. Therefore, the development of more selective therapeutic approaches has become a major goal in medicinal chemistry. Within this framework, we have developed several nontoxic drug carriers designed for both the efficient recognition of malignant specificities and the controlled release of anti-neoplastic agents exclusively at the tumour site. First, we applied the concept of glucuronide prodrugs to MMAE and Cyclopamine in order to deliver these anticancer drugs at the tumor site. Indeed, glucuronide prodrugs can be selectively activated by B-glucuronidase present in high concentration in necrotic area of numerous solid tumors. Preliminary in vitro and in vivo evaluations of these prodrugs demonstrated the potential of this approach. Second, we studied the first B-glucuronidase-responsive albumin-binding prodrug designed for the selective delivery of doxorubicin at the tumor site. In vivo experiment conducted in mice show that this compound inhibits tumor growth in a similar manner to doxorubicin whilst avoiding side effects induced by the free drug. We also developed the first B-galactosidase-responsive drug delivery system suitable for the treatment of solid tumors in PMT. Such a targeting system can be selectively activated by lysosomal B-galactosidase located inside malignant cells expressing a specific tumor-a

Le développement de réactions chimiques compatibles avec les milieux biologiques est un défi scientifique de taille. Les outils dont actuellement disponibles pour le marquage spécifique d’entités biologiques se sont multipliés pendant cette dernière décennie. Parmi les réactions vedettes du domaine, on trouve les réactions de Diels-Alder entre alcènes tendus et tétrazines ou encore les cycloadditions entre les cycloalcynes et les azotures (SPAAC). En revanche, les réactions de clivage bioorthogonal ont retenu une attention plus faible de la part de la communauté scientifique. Récemment notre groupe a identifié une réaction bioorthogonale entre une iminosydnone et un cycloalcyne permettant d’effectuer simultanément le clivage d’un composé et la ligation de deux entités. Ces travaux de thèse ont été entièrement dirigés vers cette nouvelle réactivité.En premier lieu, nous avons étudié la synthèse et la fonctionnalisation du partenaire iminosydnone dans le but d’obtenir une librairie de composés pour l’étude de la cinétique de la réaction de click & release avec les cycloalcynes. Dans un second temps, nous avons utilisé les outils synthétiques développés pour concevoir des sondes iminosydnones à double exaltation de fluorescence. Cela a marqué l’entrée de ces composés dans le contexte de la chimie bioorthogonale puisque la sonde la plus prometteuse a été utilisée sur des cellules vivantes.Enfin, la capacité des iminosydnones à être clivées par les cycloalcynes a été exploitée sous la forme d’espaceurs clivables dans deux applications. Nous avons tout d’abord conçu des outils pour le target-fishing. Les sondes obtenues ont permis l’immobilisation de protéines sur un support solide. La libération du support des protéines a pu être effectuée de manière quantitative tout en leur apposant une étiquette fluorescente. Le second objet exploitant les propriétés d’espaceurs clivables des iminosydnones est un ADC. Celui en développement dans cette thèse est destiné à traiter les infections bactériennes, cible atteignable uniquement en employant un espaceur clivable par un agent exogène. / The development of chemical reactions compatible with the biological medium is a major challenge. The availability of chemical tools for the specific labeling of biological entities increased dramatically during the last decade. The Diels-Alder reactions between tetrazines and strained alkenes or the Strained Promoted Azide Alkyne Cycloaddition (SPAAC) are among the most popular reactions for bioorthogonal ligations. On the other hand, moderate attention was given to bioorthogonal cleavage reactions. Recently our group identified a new bioorthogonal reaction between an iminosydnone and a cycloalkyne, enabling a cleavage and the ligation of two partners at the same time.The first aim of this PhD thesis was to study the synthesis and functionalisation of the iminosydnone partner. With the large library of compounds in our hands, we could study the kinetic properties of the click & release reaction.Next, using this transformation, we synthesized double fluorogenic iminosydnone probes. The most promising probe was then used on living cells, underlining the bioorthogonality of the reaction.Finally, we took advantage of the iminosydnone properties to use them as cleavable linkers in two applications. The first field we explored was target-fishing. The tools we developped allowed protein immobilization on a solid support. The quantitative release from the support of labeled proteins was achieved using the click & release reaction. The second object using iminosydnones as cleavable linkers we considered was an ADC. The one developped in this PhD thesis is aimed at bacteria. For treatment with ADCs, this target can only be reached using a linker cleavable with an external agent.

L'une des stratégies mise en œuvre pour améliorer la prise en charge thérapeutique des patients concerne le développement d'outils diagnostiques sensibles et spécifiques. Les aptamères sont des oligonucléotides artificiels obtenus par SELEX avec une très haute affinité ainsi qu'une excellente spécificité pour leurs cibles. L'immobilisation de ces motifs de reconnaissance moléculaire à la surface de nanomatériaux tels que des nanoparticules d'or (AuNPs), dont les propriétés optiques et électroniques sont uniques, permet d'amplifier le signal généré par l'interaction du ligand avec sa cible. Deux systèmes de biosensing ont été élaboré en fonctionnalisant des AuNPs avec des aptamères, l'un dirigé contre la thrombine et le second dirigé contre une marque épigénétique portée par une protéine histone. La réduction des sels d'or aurique précurseurs a été réalisée en présence de PEG4 et a conduit à l'obtention d'une population homodisperse de AuNPs sphériques d'un diamètre moyen de 14 nm et présentant une isotropie de taille et de forme. Ces AuNPs ont ensuite été fonctionnalisées par des bras espaceurs de longueur variable constitués d'unités tétraéthylène glycol successives reliées entre elles par des ponts éthers ou triazoles. L'acide lipoique a été utilisé comme motif d'ancrage à la surface des AuNPs via une liaison covalente Au-S et a été couplé aux différents bras espaceurs via une réaction de Steglich. Les linkers étaient porteurs d'un groupement terminal azoture afin de réaliser le couplage par chimie-click avec les aptamères. La stratégie de détection de la thrombine utilisait les propriétés de quenching de fluorescence des AuNPs alors que la détection de l'histone était colorimétrique et mettait à profit l'effet de résonance plasmonique de surface des nanoparticules d'or. / Improving patients therapeutic care needs the development of sensitive and specific diagnostic tools. Aptamers are synthetic oligonucleotides obtained by SELEX with a very high affinity and excellent specificity for their targets. Grafting of these molecular recognition patterns onto nanomaterials such as gold nanoparticles (GNPs), which unique optical and electronic properties, can amplify the signal induce by the interaction between the ligand and its target. Two biosensing systems have been developed by GNP functionalization with aptamers, one is directed against thrombin and the second against an epigenetic mark carried by a histone protein. Gold precursors was reduced in the presence of PEO4 and led to a homodisperse population of spherical GNP with an average diameter of 14 nm and an isotropy of size and shape. GNP were functionalized with tetraethylene glycol units interconnected by ether or triazoles bridges as a linker. Lipoic acid was used as an anchor moiety onto gold surface via a covalent Au-S bond and was coupled to the spacer through a Steglich reaction. The linkers were functionalized with an azide group to perform the coupling with aptamers by click chemistry. The thrombin sensing strategy used the fluorescence quenching properties of GNPs while the histone detection involved the gold nanoparticle plasmon resonance surface effect.

Introduit originellement par Katzenellenbogen en 1980 , les espaceurs auto-immolables sont définis comme des assemblages covalents capable de corréler la coupure de deux liaisons. La première coupure intervient au niveau du groupement protecteur A, générant un intermédiaire qui conduit spontanément à la rupture de la liaison entre l’espaceur et l’espèce B (par exemple, un composé bioactif). Katzenellenbogen avança que les espaceurs auto-immolables pourraient permettre d’outrepasser les limitations des thérapies classiques (administration directe de composés bioactifs, notamment) et conduiraient à l’émergence d’une nouvelle génération de prodrogues. Ayant effectivement amené une innovation considérable dans ce domaine, ces espaceurs ont depuis trouvé nombres d’applications dans des domaines plus variés (chimie analytique, matériaux, …) ; dont nous présenterons un aperçu.Nous avons taché également de décrire plus en détail les mécanismes d’auto-immolation, conduisant l’intermédiaire à se désassembler et à libérer la molécule B. En effet, chacun de ces mécanismes confèrent des propriétés particulières à l’espaceur en termes de cinétique d’auto-immolation et de compatibilités chimiques possibles principalement. Il est donc primordial d’établir les avantages et les inconvénients de chaque type d’espaceur afin de déterminer au mieux quel genre de structure employer pour l’utilisation choisie.Notre travail a consisté dans un premier temps à compléter certaines données de la littérature afin d’approfondir notre connaissance des espaceurs auto-immolables.De plus, si ces espaceurs ont été introduits pour dépasser les limitations des stratégies préexistantes, ils ne sont pas toujours aptes à répondre à certaines problématiques particulières (sélectivité et sensibilité de leurs activations notamment) ; ce qui nous a amené à proposer une nouvelle génération d’espaceurs auto-immolables capable de mieux répondre à ces attentes.Nos travaux ont permis de comparer la cinétique d’espaceurs cyclisants et de confirmer que les espaceurs basés sur un mécanisme d’élimination avaient une gamme plus étendue d’utilisations potentielles.Après avoir établi ce constat, nous avons développé des dérivés d’espaceurs reposant sur ce principe. Pour des utilisations particulières, deux séries ont été étudiées : - Les dérivés d’aniline bi-activables : ceux-ci ne libérant le groupement partant qu’après 2 stimuli spécifiques (contre un seul jusqu’à présents, tous types d’espaceurs considérés), nous pensons que cette nouvelle classe d’espaceurs pourra constituer une réelle innovation en terme de sélectivité, étant capable de mener à la libération de la molécules d’intérêt après 2 conditions. - Un dérivé triantenné : celui-ci étant capable de libérer la molécule qu’il porte par 3 voies d’éliminations, nous avons supposé qu’il serait bien plus sensible qu’un composé ne pouvant libérer que par une voie unique. Même si le composé n’a pu être obtenu, des avancées significatives ont eu lieu quant à sa synthèse : les résultats obtenus et l’intérêt qu’ils suscitent nous ont amené à proposer d’autres stratégies de synthèse pour aboutir à la création de cet espaceur ultra-sensible. / Originally introduced by Katzenellenbogen in 1981 , self-immolative spacers are defined as covalent assemblies that are able to correlate cleavage of two chemical bonds. First, the protecting group is cleaved, generating an intermediary which spontaneously leads to the rupture of the bond between the spacer and the released molecule (bioactive compound for instance). Katzenellenbogen planned that self-immolative spacers could allow to overcome limitations of classic therapies (especially direct administration of drugs) and constitute a novel and efficient alternative to actual prodrug strategies. Effectively, spacers have opened many possibilities in this field, but also in other domains (like analytical chemistry, material sciences, …) which will be presented in this manuscript.We also took care to detail self-immolation mechanisms (the step leading to the release of the leaving group from the intermediary): indeed, the mechanism is the most important factor of the spacer, determining its properties (kinetic of the process, chemical links allowed). Therefore, it is crucial to determine advantages and drawbacks of each mechanism in order to permit a rational choice of the spacer depending on the application we choose.Our work consisted to complete known kinetic data, leading us to acquire an overview of existing spacers.Self-immolative spacers have been introduced to overcome limits of actual strategies, but they are not always able to answer particular problems (sensitivity and selectivity of their triggering events principally): this leads us to propose a new generation of spacers capable of resolving these problematics.Our researches permitted us to compare kinetic of cyclizing spacers and to confirm that elimination based spacers show a larger scope for potential uses.Starting from this, we developed two series of derivatives using this mechanism: - Bi-triggered anilines: releasing the leaving group after two specific stimuli (only one for reported spacers actually). We are convinced that this new class of spacers can constitute a real innovation for selective treatments. - Three-branched phenol: able to release the compound by three different ways of elimination. This property can increase drastically the sensitivity of the spacer for its activation pathway, considering triggers are three-time more numerous. Even if the compound has not been obtained, significant results in its synthesis have been observed: these results on this interesting project leading us to propose new synthetic strategies in order to obtain this ultra-sensitive compound.

Le paclitaxel (Taxol®) et son analogue hémisynthétique le docetaxel (Taxotere®) appartiennent à une famille d'agents antitumoraux dont l'originalité réside dans leur structure tétracyclique inusuelle et complexe, et surtout dans leur mécanisme d'action. Ils ont en effet pour cible principale une protéine constitutive du fuseau mitotique, la tubuline.<br /> Bien que très utilisés en clinique (cancers du sein, de l'ovaire, du poumon), ils présentent un inconvénient majeur pour leur emploi : leur grande toxicité et leur mode d'administration induisent de graves effets secondaires. De plus, des phénomènes de résistance apparaissent également.<br /> Une méthode efficace d'amélioration de ces composés est de les transformer en prodrogues moins cytotoxiques et plus hydrosolubles. L'intérêt prépondérant de cette transformation apparaît dans la possibilité de délivrer ces produits de manière mieux ciblée, plus spécifique des tumeurs. Elles pourront alors être utilisés dans le cadre du concept PMT (Prodrug Mono Therapy) ou dans une stratégie immunociblée de type ADEPT (Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy).<br /><br /> Dans cette optique, des prodrogues glucuronylées du paclitaxel et du docetaxel ont été conçues et synthétisées. L'espaceur employé est un espaceur double, reliant un carbamate de p-hydroxybenzyle à une chaîne diamine. Ces prodrogues ont été évaluées biologiquement (stabilité, cytotoxicité, hydrolyse enzymatique) pour valider cette approche. L'utilisation du nouvel espaceur a donné des résultats satisfaisants, en particulier pour les hydrolyses enzymatiques qui ont été améliorées par rapport à celles des prodrogues décrites précédemment. La conception et la synthèse de différents espaceurs applicables à la préparation d'autres prodrogues sont également présentées.