Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-02Bitstream added on 2014-06-13T18:43:23Z : No. of bitstreams: 1 celestino_fma_dr_jabo.pdf: 1374304 bytes, checksum: 7550c94032b9f784eb1980b8abaaa6c0 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A suplementação de vitaminas e minerais pode melhorar a fertilidade do sêmen de suínos. No entanto, os resultados têm se mostrado contraditórios, pois as avaliações do sêmen normalmente são subjetivas. A avaliação mais precisa poderia ser obtida pela análise de transcritos relacionados a fertilidade dos espermatozoides. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito de suplementação intramuscular de vitaminas e minerais sobre a qualidade de sêmen e analisar a expressão de alguns transcritos pelo método de qPCR. Para tal, coletas de sêmen de nove machos foram avaliadas segundo a motilidade, concentração e resistência ao resfriamento e submetidas à extração do RNA. Após 60 dias, seis machos sofreram a aplicação de suplementos minerais-vitamínicos comerciais (Selenphós® e Zimag®). Outros três machos não receberam a suplementação e foram utilizados como controle. Os 60 dias foram considerados para respeitar o ciclo espermatogênico. Após este período, outras coletas de sêmen de cada macho foram realizadas e submetidas aos mesmos procedimentos. Os genes alvo escolhidos para acessar a qualidade dos espermatozoides foram: Bcl-2l que é um gene anti apoptótico; gene ativador da proteína de proteção ao choque térmico (HSP 90); gene da enzima peroxiredoxina 5, protetora contra danos oxidativos e gene inibidor da acrosina, relacionado a capacitação espermática. Os resultados mostraram aumento do número de dias em que as amostras de sêmen diluídas com diluente comercial, resfriadas a 15-18ºC, permaneciam com motilidade acima de 70% após a suplementação com vitaminas e minerais. A concentração dos espermatozoides e volume dos ejaculados, após a suplementação, também melhorou, atingindo taxas de 52 e 57%, respectivamente. Porém, os transcritos para os genes estudados não apresentaram diferença de expressão antes e depois do tratamento com as vitaminas e minerais / Vitamin and mineral supplementation could improve the swine semen fertility. However, the results, until now, are controversial because of the subjectivity of the analyses. A precise evaluation could be achieved by the analyses of the spermatozoa transcripts important for the boar fertility. The present work proposes to evaluate the effect of intramuscular vitamin and mineral supplementation on semen quality by analyzing some spermatozoa transcripts, using qPCR methodology. The semen collection of nine boars were evaluated for motility, concentration and resistance to cold, and then, submitted to RNA extraction. After this period, six of these boars received an intramuscular supplement of vitamins and minerals (Zimag® and Selenphos®). Another three animals did not receive the supplementation for control. After 60 days, other semen collections were done and submitted to the same processes of analyses and RNA extraction. The target genes to access spermatozoa quality was

Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-26Bitstream added on 2014-08-27T15:57:15Z : No. of bitstreams: 1 000777559.pdf: 3234476 bytes, checksum: cc41e2672688abab324484d35dd5bb14 (MD5) / A Tese de Doutorado foi estruturada em três capítulos, além da “Introdução Geral”, que abrange uma revisão bibliográfica das espécies em estudo e dos temas abordados, e das “Considerações Finais”. Os três capítulos darão origem a artigos científicos em revistas indexadas. O primeiro artigo (Capítulo I) descreve os parâmetros seminais e a ultraestrutura dos espermatozoides de Brycon vermelha, “vermelha” (Characiformes, Characidae). O sêmen da B. vermelha possuiu consistência viscosa, e concentração espermática média de 4,34 ± 0,75x1010 espermatozoides.mL-1. O tempo de motilidade espermática, quando ativado com água destilada, foi curto, sendo necessários 46,48 ± 0,07 segundos para perda da motilidade de 100% dos espermatozoides. A análise dos espermatozoides por MEV revelou três regiões distintas: cabeça, peça intermediária e flagelo, sendo cada região caracterizada detalhadamente em MET. Tais características sugerem que os espermatozoides de B. vermelha apresentam características ancestrais próprias de peixes com fecundação externa classificando-os como “espermatozoides aquáticos uniflagelados anacrossomais”, ou seja, aquasperm do Tipo I. Estas informações são as primeiras em relação ao sêmen e espermatozoides de B. vermelha, podendo ser uma referência para futuros estudos, embasando especialmente pesquisas que adotem biotécnicas, como a criopreservação e androgênese. O segundo artigo (Capítulo II) descreve, ultraestruturalmente, as alterações dos espermatozoides da Brycon orbignyanus, “piracanjuba” (Characiformes, Characidae) durante o processo de criopreservação. O exame ultraestrutural dos espermatozoides descongelados criopreservados em soluções contendo DMSO, metilglicol e metanol, em três tempos de armazenamento (1 dia, 1 mês e 1 ano), revelou a presença de alterações no espermatozoide, variando desde ... / The doctoral thesis consisted of three main chapters besides the “General Introduction”, which includes a bibliographic review of the species studied and the topics discussed, and the “Final Remarks”. Scientific research articles will be published from the data of the three chapters in the scientific journals listed in the index. The first scientific article (Chapter I) describes the seminal parameters and the spermatozoa structure of Brycon vermelha, “vermelha” (Characiformes, Characidae). The semen of the Brycon vermelha is viscous and contains, in average, 4.34 ± 0.75x1010 spermatozoa.mL-1. Spermatozoa motility was of short duration when activated with distilled water, 46.48 ± 0.07 seconds until 100% of spermatozoa lost their motility. Scanning transmission electron microscopy (STEM) of spermatozoa revealed three distinctive parts: head, middle piece and tail (flagellum). Each part was analysed in detail by transmission electron microscopy (TEM). The characteristics observed suggest that the spermatozoa of B. vermelha posses ancestral characteristics of fish that reproduce by external fertilization, and can thus be classified as “uniflagellate anacrosomal aquasperms”, or aquasperms Type I. These are the first reports on B. vermelha semen and spermatozoa and, therefore, could be used as a reference and benchmark for research studies using biotechniques such as cryopreservation and androgenesis. The second scientific article (Chapter II) describes the ultrastructural alterations of Brycon orbignyanus, “piracanjuba” (Characiformes, Characidae) spermatozoa after cryopreservation. Spermatozoa were cryopreserved for 1 day, 1 month or 1 year in solutions containing DMSO, methyl glycol and methanol. The ultrastructural analysis of the frozen-thawed spermatozoa revealed alterations varying from small damages to the different parts of the cell to total destruction of spermatozoa ...

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-25T16:41:27Z No. of bitstreams: 1 2018_AdalmyrMoraisBorges.pdf: 5438238 bytes, checksum: d936e356826ef0abd06970160cde3b2b (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-31T19:17:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_AdalmyrMoraisBorges.pdf: 5438238 bytes, checksum: d936e356826ef0abd06970160cde3b2b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-31T19:17:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_AdalmyrMoraisBorges.pdf: 5438238 bytes, checksum: d936e356826ef0abd06970160cde3b2b (MD5) Previous issue date: 2018-07-25 / O estudo buscou avaliar diferentes alternativas para o congelamento do sêmen de jundiá amazônico e de pintado e a melhoria da qualidade pos-descongelamento, contribuindo para o desenvolvimento de protocolos para as duas espécies. Entre as abordagens avaliadas foram: (1) a caracterização morfológica dos espermatozoides de jundiá amazônico com o uso de microscopia eletrônica de varredura e de transmissão; (2) a utilização de diferentes agentes crio protetores, para o jundiá amazônico: metanol, dimetilsulfoxido e etilenoglicol a 10%, associados a solução de glicose a 5% e para o pintado: metanol, dimetilsulfoxido e dimetilacetamida a 5%, 7,5% e 10%, associados a solução de BTS a 5%; e (3) a adição de substancias antioxidantes nos meios de congelamento para o pintado: trealose 100 mM, acido ascórbico 1 mM e α-tocoferol 0,1 mM. Para ambas espécies, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,25 mL e congelado em vapor de nitrogênio, utilizando botijão dry shipper, e descongelado a 40oC por 12 segundos. No jundiá amazônico, o espermatozoide apresentou o comprimento total de 25,46 } 2,54 μm, cabeça esférica (1,51 } 0,18 μm) ausência de acrossoma, peca intermediaria de formato cônico, ligeiramente assimétrica com presença de vesículas, e comprimento de 0,93 } 0,17 μm, e flagelo com arranjo típico e comprimento de 21,48 } 2,45 μm. O sêmen descongelado apresentou valores mais altos (p<0,05) para duração, vigor e taxa de mobilidade espermática com os crio protetores metanol 10% e dimetilsulfoxido 10% quando comparado com o etilenoglicol 10%. No pintado, o sêmen criopreservado com metanol 7,5% e 10% apresentou valores para duração e taxa de mobilidade maiores (p<0,05) comparado com o dimetilsulfoxido e dimetilacetamida. O tratamento com os três antioxidantes associados proporcionou taxa de mobilidade maior (p<0,05) em relação ao tratamento sem antioxidantes. Para os parâmetros de duração e taxa de mobilidade foi observada interação significativa (p<0,05) entre o acido ascórbico e o α-tocoferol. Assim, os resultados obtidos na criopreservação de sêmen de jundiá amazônico não foram suficientes para estabelecer um protocolo para a espécie. Na criopreservação de sêmen de pintado e recomendado o uso do metanol a 7,5% associado a solução de BTS a 5%, e a adição conjunta dos antioxidantes trealose (100mM), acido ascórbico (1mM) e α-tocoferol (0,1mM). / This study aimed to evaluate different alternatives for the semen freezing of amazon catfish and spotted catfish, contributing to the development of protocols for both species increasing the process efficiency in both species. Among the approaches used are (1) morphological characterization of amazon catfish spermatozoa using scanning and transmission electron microscopy; (2) use of different cryoprotectant agents, 10% methanol, dimethylsulfoxide and ethyleneglycol, associated 5% glucose solution in amazon catfish, and 5%, 7,5% e 10%, methanol, dimethylsulfoxide and dimethyacetamide, associated 5% BTS solution in spotted catfish; and (3) addition of antioxidants in the freezing media, trehalose (100 mM), ascorbic acid (1 mM) and α- tocopherol (0.1 mM) in spotted catfish. In both especies, semen samples were loaded in 0.25 mL plastic straws, frozen in nitrogen vapour (dry shipper) and thawed at 40oC for 12 seconds. In the amazon catfish, fresh spermatozoon was 25.46 } 2.54 μm long, head was spherical (1.51 } 0.18 μm) with no acrosome, midpiece was coneshapped with presence of vesicles, slightly asymmetric, 0.93 } 0.17 μm long and the single fagellum was 21.48 } 2.45 μm long with the typical arrangement. Postthawed semen presented higher values (p<0.05) for duration, vigor and sperm motility rate with cryoprotectants 10% methanol and 10% DMSO, when compared to 10% ethyleneglycol. In the spotted catfish, the cryopreserved semen with 7,5% and 10% methanol presented higher values (p<0.05) for latency time and motility rate compared to dimethylsulfoxide and dimethyacetamide. The treatment with associated antioxidants provided a higher motility rate (p<0.05) compared to the antioxidant-free treatment. For the parameters of latency time and motility rate, a significant interaction (p<0.05) was observed between ascorbic acid and α-tocopherol. In conclusion, the results observed in semen cryopreservation of amazon catfish were not satisfactory to establish a protocol for the specie. For the semen cryopreservation of spotted catfish, it is recommended the use of 7.5% methanol with the 5% BTS solution and the addition of the antioxidants trehalose (100 mM), ascorbic acid (1 mM) and α-tocopherol (0.1 mM).

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-05-18Bitstream added on 2014-06-13T19:17:41Z : No. of bitstreams: 1 carvalho_fm_me_jabo.pdf: 732796 bytes, checksum: 9bcaa86558c023e3a8b866ae27e2da36 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As alterações constantes do meio ambiente com diminuição do habitat natural dos primatas brasileiros têm estimulado o desenvolvimento de biotecnologias na área da reprodução, visando à preservação de espécies. Este estudo teve por objetivo avaliar, pela primeira vez, técnicas de criopreservação de sêmen de Alouatta caraya. Foram colhidas 26 amostras de sêmen de seis Alouatta caraya machos adultos e sadios, mantidos em cativeiro no Centro Nacional de Primatas (CENP), Ananindeua, PA. As amostras foram analisadas imediatamente após a colheita quanto aos parâmetros volume, pH, concentração, motilidade total e progressiva, integridade de membrana plasmática, integridade de acrossoma, atividade citoquímica mitocondrial, estresse oxidativo (TBARS) e fragmentação de DNA (SCSA). Após as análises iniciais, as amostras foram congeladas com quatro diluidores diferentes – Test-gema de ovo com glicerol 3 ou 4% e Test-lecitina de soja com glicerol 3 ou 4%, utilizando máquina de congelação automática TK 3000. As amostras foram descongeladas e analisadas aos 10, 40 e 80 minutos pós-descongelação. Diluidores à base de gema de ovo foram mais adequados para congelação de sêmen dessa espécie, quando comparados aos diluidores à base de lecitina de soja. Não houve diferença estatística quanto à concentração de glicerol, porém para o diluidor à base de gema de ovo, a concentração de 4% apresentou melhores resultados. Este trabalho trouxe informações inéditas a respeito de características seminais e aspectos da criopreservação de sêmen dessa espécie, todavia os protocolos de congelação testados não foram considerados adequados para a preservação das amostras estudadas / The constant environmental changes with reduction of the natural habitat of the Brazilian primates require the development of assisted reproductive techniques (ARTs) for species conservation. The objective of this study was to evaluate, for the first time, cryopreservation techniques for Alouatta caraya semen. Twenty-six semen samples were collected from six captive adult Alouatta caraya from the National Primate Center, Ananindeua, PA – Brazil. Samples were analyzed immediately after collection for the following parameters: volume, pH, concentration, total and progressive motility, plasma membrane integrity, acrosome integrity, oxidative stress (TBARS), and DNA fragmentation (SCSA). After initial evaluation, samples were frozen in four different extenders – Test-egg yolk with 3 or 4% glycerol and Test-soy lecithin with 3 or 4% glycerol – using an automatic freezer TK 3000. Samples were thawed and analyzed for the same parameters at 10, 40 and 80 minutes post-thaw. Egg yolk-based extenders seemed better for cryopreservation of semen from this species when compared to soy lecithin-based extenders. Although there was no statistical difference between the different glycerol concentrations, for the egg yolk-based extenders, 4% glycerol had better results. This study brought novel information on semen characteristics and cryopreservation aspects for this species, although the protocols tested were not considered suitable for the cryopreservation of the samples studied

Introdução: Doze a 29 % dos ejaculados tem viscosidade seminal aumentada. Uma das técnicas recomendadas para diminuir a viscosidade do sêmen consiste num processo físico em que se passa o sêmen, 4 vezes, por uma seringa de 10 mL com agulha 18G. Ao fim desse processo, ter-se-ia modificado o comportamento molecular das fibrilas protéicas do esperma, tornando-o mais liquefeito, sem dano aparente a morfologia ou motilidade dos espermatozoides. Atualmente, discute-se sobre a total inocuidade desta técnica, uma vez que ela poderia provocar aumento da fragmentação do DNA dos espermatozoides. A hiperviscosidade seminal, além de reduzir a concentração e a motilidade dos espermatozoides, pode afetar a capacitação e a reação acrossômica, podendo ter implicações na integridade do DNA e no desenvolvimento embrionário normal. Objetivo: Comparar a fragmentação do DNA de espermatozoides humanos em amostras com viscosidade diminuída, fisiológica e aumentada, e avaliar se o processo de expulsão do sêmen através da agulha e seringa altera significativamente as taxas de fragmentação do DNA dos espermatozoides. Método: Após a coleta e avaliação dos parâmetros seminais das amostras de sêmen, aquelas que estiverem com viscosidade aumentada passarão pelo processo de expulsão através da seringa de 10 mL com agulha 18G por 4 vezes, para diminuir a viscosidade seminal. Posteriormente, serão feitas análises da fragmentação do DNA dos espermatozoides através da técnica de TUNEL em todas as amostras. Resultados: A fragmentação do DNA entre amostras com viscosidade fisiológica, diminuída e aumentada não apresentou diferença estatisticamente significativa (P=0,857). A fragmentação do DNA aumentou significativamente (P=0,035) nas amostras com viscosidade aumentada após passar na seringa e agulha quando comparadas com as mesmas amostras antes de passar pela mesma. Conclusão: O processo de expulsão do sêmen através de seringa e agulha visando redução da viscosidade seminal aumenta a fragmentação do DNA no espermatozoide, devendo este processo ser substituído por um processo inócuo. / Background: Twelve to 29 % of the ejaculated have the semen viscosity increased. One of the techniques recommended to decrease the viscosity of semen is a physical process in which the semen passes four times through a 10mL syringe with a 18G needle. At the end of this process would have modified the molecular behavior of the protein fibrils of the sperm making it more liquefied, without apparent damage to the morphology or motility of spermatozoa. Currently, the debate is about the complete safety of this technique since it could result in increased DNA fragmentation of spermatozoa. The seminal viscosity moreover reduces the concentration and motility of sperm, can affect the capacitation and acrosome reaction which may have implications for DNA integrity and normal embryonic development. Objective: To compare the DNA fragmentation in human semen samples with reduced, physiological and increased viscosity and evaluate if the process of expulsion of semen through the needle and syringe significantly alter rates of sperm DNA fragmentation. Methods: After collecting and evaluating semen parameters of semen samples, those that are with increased viscosity will pass through the process of expulsion through the 10 mL syringe with a 18G needle four times to reduce the viscosity of semen. After that, analysis of spermatozoa DNA fragmentation through the TUNEL technique will be made in all samples. Results: The fragmentation of DNA between samples with physiological, reduced and increased viscosity is not statistically significant (P=0.857). The DNA fragmentation increased significantly (P=0.035) in samples with increased viscosity after passing the syringe and needle when compared with the same samples before going through the same. Conclusion: The process of expulsion of semen through a syringe and needle in order to reduce the semen viscosity increases the DNA fragmentation in sperm, and this shall be replaced by a harmless process.

Orientador: Luis Antonio Violin Dias Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T03:55:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arroteia_KelenFabiola_D.pdf: 15193315 bytes, checksum: b6b3930ea05ff1d7b858f560e01c178a (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O processo de fecundação em mamíferos depende de uma seqüência de eventos que culminam na ativação do oócito pelo espermatozóide. A diferenciação completa das células germinativas testiculares em células com capacidade fecundativa envolve testículos, epidídimos, ductos deferentes e trato reprodutor feminino. No epidídimo, a superfície dos espermatozóides pode sofrer diversas modificações, em um processo conhecido como maturação epididimária. Diversas proteínas sintetizadas e secretadas pelas células epiteliais do epidídimo serão posteriormente localizadas na superfície ou mesmo no interior da vesícula acrossômica do espermatozóide. A aquisição da capacidade de fertilização pelo spermatozóide tem sido correlacionada à esta nova organização das moléculas de membrana proporcionada durante o trânsito epididimário. A obtenção de anticorpos monoclonais que reconhecem os antígenos expressos pelas células germinativas testiculares durante seus processos contíguos de diferenciação, ou pelas células dos ductos pelos quais os espermatozóides transitam durante o processo de maturação tem constituído uma importante estratégia para permitir a geração de um mapa das moléculas que atuam na preparação do espermatozóide para a fecundação. O anticorpo monoclonal (Amc) TRA (testicular germ cells immunized to rat - monoclonal antibody) 54 reconhece um antígeno localizado em espermátides dos túbulos seminíferos de camundongos C57 BL/6 com idade superior a 24 dias pós-parto e também um antígeno expresso nas células epiteliais da cabeça do epidídimo e em espermatozóides da luz deste órgão. A molécula secretada percorre a luz do epidídimo no sentido ântero-posterior e, neste percurso, é incorporada pelos espermatozóides em trânsito. Com o intuito de contribuir para a compreensão dos complexos mecanismos que preparam o espermatozóide para a fecundação, o presente trabalho buscou identificar e reconhecer a estrutura protéica e a função biológica do antígeno reconhecido pelo Amc TRA 54 nas células epiteliais do epidídimo. No futuro, os resultados obtidos poderão contribuir com a geração de novas ferramentas clínicas para a solução de problemas relacionados à biologia da reprodução / Abstract: In mammals, fertilization depends on a sequence of events that culminates in the activation of the oocyte by the spermatozoa. The complete differentiation of the testicular germ cells in cells with fertilization ability involves the testis, epididymis, vas deferens and female reproductive organs. In the epididymis, the membrane surface of the spermatozoa may be modified, through a process known as epididymal maturation. Several proteins synthesized and secreted by the epididymal epithelial cells can be further located on the spermatozoa membrane surface or even though inside its acrosomal vesicle. The acquisition of the fertilization ability by the spermatozoa has been related with a new molecular organization of the membrane provided during the epididymal transit. The production of monoclonal antibodies (mAb) that recognizes antigens exclusively expressed by testicular germ cells or by the cells of the ducts through the spermatozoa passes during its maturation has been considered an important approach to permit the elaboration of the molecular map involved in the spermatozoa preparation. The mAb TRA (testicular germ cells immunized to rat - monoclonal antibody) 54 recognizes an antigen located in spermatids of seminiferous tubules of C57 BL/6 mice more than 24 days old and also in a specific population of epithelial cells in epididymal caput and in the luminal spermatozoa. The synthesis and release of the epididymal antigen occur in an androgen-dependent manner and independent of the testicular expression. Released antigen moves down the epididymis and is further incorporated by luminal spermatozoa. This work was performed in order to comprehend the complex mechanisms that prepare spermatozoa for the fertilization process. The molecular structure of the epididymal protein and its biological functions were investigated and solved. In a near future, the obtained results can contribute with new clinical tools for solving problems in reproductive biology / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Mary Anne Heidi Dolder, Jose Lino Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T15:36:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brito_PedroValedeAzevedo_M.pdf: 5058045 bytes, checksum: a8e944c3ea7b5a920db9f092ea469fc2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Hymenoptera é uma das maiores ordens de inseto no mundo e nenhum outro grupo possui tantas espécies benéficas para o homem quanto esse. A morfologia dos espermatozóides tem provado ser capaz de fornecer dados úteis para estudos filogenéticos em diversos grupos de insetos, inclusive os Hymenoptera. Porém, os estudos existentes até o momento descrevendo a morfologia dos espermatozóides nessa ordem ainda não são suficientes para permitir inferências filogenéticas mais abrangentes. Neste trabalho descrevemos a morfologia dos espermatozóides de Melittobia hawaiiensis e M. australica (Chalcidoidea) e de Neochrysis lecointei (Chrysidoidea) resultando em dois manuscritos que estão em fase de submissão. Comparando os dados desse estudo com os disponíveis na literatura observamos que algumas características como a presença de estruturas espiraladas nos espermatozóides, presença de material extracelular associado ao ápice dos espermatozóides e a ordem de desorganização dos microtúbulos do axonema no final do flagelo, parecem fornecer informações possíveis de serem utilizadas na filogenia das superfamílias de Hymenoptera. Outras características, como a morfologia do adjunto do centríolo e dos derivados mitocôndrias, parecem ser capazes de fornecer informações que indicam as relações de parentesco entre táxons inferiores, inclusive gêneros (ou tribos) da mesma família / Abstract: Hymenoptera is one of the largest insect orders in the world and no other group presents so many benefic species for humanity. In spite of these insects¿ importance, there are still many uncertainties about this group¿s phylogeny. Spermatozoa morphology has proved useful in resolving phylogenetic questions in many insects¿ orders, including Hymenoptera, although the available studies describing sperm morphology in this order do not include enough taxa to allow detailed phylogenetic studies. This study describes the sperm morphology of Melittobia hawaiiensis and M. australica (Chalcidoidea) and of Neochrysis lecointei (Chrysidoidea), which resulted in two manuscripts to be submitted for publication. Comparing data obtained in this study with those available in the literature there are some characteristics such as the presence of spiraling structures in spermatozoa, the extracellular material coating spermatozoa apex and the order of disorganization of the axoneme microtubules at the flagellum end that could be used to provide information about the Hymenoptera superfamilies¿ phylogeny. Other characteristics, such as the centriolar adjunct and mitochondrial derivatives¿ morphology, provide information about the relationships among inferior taxons, including those of the same genera, or tribes of the same family / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Introdução: Doze a 29 % dos ejaculados tem viscosidade seminal aumentada. Uma das técnicas recomendadas para diminuir a viscosidade do sêmen consiste num processo físico em que se passa o sêmen, 4 vezes, por uma seringa de 10 mL com agulha 18G. Ao fim desse processo, ter-se-ia modificado o comportamento molecular das fibrilas protéicas do esperma, tornando-o mais liquefeito, sem dano aparente a morfologia ou motilidade dos espermatozoides. Atualmente, discute-se sobre a total inocuidade desta técnica, uma vez que ela poderia provocar aumento da fragmentação do DNA dos espermatozoides. A hiperviscosidade seminal, além de reduzir a concentração e a motilidade dos espermatozoides, pode afetar a capacitação e a reação acrossômica, podendo ter implicações na integridade do DNA e no desenvolvimento embrionário normal. Objetivo: Comparar a fragmentação do DNA de espermatozoides humanos em amostras com viscosidade diminuída, fisiológica e aumentada, e avaliar se o processo de expulsão do sêmen através da agulha e seringa altera significativamente as taxas de fragmentação do DNA dos espermatozoides. Método: Após a coleta e avaliação dos parâmetros seminais das amostras de sêmen, aquelas que estiverem com viscosidade aumentada passarão pelo processo de expulsão através da seringa de 10 mL com agulha 18G por 4 vezes, para diminuir a viscosidade seminal. Posteriormente, serão feitas análises da fragmentação do DNA dos espermatozoides através da técnica de TUNEL em todas as amostras. Resultados: A fragmentação do DNA entre amostras com viscosidade fisiológica, diminuída e aumentada não apresentou diferença estatisticamente significativa (P=0,857). A fragmentação do DNA aumentou significativamente (P=0,035) nas amostras com viscosidade aumentada após passar na seringa e agulha quando comparadas com as mesmas amostras antes de passar pela mesma. Conclusão: O processo de expulsão do sêmen através de seringa e agulha visando redução da viscosidade seminal aumenta a fragmentação do DNA no espermatozoide, devendo este processo ser substituído por um processo inócuo. / Background: Twelve to 29 % of the ejaculated have the semen viscosity increased. One of the techniques recommended to decrease the viscosity of semen is a physical process in which the semen passes four times through a 10mL syringe with a 18G needle. At the end of this process would have modified the molecular behavior of the protein fibrils of the sperm making it more liquefied, without apparent damage to the morphology or motility of spermatozoa. Currently, the debate is about the complete safety of this technique since it could result in increased DNA fragmentation of spermatozoa. The seminal viscosity moreover reduces the concentration and motility of sperm, can affect the capacitation and acrosome reaction which may have implications for DNA integrity and normal embryonic development. Objective: To compare the DNA fragmentation in human semen samples with reduced, physiological and increased viscosity and evaluate if the process of expulsion of semen through the needle and syringe significantly alter rates of sperm DNA fragmentation. Methods: After collecting and evaluating semen parameters of semen samples, those that are with increased viscosity will pass through the process of expulsion through the 10 mL syringe with a 18G needle four times to reduce the viscosity of semen. After that, analysis of spermatozoa DNA fragmentation through the TUNEL technique will be made in all samples. Results: The fragmentation of DNA between samples with physiological, reduced and increased viscosity is not statistically significant (P=0.857). The DNA fragmentation increased significantly (P=0.035) in samples with increased viscosity after passing the syringe and needle when compared with the same samples before going through the same. Conclusion: The process of expulsion of semen through a syringe and needle in order to reduce the semen viscosity increases the DNA fragmentation in sperm, and this shall be replaced by a harmless process.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-04T17:38:02Z No. of bitstreams: 6 texto completo.pdf: 4447015 bytes, checksum: d4a7db2d4eee8b6edfc3828a86919a80 (MD5) Video 1.mp4: 44220469 bytes, checksum: f5c904e2e063f9c5b91c8d04de8daeb9 (MD5) Video 2.mp4: 66544797 bytes, checksum: 212e7a1bda635f49a6949f87de327262 (MD5) Video 3.mp4: 25512519 bytes, checksum: 647f3cb416774512bd02d13a32fbbe89 (MD5) Video 4.mp4: 40250551 bytes, checksum: 71514b414831667623182a240b6a9acc (MD5) Video 5.mp4: 52470028 bytes, checksum: fb97098003daea38f019ba4b52cd57ab (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-04T17:38:02Z (GMT). No. of bitstreams: 6 texto completo.pdf: 4447015 bytes, checksum: d4a7db2d4eee8b6edfc3828a86919a80 (MD5) Video 1.mp4: 44220469 bytes, checksum: f5c904e2e063f9c5b91c8d04de8daeb9 (MD5) Video 2.mp4: 66544797 bytes, checksum: 212e7a1bda635f49a6949f87de327262 (MD5) Video 3.mp4: 25512519 bytes, checksum: 647f3cb416774512bd02d13a32fbbe89 (MD5) Video 4.mp4: 40250551 bytes, checksum: 71514b414831667623182a240b6a9acc (MD5) Video 5.mp4: 52470028 bytes, checksum: fb97098003daea38f019ba4b52cd57ab (MD5) Previous issue date: 2018-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Aedes aegypti é um mosquito hematófago, com hábitos antropofílicos, sendo considerado vetor de importantes patógenos, como os vírus da febre amarela, dengue chikungunya e zika. Fêmeas de mosquitos geralmente copulam uma única vez, recebendo os gametas para produzir toda sua progênie ao longo de seu período reprodutivo. O processo de armazenamento de espermatozoides é considerado quase que totalmente papel da espermateca, garantindo certa independência reprodutiva da fêmea, bem como a viabilidade dos espermatozoides até a fertilização dos ovos. Há três espermatecas em A. aegypti, uma maior central e outras duas menores laterais. O armazenamento massivo de gametas, garante o aumento da capacidade vetorial das fêmeas dos mosquitos e de sua dispersão. Diante da importância desse órgão, no presente trabalho foi realizado uma revisão bibliográfica acerca da importância da espermateca para o sucesso reprodutivo dos insetos. Essa revisão inclui aspectos morfológicos, fisiológicos e das partes que compõe esse órgão (ducto, reservatório e glândula), ressaltando sua função ao longo dos processos de encaminhamento, alocação e liberação dos gametas para a fertilização dos ovos. Posteriormente, foi proposto uma busca pelos processos moleculares existentes nas espermatecas virgens e fertilizadas de Ae. aegypti por meio de RNAseq e análises de bioinformática. Em fêmeas virgens pode-se observar uma maior quantidade de transcritos relacionados a diferentes processos metabólicos que estabelecem um ambiente ideal para receber e alocar os espermatozoides. Já nas espermatecas fertilizadas, a maior quantidade de transcritos encontrados se relaciona com a manutenção do microambiente espermatecal, prolongando assim, a viabilidade dos espermatozoides. Foi conduzida também uma análise comparativa dos genes diferencialmente expressos (DEG) entre as espermatecas virgens e fertilizadas. Baseado nas funções de cada gene, oito genes foram escolhidos como alvos da técnica de RNAi para se determinar o efeito do silenciamento desses genes no processo reprodutivo em fêmeas de A. aegypti. As fêmeas foram injetadas com dsRNA para genes alvo relacionados ao metabolismo de energia (Ae-92048), componentes ligados à quitina (Ae- 187521 e Ae-88956), regulação transcricional (Ae-27176), regulação hormonal (AeSigP-4002), atividade enzimática (Ae-SigP-212177), atividade antimicrobiana (AeSigP-109183) e a homeostase de íons (AeSigP-66427). Para cada um dos genes, as fêmeas injetadas foram analisadas em relação à sua sobrevivência, alimentação sanguínea, produção e viabilidade da progênie. Por fim, por meio da hibridização in situ, foram identificados os locais específicos onde os genes escolhidos são expressos nas espermatecas. O presente trabalho é pioneiro a identificar os genes expressos em espermatecas virgens e fertilizadas de A. aegypti. Através de injeções de dsRNA, pudemos descrever os prejuízos nas fêmeas em relação a sua taxa de sobrevivência, capacidade de alimentação sanguínea, no armazenamento/conversão de nutrientes, no desenvolvimento dos ovos, bem como nos processos e oviposição e produção de progênie. Além disso, foi observado que uma redução nos transcritos de AeSigP-66427, responsável pela homeostase de íons, resulta na redução da motilidade dos espermatozoides e inviabiliza a produção de ovos. Por meio desse estudo, fomos capazes de elucidar o papel dos genes em alguns processos relacionados ao armazenamento de espermatozoides a longo prazo em A. aegypti. Ainda, esse trabalho nos forneceu as bases moleculares para o estabelecimento alvos específicos para o controle desse vetor, reduzindo assim, sua capacidade reprodutiva. / Aedes aegypti is an important hematophagous mosquito, with anthropophilic habits, also known as vector of important pathogens to humans, such as Yellow Fever, Dengue, Chikungunya, and, Zika viruses. A. aegypti females usually mate once, receiving the sperm to produce the whole offspring during their reproductive period. The spermatheca is responsible for sperm maintenance, nutrition and protection against physical and oxidative stress damage leading the long-term sperm storage process, resulting in the increase of the female fecundity. This reproductive autonomy of the females enhances their dispersion and then their vectorial capacity and the spermatheca play pivotal role providing the suitable environment, guaranteeing the sperm viability. There are three spermathecae in A. aegypti: two lateral and a central larger one. Considering the importance of this organ, in the present work, we reviewed different aspects of the spermatheca of insects, highlighting its importance for the reproductive success of the insects. This review also highlighted the number of spermathecae according to different taxonomic group, the role of different spermathecal parts (duct, reservoir, and gland), emphasizing their function along the processes of sperm maintenance. We also aimed to elucidate that the global gene expression in virgin and fertilized spermathecae (“spermathecomes”) separately, through RNA sequencing and bioinformatics analyzes. In virgin females, there is a greater number of coding sequences related to the establishment environment to receive and to allocate the spermatozoa. In fertilized spermathecae the most representative transcripts are related to the maintenance of the spermathecal microenvironment, thus prolonging the viability of these gametes. Differentially expressed genes (DEGs) were also analyzed by comparing virgin and fertilized spermathecae. We attempted the silencing of some of these DEG by the RNAi technique, to analyze the effects of knocking-down these genes throughout the reproductive process in A. aegypti. The females were injected with dsRNA of eight different genes related to energy metabolism (Ae-92048), chitin-bound components (Ae- 187521 and Ae-88956), transcriptional regulation (Ae-27176), hormonal regulation (AeSigP- 4002), enzymatic activity (Ae-SigP-212177), antimicrobial activity (AeSigP-109183) and ion homeostasis (AeSigP-66427). The gene silencing decreased the female survival, reduced the blood-feeding intake, nutrients storage/conversion, egg production and oviposition and offspring productions. In addition, the silencing of AeSigP-66427 affecting sperm motility and impaired egg production. At last, by the in situ hybridization we could detect in which part or the spermatheca, the chosen target genes are expressed. The present work is pioneer to identify the collection of genes expressed the virgin and fertilized spermathecae of A. aegypti. Through this intriguing study, we were able to elucidate the genes and some processes related to the long-term storage of spermatozoa in A. aegypti. Moreover, this work provided the basis for the establishment of alternative strategies to control this vector, by reducing its reproductive capacity. / Sigilo informado através do Termo de Autorização e por e-mail em 31/08/2018.

Orientador: Shirlei Maria Recco-Pimentel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:41:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Introini_GiseleOrlandi_D.pdf: 4339953 bytes, checksum: 12ffc20df8da4d8930c265634e22d822 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Aplicações de Microscopias Eletrônicas de Transmissão (TEM) e Varredura (SEM) têm contribuído para a sistemática de moluscos bivalves e classificações de táxons mais abrangentes. Em muitos casos, os resultados dessas ferramentas metodológicas têm notavelmente complementado os estudos comparativos da anatomia interna e dos caracteres conquiliológicos, contribuindo para uma ampla compreensão das relações filogenéticas entre os representantes da classe Bivalvia. A morfologia dos espermatozóides de inúmeros táxons importantes das subclasses Pteriomorphia e Heterodonta permanece pouco ou nada estudada. A análise de espécies dessas subclasses pode corroborar estudos que abordam taxonomia e filogenia. No presente trabalho, foi realizado o estudo da ultraestrutura dos espermatozóides de espécies de bivalves das famílias Veneridae, Donacidae, Tellinidae (Ordem Veneroida, Subclasse Heterodonta,), Mytilidae (Mytiloida), Isognomonidae (Pterioida) e Ostreidae (Ostreoida) (pertencentes à Subclasse Pteriomorphia). Os espermatozóides de todas as espécies de bivalves analisadas, com exceção da espécie Tellina lineata, apresentaram uma morfologia típica de animais marinhos que liberam seus gametas fertilizando seus ovos na água do mar. A microscopia eletrônica de transmissão forneceu importantes caracteres que auxiliaram na diferenciação entre os espermatozóides das espécies Isognomon bicolor e I. alatus (única coletada em território estrangeiro); Donax hanleyanus e D. gemmula; Macoma biota e M. constricta. A célula gamética masculina de Tellina lineata foi considerada modificada, portadora de acrossomo cônico e curto, núcleo longo e helicoidal, mitocôndrias alongadas que se estendiam sobre a periferia da base nuclear, estruturas longas que se dispunham ortogonalmente (mas que não apresentavam o padrão convencional dos centríolos) e um flagelo simples. Na literatura acerca dos Bivalvia, considerase a cabeça alongada mais eficiente na penetração de óvulos que possuem ampla camada gelatinosa. O espermatozóide de Tivela mactroides (em comparação com aquele produzido por Anomalocardia brasiliana) possibilitou a descrição de determinadas características que podem contribuir para vantagens adaptativas nos ambientes nos quais os bivalves ocorrem. Uma característica interessante da cabeça alongada dos espermatozóides dos membros da família Veneridae é a presença de curvatura. Populações de Mytella podem ocorrer tanto em costões rochosos quanto em bancos de sedimento areno-lamoso. Não houve diferença entre essas populações e foi sugerido que ambas se tratam de M. charruana. A presença de perforatorium no espermatozóide de Mytella charruana permite sua alocação na subfamília Mytilinae. As descrições disponíveis na literatura sobre a morfologia do gameta masculino de ostras mostram uma significativa semelhança entre as espécies investigadas, corroborando o status monofilético da família Ostreidae. Segundo os resultados apresentados é possível afirmar que a espécie Crassostrea brasiliana ocorre na região de Cananéia. Conclui-se que os dados da tese mostraram-se especialmente importantes por revelarem os detalhes internos mais sutis dos espermatozóides, ampliando o crescente entendimento da estrutura, biologia e desenvolvimento dos espermatozóides de bivalves das famílias Isognomonidae, Veneridae, Donacidae, Tellinidae, Mytilidae e Ostreidae. / Abstract: The ultrastructure of bivalve spermatozoa can be species-specific and often provide valuable taxonomic traits for systematic reviews and phylogenetic reconstructions. Transmission and scanning electron microscopy was an efficient tool to differentiate the spermatozoan structure of species sharing many conchological characters, which could lead to equivocal identification. We analyzed sperm ultrastructural features that were useful for taxonomic issues with regard to Isognomon bicolor and Isognomon alatus (Isognomonidae); Macoma constricta, Macoma biota and Tellina lineata (Tellinidae); Donax hanleyanus and Donax gemmula (Donacidae). The data revealed that the bivalve species studied here, except T. lineata, produce primitive-type spermatozoa, typical of marine invertebrates in which eggs are fertilized in the surrounding water. We, also, compared the ultrastructure of spermatozoa from the bivalves Anomalocardia brasiliana and Tivela mactroides (Veneridae). The spermatozoa of both species contain a curved nucleus with a short cone-shaped acrosome. There were six mitochondria and glycogen clusters in the middle piece of the T. mactroides sperm cell. Possibly, the glycogen clusters and the higher mitochondria number correspond to an adaptive advantage in turbulent waters. Increasing the sperm life expectance also increases the odds of finding the eggs and accomplishing fertilization. Oysters of the genus Crassostrea and mussels of the genus Mytella, commercially important in Brazil, were also investigated in this thesis. The sperm ultrastructure of the specimens described herein and molecular studies, confirm the presence of Crassostrea brasiliana (Ostreidae) in Cananéia. Spermatozoa of mussel specimens of the genus Mytella, from two populations living in distinct habitats (muddy-sand sediment and rocky shores), were examined by transmission electron microscopy. The spermatozoa of all specimens shared the same ultrastructural pattern suggesting that the analyzed specimens, which live in distinct habitats, indeed belong to a same species, which was identified as M. charruana (Mytilidae) based on conchological analysis. The presence of an axial rod in sperm cells upholds the inclusion of M. charruana in the subfamily Mytilinae. In conclusion the electron microscopy was an efficient method to solve some particular taxonomic issues. The present spermatozoan ultrastructural studies have provided new and welcome data about the families Isognomonidae, Veneridae, Tellinidae, Donacidae, Ostreidae and Mytilidae. The results showed in this thesis could be valuable in future phylogenetic analyses. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural