A coleta de sêmen da cauda do epidídimo é a última oportunidade de obter espermatozoides de garanhões valiosos, sendo que durante a criopreservação, a etapa de centrifugação é considerada um ponto crítico. A principal hipótese é que a centrifugação com coloides pode melhorar a qualidade dos espermatozoides coletados da cauda do epidídimo de garanhões. Para avaliação da hipótese foram realizados dois experimentos. O experimento um teve por objetivo avaliar o efeito da centrifugação com cushion e com coloide em camada única (SLC) na motilidade de sêmen do epidídimo de garanhões após a etapa de centrifugação. O experimento dois teve o objetivo de determinar o efeito da SLC prévio ao congelamento e após o descongelamento. Experimento 1) Oito garanhões foram submetidos à orquiectomia bilateral e o sêmen foi coletado da cauda dos epidídimos (n=16). Após a coleta, as amostras foram submetidas a três protocolos de centrifugação: Convencional (20 minutos a 600xg), cushioned (20 minutos a 900xg) e SLC (20 minutos a 300xg). Os pellets foram ressuspendidos e as amostras foram submetidas à avaliação laboratorial de motilidade e morfologia espermática. Experimento 2) Dez garanhões foram submetidos a orquiectomia bilateral e o sêmen foi coletado da cauda dos epidídimos (n=20). Para criopreservação, as amostras foram submetidas a: centrifugação convencional (20 minutos a 600xg), SLC prévio a criopreservação (SLC-Pre) (20 minutos a 300xg) e SLC após a criopreservação (SLC+) (20 minutos a 600xg seguidos de uma segunda centrifugação descrita após descongelamento). Os pellets foram ressuspendidos em diluente de congelamento, submetidos ao processo de congelamento em nitrogênio líquido e descongelamento. Os grupos de 6 centrifugação convencional e SLC-Pre foram avaliados imediatamente após descongelamento. O grupo SLC+ foi descongelado e submetido à SLC (20 minutos a 300xg) e ressupendido em diluente de congelamento (SLC+F) ou resfriamento (SLC+C). A motilidade total e a motilidade progressiva das amostras foram avaliadas com análise computadorizada do movimento espermático. A morfologia foi avaliada com auxílio de microscópio com contraste de fase. Funcionalidade de mitocôndria, integridade de membrana e DNA foram avaliados com auxílio de microscópio de fluorescência. Os dados foram analisados por estatística descritiva, simple one-way ANOVA e Teste de Tukey. Experimento 1) a motilidade de espermatozoide submetidos à SLC (p<0,05) e cushion (p>0,05) foi superior do que os submetidos a centrifugação convencional. Experimento 2) SLC-Pre e SLC+F apresentaram maior motilidade total, enquanto SLC+F apresentou maior motilidade progressiva. O percentual de espermatozoides com morfologia normal foi maior em SLC-Pre e SLC+F. A funcionalidade de mitocôndria foi maior em todos grupos com SLC, enquanto a integridade de membrana foi maior em SLC-Pre. A centrifugação com coloides melhorou a qualidade de espermatozoides coletados da cauda do epidídimo de garanhões, tanto no momento prévio ao congelamento como após o descongelamento. / Epididymis cauda sperm recovery and cryopreservation are last opportunity to obtain spermatozoa from a valuable animal, even though during cryopreservation centrifugation step is considered as a critical point. It is hypothesized that colloidal centrifugation could enhance epididymal stallion sperm parameters. To evaluate this hypothesis two experiments were performed. In experiment one, the objective was to evaluate the effect of cushioned and Single Layer Centrifugation (SLC) on epididymal stallion sperm motility postcentrifugation. In experiment two, the objective was to determine the effect of SLC on epididymal stallion sperm quality pre-freezing and post-thawing. Experiment 1) Eight stallions were submitted to bilateral orchiectomy and the resulting epididymal cauda (n = 16) were flushed with semen extender. After harvesting, samples were submitted to three centrifugation protocols: conventional (20 minutes at 600xg), cushioned (20 minutes at 900xg), and SLC (20 minutes at 300xg). Pellets were resuspended, motility and morphology were evaluated. Experiment 2) Ten stallions were submitted to bilateral orchiectomy and epididymal cauda (n=20) were harvested. For cryopreservation, epididymal sperm were submitted to: conventional centrifugation (20 minutes at 600xg), Single Layer Centrifugation prior cryopreservation (SLC-Pre) (20 minutes at 300xg) and Single Layer Centrifugation after cryopreservation (SLC+) (20 minutes at 600xg followed by a second centrifugation described after thawing). Pellets were resuspended in freezing extender, submitted to cryopreservation process in liquid nitrogen and thawed. Conventional and SLC-Pre were evaluated immediately after thawing. SLC+ samples were thawed, submitted to SLC (20 minutes at 300xg) and the pellets were resuspended with freezing (SLC+F) and cooling extender (SLC+C). Total motility (TM) and progressive 8 motility (PM) were evaluated with computer-assisted semen analyses. Sperm morphology was evaluated under a phase-contrast microscope. Mitochondrial functionality, membrane e DNA integrity were evaluated with an epifluorescence microscope. Data was evaluated by descriptive statistics, simple one-way ANOVA and comparison between means by Tukey test. Significance was assigned to all values p<0.05. Experiment 1) Motility of spermatozoa recovered by SLC (p<0.05) and cushioned centrifugation (p>0.05) were higher than those recovered by conventional centrifugation. Experiment 2) SLC-Pre and SLC+F yielded the highest TM, while SLC+F yielded the highest PM. Higher morphological normal sperm was observed in SLC-Pre and SLC+F. Mitochondrial functionality was significantly higher in all treatments with SLC, while membrane integrity was higher in SLC-Pre. Colloidal centrifugation improved epididymal sperm quality before freezing and after thawing.

PEREIRA, Jeane Ferreira. Efeito da composição bioquímica do plasma seminal de caprinos sobre os espermatozoides da cauda do epidídimo e ejaculado resfriados a 5º C. 2012. 48 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Zootecnia,Fortaleza-CE, 2012 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-29T13:55:37Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_jfpereira.pdf: 456808 bytes, checksum: 98257194240b5625e97a8337ee8c5779 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-29T13:55:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_jfpereira.pdf: 456808 bytes, checksum: 98257194240b5625e97a8337ee8c5779 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-29T13:55:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_jfpereira.pdf: 456808 bytes, checksum: 98257194240b5625e97a8337ee8c5779 (MD5) Previous issue date: 2012 / The present study was carried out to evaluate the effect of biochemical composition of seminal plasma (SP) on spermatozoa from caudal epididymis and ejaculated goat sperm, diluted in egg yolk-citrate (EYC) and egg yolk-tris (EYT). The ejaculates of 8 animals were collected in the morning and fresh semen was divided in order to obtain 4 treatments: EYC (washed ad no washed), EYT (washed ad no washed). On the same day, in the afternoon, the animals were orchidectomized to obtain spermatozoa from caudal epididymis, of which four aliquots of 100 L were removed. Two of them were added 120 L of autologous seminal plasma, consisted in other 4 treatments: EYC (spermatozoa from caudal epididymis with and without seminal plasma) e EYT (spermatozoa from caudal epididymis with and without seminal plasma). The seminal plasma was evaluated for biochemical composition. Samples of 8 treatments were analyzed for vigor, motility and sperm morphology, at 0 hour (fresh) and after 2 and 24 hours in storage at 5ºC. Data were analyzed with the statistic software SAS@. The following results were found. In grouping by the concentration of fructose and chlorides was observed a significant effect (p <0.05) independent of diluent and treatment, for ejaculated spermatozoa with minor defects and normal. From the potassium concentration was showed that only the vigor suffered group effect (p <0.05). In the spermatozoa from caudal epididymis, fructose was a significant effect for group interaction, treatment and time on motility, for the vigor there was a significant interaction effect between treatment and time and group effect, in the fructose and potassium concentrations, respectively. For the chloride concentration was observed a significant interaction between group and treatment on the occurrence of major defects, (p <0.05). After 24 hours of storage, the best values were observed in sperm without seminal plasma from caudal epididymis, however in the presence of seminal plasma, sperm from the ejaculate withstood better conservation (p <0.05). The addition of seminal plasma reduced seminal parameters of the sperm from caudal epididymis. The biochemical composition of seminal plasma of goats raised in northeastern Brazil interferes directly on the quality of cooled semen. / O objetivo do trabalho foi verificar o efeito da composição bioquímica do plasma seminal nos espermatozoides da cauda do epidídimo e do ejaculado caprino, diluídos em citrato-gema (CG) e tris-gema (TG). Os ejaculados de 8 animais foram coletados pela manhã e o sêmen fresco foi dividido de forma a se obter 4 tratamentos: CG (lavado e não lavado), TG (lavado e não lavado). No mesmo dia à tarde, os animais foram castrados para obtenção dos espermatozoides da cauda do epidídimo, dos quais foram retiradas quatro alíquotas de 100 L. Em duas delas foi adicionada 120 L de plasma seminal autólogo, constituindo assim outros 4 tratamentos: CG (espermatozoide da cauda do epidídimo com e sem plasma seminal) e TG (espermatozoide da cauda do epidídimo com e sem plasma seminal). O plasma seminal foi avaliado quanto à composição bioquímica. As amostras dos 8 tratamentos foram analisadas quanto ao vigor, motilidade e morfologia espermática, a 0 h (fresco) e após 2 e 24 h conservação a 5°C. Os dados foram analisados pelo SAS@. No agrupamento pela concentração de frutose e cloretos foi observado um efeito significativo (p<0,05) independente do diluidor e tratamento, para os espermatozoides ejaculados com defeitos menores e normais. A partir da concentração de potássio foi revelado que apenas o vigor sofreu efeito de grupo (p<0,05). Nos espermatozoides da cauda do epidídimo, a frutose constituiu efeito significativo para interação entre grupo, tratamento e tempo sobre a motilidade, já para o vigor foi observado um efeito significativo da interação entre tratamento e tempo e efeito de grupo, para as concentrações de frutose e potássio respectivamente. Para a concentração de cloretos, foi constatado um efeito significativo na interação entre o grupo e o tratamento sobre a ocorrência dos defeitos maiores, (p<0,05). Após a conservação por 24 horas, os melhores valores foram observados nos espermatozoides da cauda do epidídimo sem plasma seminal, no entanto na presença de plasma seminal, os espermatozoides do ejaculado suportaram melhor a conservação. A adição de plasma seminal reduziu os parâmetros seminais dos espermatozoides da cauda do epidídimo. A composição bioquímica do plasma seminal de caprinos criados no nordeste do Brasil interfere sobre a qualidade do sêmen resfriado.

SOUZA, Carlos Eduardo Azevedo. Análise proteômica do plasma seminal e secreções do epidídimo em ruminantes: potenciais associações com o desenvolvimento sexual, parâmetros seminais e função espermatica. 2007. 185 f. Tese (doutorado em zootecnia)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2007. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-04-07T19:20:05Z No. of bitstreams: 1 2007_tese_ceasouza.pdf: 1841396 bytes, checksum: 739bf3cd94874396bf0fb93e6971b775 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-25T19:34:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_tese_ceasouza.pdf: 1841396 bytes, checksum: 739bf3cd94874396bf0fb93e6971b775 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-25T19:34:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_tese_ceasouza.pdf: 1841396 bytes, checksum: 739bf3cd94874396bf0fb93e6971b775 (MD5) Previous issue date: 2007 / This research includes three different studies, evaluating distinct aspects about the composition of proteins expressed in the ruminant reproductive tract fluids. The first study describes variations in the seminal plasma protein profile of Santa Inês rams. The second identifies proteins present in the cauda epididymal fluid of Holstein bulls, and the third study details the binding pattern of BSPs and osteopontin to bovine sperm membrane. In Study 1, semen samples of sixteen rams were collected and centrifuged to obtain seminal plasma. A volume containing 150 μg of proteins was used to prepare the 2D gels, which were scanned and electronically analyzed. The quantification of the protein spots was given as PPM of the total integrated optical density. We detected 186 ± 10 spots in the gels prepared with the 48 weeks samples, similar to the amount found in the gels obtained from samples of 34 (183) and 30 (179) weeks of age. Maps representing 34 and 48 weeks showed a train of spots with 63 kDa (pI 4.2 to 5.0) that was not present in early ages. New proteins were detected in the gels as the rams matured. In the maps of 20 weeks, high molecular weight trains (158 to 160 kDa) were detected compared to other gels obtained before that age. Quantitative changes in the spots with age were more evident before puberty. We also described a relationship between the intensity of some spots in the 48-week maps and semen scores. We conclude that protein secretion in the seminal plasma of hairy rams is synchronized with a series of complex changes during the sexual development of the males. The objective of Study 2 was to describe the binding pattern of OPN and BSP proteins to the membrane of ejaculated bovine sperm and after in vitro exposure of these cells to bovine oviductal fluid. Semen samples of five Holstein bulls were obtained and subjected to the following treatments: 1. Ejaculated sperm; 2. Ejaculated sperm incubated with isthmus oviductal fluid; 3. Ejaculated sperm incubated sequentially with isthmus and ampullary oviductal fluid. From each of these treatments, sperm samples were subjected to immunocytochemistry and confocal microscopy. Positive reaction for BSP-A1/A2 was detected in the midpiece, equatorial and post-equatorial regions and acrosome, in all treatments. The signal was higher in the midpiece compared to the rest of the cells, irrespective of the treatment. The binding pattern of BSP-30kDa was similar to that observed for BSP-A1/A2. Additionally, sperm with a reacted acrosome showed a reduction in the signal of 4.9 and 3.6 times, after exposure to isthmic and ampullary fluids, respectively. OPN binding was detected in the post-equatorial region and acrosome of ejaculated sperm, with higher intensity in the acrosome. A greater amount of capacitated sperm and capable of acrosome reaction in response to LPC was seen after exposure to isthmic (39.8% and 79%) and ampullary (20.5% and 69.3%, respectively) compared to sperm exposed to MTMS alone (12.3% and 49.3%) or heparin (23.7% and 38.9%). We conclude that sperm exposure to oviductal fluids influences interactions between seminal plasma proteins and sperm membrane, possibly modulating sperm function. In Study 3, we used a proteomic approach to identify the proteins present in cauda epididymal fluid (CEF) of Holstein bulls. CEF samples were obtained from 11 bulls and used to prepare 2D gels. The spots were cut and identified using mass spectrometry. This first analysis showed that albumin composed almost 21% of the total intensity of the spots, interfering with the identification of low abundance proteins. To improve resolution, we depleted albumin from the samples using affinity spin columns and new maps were prepared. Spots detected after depletion not seen before were also identified. We observed 114 ± 3 spots before albumin detection. We identified 55 of them, comprising 23 different proteins. Based on the optical density, the most abundant proteins in the CEF samples were albumin (21.1%), cholesterol binding proteins (6 low molecular weight isoforms; 10.5%), prostaglandin D synthase (7.6%) and gelsolin (6%), accounting for 45.2% of the proteins. Another 36 spots were also identified, corresponding to 13 different proteins. After albumin depletion, the intensity of the albumin spot in the gels was reduced to 10%, and the number of spots in the maps increased to 137 ± 4. Also, 48 spots were at least 3 times more abundant after depletion. The identity of those proteins suggest a wide range of functions, including sperm metabolism regulation, changes in membrane and sperm protection against oxidative damage during epididymal storage. / Este trabalho se compõe de três estudos distintos, avaliando diferentes enfoques da composição das proteínas expressas nos fluidos reprodutivos de ruminantes. O primeiro estudo descreve as variações no perfil protéico do plasma seminal de ovinos Santa Inês. O segundo avalia as proteínas presentes no fluido da cauda do epidídimo de touros Holandês maduros. A terceira parte mostra detalhes da distribuição topográfica e intensidade de ligação das BSPs e da osteopontina à membrana de espermatozóides bovinos. No estudo 1, amostras de sêmen de dezesseis cordeiros da raça Santa Inês foram colhidas. As amostras foram centrifugadas para obtenção do plasma seminal. Um volume contendo 150 µg de proteínas foi utilizado para a preparação de géis bidimensionais, que foram digitalizados e analisados. A quantificação das proteínas nos géis foi dada como PPM da densidade óptica total integrada de todas as proteínas, de acordo com o programa. Foram encontrados 186 ± 10 spots protéicos nos géis oriundos de amostras coletadas às 48 sem., semelhante ao encontrado às 34 (183) e 30 (179) semanas de idade. Os mapas representando 34 e 48 semanas apresentaram uma seqüência de spots de 63 kDa (pI 4,2 a 5,0) que não estava presente nas idades mais jovens. À medida que os animais amadureceram, novas proteínas foram detectadas no plasma seminal. Nos mapas de 20 semanas de idade, seqüências de elevada massa molecular (158 a 160 kDa) foram detectadas, diferentemente dos mapas obtidos em idades mais jovens. Mudanças quantitativas na secreção dos spots em função da idade foram mais evidentes durante a fase pré-púbere. Detectaram-se também relações entre a intensidade de alguns spots nos mapas protéicos de amostras obtidas às 48 sem. de idade e parâmetros espermáticos. Portanto, a secreção de proteínas no plasma seminal em cordeiros Santa Inês ocorre de forma sincronizada com uma série de alterações complexas no desenvolvimento sexual como um todo. Estas mudanças foram mais marcantes na fase de pré-puberdade, justamente quando os espermatozóides começaram a adquirir motilidade progressiva. O objetivo do estudo 2 foi avaliar a distribuição topográfica e a intensidade de ligação das proteínas BSP A1/A2, BSP-30kDa e OPN à membrana de espermatozóides ejaculados e após exposição destas células in vitro às secreções do oviduto. O padrão de ligação das proteínas BSP-A1/A2, BSP-30kDa e osteopontina foi avaliado em espermatozóides obtidos de sêmen fresco e exposto seqüencialmente aos fluidos do istmo (IODF) e da ampola (AODF) do oviduto. Foram utilizadas amostras de sêmen de cinco touros Holandês, submetidos às seguintes condições: 1. Espermatozóides ejaculados; 2. Espermatozóides ejaculados incubados com IODF; 3. Espermatozóides ejaculados + IODF incubados com AODF. De cada um desses tratamentos foram colhidas alíquotas de células espermáticas para o procedimento de imunocitoquímica e análise por microscopia confocal. Uma reação positiva para BSP-A1/A2 foi detectada na peça intermediária, regiões equatorial e pós-equatorial e acrossomo dos espermatozóides, em todos os tratamentos. A análise dos diferentes planos de várias células mostrou fluorescência significativamente mais intensa na peça intermediária, em comparação com o restante das células, independente das condições de incubação. O modelo de ligação da BSP-30kDa aos espermatozóides foi semelhante àquele observado para a BSP-A1/A2. Além disso, nos espermatozóides com acrossomo reagido, a fluorescência apresentou redução de 4,9 e 3,6 vezes após exposição aos fluidos do istmo e da ampola, respectivamente. A ligação da osteopontina foi identificada na região pós-equatorial e na extremidade do acrossomo em espermatozóides ejaculados, apresentando fluorescência mais intensa no acrossomo em comparação com o segmento pós-equatorial. A maior percentagem de células capacitadas e capazes de reação acrossômica em resposta ao LPC ocorreu após exposição das células aos fluidos do istmo (39,8% e 79%) e ampola (20,5% e 69,3%, respectivamente) em comparação aos espermatozóides expostos apenas ao MTMS (12,3% e 49,3%) e à heparina (23,7% e 38,9%). Conclui-se que a exposição dos espermatozóides aos fluidos do oviduto modifica as interações entre as BSPs, a osteopontina e a membrana espermática, sendo potencialmente um mecanismo modulatório da função espermática. No estudo 3, o objetivo foi utilizar uma abordagem proteômica para identificar detalhadamente as proteínas presentes no fluido epididimal de touros sexualmente maduros. Foram obtidas amostras de fluido da cauda do epidídimo (CEF) de 11 touros Holandês maduros, canulados nos ductos deferentes. As amostras foram utilizadas para a preparação de mapas protéicos, através de eletroforese 2D, os quais foram analisados pelo software PDQuest, sendo os spots identificados por espectrometria de massa. Esta primeira análise do CEF mostrou que cerca de 21% da intensidade de todos os spots dos géis era composta por albumina, prejudicando a identificação de proteínas menos abundantes. Para contornar esse obstáculo, a albumina foi parcialmente removida das amostras utilizando-se cromatografia de afinidade e foram preparados novos mapas bidimensionais, novamente sujeitos à análise computadorizada. Os spots detectados nesses novos géis, não identificados nos mapas anteriores foram também sujeitos a espectrometria de massa. Foram detectados 114 ± 3 spots, nas amostras antes da depleção de albumina, dos quais foram identificados 55, representando 23 proteínas. Com base na densidade óptica integrada dos spots, as proteínas mais abundantes no CEF foram albumina (21,1%), proteínas ligadoras de colesterol (6 isoformas de baixa massa molecular; 10,5%), prostaglandina D sintetase (PGDS; 7,6%), e gelsolina (6%), totalizando quase a metade (45,2%) do total de proteínas. Outros 36 spots também foram identificados, correspondendo a 13 diferentes proteínas. Após a depleção da albumina, o número de spots detectados nos mapas passou para 137 ± 4 spots. Comparação dos géis antes e após o procedimento de depleção, mostrou que a intensidade da albumina foi reduzida para 1/10 da intensidade nos géis não submetidos à depleção. Além do aumento no número de spots, 48 deles tiveram sua intensidade aumentada em 3X, pelo menos, nos géis depletados em comparação aos originais. A identidade dessas proteínas sugere que elas apresentam uma enorme gama de funções, incluindo a modulação do metabolismo espermático, participação na modificação superficial da membrana e proteção dos espermatozóides durante seu armazenamento na cauda epididimal.

Introdução: Em torno de 15% dos casais apresentam o diagnóstico de infertilidade, sendo que 50% se devem a fatores masculinos. Diversos testes de função espermática são propostos para a avaliação da fertilidade, mas o espermograma é o principal exame para o diagnóstico de infertilidade masculina. O valor prognóstico das características seminais como concentração, morfologia e motilidade como marcadores de infertilidade masculina é confundido. A avaliação desses e a classificação quanto à normalidade dos mesmos permanece sendo tema de discussão frequente. Objetivos: Comparar as diferentes classificações de parâmetros seminais (OMS 1999, OMS 2010 e TMSC) e avaliar as características de pacientes em terapia de reprodução humana assistida que se relacionam com esses parâmetros. Métodos: Foi realizado estudo longitudinal, retrospectivo, baseado em revisão de banco de dados para avaliar as características e parâmetros seminais e comparar as mesmas conforme as classificações da OMS de 1999, OMS de 2010 e TMSC de 477 homens submetidos a investigação de infertilidade ou tratamentos de reprodução assistida na clínica Generar – Reprodução Humana, entre 2011 e 2015. Resultados: 401 pacientes tiveram alguma alteração pela OMS 1999, 223 pela OMS 2010 e 200 pela TMSC. O critério que mais alterou a condição de uma amostra seminal de anormal em 1999 para normal em 2010 foi a morfologia. Conclusão: Os parâmetros se tornaram menos rígidos de 1999 para 2010 alterando significativamente a proporção de indivíduos que deixaram de ser classificados como inférteis. A classificação baseada no TMSC pode ser útil na indicação de alguns tratamentos, mas não pode definir um indivíduo como fértil ou infértil em função de não levar em consideração a morfologia espermática. / Background: Approximately 15% of couples presenting the diagnosis of infertility, and 50% of cases are due to male factors. Several sperm function testing is proposed for the evaluation of male fertility, but sperm is the first test for the diagnosis of male infertility causes. The prognostic value of the seminal characteristics as concentration, morphology and motility as male infertility markers is often confused. Evaluation of semen parameters and classification for normality remains frequent topic of discussion. Objectives: Compare the different classifications of seminal parameters (OMS 1999, WHO 2010 and TMSC) and evaluate the characteristics of patients treated in assisted reproduction therapy relating to these parameters. Methods: Retrospective study based on chart review evaluated 477 semen samples from men undergoing investigation or infertility treatments in assisted reproduction between 2011 and 2015. Results: 401 patients were considered abnormal by the WHO 1999, 223 by WHO 2010 and 200 for TMSC. The criteria that most changed the classification was sperm morphology. Conclusion: The parameters have become less rigid 1999 to 2010 significantly changing the proportion of individuals who are no longer classified as infertile. The classification based on TMSC can’t define an individual as fertile or infertile regardless due to not take into account the sperm morphology, but may be helpful when it comes to the indication of the intrauterine insemination.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-31Bitstream added on 2014-06-13T19:33:22Z : No. of bitstreams: 1 lucio_ac_me_jabo.pdf: 498660 bytes, checksum: f8a6a9a504926a49d1926ba32ce8e61e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A produção de doses de sêmen, enriquecidas com espermatozóides portadores do cromossomo X ou Y, aumentará a contribuição da inseminação artificial para: o incremento do progresso genético, produtividade e retorno econômico nas atividades pecuárias, e para a prevenção de doenças ligadas ao cromossomo X, na espécie humana. Constituiu objetivo do presente trabalho: aplicar o método de “swim-up” associado à centrifugação em gradiente descontínuo de densidade para produzir amostras de sêmen enriquecidas com espermatozóides portadores do cromossomo X, em bovinos. Após os tratamentos, os espermatozóides foram submetidos ao controle de qualidade pela avaliação da integridade acrossomal e taxas de produção de embriões in vitro. A validação dos resultados foi feita pela análise da proporção sexual dos embriões produzidos in vitro através da amplificação de uma seqüência específica do cromossomo Y presente no genoma bovino. Após a análise dos resultados observouse que não houve diferença significativa (P>0,05) no desvio da proporção sexual quando comparamos o grupo controle (45,20% de fêmeas) com os procedimentos de separação de espermatozóides (60,65% de fêmeas, em média). Os métodos de separação de espermatozóides, não prejudicaram a fertilidade dos espermatozóides (taxas de clivagem e blastocistos, em média, de 70% e 26% respectivamente). Este pode ser considerado um procedimento a ser utilizado na PIV de embriões bovinos. / The production of doses of semen enriched with X- and Y- bearing spermatozoa will increase the artificial insemination contribution for genetic progress, productivity and economic return in livestock production and prevention of diseases connected to X chromosome, in humans. The purpose of this work was associated the modified swimup method with the centrifugation in density gradient for separation of X-bearing spermatozoa. Quality control of centrifuged spermatozoa were evaluated by acrosomal integrity and in vitro embryo production. The results were validated by sex proportion of in vitro produced embryos using PCR by Y- specific sequences present in bovine male genomic DNA. After the determination of genetic sex of in vitro produced embryos, the results showed no statistical difference (P>0.05) on deviation of sex ratio when the control group (45.20% female) was compare with the others spermatozoa selection procedures (60.65% female). The spermatozoa selection methods didn’t impair fertility of X-bearing spermatozoa (cleavage and blastocyst rates: 70% and 26%, respectively) and would be considered methods of relevance to be introduced on in vitro produced embryos programs.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:54:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 869208 bytes, checksum: 49cc1ade4a40ef37c41af4eebf8c42a1 (MD5) Previous issue date: 2010-07-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The objectives of this study were to examine whether vitamin E has an effect on the structural integrity of goat sperm plasma membrane, as well to investigate the potential use of this vitamin in extenders medium for cryopreservation of goat semen. Two adult Parda Alpina breed males were used, totalizing 8 semen samples for each one. After collection, the physical characteristics of the semen, the sperm morphology and the functional integrity of sperm membrane by hypoosmotic swelling test were evaluated. Then the semen was diluted as follows: BIOXCELL® (Control), BIOXCELL® + Equex, BIOXCELL® + Vitamin E (25&#956;M), BIOXCELL® + Vitamin E (50&#956;M) and BIOXCELL® + Vitamin E (100&#956;M). After the final dilutions, the progressive motility, sperm vigor and hypoosmotic swelling test were performed for each treatment. The semen was packaged in 0.25 ml straws, the straws were cooled to 5 oC for 1 hour in plastic container containing ethyl alcohol. The pre-freezing was done in liquid nitrogen vapor for 15 minutes. After this period, the straws were immersed in liquid nitrogen. The samples were thawed in a water bath at 37 oC for 30 seconds, packaged in plastic tubes and homogenized for immediate analysis of sperm motility and vigor, hypoosmotic swelling test and thermoresistance test. In fresh semen, the physical and morphological characteristics remained within normal parameters. No correlation of motility with other variables were detected. The average volume correlated negatively with sperm vigor, minor defects and total defects (r = -0.55, r = -0.52 and r = -0.53, respectively) and positive correlation with the hypoosmotic swelling test (r = 0, 44). A negative correlation (r = -0.48) was found between sperm concentration and major defects. The minor defects and total defects values were markedly positive correlated (r = 0.98). The treatments did not differ (P > 0.05) for progressive motility, spermatic vigor and hypoosmotic swelling test of semen. The motility and vigor after thawing and during the TTR did not differ (P > 0.05) among treatments. No significant difference (P > 0.05) among treatments after the completion of the hypoosmotic swelling test was detected. Correlation was observed between motility and vigor in all treatments in the diluted semen (pre-cooled) and at all times of the TTR. No correlation between the vigor and the hypoosmotic swelling test in any of the treatments on 0H and 2H of TTR times was found, however a correlation at 1H time Equex treatment (r = 0.51) and the Control, Equex and Vit. E 50&#956;M treatment at time 3H (r = 0.44, 0.69, 0.57, respectively) were found. The thawed semen samples from Equex treatment and Vit. E 100&#956;M treatment showed correlation between motility and hypoosmotic swelling test. It is concluded that: The vitamin E did not affect any of parameters under study. / O objetivo deste estudo foi verificar se a vitamina E afeta a integridade estrutural da membrana plasmática dos espermatozóides caprinos, bem como verificar o potencial uso desta vitamina em meios diluentes de criopreservação de sêmen caprino. Foram utilizados 2 machos adultos da raça Parda alpina. Para as coletas de sêmen foi utilizada vagina artificial onde se obteve 8 ejaculados por animal. Após a coleta, fez-se a avaliação física do sêmen, morfológica dos espermatozóides e da integridade funcional da membrana espermática pelo teste hiposmótico. Em seguida, o sêmen foi diluído com os seguintes tratamentos: BIOXCELL® (Controle), BIOXCELL® + Equex, BIOXCELL® + Vitamina E 25&#956;M, BIOXCELL® + Vitamina E 50&#956;M e BIOXCELL® + Vitamina E 100&#956;M. Após as diluições finais, foram avaliados a motilidade progressiva e vigor espermático e realizado teste hiposmótico de cada tratamento. O sêmen foi envasado em palhetas de 0,25mL, as palhetas foram resfriadas a 5 oC, durante 1 hora em refil plástico contendo álcool etílico. O pré-congelamento foi realizado em vapor de nitrogênio líquido durante 15 minutos. Após esse período, as palhetas foram imersas no nitrogênio para o congelamento final do sêmen. As partidas foram descongeladas em banho-maria a 37 oC por 30 segundos, acondicionadas em tubos plásticos e homogeneizadas para a análise imediata de motilidade e vigor espermático, teste hiposmótico e teste de termorresistência. No sêmen fresco, as características físicas e morfológicas mantiveram-se dentro de parâmetros normais. Não houve correlação da motilidade progressiva com outras variáveis. O volume apresentou correlação negativa com o vigor espermático, defeitos menores e defeitos totais (r = -0,55, r = -0,52 e r = - 0,53, respectivamente) e correlação positiva com o teste hiposmótico (r = 0,44). Houve correlação média negativa (r = -0,48) entre a concentração de espermatozóides e os defeitos maiores. Os valores de defeitos menores e defeitos totais apresentaram correlação forte e positiva (r = 0,98). A motilidade progressiva, o vigor espermático e o teste hiposmótico do sêmen diluído não diferiram entre os tratamentos (P > 0,05). As médias gerais de motilidade e vigor logo após o descongelamento e ao longo do TTR não diferiram (P > 0,05) entre os tratamentos. A integridade funcional da membrana espermática, avaliada pelo teste hiposmótico, não diferiu (P > 0,05) entre os tratamentos. Foi observada correlação positiva entre motilidade e vigor dos espermatozóides em todos os tratamentos no sêmen diluído (pré-resfriado) e em todos os tempos do TTR. Não houve correlação entre o vigor e o teste hiposmótico dos espermatozóides em nenhum dos tratamentos no sêmen diluído e nos tempos 0H e 2H do TTR, havendo correlação média positiva no tratamento Equex no tempo 1H (r = 0,51) e nos tratamentos Controle, Equex e Vit. E 50&#956;M no tempo 3H (r = 0,44, 0,69, 0,57, respectivamente). Houve correlação entre a motilidade e o teste hiposmótico do sêmen diluído no Tramento Vit. E 50&#956;M (r = 0,68). As amostras de sêmen dos tratamentos Equex e Vit. E 100&#956;M descongeladas mostraram correlações entre motilidade e teste hiposmótico. Conclui-se que: Nenhum dos parâmetros avaliados neste estudo foi afetado pela Vitamina E.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-02-13Bitstream added on 2014-06-13T20:59:33Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_fs_me_jabo.pdf: 514303 bytes, checksum: 2ff947581f5831ab66e019d8c9ec7990 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Recentemente, tem-se dado atenção crescente aos efeitos deletérios dos radicais livres sobre os oócitos e embriões cultivados in vitro em mamíferos. No entanto, poucos estudos foram conduzidos sobre a ação desses agentes sobre a interação entre o espermatozóide-oócito durante a fertilização in vitro (FIV). Com o intuito de melhorar os resultados da produção in vitro de embriões bovinos, este trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos da suplementação do meio de fecundação in vitro com antioxidantes cisteamina (Cist) e 2-Mercaptoetanol (2-ME) sobre a capacitação espermática, fecundação, qualidade dos zigotos e competência no desenvolvimento embrionário. Os espermatozóides apresentaram o DNA íntegro quase na totalidade entre os diferentes tratamentos e durante o tempo no processo da FIV. / Recently, deleterious effects of free radicals over oocytes and embryos cultivated in vitro in mammals have received increasing attention. Nonetheless, few studies were conducted about the action of those agents over the interaction between the sperm-oocyte during in vitro fertilization (IVF). Aimed at improving results of in vitro production of bovine embryos, this work had as objective to evaluate the effects of supplementation of the in vitro fertilization environment with antioxidants cisteamine (Cist) and 2-Mercaptoethanol (2-ME) over the spermatic capacitation, fertilization, quality of zygotes and competency in the embryonic development. Spermatozoas exhibited an integral DNA almost in the totality of the different treatments and along the time in the IVF process.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-30Bitstream added on 2014-06-13T19:59:07Z : No. of bitstreams: 1 silva_rb_me_jabo.pdf: 1298125 bytes, checksum: 1ad82f6104f2a03b81c31c4de310d4d7 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Foram investigados os efeitos da irradiação com diodos lasers operando em 780 nm (infravermelho) e 660 nm (visível) na maturação, fertilização e cultivo in vitro de embriões bovinos. Verificou-se que a irradiação de oócitos com ambos os lasers, durante 30, 60, 120 e 180 segundos (L30, L60, L120, L180) não afetou (p>0,05) as taxas de maturação nuclear (Infravermelho: L30 - 88,92% vs. C30 – 81,84%; L60 – 83,56% vs. C60 – 87,40%; L120 – 76,06% vs. C120 – 85,30%; L180 – 77,42% vs. C180 - 80,16%; e Visível: L30 – 65,81% vs. C30 – 71,59%; L60 – 62,75% vs. C60 – 69,62%; L120 – 70,38% vs. C120 – 64,04%; L180 – 56,72% vs. C180 – 67,41%), e de maturação citoplasmática, avaliada por meio da distribuição dos grânulos corticais (Infravermelho: L30 – 86,18% vs. C30 – 61,04%; L60 – 66,03% vs. C60 – 56,16%; L120 – 53,75% vs. C120 – 79,81%; L180 – 57,70% vs. C180 – 82,04% e Visível: L30 – 81,08% vs. C30 – 74,42%; L60 – 68,11% vs. C60 – 61,63%; L120 – 75,95% vs. C120 – 48,33%; L180 – 77,77% vs. C180 – 59,52%). As porcentagens de produção embrionária ao sétimo dia de cultivo in vitro não foram alteradas (p>0,05) após a irradiação de oócitos com laser infravermelho (L30 – 29,20% vs. C30 – 42,60%; L60 – 32,0% vs. C60 – 31,0%; L120 – 38,0% vs. C120 – 35,0%; L180 – 37,0% vs. C180 – 32,0%), mas foram reduzidas após a irradiação com laser visível durante 180 seg. (L180 – 36,0% vs. C180 – 56,0 %). A irradiação em espermatozóides com ambos os lasers não afetou (p>0,05) as taxas de clivagem ao terceiro dia de cultivo in vitro (Infravermelho: L30 – 90,0% vs. C30 – 95,83%; L60 – 85,56% vs. C60 – 98,33%; L120 – 90,83% vs. C120 – 90,83%; L180 – 89,72% vs. C180 – 97,50%; e Visível: L30 – 82,96% vs. C30 – 85,61%; L60 – 82,10% vs. C60 – 82,53%; L120 – 80,48% vs. C120 – 82,44%;... / The diodo lasers irradiation effects, operating in 780nm (infrared light) and 660 nm (visible light), were evaluated on in vitro maturation, fertilization and culture rates of bovine embryos. Both infrared and visible laser irradiation on oocytes, during 30, 60, 120 and 180 seconds (30, 60, 120, 180) did not change (p>0,05) the rates of nuclear maturation (Infrared: L30 – 88.92% vs. C30 – 81.84%; L60 – 83.56% vs. C60 – 87.40%; L120 – 76.06% vs. C120 – 85.30%; L180 – 77.42% vs. C180 – 80.16%; and Visible: L30 – 65.81% vs. C30 – 71.59%; L60 – 62.75% vs. C60 – 69.62%; L120 – 70.38% vs. C120 – 64.04%; L180 – 56.72% vs. C180 – 67.41%), and the cytoplasmic cortical granule distribution (Infrared: L30 – 86.18% vs. C30 – 61.04%; L60 – 66.03% vs. C60 – 56.16%; L120 – 53.75% vs. C120 – 79.81%; L180 – 57.70% vs. C180 – 82.04% and Visible: L30 – 81.08% vs. C30 – 74.42%; L60 – 68.11% vs. C60 – 61.63%; L120 – 75.95% vs. C120 – 48.33%; L180 – 77.77% vs. C180 – 59.52%). The in vitro embryo production rates measured on seventh day of culture were not changed (p.0,05) after the infrared laser irradiation (L30 – 29.20% vs. C30 – 42.60%; L60 – 32.0% vs. C60 – 31.0%; L120 – 38.0% vs. C120 – 35.0%; L180 – 37.0% vs. C180 – 32.0%), but they were reduced (p<0,05) after the visible laser irradiation during 180 seconds (L180 – 36.0% vs. C180 – 56.0 %). When spermatozoa were irradiated, both lasers did not change the rates of cleavage (p>0,05) on third day of in vitro culture (Infrared: L30 – 90.0% vs. C30 – 95.83%; L60 – 85.56% vs. C60 – 98.33%; L120 – 90.83% vs. C120 – 90.83%; L180 – 89.72% vs. C180 – 97.50%; and Visible: L30 – 82.96% vs. C30 – 85.61%; L60 – 82.10% vs. C60 – 82.53%; L120 – 80.48% vs. C120 – 82.44%; L180 – 83.53% vs. C180 – 87.15%), the embryo production percentages on seventh day ...(Complete abstract, click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-17Bitstream added on 2014-06-13T20:59:38Z : No. of bitstreams: 1 gonzalescadavid_v_me_jabo.pdf: 429592 bytes, checksum: 2cf62512218e0651d7acdf97deb6dd74 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O experimento foi realizado em uma suinocultura de produção comercial da linhagem Topigs, utilizando dez machos reprodutores, com o objetivo de avaliar o efeito das suplementações intramusculares com vitaminas e minerais (Selen- Fos® e Zimag®) na qualidade espermática do sêmen in natura e após a congelação. Foram realizadas duas análises estatísticas: Multivariada para descrição das alterações observadas; ANOVA utilizando o modelo inteiramente casualizado. As variáveis seminais analisadas foram: volume, concentração, turbilhonamento, motilidade, vigor, porcentagem de espermatozóides vivos, mortos, e vivos sem acrossomo, morfologia e integridade da membrana (Teste hiposmótico). O experimento foi dividido em duas fases. Na primeira fase o sêmen in natura dos 10 cachaços foi avaliado e posteriormente congelado. Uma vez terminada esta fase iniciou-se a segunda fase onde sete animais receberam as suplementações com vitaminas e minerais via intravenosa e três permaneceram sem recebê-las. Após um período de 60 dias contados a partir do dia da administração das vitaminas e dos minerais se iniciaram novamente as coletas de sêmen e as avaliações tanto in natura como o descongelado. O sêmen in natura apresentou melhor qualidade espermática quando comparado com o sêmen descongelado e o sêmen dos cachaços que receberam as suplementações tiveram melhora (p 0,05) significativa na qualidade do sêmen e na criotolerância / The experiment was conducted in a commercial swine production using ten boars of Topigs® line. The aim was to evaluate the effect of intramuscular supplementation of vitamins and minerals (Selen-Fos® and Zimag®) on fresh semen quality and after freezing. Two statistical analysis were used: multivariate description of the observed changes and ANOVA with randomized design. Analyzed seminal variables were: concentration, turbilhamento, motility, vigor, percentage of live sperm, dead and alive without acrosome, morphology and membrane integrity (HO). The experiment was divided into two phases. In the first phase, the fresh semen of 10 boars was evaluated and subsequently frozen. About three days after the freezing process, the semen was thawed and the quality was assessed. After this in the second phase, seven boars received intramuscular supplementation of minerals and vitamins and three boars received without the supplementation for control. About 60 days later, all these boars were submitted to semen collection and the semen was again evaluated both, fresh and thawed. The fresh semen showed better quality than the frozenthawed in the two phases of the experiment (p< 0,05). The semen of boars that received the supplementation had a significant improvement on semen quality and freezing resistant (p< 0,05)

Resumo: A produção de doses de sêmen, enriquecidas com espermatozóides portadores do cromossomo X ou Y, aumentará a contribuição da inseminação artificial para: o incremento do progresso genético, produtividade e retorno econômico nas atividades pecuárias, e para a prevenção de doenças ligadas ao cromossomo X, na espécie humana. Constituiu objetivo do presente trabalho: aplicar o método de "swim-up" associado à centrifugação em gradiente descontínuo de densidade para produzir amostras de sêmen enriquecidas com espermatozóides portadores do cromossomo X, em bovinos. Após os tratamentos, os espermatozóides foram submetidos ao controle de qualidade pela avaliação da integridade acrossomal e taxas de produção de embriões in vitro. A validação dos resultados foi feita pela análise da proporção sexual dos embriões produzidos in vitro através da amplificação de uma seqüência específica do cromossomo Y presente no genoma bovino. Após a análise dos resultados observouse que não houve diferença significativa (P>0,05) no desvio da proporção sexual quando comparamos o grupo controle (45,20% de fêmeas) com os procedimentos de separação de espermatozóides (60,65% de fêmeas, em média). Os métodos de separação de espermatozóides, não prejudicaram a fertilidade dos espermatozóides (taxas de clivagem e blastocistos, em média, de 70% e 26% respectivamente). Este pode ser considerado um procedimento a ser utilizado na PIV de embriões bovinos. / Abstract: The production of doses of semen enriched with X- and Y- bearing spermatozoa will increase the artificial insemination contribution for genetic progress, productivity and economic return in livestock production and prevention of diseases connected to X chromosome, in humans. The purpose of this work was associated the modified swimup method with the centrifugation in density gradient for separation of X-bearing spermatozoa. Quality control of centrifuged spermatozoa were evaluated by acrosomal integrity and in vitro embryo production. The results were validated by sex proportion of in vitro produced embryos using PCR by Y- specific sequences present in bovine male genomic DNA. After the determination of genetic sex of in vitro produced embryos, the results showed no statistical difference (P>0.05) on deviation of sex ratio when the control group (45.20% female) was compare with the others spermatozoa selection procedures (60.65% female). The spermatozoa selection methods didn't impair fertility of X-bearing spermatozoa (cleavage and blastocyst rates: 70% and 26%, respectively) and would be considered methods of relevance to be introduced on in vitro produced embryos programs. / Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Coorientador: Lúcia Galvão de Albuquerque / Coorientador: Francisco Antonio Techiatti Fazano / Banca: Humberto Tonhati / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Mestre