Orientador: Sonia Nair Bao / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T17:46:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fiorillo_BrunoSilva_M.pdf: 2862348 bytes, checksum: 42cb5c70d4103ce2bdba326ff2ae1788 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As vespas da família Agaonidae, são as únicas entre as vespas de figo que polinizam as figueiras possuindo uma identidade espécie-específica em relação à planta. A relação de polinização das vespas do figo com as figueiras é de um mutualismo obrigatório: a planta necessita das vespas para a dispersão do pólen e para a polinização e, por sua vez, as vespas são completamente dependentes dos figos para que seu ciclo de vida se complete. Essa interação representa talvez o melhor exemplo de mutualismo integrado à polinização que se tem conhecimento. Trabalhos de sistemática com estas vespas são de fundamental importância para estudos de ecologia e evolução. Inúmeros estudos têm demonstrado que a estrutura e a ultra-estrutura do trato reprodutor masculino e dos espermatozóides em Hymenoptera apresentam variações suficientes para gerar caracteres adicionais para as análises cladísticas. Sendo assim, análises estruturais e ultra-estruturais foram realizadas a fim de descrever a morfologia do trato reprodutor masculino e dos espermatozóides em três espécies do gênero Pegoscapus. Para tanto, utilizamos as seguintes metodologias: microscopia de luz utilizando campo claro, contraste de fase e fluorescência para DAPI; microscopia eletrônica de transmissão convencional e citoquímica com E-PTA e microscopia eletrônica de varredura. As espécies de Pegoscapus apresentaram o trato reprodutivo interno e a estrutura básica dos espermatozóides similares a outros Chalcidoidea. Os espermatozóides de duas espécies demonstraram as mesmas características enquanto a terceira apresentou diferenças em relação ao comprimento e à espessura da camada extracelular. Além dessas diferenças, todas as espécies analisadas compartilharam de algumas características: vesícula seminal sem divisões de câmaras; ausência de estruturas acrossomais no espermatozóide; comprimento da camada extracelular e os microtúbulos centrais sendo os primeiros a terminar na seqüência de desmontagem do axonema em sua porção final. Essas características permitem o estabelecimento de um padrão para o gênero Pegoscapus que será útil para futuros estudos filogenéticos do grupo Chalcidoidea / Abstract: The wasps of the family Agaonidae, are the only among fig wasps which pollinate figs, they are also species-specific to their host. The relationship of the pollinating fig wasps with their host fig tree is an obligate mutualism: the tree relies on the wasps for pollen dispersal and pollination, and in turn the wasps are completely dependent on the fig for the completion of their life cycle. This interaction represents perhaps the most tightly integrated pollination mutualism that is known. Systematic works on these wasps are of fundamental importance to ecological and evolutionary studies. Numerous investigations have demonstrated that structure and ultrastructure of the male reproductive tract and spermatozoa in Hymenoptera furnish sufficient variations to provide additional characters for cladistic analysis. Thus, structural and ultrastructural studies were carried out to describe the morphology of the male reproductive tract and the spermatozoa in three species of the genus Pegoscapus. For this study, we employed the methods: light microscopy using bright-field, phase-contrast and DAPI fluorescence; transmission electron microscopy with conventional preparations and cytochemistry (E-PTA) and scanning electron microscopy. Pegoscapus species presented the internal reproductive tract features and the basic sperm structure similar to that of other Chalcidoidea. The spermatozoa of two Pegoscapus species showed the same features while the other presented differences in length and in extracellular sheath thickness. Besides these differences, all species analyzed share some characteristics: the seminal vesicle not divided in chambers; the absence of acrosomal structures in the spermatozoa; the length of the extracellular sheath and the central microtubules being the firsts to terminate in the sequence of microtubular cutoff at the final axonemal portion. These characteristics permit the establishment of a pattern for the genus Pegoscapus that will be useful for phylogenetic studies in Chalcidoidea / Mestrado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

É sabido das vantagens da utilização do sêmen criopreservado na reprodução eqüina, mas também é de conhecimento que o entendimento desta biotecnologia ainda é carente. Não se tem concordância quanto à dose e concentração espermáticas ideais para se obter bons resultados de fertilidade. Assim, este experimento teve o intuito de avaliar o movimento espermático pelo sistema computadorizado (CASA), a morfologia espermática, além da integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, com sondas fluorescentes, em espermatozóides eqüinos criopreservados nas concentrações de 100, 200, e 400x106sptz/mL e nos volumes 0,50 e 0,25mL. Foram utilizados quatro garanhões sendo oito colheitas de cada animal, através de vagina artificial. Após a colheita, o sêmen foi diluído em extensor à base de leite desnatado (1:1), centrifugado 500xg por 10 minutos, o sobrenadante retirado, e o pellet ressuspendido em diluidor Botu-Crio® nas concentrações de 100 (C100), 200 (C200) e 400x106sptz./mL (C400). Em seguida, envasado em palhetas de 0,50 e 0,25mL. Para criopreservação do sêmen utilizou–se aparelho automatizado (TK3000®), com curvas de resfriamento -0,25ºC/min e de congelação -15ºC/min até -80ºC e -10ºC/min, até atingir -120ºC, quando as palhetas foram mergulhadas em N2 líquido (-196 ºC) e armazenadas em botijões criogênicos. Foram descongeladas duas palhetas de cada tratamento em banho-maria (37ºC por 30s). Uma amostra do sêmen foi diluída em formol salino para avaliação da morfologia espermática e outra em TALP sperm à concentração de 25x106sptz/mL. Logo após, uma amostra desta solução foi submetida à análise computadorizada do movimento espermático. As características analisadas foram: motilidade total (MTCA, %), motilidade progressiva (MPRO, %), velocidade progressiva (VSL, &#956;m/s), velocidade curvilinear (VCL, &#956;m/s), deslocamento lateral de cabeça (ALH, &#956;m) e freqüência de batimento flagelar (BCF, Hz). Em seguida, uma outra amostra foi avaliada quanto à integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando PI, JC-1 e FITC-PSA, por microscopia de epifluorescência. Foram determinados os percentuais de espermatozóides com membranas plasmáticas intactas (MPI), acrossomais intactas (MAI) e mitocondriais de alto potencial (APM) e membranas plasmática e acrossomal intactas e com alto potencial de membrana mitocondrial (PIAIA). Foi utilizada análise de variância (ANOVA) (p<0,05) e teste de médias SNK (p<0,05), pelo método SAS®. Não houve efeito da interação entre volume da palheta e concentração espermática para as características estudadas. As características do movimento espermático foram influenciadas pela concentração, de forma que C100>C200>C400, exceto em LIN e STR. O volume somente alterou os valores de STR e VCL. Quanto à integridade e funcionalidade das membranas, não houve efeito do volume, enquanto que as concentrações alteraram somente MPI (C100>C200>C400) e APM (C100=C200>C400). Na morfologia espermática, a concentração somente afetou a percentagem de cauda dobra ou enrolada (C100>C200=C400) e o volume de armazenamento somente as quantidades de cabeça isolada normal e patológica (0,50>0,25mL). Assim, o melhor método de congelação, neste experimento, foi em C100, seguido por C200 e por último C400, em ambos os volumes. Portanto, a qualidade seminal pós-descongelação está diretamente relacionada com a quantidade de agentes crioprotetores por unidade celular, independente do volume da palheta. / It has been known the advantages of cryopreserved semen utilization in equine reproduction, but the understanding of this biotechnology is uncertain yet. There was not agreement of the ideal spermatic dose and concentration to optimize fertility results. Thus this experiment had the objective to evaluate spermatic motion by computed analysis (CASA), spermatic morphology and the plasmatic and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential with fluorescence probes of equine cryopreserved spermatozoa on 100, 200 and 400x106sptz/mL concentrations and 0.50 and 0.25mL volumes. Eight ejaculates from four stallions were collected in artificial vagina. The semen was diluted in skim-milk extender (1:1), centrifuged at 500xg for ten minutes, the supernatant was removed and the freezing extender Botu-Crio® was added in the pellet to a final concentrations of 100 (C100), 200 (C200) and 400x106sptz/mL (C400); after that, it was packed in 0.50 and 0.25mL straws. The cryopreservation of semen utilized an automatic system (TK3000®), with cooling slope -0.25°C/minute and freezing slope of -15°C/minute, until -80°C, and -10°C/minute, until -120°C, when the straws were plunged into liquid nitrogen (-196°C), and stored in cryogenics tank. They were thawed for 30s in a 37°C waterbath. A sample of semen was diluted in saline formol to morphology spermatic evaluation and another diluted in TALP sperm at 25x106sptz/mL. After, a sample was submitted to CASA evaluation. The analyzed characteristics were: total motility (TMCA, %), progressive motility (PROM, %), progressive velocity (VSL, µm/s), track speed (VCL, µm/s), beat cross frequency (BCF, Hz) and lateral amplitude of head (ALH, µm). Afterward, another sample was evaluated about plasmatic and acrosomal membranes integrity and mitochondrial potential membrane, using PI, JC-1 and FITC-PSA by epifluorescence microscope. It was determined the spermatozoa percentage with intact plasmatic membranes (IPM), intact acrosomal membranes (IAM), and high potential mitochondrial membrane (HPM) and intact plasmatic and acrosomal membranes and with high potential mitochondrial membrane (IPIAH). For statistical analysis were utilized variance analysis (ANOVA - p<0.05) and SNK test (p<0.05) with standard deviation, by SAS® system. There was not effect of straw volume and spermatic concentration interaction in the studied characteristics. The spermatic motion characteristics were influenced by concentration (C100>C200>C400), except LIN and STR. The volume changed the values of percentage of STR e VCL. In membrane integrity and functionality there was no volume effect, however the concentrations changed only IPM C100>C200>C400) e HPM (C100=C200>C400). In spermatic morphology, the concentration affected the percent of folded or coiled tail (C100>C200=C400) and the volume only affected the loose normal and abnormal head (0.50>0.25mL). Thus, the better freezing method, in this experiment, was C100, followed by C200, and C400, in both straws volumes. The seminal quality post-thawed is related with the cryoprotector quantity by cell, free of the straw volume.

Orientador: Shirlei Maria Recco-Pimentel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T09:25:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SiqueiraJunior_Sergio_D.pdf: 45553042 bytes, checksum: e8a175ee3eabcc8492c6fdbca5adf69a (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Terrarana é atualmente o maior táxon da ordem Anura, possuindo cerca de 900 espécies. Recentemente, esse grupo de anuros foi alvo de uma série de modificações taxonômicas. Primeiramente essas espécies foram removidas da família Leptodactylidae e colocadas na sinonímia de Brachycephalidae, e mais tarde alocadas em um novo táxon chamado Terrarana. Atualmente as espécies deste grupo estão distribuídas nas famílias, Eleutherodactylidae, Craugastoridae, Strabomantidae e Brachycephalidae. Embora tenha sido bastante estudado, alguns dos relacionamentos inter- e intragenéricos permanecem não esclarecidos. Devido ao baixo número de espécies amostradas nos estudos filogenéticos, os clados da América do Sul, Strabomantidae e Brachycephalidae, são os grupos que têm as relações filogenéticas menos desvendadas. Neste trabalho foram realizados estudos citogenéticos e da ultra-estrutura dos espermatozóides de algumas espécies de Terrarana dos gêneros, Pristimantis, Ischnocnema, Barycholos, Haddadus e Brachycephalus. As metáfases foram obtidas por suspensão do epitélio intestinal e coradas com Giemsa ou submetidas a técnicas de impregnação por prata (Ag-NOR) e hibridação in situ (FISH) para a detecção das regiões organizadoras do nucléolo e bndamento-C, para a localização da heterocromatina. Os dados da ultra-estrutura dos espermatozóides foram analisados ao microscópio eletrônico de transmissão. As espécies estudadas foram Pristimantis fenestratus (Borba e Manaus, Reserva Florestal Adolfo Ducke, Amazonas e Rio Branco, Acre), P. dundeei (Chapada dos Guimarães, Rondonópolis e Aripuanã, Mato Grosso), P. crepitans (Chapada dos Guimarães e São Vicente, Cuiabá, Mato Grosso), Ischnocnema paulodutrai (Ilhéus, Bahia); I. juipoca (Atibaia e Campos do Jordão, São Paulo), I. guentheri e I. parva (Mogi das Cruzes, São Paulo), Brachycephalus ephippium (Mogi das Cruzes e Atibaia, São Paulo, Barycholos ternetzi (Uberlândia, Minas Gerais e Porto Nacional, Tocantins), e Haddadus binotatus (Mogi das Cruzes e Ilhabela, São Paulo). Os dados citogenéticos foram importantes na caracterização cromossômica das espécies P. fenestratus 2n=34 cromossomos, P. crepitans 2n=22, P. dundeei 2n=28 e I. paulodutrai 2n=30 e ainda B. ternetzi e I. juipoca 2n=22. Os dados citogenéticos revelaram diferenças no bandamento-C e Ag-NOR, sugerindo a existência de espécies ainda não descritas de Pristimantis nas localidades de Manaus, Rio Branco, e Aripuanã, e de Barycholos (Tocantins) identificadas incorretamente como P. fenestratus, P. dundeei e B. ternetzi. A análise citogenética indicou ainda que o baixo número cromossômico em P. crepitans é único dentro do gênero e sugere que esta a mesma não seja proximamente relacionada a espécies congenéricas. As similaridades cariotípicas entre I. paulodutrai e P. dundeei indicam que estas espécies podem ser proximamente relacionadas. Além disso, foi encontrado um caso incomum de variação intra-individual cromossômica no número fundamental de células somáticas de P. fenestratus, que pode estar relacionada com a segregação anômala de cromatides irmãs durante a mitose. A ultra-estrutura dos espermatozóides das espécies brasileiras de P. fenestratus, P. dundeei, P. crepitans, B. ternetzi, B. ephippiun, I. guentheri, I. parva, I. juipoca e H. binotatus revealaram diferenças na estrutura básica do acrossomo, peça intermediária e flagelo, apresentando características distintas dentro da família Brachycephalidae e subfamília trabomantinae, assim como dentro do gênero Pristimantis. Como característica marcante da ultra estrutura dos espermatozóides, observou-se a presença de um bastão paraxonemal em H. binotatus, B. ephippium, B. ternetzi e P. crepitans e a ausência desta estrutura em P. fenestratus, P. dundeei e todos os Ischnocnema amostrados. A divergência ultra-estrutural no bastão paraxonemal é coerente com dados recentes de filogenia molecular, que suportam transferência de H. binotatus do gênero Ischnocnema para um novo táxon e também agrupa as espécies I. guentheri, I. parva e I. juipoca em um mesmo clado. Além disso, a ultra-estructura dos espermatozóides indicou que B. ephippium não é proximamente relacionado as espécies de Ischnocnema, e que a taxonomia das espécie de Brachycephalidae deve ser reexaminada. As análises da ultra-estructura dos espermatozóides também corroboram os dados cromossômicos que indicam que P. crepitans estão erroneamente alocados no gênero Pristimantis e que as espécies I. paulodutrai e P. dundeei são proximamente relacionadas. Apesar do pequeno número de espécies amostradas, os dados citogenéticos e da ultra-estrutura dos espermatozóides de espécies das três famílias dos Terrarana do Brazil, apresentaram características inter- e intragenéricas não conservadas, levantamento de novos questionamentos e fortes evitências da existência de novas espécies. / Abstract: The Terrarana is the largest taxon of the Anura order, comprising 900 species. Recently this anuran group has undergone a series of taxonomical rearrangements. At first, these species were removed from the Leptodactylidae family and transferred to the synonymy of Brachycephalidae, and lately they were placed into a new taxon named Terrarana. Currently, the Terrarana species are distributed in the families, Eleutherodactylidae, Craugastoridae, Strabomantidae and Brachycephalidae. Despite being intensively studied, many aspects of their inter- and intrageneric relationships remain unclear. The South American Strabomantidae and Brachycephalidae are the least known clades regarding molecular phylogeny. In the present work, Brazilian Terrarana species of Pristimantis, Ischnocnema, Barycholos, Haddadus and Brachycephalus were studied by means of cytogenetical and sperm ultrastructural characteristics. Metaphases obtained from suspensions of intestinal epithelium were stained with Giemsa or submitted to silver staining (Ag- NOR) and fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques, in order to detect the nucleolus organizing region, and to C-banding for heterochromatin localization. Sperm ultrastructure was analyzed by transmission electron microscopy. The studied species were P. fenestratus (Borba and Manaus at Reserva Florestal Adolfo Ducke, Amazonas, and Rio Branco, Acre), P. dundeei (Chapada dos Guimarães, Rondonópolis, and Aripuanã, Mato Grosso), P. crepitans (Chapada dos Guimarães and São Vicente, Cuiabá, Mato Grosso), Ischnocnema paulodutrai (Ilhéus, Bahia), I. juipoca (Atibaia and Campos do Jordão, São Paulo), I. guentheri and I. parva (Mogi das Cruzes, São Paulo), B. ephippium (Mogi das Cruzes and Atibaia, São Paulo), Barycholos ternetzi (Uberlândia, Minas Gerais, and Porto Nacional, Tocantins), and Haddadus binotatus (Mogi das Cruzes and Ilhabela, São Paulo). The cytogenetical analyses allowed chromosomal characterization of the species P. fenestratus 2n=34 chromosomes, P. crepitans 2n=22, P. dundeei 2n=28 and I. paulodutrai 2n=30, which have not been previously analyzed in phylogenetical studies, in addition to B. ternetzi and I. juipoca 2n=22. The data revealed differences in C-banding and Ag-NOR, which indicated the existence of not yet described Pristimantis species in the Manaus, Rio Branco, and Aripuanã localities, and of Barycholos (from Tocantins) uncorrectly identified as P. fenestratus, P. dundeei and B. ternetzi. The cytogenetical analysis also indicates that the low chromosome number in P. crepitans is unique within this genus and suggests that this species is not closely related to its congeneric species. The karyotypical similarities between I. paulodutrai and P. dundeei indicate that these species could be close relatives. Moreover, an unusual case of intra-individual chromosomal variation in the fundamental number of several somatic cells was found in the P. fenestratus species, which may be a consequence of anomalous segregation of sister chromatids during mitosis. The sperm ultrastructure of the Brazilian species P. fenestratus, P. dundeei, P. crepitans, B. ternetzi, B. ephippiun, I. guentheri, I. parva, I. juipoca and H. binotatus revealed differences in the basic structures of the acrosome, midpiece and flagellum, showing distinct characteristics within the family Brachycephalidae and subfamily Strabomantinae, as well as within the genus Pristimantis. The most remarkable sperm characteristic was an axonemal fiber in H. binotatus, B. ephippium, B. ternetzi and P. crepitans, which has not been observed in P. fenestratus, P. dundeei and in all of the analyzed Ischnocnema specimens. The ultrastructural divergence in the axonemal fiber is in accordance with recent molecular data, which supported the transfer of H. binotatus from the Ischnocnema genus to a new taxon and also grouped the species I. guentheri, I. parva and I. juipoca in a same clade. In addition, the sperm ultrastructure showed that B. ephippium is not closely related to the Ischnocnema species, and that the taxonomy of the Brachycephalidae species should be reexamined. Furthermore, the sperm ultrastructure analysis corroborated chromosomal data indicating that P. crepitans is misallocated in the Pristimantis genus and that the I. paulodutrai and P. dundeei species are close relatives. Despite the small number of studied species, the cytogenetical and ultrastructural data on sperm ultrastructure of the three Brazilian Terrarana families revealed inter- and intrageneric non-conservative characteristics that generate new taxonomic questions within this anuran group and provide strong evidence of the existence of undescribed species in this taxon. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Irani Quagio Grassiotto, Luiz Roberto Malabarba / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T19:44:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baicere-Silva_ClariannaMartins_D.pdf: 11314225 bytes, checksum: beda03a1ee3e0b2d960e66de41e95061 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A família Characidae apresenta 16 subfamílias e noventa e dois gêneros não assinalados a nenhuma subfamília e, portanto, considerados incertae sedis. Neste grupo são inúmeros os problemas taxonômicos/filogenéticos. A maior parte destes gêneros encontravam-se alocados na subfamília Tetragonopterinae, mas dada à falta de evidências de que Tetragonopterinae constitui um grupo monofilético, manteve-se na subfamília apenas o gênero Tetragonopterus. Os gêneros incertae sedis, em Characidae, constituem um grupo imenso e heterogêneo de peixes, predominantemente pequenos, abundantes nos rios e em outros habitats aquáticos da região neotropical. O conhecimento das relações de parentesco entre os Characidae e, consequentemente, entre os antigos Tetragonopterinae, tem por base principalmente características osteológicas, de anatomia de partes moles e, mais recentemente, dados de seqüência molecular. Sabe-se que as características reprodutivas podem conter importantes sinais filogenéticos. Portanto, procedeu-se uma análise filogenética a partir de dados reprodutivos como a estrutura testicular, o tipo de espermiogênese e a ultraestrutura dos espermatozoides de representantes de alguns dos gêneros incertae sedis em Characidae, anteriormente alocados em Tetragonopterinae e outros Characiformes utilizados como grupo externo. A topologia da árvore obtida, foi parcialmente congruente com as hipóteses existentes para o grupo, comprovando a utilidade deste tipo de dado no que se refere à elucidação dos padrões evolutivos em Characidae / Abstract: The family Characidae presents 16 subfamilies and ninety-two genera not reported to any subfamily and therefore considered incertae sedis. In this group there are numerous taxonomic / phylogenetic problems. Most of these genera were allocated in the subfamily Tetragonopterinae, but given the lack of evidence that Tetragonopterinae constitute a monophyletic group, remains the only genus Tetragonopterus in the subfamily. Genera incertae sedis in Characidae are a vast and heterogeneous group of fish, mostly small, abundant in rivers and other aquatic habitats of the Neotropics. Researches of relationships among the Characidae and consequently between the old Tetragonopterinae is based mainly in external morphollogical and osteological features and, more recently, molecular sequence data. It is known that reproductive characteristics may contain significant phylogenetic signals. So we proceeded from a phylogenetic analysis of reproductive data such as testicular structure, the type of spermiogenesis and sperm ultrastructure of representatives of some of the genera incertae sedis in Characidae, previously allocated to Tetragonopterinae and other Characiformes used as outgroup. The tree topology obtained was parcially congruent with the hypotheses exist for the group proving the usefulness of this type of data in relation to elucidate the evolutionary patterns in characid / Doutorado / Biologia Tecidual / Doutora em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Luis Antonio Violin Dias Pereira, Suzana de Fatima Paccola Mesquita / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T22:34:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garcia_PatrickVianna_D.pdf: 2682268 bytes, checksum: c80303a2f196fc3cdb21e73865600ba4 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Durante o processo de maturação epididimária, proteínas secretadas pelo epidídimo interagem com os espermatozoides modificando-os funcionalmente. Cerca de 75% das proteínas que participam da maturação epididimária são secretadas pelas células epiteliais do segmento inicial e cabeça do epidídimo e 48% destas proteínas tem a síntese dependente de dihidrotestosterona (DHT), a qual é sintetizada a partir da testosterona pela ação da enzima 5 ? redutase. A DHT é de extrema importância para a fisiologia do sistema reprodutor masculino. Níveis elevados de DHT na vida adulta podem predispor a vários distúrbios, tais como a alopecia androgênica. Com o intuito de se minimizar os efeitos da DHT, a finasterida foi o primeiro inibidor da 5 ? redutase que recebeu aprovação clínica para o tratamento desses distúrbios.Um público cada vez mais jovem utiliza a finasterida como um método preventivo e paliativo contra a alopecia androgênica, com isso, estudos dos efeitos da finasterida no sistema reprodutor masculino são de grande interesse clínico. O ojetivo desse estudo foi avaliar as possíveis alterações no segmento da cabeça do epidídidmo e na qualidade espermática em animais submetidos ao tratamento agudo (15 dias), crônico (56 dias) e animais que tiveram o tratamento (agudo e crônico) interrompido por um período de 30 dias. Na administração aguda (15 dias) de finasterida em ratos observou-se algumas alterações na integridade da membrana plasmática do espermatozoide. A administração crônica (56 dias) de finasterida em ratos leva a alterações no epidídimo, tais como: redução do peso, alterações morfométricas-estereológicas, diminuição do tempo de trânsito do espermatozoide, redução da motilidade, alterações na integridade da membrana do espermatozóide e redução nos parâmetros de fertilidade desses animais. Mesmo com a interrupção do tratamento com finasterida (por 30 dias) a qualidade do espermatozóide continua comprometida. Dessa forma, estudos adicionais devem ser realizados para complementar o conhecimento existente sobre a fisiologia do epidídimo após a depleção DHT, sobre o tempo que necessário para a recuperação dos parâmetros de fertilidade após a interrupção do tratamento com finasterida, e se estes parâmetros podem ser totalmente recuperados / Abstract: During epididymal maturation, proteins secreted by epididymis functionally interact with the spermatozoa modifying it. About 75% of the proteins that participate in the epididymal maturation are secreted by the epithelial cells of the initial segment and caput of the epididymis and 48% of the synthesis is dependent on dihydrotestosterone (DHT), which is synthesized from testosterone by the action of the enzyme 5 ? reductase.The DHT is extremely important for the physiology of the male reproductive system. High levels of DHT in adulthood may predispose to various disorders such as androgenic alopecia. In order to minimize the effects of DHT, medications were produced with the purpose of inhibit the action of 5 ?-reductase and among those medications the finasteride was the first 5 ? reductase inhibitor that received clinical approval for the treatment of these disorders. A public increasingly young uses finasteride as a preventive and palliative method and against androgenic alopecia, in this way; studies of the effects of finasteride in the male reproductive system are of clinical and commercial interest. The aim of this study was to evaluate the possible alterations in the caput epididymis and sperm quality in animals submitted to acute (15 days) and chronic (56 days) treatment and animals with 30 days post- treatment. Acute administration of finasteride in rats (15 days) was observed reduction in sperm membrane integrity. Chronic administration of finasteride in rats (56 days), leads to changes in the epididymis, such as weight reduction, morphometric-stereological changes, decreased transit time of sperm, motility of the sperm membrane integrity and consequently in fertility parameters of these animals. Even with the interruption of treatment with finasteride (30 days) sperm quality remains committed. Thus, further studies should be performed to complement the existing knowledge on the physiology of the epididymis after DHT depletion, on the time that is needed for the recovery of fertility parameters after interruption of finasteride treatment, and if it these parameters can be fully recovered / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Shirlei Maria Recco Pimentel , Gisele Orlandi Introíni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:18:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_JulioSergiodos_D.pdf: 6299599 bytes, checksum: 7b5ca57cc296e80450e00cfd661976ad (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os anuros da família Leptodactylidae estão alocados em três subfamílias: Leiuperinae, Leptodactylinae e Paratelmatobiinae. Com o auxílio da microscopia eletrônica, foram observados os espermatozoides de 23 espécies de leptodactilídeos buscando-se contribuir com elementos para o entendimento de incertezas filogenéticas. Em Pseudopaludicola, gênero alocado em Leiuperinae, é comparado o espermatozoide de representantes do grupo P. pusilla e de espécies dos quatro clados recuperados na filogenia molecular, os quais correspondem aos grupos cromossômicos 2n=22, 20, 18 e 16. A análise das espécies de Pseudopaludicola mostrou que as cabeças dos espermatozoides são semelhantes e contém a vesícula acrossomal cobrindo o cone subacrossomal. Já as caudas dos espermatozoides de Pseudopaludicola apresentam diferenças marcantes. Nas espécies com número cromossômico 2n=22, Pseudopaludicola sp. 1 (grupo P. pusilla), P. saltica, P. falcipes e P. mineira, as caudas exibem fibras acessórias (justa-axonemal, membrana ondulante e a fibra axial). Essas fibras também são observadas em P. ternetzi e P. ameghini, ambas do clado com 2n=20, mas nas suas caudas a fibra axial é mais desenvolvida. Nos indivíduos do clado com número cromossômico 2n=18, P. canga, P. facureae, P. giarettai, P. atragula e Pseudopaludicola sp. 2 e com 2n=16, P. mystacalis, a cauda apresenta a membrana ondulante espessa, caracterizando um bastão para-axonemal, o qual é mais curto do que a membrana ondulante da cauda dos Pseudopaludicola com número cromossômico 2n=22 e 20. As diferenças morfológicas ultraestruturais observadas nas caudas dos espermatozoides indicam que esses caracteres podem ser filogeneticamente informativos, quando mapeados na filogenia molecular, pois os perfis ultraestruturais da cauda coincidem parcialmente com a formação dos quatro clados filogenéticos e possibilitam levantar a hipótese de uma progressiva simplificação do espermatozoide durante a evolução do gênero Pseudopaludicola. A análise comparativa de espécies entre os gêneros de leiuperíneos mostra que as caudas dos espermatozoides de Physalaemus (P. albifrons, P. centralis, P. cicada e P. cuvieri), também exibem fibras acessórias, como a fibra justa-axonemal e a membrana ondulante, contudo, a membrana ondulante nesse gênero é mais longa que aquela encontrada em Pseudopaludicola. Além disso, as caudas dos espermatozoides de Physalaemus não mostram fibra axial. Do gênero Engystomops, grupo irmão de Physalaemus, foram analisadas E. petersi, E. freibergi e E. puyango, cujas caudas apresentam fibra justa-axonemal, membrana ondulante e fibra axial. Esses gêneros diferem ainda pela membrana ondulante mais curta em Engystomops, corroborando a revalidação do gênero Engystomops. A cauda de Engystomops puyango difere de E. petersi e E. freibergi, clado Duovox, e é igual a E. pustulosus, do clado Edentulus, indicando a necessidade de ampliar os estudos desse gênero. A espécie Pleurodema diplolister, do gênero próximo a Physalaemus e Engystomops, apresenta na cauda do espermatozoide a fibra justa-axonemal e a membrana ondulante, as quais são semelhantes àquelas observadas nas espécies de Physalaemus, entretanto, a membrana ondulante de P. diplolister é menor que a observada em Physalaemus. A comparação dos espermatozoides de representantes das outras subfamílias de Leptodactylidae mostrou que Paratelmatobiinae, representada por P. poecilogaster, apresenta estruturas iguais àquelas observadas nos Pseudopaludicola do clado com número cromossômico 2n=22. Por outro lado, a espécie analisada, Leptodactylus natalensis, Leptodactylinae, apresenta fibra axial bem desenvolvida, diferente daquela exibida nos espermatozoides de Engystomops, Pseudopaludicola e P. poecilogaster. A outra espécie de Leptoctylinae, Adenomera marmorata, a qual era alocada em Leptodactylus, apresenta apenas o axonema na cauda do espermatozoide. Essa diferença ultraestrutural das caudas de A. marmorata e L. natalensis, corrobora com a re-alocação de A. marmorata como espécie válida e diferente de Leptodactylus. A descrição ultraestrutural dos gametas masculinos leptodactilídeos mostra caracteres filogenéticos informativos, principalmente aqueles das caudas dessas células, que podem ser usados para o entendimento dos relacionamentos intragenérico e intergenérico. / Abstract: The anurans of the family Leptodactylidae are distributed in three subfamilies ¿Leiuperinae, Leptodactylinae and Paratelmatobiinae. The spermatozoa of 23 leptodactylid species were analyzed under an electron microscope in order to provide evidence for the better understanding of a number of phylogenetic uncertainties. In the case of the leiuperine genus Pseudopaludicola, the sperm of the representative of the P. pusilla group and those of four clades identified in the molecular phylogeny, which correspond to well-defined chromosomal groups with 2n=22, 20, 18, and 16, were compared. The analysis of the different Pseudopaludicola species found spermatozoa with heads of similar shape, which contain an acrosomal vesicle covering the subacrosomal cone. However, the tails present marked differences. In the species with 2n=22, that is, Pseudopaludicola sp. 1 (P. pusilla group), P. saltica, P. falcipes and P. mineira the tails present accessory fibers (juxtaxonemal fiber, undulating membrane and axial fiber). Fibers of this type are also observed in P. ternetzi and P. ameghini (representatives of the 2n=20 clade), although the axial fiber is more developed. In the specimens of the 2n = 18 clade (P. canga, P. facureae, P. giarettai, P. atragula and Pseudopaludicola sp. 2) and the 2n=16 clade (P. mystacalis), the tail has a thick undulating membrane, characterized by a paraxonemal rod, which is shorter than the undulating membrane of the tail of Pseudopaludicola (2n=22 and 20). The ultrastructural morphological differences observed in the tails of the spermatozoa indicates that these traits are phylogenetically informative, given their partial correspondence to the four clades identified in the molecular studies, and provide evidence of a progressive simplification of the spermatozoa during the evolution of the genus Pseudopaludicola. The comparative analysis of the leiuperine genera indicates that in Physalaemus (P. albifrons, P. centralis, P. cicada and P. cuvieri), the tail of the spermatozoon also shows accessory fibers, such as the juxtaxonemal and the undulating membrane, although in this genus, the membrane is longer than that observed in Pseudopaludicola. In addition, there is no axial fiber on the tail of the spermatozoon in Physalaemus. In the case of Engystomops, sister group of Physalaemus, the species E. petersi, E. freibergi, and E. puyango the sperm tail presents all three types of fiber (juxtaxonemal, undulating membrane and axial fiber). The tail of these two genera also differ each other for the shorter undulating membrane in Engystomops, corroborating the revalidation of the genus Engystomops. Additionaly, the tail of E.puyango differs from E. petersi and E. freibergi, Duovox clade, and it is similar to E. pustulosus, Edentulus clade, indicating the need of more studies in this genus. In Pleurodema diplolister, representing the genus closest to Physalaemus and Engystomops, the sperm tail has a juxtaxonemal fiber and undulating membrane, which are similar to those found in Physalaemus, although the membrane observed in Pleurodema diplolister is shorter than that observed in Physalaemus. Comparisons with other leptodactylid subfamilies indicated that the Paratelmatobiinae, represented by P. poecilogaster, has the same structures as those observed in the 2n = 22 clade of Pseudopaludicola. On the other hand, the leptodactyline species analyzed, Leptodactylus natalensis, has a well-developed axial fiber, distinct from that found in the sperm of Engystomops, Pseudopaludicola and P. poecilogaster. However, in the other leptodactyline species analyzed, Adenomera marmorata, previously allocated to Leptodactylus, the sperm tail has only an axoneme. This ultrastructural difference in the tails of A. marmorata and L. natalensis supports the status of A. marmorata as a valid taxon distinct from Leptodactylus. Overall, then, the ultrastructural description of the male gametes of a selection of leptodactylid species provided informative phylogenetic characters, especially with regard to the morphology of the sperm tails, which can be used for understanding of the intrageneric and intergeneric relationships / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Durante o processo de criopreservação o espermatozóide passa por mudanças estruturais nas membranas que resulta em diminuição da fertilidade. Este estudo foi realizado para comparar os efeitos de duas técnicas de congelação (técnica convencional e técnica automatizada), curvas de congelação e o uso de três crioprotetores (glicerol, etilenoglicol e dimetilformamida) sobre a motilidade, vigor e integridade das membranas espermáticas (plasmática, acrossomal e mitocondrial) do sêmen bovino. Foram utilizados cinco touros da raça Simental, coletados semanalmente por seis semanas. O semên foi avaliado e diluído em tris-gema (fração única), preparado previamente com os seguintes crioprotetores:- dimetilformamida (3%), etilenoglicol (7%) ou glicerol (7%). A metade das doses foi congelada pela técnica convencional (TC), da seguinte maneira:- seis quilogramas de gelo moído foi colocado em uma de uma caixa de isopor de 15 litros, quando então as palhetas a serem congeladas foram colocadas sobre um suporte, na posição horizontal, por 90 minutos (curva de resfriamento, -0,55°C/min). Imediatamente após, o suporte com as palhetas foi transferido para outra caixa de isopor onde as palhetas permaneceram em vapor de nitrogênio (3cm), por 15 minutos (curva de congelação, -19,1°C/min). A outra metade das palhetas foi criopreservada pela técnica automatizada (TA), utilizando-se um aparelho programável portátil de controle eletrônico (TK2000), com taxa de resfriamento de -0,23°C/minuto e taxa de congelação de -15,5°C/minuto. Após a congelação as palhetas foram mantidas em botijões criogênicos e descongeladas para avaliação da motilidade (%) e vigor (1-5) por microscopia óptica. A integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial foi avaliada utilizando-se o iodeto de propídio (PI); aglutinina de Pisum sativum conjugada a fluoresceína (FITC-PSA) e MitoTracker Green FM (MITO), respectivamente, por microscopia de epifluorescência. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do Programa StatView® (SAS Institute, Cary, NC, USA). Não houve diferenças significativas entre as técnicas e nem interação entre crioprotetor e técnica de congelação (P>0,05) para os parâmetros avaliados. Houve diferença entre os crioprotetores (P<0,05), sendo que o glicerol preservou melhor a motilidade, o vigor e a integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial dos espermatozóides quando comparado ao etilenoglicol e a dimetilformamida. O etilenoglicol foi superior à dimetilformamida para as avaliações da motilidade e da integridade das membranas plasmática e mitocondrial (P<0,05). Uma vez que, 85% dos espermatozóides apresentaram algum grau de lesão, isto nos conduz a inferir que pesquisas são necessárias para que se obtenha melhoria nos resultados após a criopreservação do sêmen bovino / During cryopreservation, spermatozoa undergo many changes leading to membrane damage which result in decreased fertility. This study was designed to compare the effects of two freezing techniques (conventional and automated), their freezing curves and the use of three cryoprotectants (glycerol, ethylene glycol and dimethylformamide) on the motility, vigor and integrity of spermatic membranes (plasmatic, acrosomal, and mitochondrial) of bovine semen. Five Simmental bulls ranging from 24 to 36 months age were submitted one a week to semen collection for six weeks. Semen samples were evaluated and diluted in TRIS-yolk medium (one step). Each semen collection dilutors were prepared previously with each of following cryoprotectants:- glycerol (7%), ethylene glycol (7%) or dimethylformamide (3%). Half of the amount of straws (0.5 mL) was frozen by a conventional manual technique (TC), as in following protocol:- six kilograms of ground ice were placed in the bottom of a thermal box (15 L), straws were cooled on a grid placed horizontally for 90 minutes (cooling rate, -0.55°C/min), immediately transferred to another thermal box and frozen in static liquid nitrogen vapor (15 min) on the same grid placed 3 cm above the liquid nitrogen (freezing rate, -19.1°C/min). The other half of straws was frozen by automated technique (TA). TA was performed using an electronic controlled programmed machine (TK2000) which cooling rate was -0.23°C/min and freezing rate was -15.5°C/min. Straws were plunged into liquid nitrogen and stored at -196°C. The motility (%) and vigor (1-5) were assessed using optic microscopy. The integrity of plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes were evaluated using propidium iodide (PI), fluorescein conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and MitoTracker Green FM (MITO), respectively, by fluorescence microscopy. Effects of treatment were analyzed by StatView® Program, (SAS Institute, Cary, NC, USA). There were no significant differences (P>0.05) between the two freezing techniques and no interaction among cryoprotectant and freezing techniques for all assessed parameters. Glycerol showed better results (P<0.05) than other two cryoprotectants for motility, vigor, and integrity of plasmatic, acrosomal and mitocondrial membranes. Ethylene glycol was superior (P<0.05) than dimethylformamide in preserve motility, and integrity of plasmatic and mitochondrial membranes. Because 85% of spermatozoa showed some kind of post thawing injury, further studies are required to improve cryopreservation techniques used routinely for bovine semen

O processo de fertilização está intimamente relacionado ao íon cálcio. Há relatos que bloqueadores de canais de íons cálcio voltagem-dependentes, utilizados na terapia anti-hipertensiva, podem levar à infertilidade masculina, mas poucos relatos são os de seus efeitos sobre o oócito. O objetivo deste experimento foi verificar a influência dos bloqueadores de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo-L, verapamil, nifedipina e diltiazem, sobre os gametas masculino e feminino. Machos e fêmeas hamsters foram utilizados em testes in vivo e in vitro. Foram realizados tratamentos in vitro no Experimento I: espermatozóides foram capacitados em meios contendo três concentrações de bloqueadores de canais de cálcio e avaliados quanto à capacitação espermática, hiperatividade e fertilidade in vitro. Oócitos foram tratados previamente por 30 minutos com quatro concentrações de antagonistas de canais de cálcio e submetidos a teste de fertilização in vitro e à avaliação do comportamento dos grânulos corticais. No Experimento II, os bloqueadores de canais de cálcio foram administrados, duas vezes ao dia, por 60 dias nos machos e por 30 dias nas fêmeas, que foram analisados pela fertilidade in vivo, capacitação e hiperatividade espermáticas, fecundação in vitro e exocitose dos grânulos corticais, e microscopia eletrônica de transmissão nos oócitos tratados in vivo. No Experimento III, a concentração intracelular de cálcio foi mensurada em espermatozóides e oócitos na presença dos bloqueadores de canais de cálcio. Como resultados, no Experimento I, os fármacos atuaram de forma dose-dependente, os espermatozóides tratados apresentaram menor taxa de capacitação espermática, de hiperatividade e de fecundação in vitro. Os oócitos tratados mostraram menor taxa de fertilização in vitro em relação ao controle e, nos grupos verapamil e diltiazem, exocitose parcial dos grânulos corticais e ativação não completa dos oócitos. O Experimento II demonstrou que os machos dos grupos tratados tiveram menor taxa de capacitação espermática, de hiperatividade e de fertilidade in vitro em relação ao grupo controle, e nos grupos verapamil e nifedipina houve uma redução da fertilidade refletida no número de fêmeas paridas em relação ao grupo controle e diltiazem. A fecundação in vivo das fêmeas tratadas não variou entre os grupos; porém, a taxa de fertilização in vitro dos oócitos de fêmeas tratadas in vivo com os antagonistas foi menor em relação ao controle; tanto a exocitose dos grânulos corticais quanto a microscopia eletrônica não foram detectadas diferenças entre os grupos. As ninhadas de fêmeas que receberam a terapia no início da gestação apresentaram menor peso ao nascimento e maior taxa de mortalidade. No Experimento III, notou-se que os fármacos causaram um bloqueio do influxo de cálcio extracelular tanto em espermatozóides como em oócitos. Concluiu-se que, tanto espermatozóides como oócitos, possuem em sua membrana plasmática canais de íons cálcio sensíveis aos bloqueadores de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo-L. Nos tratamentos in vitro, estes fármacos atuaram negativamente na capacidade de fecundação dos espermatozóides e dos oócitos. A terapia com os bloqueadores de canais de cálcio reduziu a fertilidade nos machos, mas não nas fêmeas. A administração dos bloqueadores no início da gestação causou efeitos teratogênicos / Fertilization process is closely related with calcium ion. There are reports about voltage-dependent calcium ion channel blockers of anti-hypertension therapeutic use causing male infertility, but there are few reports about such effects on the oocyte. The main goal of this experiment was to check the influence of verapamil, nifedipine and diltiazem (L-type voltage-dependent calcium ion channel blockers) on spermatozoa and oocytes. Male and female hamsters were used for in vivo and in vitro experiment. In vitro treatments were preformed in the Experiment I, in which: spermatozoa were capacitated in three concentrations of the three calcium ion channel blockers and they were evaluated for sperm capacitation, hyperactivity and in vitro fertility. Oocytes were incubated for 30 minutes in four concentrations of the same calcium channel antagonists and submitted to in vitro fertilization and evaluation of cortical granules exocytosis. In the Experiment II, calcium channel blockers were supplied twice per day to males during 60 days and to females during 30 days. After this period, drug effects on the animals were evaluated through in vivo fertility, sperm capacitation and hyperactivity, in vitro fertilization, cortical granules exocytosis and transmission electronic microscopy of in vivo treated oocytes. In the Experiment III, the intracellular calcium concentrations were measured in spermatozoa and oocytes in the presence of calcium ion channel blockers. As results, in the Experiment I, the antagonists presented dose-dependent effects, affecting sperm capacitation rate, hyperactivity and in vitro fertilization rate on treated spermatozoa. Treated oocytes presented lower in vitro fertilization rate when compared to the control group and, in the verapamil and diltiazem groups, cortical granules exocytosis was partial and oocyte activation was not concluded. Experiment II showed that male hamsters of treatment groups presented lower sperm capacitation rate, hyperactivity and in vitro fertilization rate and there were fewer pregnant females, demonstrating a reducing male fertility in verapamil and nifedipine groups when compared to the control and diltiazem groups. In vivo fertility of treated females did not change among groups; however, in vitro fertilization rates in oocytes of calcium antagonists in vivo treated females were lower. Nor cortical granules exocytosis neither electronic microscopy detected differences among groups. Progeny of females that received the therapy in the beginning of pregnancy presented lower birth weight and higher mortality rate. In the Experiment III, the antagonists blocked extracellular calcium influx in spermatozoa and in oocytes. It is concluded that, there were calcium ion channels with sensibility to L-type voltage-dependent calcium ion channel blockers in the plasmatic membrane of spermatozoa and oocytes. In in vitro treatments, these antagonists influenced negatively spermatozoa and oocytes capacity of fertilization. Calcium channel blocker therapy reduced the fertility in males, but not in females. Calcium channel blockers supplied in the beginning pregnancy caused teratogenic effects

Na cascavel Crotalus durissus terrificus ocorre o armazenamento de longo prazo do esperma (LTSS), no trato genital da fêmea, durante o intervalo entre a cópula (outono) e a ovulação (primavera). Peptídeos e peptidases estão entre os principais componentes que influenciam a atividade espermática em mamíferos. O presente estudo objetivou caracterizar a presença de peptidases em C. d. terrificus, com esta função reconhecida em mamíferos e/ou que clivam peptídeos atuantes nesta função, bem como avaliar a hipótese do envolvimento destas peptidases na preservação dos espermatozóides desta serpente. O aspecto morfo-funcional dos espermatozóides foi comparado na presença dos peptídeos angiotensina II (AngII), arginina vasotocina (AVT), bradicinina (BK), peptídeo promotor da fecundação (FPP) e hormônio liberador de tireotrofina (TRH). Caracterizamos os efeitos de agentes quelante, tiol-redutor, cofator e inibidores, bem como dos peptídeos supracitados, sobre as atividades enzimáticas relacionadas, quais sejam: aminopeptidases ácida (APA), básica (APB), alanil sensível (APN-PS) e insensível à puromicina (APN-PI), cistil (CAP), dipeptidil-peptidase IV (DPPIV), piroglutamil tipo 1 (PAP-I) e prolil-imino- (PIP), bem como da prolil endopeptidase (POP), em frações solúvel (FS) e/ou de membrana solubilizada (FM) do sêmen proveniente do ducto deferente, assim como deste próprio tecido e dos tecidos uterino e vaginal de C. d. terrificus, ou seja, tecidos por onde passam ou armazenam-se os espermatozóides. Verificamos a variação sazonal destas mesmas atividades, nestes tecidos, incluindo o sêmen armazenado no útero durante o LTSS. O sêmen coletado do ducto deferente foi fracionado para avaliação da distribuição destas atividades peptidásicas. Nossos dados mostraram características de liquefação do sêmen e movimento dos espermatozóides da cascavel que os diferenciam do padrão humano. FPP com cálcio e BK melhoraram a preservação da viabilidade espermática, similarmente ao que ocorre em mamíferos. Em todos os tecidos e no sêmen as atividades APB, PIP e POP foram detectadas apenas da FS, enquanto as demais estão presentes em FS e FM, seguindo um padrão de distribuição observado na maioria dos tecidos de mamíferos. Amastatina e bestatina inibiram APB e APN, enquanto a diprotina A foi o inibidor mais eficiente para a DPPIV em FM. PAP-I e PIP foram inibidas, respectivamente, por bestatina e puromicina. Este perfil de inibição também é similar ao encontrado para as aminopeptidases em tecidos de mamíferos. Todas as atividades peptidásicas foram influenciadas por algum dos peptídeos estudados, sugerindo que tais peptídeos são substratos potenciais e/ou moduladores destas atividades na cascavel. As atividades APB e APN foram caracterizadas como metalopeptidases. APB, CAP e DPPIV foram inibidas por MnCl2. CAP e PAP-I foram caracterizadas como enzimas sulfidril-dependentes. As atividades APB, APN-PI e APN-PS predominaram, em relação às demais peptidases, em todas as estações e na maioria dos tecidos e no sêmen, sugerindo sua maior relevância na fisiologia reprodutiva da C. d. terrificus. Os níveis de todas as atividades peptidásicas estudadas variaram sazonalmente, sugerindo que sua ação moduladora sobre peptídeos susceptíveis está integrada ao ciclo reprodutivo desta serpente. O fracionamento do sêmen do ducto deferente revelou a presença de fluido seminal e espermatozóides, bem como de uma estrutura prostassoma-símile, até então somente identificada em mamíferos. Em todas estas frações há atividade peptidásica, predominando a APN-PI no prostassoma-símile e no fluido seminal, e APN-PS e APN-PI na FS e FM dos espermatozóides, caracterizando um envolvimento com a redução da motilidade espermática, tal qual ocorre em mamíferos. Concluimos que as atividades peptidásicas estudadas apresentam características sazonais e tecido-específicas que sugerem uma atuação relevante na preservação dos espermatozóides de C.d. terrificus. / In the rattlesnake Crotalus durissus terrificus occurs the long-term sperm storage (LTSS), in the female tract, during the interval between mating (autumn) and ovulation (spring). Peptides and peptidases are among the main components that influence the spermatic activity in mammals. The present study aimed to characterize the presence of peptidases in C. d. terrificus, that are well-recognized to exert this function and/or that have the ability to hydrolyze peptides that exert this function in mammals, as well to evaluate whether these peptidases are related to the preservation of spermatozoids in this snake. The morphological and functional characteristics of spermatozoids were compared in the presence of angiotensin II (AngII), arginine-vasotocin (AVT), bradykinin (BK), fertilization promoting peptide (FPP) and thyrotropin-releasing hormone (TRH). We have checked the effect of chelating and thiol-reducing agents, cofactor and inhibitors, as well the effect of aforementionated peptides on related enzyme activities such as acid (APA), basic (APB), puromycin-sensitive (APN-PS) and puromycin-insensitive alanyl (APN-PI), cystyl (CAP), pyroglutamyl type 1 (PAP-I) and prolyl-imino (PIP) aminopeptidases, and dipeptidyl-peptidase IV (DPPIV), as well as on prolyl endopeptidase (POP), in soluble (FS) and/or solubilized membrane-bound (FM) fractions of semen from vas deferens, of this own tissue, and vagina and uterus tissues of C. d. terrificus, i.e. tissues where spermatozoids pass through or where they are stored. The seasonal variation of these peptidase activities, in all tissues, including the semen stored in uterus during the LTSS, were evaluated. The semen from vas deferens was fractioned in order to know the distribution of these peptidase activities. The features of seminal liquefaction and movement of spermatozoids were different between the rattlesnake and human. Similar to mammals, FPP plus calcium and BK improved the preservation of the viability of spermatozoids from C. d. terrificus. In all tissues and semen, the APB, PIP and POP activities were detected only in FS, while others peptidases were present in FS and FM, following a similar pattern of distribution usually observed in mammalian tissues. Amastatin and bestatin inhibited APB and APN activities, while diprotin A was the most efficient inhibitor of DPPIV in FM. PAP-I and PIP activities were inhibited by bestatin and puromycin, respectively. This inhibition profile was similar to that of mammalian tissues. All peptidase activities were influenced at least by one of the peptides under study, suggesting these peptides as potential substrates and/or modulators for these peptidases of the rattlesnake. The APB and APN activities were characterized as metallopeptidases. APB, CAP and DPPIV were inhibited by MnCl2. CAP and PAP-I were characterized as sulfhydryl-dependent enzymes. The APB, APN-PI and APN-PS activities were predominant, in relation to the other examined peptidases, in all seasons and in most tissues and semen, suggesting their great relevance in the reproductive physiology of the C. d. terrificus. The levels of all studied peptidase activities were seasonally variable, suggesting that their modulator actions on susceptible peptides are integrated to the reproductive cycle of this snake. The fractionation of C. d. terrificus semen revealed the presence of seminal fluid and spermatozoids, as well a prostasome-like structure, until then identified only in mammals. In all of these fractions, there are peptidase activities, predominating the APN-PI in prostasome and seminal fluid, and the APN-PS and APN-PI in FS and FM of spermatozoids, suggesting their involvement in the reduction of the spermatic mobility, such as in mammals. In conclusion, the studied peptidase activities present seasonal and tissue-specific characteristics, which suggest a relevant role in the preservation of the spermatozoids of C. d. terrificus.

Objetivo: Avaliar a função gonadal de homens com miopatias inflamatórias idiopáticas (MII). Métodos: Vinte e cinco pacientes com MII foram avaliados e comparados com 25 homens saudáveis. Os pacientes foram subdivididos em dois sub-grupos de acordo com as alterações dos espermatozóides: grupo A (n=10, duas ou mais das seguintes alterações: terato/oligo/astenozoospermia ou azoospermia) e grupo B (n=15, teratozoospermia). Foram realizados: exame urológico, ultra-sonografia testicular, análise dos espermatozóides (critérios da OMS e Kruger), pesquisa dos anticorpos anti-espermatozóides e dosagens hormonais Nos subgrupos foram também avaliados: Disease Activity Score (DAS), Visual Analogue Scale (VAS), Manual Muscle Testing (MMT), myositis disease activity assessment visual analogue scales (MYOACT), myositis intention to treat activity index (MITAX), Myositis damage index [MDI], enzimas musculares e tratamento. Resultados: Pacientes apresentaram alterações nos espermatozóides comparados com controles com freqüência maior de nível elevado de FSH (20% versus 0%, p=0,05). O sub-grupo A apresentou freqüência e mediana maior do nível de CK (p=0,001 e p=0,001) assim como DAS (p=0,01), VAS (p=0,051), MMT (p=0,003). As medianas dos volumes testiculares foram menores no grupo A (direito, p=0,015 e esquerdo, p=0,025). As medianas dos parâmetros espermáticos foram reduzidas no grupo A [contagem total (p=0,0001); motilidade (p=0,0001); morfologia pela OMS (p=0,0001) e por Kruger (p=0,0001). A mediana de FSH foi elevada (p=0,035) e de androstenediona foi reduzida (p=0,02) no sub-grupo A. Afrequência de ciclofosfamida foi similar nos grupos (30% versus 6%, p=0,26). Conclusões: Atividade da doença foi o principal fator contribuinte para disfunção gonadal. Hipogonadismo hipergonadotrófico pode explicar as alterações anatômicas e funcionais observadas / Objective: To perform a global gonad evaluation in male idiopathic inflammatory myopathies (IIM) patients. Methods: Twentyfive consecutive IIM were compared to 25 age-matched healthy subjects. Patients were subdivided in two groups according to the severity of sperm abnormalities: group A (at least two of the following terato/oligo/asthenozoospermia or azoospermia) and group B (teratozoospermia). Patients and controls underwent a systematic assessment consisting of: urologic examination, testicular ultrasound, semen analysis and hormones. Patients´ serum CK levels, visual analogue scale (VAS), disease activity score (DAS), manual muscle testing (MMT), myositis disease activity assessment visual analogue scales (MYOACT), myositis intention to treat activity index (MITAX), and Myositis damage index (MDI) were evaluated. Results: Several sperm variables were significantly altered compared to controls (p<0.05). The subgroup analysis according to the severity of sperm alterations revealed that the frequency of elevated CK and its median level was significantly higher in group A (p=0.001 and p=0.001), as also was DAS, VAS and MMT (p=0.01; p=0.051 and p=0.03). The median of testicular volumes were lower in group A (right p=0.015 and left p=0.025). All median sperm parameters were lower in group A (total sperm count, p=0.0001; total motile sperm count, p=0.0001; and sperm morphology by Kruger p=0.0001 and WHO p=0.0001). Higher median FSH (p=0.035) and lower median androstenedione levels (p=0.02) were observed in group A. The frequency of cyclophosphamide was similar in both groups (30% vs. 6%, p=0.26). Conclusions: Active disease was the major contributing factor for severe gonad dysfunction. The hypergonadotrophic hypogonadism may explain the anatomical and dysfunctional alterations observed