A interação entre as vias de sinalização do ER, do IGF-I e da integrina 1 é essencial para a manutenção da homeostase da glândula mamária normal, e alterações nessas vias de sinalização estão associadas ao processo de tumorigênese da mama. Portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar a influência e inter-relação entre as vias de sinalização do IGF-I, do ER e da integrina 1 na regulação da transcrição dos genes PHLDA1 e PAWR. Para isso, células MCF-7 foram tratadas, por diferentes tempos, com 10nM de 17- estradiol (E2), 12,5nM de IGF-I, 30M de LY294002 (inibidor da PI-3K), 30M de SB202190 (inibidor da p38MAPK) e 1M de ICI182780 (antagonista do ER), ou transfectadas com 40nM de siRNA para integrina 1. A expressão gênica foi avaliada por PCR em tempo real e a expressão protéica por Western Blot. A expressão do gene PHLDA1 aumentou após tratamento com E2 por 6h (p=0,05), e esse efeito foi inibido pelo tratamento com ICI (p<0,05). O tratamento com E2 por 24h inibiu a expressão do gene PAWR (p<0,05), e esse efeito foi dependente de ER, pois foi inibido pelo tratamento com ICI (p<0,05). O tratamento com IGF-I por 1,5h causou aumento na expressão do gene PHLDA1 (p<0,05); e o tratamento com IGF-I por 24h causou diminuição na expressão do gene PAWR (p<0,05). Foi observado aumento na expressão protéica de PHLDA1 após tratamento das MCF-7 com E2 ou IGF-I por 1:30h. A regulação da expressão do PAWR pelo IGF-I ocorreu através das vias da PI-3K e p38MAPK. O efeito do IGF-I sobre a expressão dos dois genes foi independente da ativação do ER, mas foi observado sinergismo entre E2 e IGFI na inibição da expressão dos transcritos do PAWR, com diminuição na expressão para nível menor do que o observado após tratamento com E2 ou IGF-I sozinhos (p<0,05). A repressão da expressão da integrina 1 resultou na diminuição dos níveis de expressão dos genes PHLDA1 e PAWR. Não foi observada interação entre o IGF-I e a integrina 1 na regulação dos genes PHLDA1 e PAWR. Portanto, o gene PHLDA1 é regulado positivamente pelo E2 e pelo IGF-I, mas não existe interação entre as vias. O gene PAWR é regulado negativamente pelo E2 e pelo IGF-I; o efeito do IGF-I é dependente da ativação da PI3-K e da p38MAPK, mas não do ER; e existe sinergismo entre E2 e IGF-I na regulação do PAWR / The interactions among ER, IGF-I and 1 integrin signaling pathways are essential for the maintenance of normal mammary gland homeostasis, and alterations in these pathways have been associated with mammary tumorigenesis. Therefore, the goal of this work was to investigate the influence and interaction among IGF-I, ER and 1 integrin signaling pathways on the regulation of PHLDA1 and PAWR transcription regulation. To accomplish that, MCF-7 cells were treated with 10nM 17-estradiol (E2), 12.5nM IGF-I, 30M LY294002 (a PI3-K inhibitor), 30M SB202190 (a p38MAPK inhibitor) and 1M ICI182,780 (ICI an ER antagonist), or transfected with 40nM siRNA aiming 1 integrin. Real time PCR and western blot were used to evaluate gene and protein expression, respectively. PHLDA1 mRNA expression increased after 6h of treatment with E2 (p=0.05), and this effect was inhibited by ICI (p<0.05). Treatment with E2 for 24h repressed PAWR gene expression (p<0.05) and this effect was dependent on ER, since treatment with ICI inhibited it (p<0.05). Treatment with IGF-I for 1.5h resulted in increased PHLDA1 gene expression (p<0,05) and also PHLDA1 protein expression; and treatment with IGF-I for 24h inhibited PAWR mRNA expression (p<0.05). IGF-I regulation of PAWR expression was dependent on PI3-K and p38MAPK activation. The regulation of both genes by IGF-I was independent of ER activation; however, IGF-I acted in synergism with E2 on PAWR expression resulting in lower PAWR expression than the observed after the treatments alone (p<0.05). Repression of 1 integrin expression resulted in downregulation of PHLDA1 and PAWR expression levels. No interaction was observed between IGF-I and 1 integrin on PHLDA1 and PAWR gene expression. In conclusion, PHLDA1 is positively regulated by E2 and IGF-I, but there is no interaction between them on PHLDA1 regulation. On the other hand, PAWR is negatively regulated by E2 and IGF-I; IGF-I effect is dependent on PI3-K and p38MAPK, but not on ER activation; E2 and IGF-I act synergistically on PAWR gene expression regulation

Orientador: Valéria Helena Alves Cagnon Quitete / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-11-05T17:40:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Candido_EduardoMarcelo_D.pdf: 29056954 bytes, checksum: 56337986d8eaf83c84b1cf42b26d64df (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O objetivo do presente estudo foi caracterizar e comparar a estrutura e a biologia molecular dos receptores esteróides dos lobos prostáticos e da glândula de coagulação em ratos senis, submetidos a diferentes terapias hormonais exógenas, além de identificar os processos de proliferação e apoptose nesses órgãos. Trinta ratos da linhagem Sprague-Dawley com 10 meses de idade foram divididos em seis grupos experimentais e submetidos aos respectivos tratamentos: Grupo Senil/Controle (SC); Grupo Senil/Testosterona (ST); Grupo Senil/Estrógeno (SE); Grupo Castrado (CA); Grupo Castrado-Testosterona (CT); e Grupo Castrado-Estrógeno (CE). Após trinta dias de tratamento, os animais foram sacrificados e as amostras do lobo ventral (LV), lobo dorsal (LD) e glândula de coagulação (GC) foram coletados e processados para microscopia de luz, imunohistoquímica e Western Blotting. As concentrações séricas de hormônios esteróides em amostras sanguíneas também foram determinadas. Os resultados mostraram manutenção tecidual epitelial no LD e na GC após administração de testosterona (grupos ST). Já o LV apresentou espaçamento entre epitélio e estroma. Na administração de testosterona pós-castração (grupos CT), as respostas divergiram entre as glândulas analisadas. No LV tanto o epitélio quanto o estroma mantiveram-se alterados. O LD apresentou recuperação morfológica na comparação com o grupo CA. Já na GC, enquanto o epitélio mostrou sinais de recuperação, o estroma manteve características de hiperplasia e hipertrofia. A administração de estrógeno (grupos SE e CE) manteve ou pouco alterou a morfologia da GC, porém, provocou ampla desestruturação tecidual nos lobos ventral e dorsal, com geração de micro-ácinos, presença de NIPs e focos inflamatórios. A imunohistoquímica revelou diferenças quanto à imunorreatividade dos receptores androgênicos e estrogênicos em relação aos compartimentos epiteliais e estromal em todos os órgãos avaliados. O AR foi intensamente imunorreativo no epitélio dos lobos dorsal e ventral, situação oposta à observada nas glândulas de coagulação, onde o AR foi prevalentemente estromal. O ERa foi essencialmente estromal em todos os órgãos, enquanto que o ERb foi essencialmente encontrado no epitélio do lobo ventral e no estroma das glândulas de coagulação. No lobo dorsal, o ERb foi essencialmente estromal nos grupos SC e ST, com sua imunorreatividade alterando-se para epitelial nos grupos SE e CA, mostrando que esse receptor respondeu efetivamente à ação hormonal alterando sua localização. Assim, pode-se concluir que a terapia hormonal exógena, especialmente de testosterona, pode ser útil na manutenção tecidual prostática e que a imunorreatividade diferencial dos receptores hormonais pode sugerir uma forma lobo-específica de atuação dos hormônios sexuais na manutenção tecidual e promoção de patogênese prostática / Abstract: The aim of the present study was to characterize and compare the structure and the molecular biology of the steroid hormone receptors from prostatic lobes and coagulating gland in elderly rats submitted to different hormonal exogen therapies, besides identifying the apoptosis and proliferation processes in these organs. Thirty ten-month-old male rats were divided into six groups: Senile/Control group (SC); Senile/Testosterone group (ST); Senile/Estrogen group (SE); Castrated group (CA); Castrated-Testosterone group (CT); and Castrated-Estrogen group (CE). After 30-day treatment, the animals were sacrificed and the prostatic ventral lobe (VL), dorsal lobe (DL) and coagulating gland (CG) samples were collected and processed for light microscopy, immunohistochemistry and Western Blotting analyses. Serum steroid hormone concentrations in blood samples were also determined. The results showed epithelial tissue maintenance in DL and CG after testosterone administration (ST groups). However, the VL presented spacing between the epithelium and the stroma. After castration and testosterone administration, it was verified that both epithelium and stroma were changed in the VL. The DL showed morphological recovery in relation to the CA group. The CG showed signs of epithelial recovery in contrast to the glandular stroma, which maintained features of hyperplasia and hypertrophy. Estrogen administration (SE and CE groups) caused few changes in the CG morphology. However, the estrogen led to intense tissue disorganization in both VL and DL, showing microacini, prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) and inflammatory foci. The immunohistochemical analysis showed intense AR immunoreactivity in the epithelium of the DL and VL, whereas AR immunoreaction was predominant in the stromal cells in the CG. ER? occurred preferentially in the stromal compartment in all the studied organs, while ER? was found preferentially in the VL epithelium and in the CG stroma. ER? immunoreactivity was predominantly stromal in the DL from SC and ST groups. In contrast, there was a change of the ER? reactivity to the epithelial cells in the DL from SE and CA groups. This fact showed that this hormone receptor actually was responsive to the hormonal action changing its localization. So, it could be concluded that hormonal exogen therapy, especially with testosterone, could be useful in prostatic tissue maintenance. In addition, the differential immunoreactivities of the hormonal receptors could suggest a lobe-specific way of action of the sex steroidal hormones in tissue maintenance and in the triggering of prostatic pathogenesis / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Introdução: Polimorfismo é variação genética de ocorrência habitual na população em geral, encontrado em frequência superior a 1%. Há vários polimorfismos conhecidos no gene do receptor estrogênico alfa, alguns dos quais podem modificar a função do receptor e a ação dos estrogênios. Associação de polimorfismos no gene do receptor estrogênico alfa e risco de doenças, incluindo o câncer de mama, tem sido objeto de grande interesse, porém existem poucos estudos publicados sobre a prevalência destes na população brasileira. Objetivos: Verificar em mulheres com mamas densas após a menopausa; 1) A distribuição dos fatores de risco para câncer de mama; 2) A frequência dos polimorfismos do gene do receptor estrogênico alfa Pvull, Xbal e (GT)n; 3) A associação entre os resultados moleculares e os fatores de risco para o câncer de mama. Casuística e métodos: Estudo observacional realizado na divisão de Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, em 308 mulheres com idade entre 45 e 65 anos, mamas densas, que estavam há pelo menos um ano sem menstruar, que não faziam uso de terapia hormonal há 1 ano ou mais e sem antecedente pessoal de câncer de mama e ovário. Caracterizaram-se na história clínica e no exame físico, idade da menarca e da menopausa, paridade, idade ao nascimento do primeiro filho, antecedentes familiares de câncer de mama, hábito de fumar, ingestão de bebida alcoólica e o Índice de Massa Corpórea. Foi coletada amostra de sangue periférico para extração do DNA genômico e determinação dos polimorfismos presentes no intron 1 (Pvull e Xbal) e na região promotora do éxon 1 (GT)n e dosagens de glicemia, colesterol total e frações, insulina, IGF1, TSH, T3, T4, FSH, LH e estradiol. Resultados: Os fatores considerados de risco para o câncer de mama, menarca antes dos 12 anos (35,38%), nuliparidade ou idade ao ter o 1º filho após os 28 anos (41,66%), história familiar de câncer de mama (19,16%) e sobrepeso/obesidade (62,01%) foram mais prevalentes nessa população. A cor branca foi a mais frequente, coincidindo com os resultados de outros estudos, e a menopausa tardia não se mostrou um fator de influência nessa população. As frequências alélica e genotípica para os SNPs no RE?-397-Pvull e Xbal foram: P=43,99%; p=56,01%; pp=32,14%, Pp=47,73% e PP=20,13%; X=41,56%, x=58,44%; xx=33,44%, Xx=50,00% e XX=16,56%, respectivamente. Para o polimorfismo de repetição STRs (GT)n, os genótipos mais frequentes foram 14, 15 e 16, com predomínio da repetição 16. As distribuições alélica e genotípica dos polimorfismos (Pvull, Xbal e GTn), não sofreram influências significativas dos fatores de risco pesquisados. Conclusão: Os fatores de risco para o câncer de mama foram mais prevalentes nessa população de mulheres com mamas densas, embora, não tenham mostrado associações significativas com os polimorfismos estudados. Estudos caso controle adicionais são necessários para melhor compreender a associação destes polimorfismos e o câncer de mama. / Introduction: Polymorphism is genetic variation of usual occurrence in the general population, found with frequency higher than 1%. There are several known polymorphisms in the estrogen receptor alpha (ER?), some of which can modify the receptor function and the action of the estrogen. Association of polymorphisms in the estrogen receptor alpha gene and risk of diseases, including breast cancer, has been a subject of great interest, but there are few published studies on the prevalence of these in the Brazilian population. Objective: Checking on women with high breast density after menopause; 1) the distribution of risk factors for breast cancer; 2) the frequency of polymorphism of the estrogen receptor alpha gene Pvull, Xbal and (GT)n; 3) the association between the molecular results and the risk factors for breast cancer. Methods: Observational study carried out in the Gynecology Department of the Hospital das Clínicas of Medical School of São Paulo University, in 308 women aged between 45 and 65 years-old, high breast density, who were at least one year without menstruating and did not use hormone therapy for 1 year or more and no personal history of breast and ovarian cancer. It was characterized on clinical history and physical examination: age of menarche and menopause, parity, age at birth of first child, family history of breast cancer, smoking, alcohol intake and body mass index. Peripheral blood sample was collected for DNA extraction and determination of genomic polymorphisms present in the intron 1 (Pvull and Xbal), in the promoter region of exon 1 (GT)n, dosages of blood glucose, total cholesterol and fractions, insulin, IGF1, TSH, T3, T4, FSH, LH, and estradiol. Results: The factors considered of risk for breast cancer, menarche before age 12 (35.38%), nulliparity or first child after the 28 years-old (41.66%), family history of breast cancer (19.16%) and Overweight/obesity (62.01%) were more prevalent in this population. The Caucasian were the most frequent, coinciding with the results of other studies, and late menopause was not a factor of influence in this population. The allele and genotypic frequencies for SNPs in ER?-397-Pvull and Xbal were: P = 43.99%; p = 56.01%; pp = 32.14%, Pp = 47.73% and PP = 20.13%; X = 41.56%, x = 58.44%; xx = 33.44%, Xx = 50.00% and XX = 16.56%, respectively. For the STRs repeat polymorphism (GT)n, the most common genotypes were 14, 15 and 16, with a predominance of repeat 16. The allele and genotypic distributions of polymorphisms (Pvull, Xbal and GTn), did not suffer significant influences of the risk factors surveyed. Conclusion: The risk factors for breast cancer were more prevalent in this population of women with high breasts density, although have not shown significant associations with polymorphisms studied. Additional studies case-control are needed to better understand the Association of these polymorphisms and breast cancer.

Apesar dos avanços no tratamento dos diferentes subtipos moleculares do câncer de mama, diversos efeitos colaterais e resistência ao tratamento são observados. Nesse contexto, a busca por novos marcadores moleculares ainda é necessária. A família do coativador - 1 do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama-1 (PGC-1) exerce funções cruciais no metabolismo energético celular e alguns trabalhos na literatura mostram alterações de PGC-1 no desenvolvimento do câncer. Contudo, mecanismos envolvidos na proliferação celular do carcinoma de mama permanecem desconhecidos. O objetivo geral foi determinar os mecanismos pelos quais PGC-1 controla a proliferação de células tumorais de mama, com foco em vias metabólicas e de sinalização redox. Para alcançar os objetivos, foi determinada a expressão de PGC-1alfa e beta em células tumorais de mama dos subtipos moleculares luminal (MCF-7), HER2- superexpresso (SKBR3) e triplo negativo (MDAMB231) em relação a uma linhagem de mama não tumoral (MCF-10A). Foi encontrada maior expressão gênica e proteica de PGC-1beta na superexpressão de HER2, e maior taxa de crescimento para essa linhagem. Para investigar se PGC-1beta pode estar envolvido na proliferação dessas células, utilizamos sequências específicas de RNA de interferência para o knockdown de PGC-1beta nas células SKBR3. Após o tratamento houve diminuição de proliferação celular. Assim, investigamos os prováveis mecanismos pelos quais PGC-1beta diminui a proliferação celular. Nossos resultados mostram que o knockdown de PGC-1beta não influenciou a expressão de ciclinas (B, C, D e E) e não houve diferença na quantidade de DNA mitocondrial, fator de transcrição mitocondrial A (TFAM), fator de respiração nuclear (NRF) 1 e 2. Em seguida, mostramos que o knockdown de PGC-1beta diminuiu a produção de lactato intracelular e aumentou a atividade da enzima citrato sintase, e houve tendência a maior taxa de respiração celular. Detectamos maiores níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) após knockdown de PGC-1beta enquanto que a produção de nitrito e nitrato, não diferiu. Não houve alteração na atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase, catalase e sistema glutationa. Os resultados revelam presença de despolarização mitocondrial quando PGC-1? é diminuído nas células HER2. Como os receptores relacionados a estrógeno (ERR) possuem conhecido papel na regulação do metabolismo energético, avaliamos se sua expressão é modulada por PGC-1?. A diminuição de PGC-1beta não influenciou a expressão gênica de ERRy e reduziu a expressão gênica de ERRalfa. Por fim, mostramos maior expressão de PGC-1beta proveniente de tumores de pacientes com câncer de mama HER2- superexpresso em relação aos diferentes subtipos moleculares. Conclui-se que a diminuição da sinalização por HER2/ PGC-1beta/ ERRalfa está envolvida com a diminuição da via glicolítica e aumento da via oxidativa com consequente aumento de EROs e perda do potencial de membrana mitocondrial, resultando em diminuição da proliferação celular. Espera-se que os resultados desse estudo ajudem na identificação de vias de sinalização importantes que controlam tanto o metabolismo energético quanto a proliferação de células tumorais, as quais poderão se tornar alvos terapêuticos no futuro / Despite a marked improvement in treatments for all breast cancer subtypes, several side-effects and resistance to therapy are noticed. In this context, the searching for new molecular targets for breast cancer treatment is still a challenge. Peroxisome proliferator-activated receptor- gamma coactivator 1 (PGC-1) is the main regulator of cell energy homeostasis and studies in the literature show alterations regarding PGC-1 in cancer development. However, mechanisms involved in cellular proliferation of breast cancer remain unknown. We aimed to determine the mechanisms by which PGC-1beta controls breast cancer cell proliferation, focusing on metabolic and redox signaling. To reach this goal, we determined PGC-1alfa and beta expression in breast cancer cell lines as luminal (MCF-7), HER2-overexpressed (SKBR3) and triple- negative (MDAMB231) as compared to a non-tumoral breast cell line (MCF-10A). We found increased gene and protein expression of PGC-1beta in HER2- overexpressed cells and increased cellular proliferation. To investigate whether PGC-1beta could be involved in the proliferation of those cells, we used specific sequences of silencing interfering RNA for knockdown of PGC-1beta in SKBR3 cells. After treatment we observed a decrease in cellular proliferation. Thus, we next investigated the probable mechanisms by which PGC-1beta could decrease cellular proliferation. Our results showed that knockdown of PGC-1beta did not influence on cyclin expression (B, C, D and E), mitochondrial DNA number, mitochondrial transcription factor - A (TFAM), nuclear receptor factor (NRF) 1 and 2 expression. We showed that knockdown of PGC-1beta induced a decrease intracellular lactate production, increase in citrate synthase activity and a trend to increase cellular respiration rate. Thereby, we detected greater amounts of reactive oxygen species (ROS) after knockdown of PGC-1beta, and no alterations was found for nitrite and nitrate levels. No alterations regarding antioxidant enzymes activities as superoxide dismutase, catalase, and glutathione system were found. Results revealed loss of mitochondrial membrane potential when PGC-1beta is decreased in HER2- overexpressed cells. As estrogen related receptors (ERR) have a recognized role in the regulation of energetic metabolism, we assessed whether their expression could be modulated by PGC-1beta. The decrease in PGC-1beta expression did not influence on ERRy expression, but it decreased the gene expression of ERRalfa. Finally, we demonstrated increased PGC-1beta expression in HER2- overexpressing tumors from breast cancer patients. Taken together, we conclude that decrease in HER2/ PGC-1beta/ ERRalfa signaling may be related to decrease in glycolytic pathway and increase in oxidative metabolism resulting in increased ROS production and loss of mitochondrial membrane potential, which can lead to decreased cellular proliferation. We hope that the findings may help in the identification of important cellular signaling that may control energetic metabolism regarding tumor cells proliferation, which can became future target therapies

A interação entre as vias de sinalização do ER, do IGF-I e da integrina 1 é essencial para a manutenção da homeostase da glândula mamária normal, e alterações nessas vias de sinalização estão associadas ao processo de tumorigênese da mama. Portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar a influência e inter-relação entre as vias de sinalização do IGF-I, do ER e da integrina 1 na regulação da transcrição dos genes PHLDA1 e PAWR. Para isso, células MCF-7 foram tratadas, por diferentes tempos, com 10nM de 17- estradiol (E2), 12,5nM de IGF-I, 30M de LY294002 (inibidor da PI-3K), 30M de SB202190 (inibidor da p38MAPK) e 1M de ICI182780 (antagonista do ER), ou transfectadas com 40nM de siRNA para integrina 1. A expressão gênica foi avaliada por PCR em tempo real e a expressão protéica por Western Blot. A expressão do gene PHLDA1 aumentou após tratamento com E2 por 6h (p=0,05), e esse efeito foi inibido pelo tratamento com ICI (p<0,05). O tratamento com E2 por 24h inibiu a expressão do gene PAWR (p<0,05), e esse efeito foi dependente de ER, pois foi inibido pelo tratamento com ICI (p<0,05). O tratamento com IGF-I por 1,5h causou aumento na expressão do gene PHLDA1 (p<0,05); e o tratamento com IGF-I por 24h causou diminuição na expressão do gene PAWR (p<0,05). Foi observado aumento na expressão protéica de PHLDA1 após tratamento das MCF-7 com E2 ou IGF-I por 1:30h. A regulação da expressão do PAWR pelo IGF-I ocorreu através das vias da PI-3K e p38MAPK. O efeito do IGF-I sobre a expressão dos dois genes foi independente da ativação do ER, mas foi observado sinergismo entre E2 e IGFI na inibição da expressão dos transcritos do PAWR, com diminuição na expressão para nível menor do que o observado após tratamento com E2 ou IGF-I sozinhos (p<0,05). A repressão da expressão da integrina 1 resultou na diminuição dos níveis de expressão dos genes PHLDA1 e PAWR. Não foi observada interação entre o IGF-I e a integrina 1 na regulação dos genes PHLDA1 e PAWR. Portanto, o gene PHLDA1 é regulado positivamente pelo E2 e pelo IGF-I, mas não existe interação entre as vias. O gene PAWR é regulado negativamente pelo E2 e pelo IGF-I; o efeito do IGF-I é dependente da ativação da PI3-K e da p38MAPK, mas não do ER; e existe sinergismo entre E2 e IGF-I na regulação do PAWR / The interactions among ER, IGF-I and 1 integrin signaling pathways are essential for the maintenance of normal mammary gland homeostasis, and alterations in these pathways have been associated with mammary tumorigenesis. Therefore, the goal of this work was to investigate the influence and interaction among IGF-I, ER and 1 integrin signaling pathways on the regulation of PHLDA1 and PAWR transcription regulation. To accomplish that, MCF-7 cells were treated with 10nM 17-estradiol (E2), 12.5nM IGF-I, 30M LY294002 (a PI3-K inhibitor), 30M SB202190 (a p38MAPK inhibitor) and 1M ICI182,780 (ICI an ER antagonist), or transfected with 40nM siRNA aiming 1 integrin. Real time PCR and western blot were used to evaluate gene and protein expression, respectively. PHLDA1 mRNA expression increased after 6h of treatment with E2 (p=0.05), and this effect was inhibited by ICI (p<0.05). Treatment with E2 for 24h repressed PAWR gene expression (p<0.05) and this effect was dependent on ER, since treatment with ICI inhibited it (p<0.05). Treatment with IGF-I for 1.5h resulted in increased PHLDA1 gene expression (p<0,05) and also PHLDA1 protein expression; and treatment with IGF-I for 24h inhibited PAWR mRNA expression (p<0.05). IGF-I regulation of PAWR expression was dependent on PI3-K and p38MAPK activation. The regulation of both genes by IGF-I was independent of ER activation; however, IGF-I acted in synergism with E2 on PAWR expression resulting in lower PAWR expression than the observed after the treatments alone (p<0.05). Repression of 1 integrin expression resulted in downregulation of PHLDA1 and PAWR expression levels. No interaction was observed between IGF-I and 1 integrin on PHLDA1 and PAWR gene expression. In conclusion, PHLDA1 is positively regulated by E2 and IGF-I, but there is no interaction between them on PHLDA1 regulation. On the other hand, PAWR is negatively regulated by E2 and IGF-I; IGF-I effect is dependent on PI3-K and p38MAPK, but not on ER activation; E2 and IGF-I act synergistically on PAWR gene expression regulation

Introdução: Receptores hormonais modulam a resposta dos tecidos ao estímulo humoral. Evidências epidemiológicas mostram que as variações dos genes que regulam a biossíntese e metabolização dos receptores estrogênicos (RE) causam alterações no efeito dos estrógenos no tecido mamário, podendo explicar as variações individuais da densidade mamográfica. A alta densidade mamográfica é um fator de risco importante para o câncer de mama.Objetivo: Avaliar a associação das características clínicas e dos polimorfismos do gene do REalfa (XBal, Pvull e (GT)n) com a densidade mamográfica em mulheres após a menopausa. Casuística e métodos: Avaliaram-se prospectivamente 463 mulheres após a menopausa, sendo que 308 mulheres com mamas densas e 155 com mamas não densas, segundo os critérios do ACR-BIRADS (2003) por avaliação objetiva computadorizada, com idade de 45 a 60 anos, não usuárias de terapia hormonal nos últimos 12 meses e sem antecedentes pessoais de câncer de mama. Amostras de sangue periférico foram obtidas para extração de DNA e análise dos polimorfismos presente no íntron 1 e região promotora (Xbal, Pvull e (GT)n) do gene do RE?. Resutados: Dos fatores considerados de risco para o câncer de mama, houve associação com a densidade mamográfica: idade (p=0,005); medida da cintura abdominal (p=0,001); número de gravidezes (p=0,007); idade ao ter o 1º filho (p=0,035); antecedentes familiares (p=0,035); tempo decorrido deste a data da última menstruação (p=0,007) e índice de massa corpórea (p=0,022). Foi verificada diferença significante entre os grupos de mama densa e não densa para distribuição do genótipo do polimorfismo Pvull (p=0,024). Xbal (p=0,362) e, para o polimorfismo de repetição (GT)n (p=0,151) a associação não foi significante. Conclusão: Apenas o polimorfismo Pvull e os fatores clínicos: idade, cintura abdominal, número de gravidezes, idade ao ter o primeiro filho, antecedentes familiares de câncer de mama, tempo decorrido desde a data da última menstruação e o índice de massa corpórea mostraram-se associados com a densidade mamográfica após a menopausa / Introduction: The hormone receptors modulate the tissue response to hormonal stimulation. Epidemiological evidences show that the variations in genes that regulate the biosynthesis and metabolism of estrogen receptors (ER) cause changes in the effect of estrogen in breast tissue, which may explain individual variations of the mammographic density. High mammographic density is an important risk factor for the breast cancer. Objective: Evaluating the association of clinical characteristics and polymorphisms of the gene ERalfa [XbaI, PvuII and (GT)n] and mammographic density in postmenopausal women. Methods: It was prospectively evaluated 463 postmenopausal women - 308 women with high mammographic density (HMD) and 155 controls (to 50% density or less), according to the criteria of the ACR - BIRADS (2003 ) computed objective assessment , aged 45 to 60 , nonusers of hormone therapy in the past 12 months and with no personal history of breast cancer. Peripheral blood samples were obtained for DNA extraction and analysis of this polymorphism in intron 1 and promoter [XbaI, PvuII and (GT) n)] of the ERalfa gene region. Results: Among the risk factors for breast cancer there was an association with mammographic density: age (p = 0.005), waist circumference (p = 0.001), number of pregnancies (p = 0.007), age of first birth ( p = 0.035 ), family history (p = 0.035), time after menopause (p = 0.007 ) and body mass index (p = 0.022). Significant difference was observed between the groups of HMD and control only for the distribution of the polymorphism PvuII (p = 0.024 ). XbaI (p = 0.362 ) and for repeat polymorphism (GT) n (p = 0.151) the association was not significant. Conclusion: Only the PvuII polymorphism and clinical factors: age, waist circumference, number of pregnancies, age of first birth, family history of breast cancer, time after menopause and body mass index proved to be associated with high mammographic density after menopause

A idade normal para início da puberdade em meninas varia bastante, de 8 a 13 anos, e os genes envolvidos nesse controle são parcialmente conhecidos. Fatores ambientais, como alimentação e exposição a disruptores endócrinos, contribuem para essa variabilidade, de modo que genes modulados epigeneticamente podem justificar parte da complexidade desse processo. O termo epigenética se refere às modificações na expressão gênica que não são causadas por alterações na sequência do DNA. A metilação do DNA é o mecanismo epigenético mais bem estudado. Na última década surgiram evidências demonstrando a relação entre metilação do DNA e desenvolvimento puberal. Em fêmeas de roedores, a hipermetilação do DNA levou à puberdade precoce. Em humanos, a puberdade precoce central (PPC) familial causada por mutações nos genes MKRN3 e DLK1 é considerada um defeito do imprinting, fenômeno epigenético no qual apenas um dos alelos parentais é expresso, estando o outro metilado e inativo. Além disso, um conceito atual propõe que o início da puberdade requer a repressão epigenética de fatores inibidores do eixo gonadotrófico. Recentemente, genes zinc finger (ZNF) foram relacionados ao processo puberal, e muitos deles codificam repressores transcricionais. Neste trabalho, estudamos a metilação do DNA do sangue periférico de 10 pacientes do sexo feminino com PPC familial (casos índices) e 33 meninas com desenvolvimento puberal normal (15 pré-púberes e 18 púberes), usando a plataforma Human Methylation 450 BeadChip. Duas pacientes tinham PPC de causa genética (uma com mutação no MKRN3 e outra com deleção no DLK1) e oito tinham PPC idiopática, sem mutações identificadas pelo sequenciamento exômico global. Cento e vinte regiões diferencialmente metiladas foram identificadas entre as meninas saudáveis pré-púberes e púberes, estando 74% delas no cromossomo X. Apenas uma região mostrou-se hipometilada no grupo púbere e, de maneira importante, contém a região promotora do ZFP57, fator necessário para manutenção do imprinting. Uma vez que a hipermetilação nas regiões promotoras dos genes é relacionada à inibição transcricional, o achado de hipermetilação global do DNA na puberdade sugere que haja inibição de fatores inibidores do eixo gonadotrófico, o que resultaria no início do processo puberal. O receptor estrogênico destacou-se como um fator transcricional que se liga a sete genes diferencialmente metilados entre os controles pré-púberes e púberes. As pacientes com PPC apresentaram mais sítios CpG hipermetilados tanto na comparação com as meninas pré-púberes (81%) quanto púberes (89%). Há doze genes ZNF contendo sítios CpG hipermetilados na PPC. Não foram encontradas anormalidades de metilação nos genes MKRN3 e DLK1 nem em suas regiões regulatórias. Em conclusão, este estudo evidenciou hipermetilação global do DNA em meninas com puberdade normal e precoce, sugerindo que esse padrão é uma marca epigenética da puberdade. Pela primeira vez, mudanças no metiloma de pacientes com PPC foram descritas. Modificações na metilação de vários genes ZNF parecem compor a complexa rede de mecanismos que leva ao início da puberdade humana / Normal puberty initiation varies greatly among girls, from 8 to 13 years, and the genetic basis for its control is partially known. Environmental factors, such as nutrition and exposure to endocrine disruptors, contribute to this variance, and epigenetically modulated genes may justify some of the complexity observed in this process. Epigenetics refers to alterations in gene expression that are not caused by changes in DNA sequence itself. DNA methylation is the best studied epigenetic mechanism. In the last decade, evidence has emerged showing the relationship between DNA methylation and pubertal development. In female mice, DNA hypermethylation led to precocious puberty. In humans, familial central precocious puberty (CPP) caused by mutations in the MKRN3 and DLK1 genes is considered a disorder of imprinting, an epigenetic phenomenon in which only one parental allele is expressed, and the other allele is methylated and inactive. In addition, animal studies indicated that pubertal timing requires epigenetic repression of inhibitory factors of the gonadotrophic axis. Recently, zinc finger genes (ZNF) were related to pubertal development, many of which encode transcriptional repressors. In the present study, we analyzed the DNA methylation of peripheral blood samples from 10 female patients with familial CPP (index cases) and 33 girls with normal pubertal development (15 pre-pubertal and 18 pubertal), using the Human Methylation 450 BeadChip assay. Genetic CPP was diagnosed in two patients (one with a MKRN3 mutation and the other with a DLK1 deletion). The remaining eight cases with idiopathic CPP were previously evaluated by whole exome sequencing and no causative mutations were identified so far. We evidenced 120 differentially methylated regions between pre-pubertal and pubertal healthy girls, and 74% of them were located at the X chromosome. Only one genomic region was hypomethylated in the pubertal group. Of note, it contains the promoter region of ZFP57, an important factor for imprinting maintenance. As DNA hypermethylation in gene promoters is related to gene silencing, the finding of global DNA hypermethylation in puberty suggests inhibition of inhibitory factors of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis that results in puberty onset. Importantly, the estrogen receptor was identified as a transcriptional factor that binds to seven differentially methylated genes associated with pubertal process. Patients with CPP exhibited more hypermethylated CpG sites compared to both pre-pubertal (81%) and pubertal (89%) controls. Twelve ZNF genes were recognized as having hypermethylated CpG sites in CPP. The methylation analyses of MKRN3 and DLK1 genes showed no abnormalities. In conclusion, this study revealed a widespread DNA hypermethylation in girls with normal and precocious puberty, suggesting that this pattern can be an epigenetic signature of puberty. For the first time, changes in the methylome of patients with CPP were described. We highlight that alterations in methylation levels of several ZNF genes may impact the onset of human puberty

Introdução: A endometriose é uma doença ginecológica comum caracterizada pela presença de estroma e/ou glândula endometrial fora da cavidade uterina, e que não possui sua etiopatogenia bem estabelecida. A transição epitélio-mesênquima (TEM) é um processo que consiste em uma série de mudanças no fenótipo de células epiteliais que fazem com que estas células assumam características de células mesenquimais. Assim como observado na TEM, as células endometriais no contexto da endometriose apresentam capacidade migratória, invasibilidade e elevada resistência à apoptose. As moléculas de adesão têm adquirido crescente relevância na TEM, pois relacionam-se à perda de adesão célula-célula com o aumento da invasão e metástase. O objetivo deste estudo foi investigar a expressão de marcadores relacionados com a TEM na endometriose superficial, ovariana e profunda. Pacientes e Métodos: Foram selecionadas 103 mulheres que preenchiam os critérios de inclusão estabelecidos, constituindo 2 grupos de estudo independentes entre si: 18 mulheres com endometriose peritoneal, ovariana e profunda concomitantes; 85 mulheres com endometriose ovariana e/ou profunda, dividido em 44 mulheres com endometriose ovariana e 41 com endometriose intestinal. Através de reações de imunoistoquímica, a expressão proteica dos marcadores e-caderina, n-caderina, betacatenina, receptor de estrogênio e receptor de progesterona foram avaliados nos tecidos de interesse em cada grupo de estudo. Além dos locais de doença, as mulheres foram avaliadas quanto à relação com a fase do ciclo e à classificação histológica da doença. Resultados: As lesões de endometriose de ovário mostraram uma menor expressão de n-caderina em comparação às lesões de intestino e peritônio (p=0,032). O receptor de estrogênio e receptor de progesterona se mostraram significativamente menos expressos no componente epitelial da doença de ovário do que no epitélio da endometriose de peritônio e intestino (p=0,002; p=0,48). A expressão da n-caderina apresentou uma correlação direta com a expressão do receptor de estrogênio no estroma da endometriose de intestino (p=0,036). Conclusão: Estes resultados sugerem que a transição epitélio-mesênquima esteja envolvida na etiopatogenia da endometriose, demonstrando que a doença de ovário se comporta de maneira diferente da doença superficial e da doença infiltrativa profunda, sendo a n-caderina um importante fator envolvido neste processo possivelmente influenciada pela ação do estrogênio / Background: Endometriosis is a common gynecological disease defined as the presence of ectopic endometrial glands and stroma outside the uterine cavity, and its pathogenesis is not well established. The epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a process consisting of a series of changes in the phenotype of epithelial cells that make these cells assume the characteristics of mesenchymal cells. As observed in the EMT, endometrial cells in the context of endometriosis have the capacity of migration, invasiveness and high resistance to apoptosis. . The adhesion molecules have become progressively relevant in EMT, in view of the cell-to-cell adhesion loss, with increased invasion and metastasis. The goal of this study was to investigate the expression of markers related to EMT in superficial, ovarian and deep endometriosis. Patients and Methods: 103 women were selected who met the inclusion criteria, constituting two independent study groups: 18 women with peritoneal, ovarian and deep concomitant endometriosis, 85 women with ovarian and / or deep endometriosis, divided in 44 women with ovarian endometriosis and 41 with intestinal endometriosis. Through immunohistochemical reactions, the protein expression of e-cadherin, ncadherin, beta-catenin, estrogen receptor and progesterone receptor markers were evaluated in tissues of interest in each study group. In addition to the sites of the disease, menstrual phase and histological classification (well-differentiated, undifferentiated, mixed pattern and stromal) of the disease were recorded. Results: The ovarian endometrisis showed less n-cadherin marker than lesions of the peritoneum and bowel (p=0,032). Ovarian endometriosis also showed markedly decreased expression of estrogen and progesterone receptors in epithelial cells, compared with peritoneal and deep endometriosis (p=0,002; p=0,48). The expression of N-cadherin showed a direct correlation with estrogen receptor expression in the stroma of bowel endometriosis (p = 0.036). Conclusion: These results suggest that epithelial to mesenchymal transition involved in the pathogenesis of endometriosis, demonstrating that the ovary disease behaves differently disease than peritoneal and deep disease, so that the n-cadherin is an important factor involved in this process, possibly influenced by the action of estrogen

O câncer de mama corresponde a aproximadamente um quarto das neoplasias malignas em mulheres. A incidência do câncer de mama no Brasil é de cerca de 50.000 novos casos por ano, sendo considerado importante problema de saúde pública. HER2 e receptores hormonais (receptores de estrógeno e progesterona) são considerados os mais importantes marcadores prognósticos e preditivos em carcinoma de mama. A amplificação do gene HER2 ou a superexpressão da proteína HER2, que ocorre em cerca de 20 porcento dos carcinomas de mama, está associada a curso clínico mais agressivo e determina elegibilidade para terapia específica anti-HER2 com trastuzumabe. A terapia hormonal reduz em mais de 50 porcento o risco relativo de recorrência da doença em pacientes com tumores sensíveis a esse tratamento. Os testes de HER2 e receptores hormonais são partes essenciais da avaliação clínica das pacientes com carcinoma de mama; resultados precisos são fundamentais na identificação de pacientes que podem ser beneficiadas por terapias específicas. O presente estudo investigou a concordância nos resultados dos testes de HER2 e receptores hormonais determinados por imuno-histoquímica em 500 carcinomas invasivos de mama entre um laboratório referência e laboratórios locais de todas as regiões geográficas do Brasil. Os resultados demonstram baixa concordância geral (171/500 casos, 34,2 porcento) em relação aos resultados do teste de HER2 entre laboratórios locais e referência, o que pode estar relacionado ao baixo volume de testes de HER2 realizados, inexperiência com o sistema de escores de HER2 e/ou questões técnicas relacionadas à imuno-histoquímica nos laboratórios locais. A concordância nos resultados do teste de receptores de estrógeno e progesterona foi de 89,4 porcento (447/500 casos) e de 85,0 porcento (425/500 casos), respectivamente, entre laboratórios locais e referência. Padronização dos testes de HER2 e receptores hormonais com medidas de controle de qualidade rigorosas por laboratórios locais é fortemente recomendada para se evitar o tratamento inadequado de pacientes com câncer de mama / Breast cancer accounts for approximately one quarter of all cancers in females. The incidence of breast cancer in Brazil is about 50,000 new cases per year, and it is considered an important public health problem. HER2 and hormone receptors (estrogen and progesterone receptors) are considered the main prognostic and predictive markers for breast carcinoma. HER2 gene amplification or HER2 protein overexpression, detected in about 20 percent of breast carcinomas, predicts a more aggressive clinical course and determines eligibility for targeted therapy with trastuzumab. Hormonal therapy reduces the relative risk of recurrence by more than 50% in breast cancer patients with hormone-sensitive tumors. HER2 and hormone receptors testing has become an essential part of the clinical evaluation of all breast carcinoma patients, and accurate results are critical in identifying patients who may benefit from targeted therapy. The present study investigated the concordance in the results of HER2 and hormone receptors immunohistochemistry assays performed in 500 invasive breast carcinomas between a reference laboratory and local laboratories from all geographic regions of Brazil. Our results showed an overall poor concordance (171/500 cases, 34.2 percent) regarding HER2 results between local and reference laboratories, which may be related to the low-volume load of HER2 assays, inexperience with HER2 scoring system, and/or technical issues related to immunohistochemistry in local laboratories. The concordance of estrogen and progesterone receptors results was 89.4 percent (447/500 cases) and 85.0 percent (425/500 cases), respectively, between local and reference laboratories. Standardization of HER2 and hormone receptors testing with rigorous quality control measures by local laboratories is highly recommended in order to avoid erroneous treatment of breast cancer patients

Orientador: Lúcia Helena Simões da Costa Paiva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-11-07T13:42:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinheiro_Anderson_M.pdf: 3122120 bytes, checksum: dced5efa50ee11a7d5554366020908bb (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Introdução: A prevalência de obesidade tem aumentado em todo o mundo e hoje já representa um problema de saúde pública. Na população feminina, seu aumento ocorre principalmente nos anos próximos da transição para menopausa. O aumento de peso representa um risco para diversas comorbidades, dentre elas um importante fator de risco para patologia endometrial. A etiologia e a patogênese dos pólipos não estão completamente esclarecidas. Estuda-se se o desenvolvimento dos pólipos endometriais está diretamente relacionado à presença de receptores hormonais, além de estar relacionado a mecanismos envolvidos à proliferação e à apoptose celular. Objetivos: Avaliar a imunoexpressão dos receptores de estrógeno (RE), progesterona (RP), Cox-2, Ki67 e Bcl-2 em pólipos endometriais benignos na pré e pós-menopausa e associação com a obesidade. Materiais e métodos: Dentre 1050 mulheres submetidas à histeroscopia cirúrgica no Hospital da Mulher Prof. Dr. Aristodemo Pinotti - CAISM/UNICAMP, de janeiro de 1998 a dezembro de 2008, 800 foram casos de polipectomia endometrial confirmados com exame anatomopatológico. Deste total, foram excluídas as usuárias de Tamoxifeno, as que faziam uso de terapia hormonal e os casos de pólipos malignos ou pré-malignos. Obteve-se uma amostra de 515 pólipos endometriais benignos em mulheres na pré e pós-menopausa. Foram avaliadas as expressões de RE, RP, Bcl-2, Ki67 e Cox-2, através de imuno-histoquímica, segundo a porcentagem de células coradas, intensidade da coloração e escore final. Os escores finais de RE, RP, Bcl-2, Cox-2 variam de 0 a 8 e o de Ki67 de 0 a 3. A mediana dos escores finais de RE, RP, Bcl-2, Cox-2 e Ki67 no epitélio glandular e no estroma dos pólipos foi comparada entre mulheres obesas e não obesas na pré e pós-menopausa, utilizando os testes qui-quadrado, exato de Fisher ou não paramétrico de Mann-Whitney. Resultados: A mediana do escore final de receptores hormonais mostrou maior expressão de RP no estroma e no epitélio glandular das mulheres obesas na pós-menopausa, sem diferença em relação à expressão dos RE. Em mulheres na pré-menopausa não houve diferença na expressão de RE e RP entre obesas e não obesas. Nos pólipos endometriais de mulheres pós-menopausadas houve maior expressão de Cox-2 e Bcl-2 no epitélio glandular das mulheres obesas do que em relação às mulheres não obesas. Não houve diferenças em relação ao estroma endometrial. Na pré-menopausa, houve maior expressão de Bcl-2 apenas no epitélio glandular das mulheres obesas. Não houve diferenças na expressão de Ki67 entre obesas e não obesas tanto na pós-menopausa quanto na pré-menopausa. Conclusões: Os pólipos de mulheres obesas apresentam, na pós-menopausa, maior expressão de RP glandular e estromal, Cox-2 glandular e Bcl-2 glandular, sem diferenças na expressão de Ki67. Estes dados sugerem que sua etiopatogênese dos pólipos em obesas parece estar mais relacionada aos receptores de progesterona, à inibição da apoptose e aos mecanismos relacionados à inflamação celular / Abstract: Introduction: The prevalence of obesity has increased worldwide and represents a public health problem nowadays. The female population, considerably presents its increase in the coming years of the transition to menopause. Weight gaining represents a risk for various comorbidities, but among them all, it is an important risk factor for the endometrial pathology. The polyps etiology and pathogenesis have not been completely clarified so far. It has been studied whether the endometrial polyps development is directly related to the presence of hormone receptors, besides being associated with mechanisms involved in the proliferation and cellular apoptosis.Objectives: To evaluate the immunoexpression of estrogen and progesterone receptors, Ki67, Bcl-2 and Cox-2 in benign endometrial polyps in pre and postmenopausal women and their association with obesity. Methods: It was observed that among 1050 women who underwent hysteroscopic surgery at the "Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti" Women's Hospital-CAISM-UNICAMP from January 1998 to December 2008, 800 were confirmed with endometrial polyp anatomopathological diagnosis. Of this total amount, it was excluded tamoxifen users, those who used hormone therapy and cases of malignant or pre-malignant polyps. It was obtained a sample of 515 benign endometrial polyps in women before and after menopause. It was also assessed the expression of ER, PR, Bcl-2, COX-2 and Ki67 through immunohistochemistry according to stained cells percentage, staining intensity, and the final score. The ER, PR, Bcl-2, Cox-2 final score ranges from 0 to 8 and the Ki67 from 0 to 3). The ER, PR, Bcl-2, Cox-2 and Ki67 median final scores in the glandular epithelium and stroma of the polyps were compared among obese and nonobese women, in pre and postmenopausal condition, using the Chi-square Fisher's exact test or nonparametric Mann-Whitney test. Results: The hormonal receptors median final score has showed an increased expression of progesterone receptors in the stroma and glandular epithelium of postmenopausal obese women but there was no difference in expression of ER estrogen receptors. In premenopausal women, there was no difference in expression of ER and PR among obese and nonobese women. The endometrial polyps in postmenopausal women have showed a higher expression of Cox-2 and Bcl-2 in glandular epithelium in obese women rather than in nonobese women. There were no differences in the endometrial stroma. In premenopausal women, there was a higher expression of Bcl-2 only in the obese women glandular epithelium. There were no differences in Ki67 expression among obese and nonobese both postmenopausal and premenopausal women. Conclusions: Obese women polyps, in postmenopausal condition, have increased expression of glandular and stromal PR, Cox-2 and Bcl-2 glandular. However, there are no differences in the Ki67 expression . These data suggest that its etiopathogenesis in obese women polyps, seem to be related to progesterone receptors, apoptosis inhibition and also to mechanisms associated with cellular inflammation / Mestrado / Fisiopatologia Ginecológica / Mestre em Ciências da Saúde