La thérapie génique, appelée aussi génothérapie, est une stratégie thérapeutique utilisable en principe pour traiter de nombreuses maladies génétiques. Une variation récente de cette approche thérapeutique utilise le système bactérien CRISPR/Cas9 (The Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)) pour modifier les gènes défectueux des patients atteints d'une maladie héréditaire. Ce système a déjà démontré sa grande capacité à modifier l'ADN chromosomique in vitro ainsi que in vivo mais le problème majeur réside au niveau de la livraison des composantes du système CRISPR, soit la Cas9 et un ARN guide (ARNg). Malgré l'existence de plusieurs vecteurs de livraison viraux ou non viraux, les Adeno-associated virus (AAV) sont les virus les plus utilisés pour livrer des gènes thérapeutiques aux cellules in vitro et aux animaux et aux humains in vivo. Malheureusement, cet outil de livraison commence à démontrer ses limites à cause de sa capacité d'empaquetage très limitée (environ 4.8 kb) par rapport à d'autres outils de livraison et à cause de son immunogénicité. Ces limitations nous amènent à développer une nouvelle approche qui pourrait être plus puissante et beaucoup moins immunogène soit l'utilisation des vésicules extracellulaires produites par toutes les cellules de l'organisme et qui constituent un outil de communication cellulaire. Les travaux de ce mémoire démontrent qu'il est possible d'introduire la protéine Cas9 et plus spécifiquement la Cas9 du Streptococcus pyogène (SpCas9) dans les vésicules extracellulaires. L'utilisation de ces vésicules nous a permis de livrer la SpCas9 à des cellules in vitro et d'induire une édition génique. / Gene therapy, also called genotherapy, is a therapeutic strategy used to treat many genetic diseases. A recent variation of this technology uses the bacterial CRISPR/Cas9 system, The Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) to modify the defective genes of affected patients. This system has already demonstrated its great capacity to modify chromosomal DNA in vitro as well as in vivo, but the major problem lies in the delivery of the CRISPR components (i.e., the Cas9 gene or protein and its guide RNA (gRNA)). Despite the existence of several viral and non-viral delivery vectors, Adeno-associated viruses (AAV) are the most used vector to deliver therapeutic genes to cells in vitro and to animals and humans in vivo. Unfortunately, this delivery vector is starting to demonstrate its limitations due to its very limited packaging capacity (about 4.8 kb) compared to other delivery vectors and due also to its immunogenicity. These limitations lead us to develop a new approach that could be more powerful and much less immunogenic such as extracellular vesicles, which are produced by all cell types in the body, and which constitute an inter-cellular communication tool. Our work demonstrates that we are able to introduce the Cas9 protein, more specifically the Streptococcus pyogene Cas9 (SpCas9) into extracellular vesicles. These vesicles allowed us to deliver the SpCas9 to cells in vitro and to induce genetic editing.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Le marché des agents de livraison d'acides nucléiques est en pleine expansion et atteindra plus de cinq milliards de dollars en 2030. Ces agents, utilisés pour livrer de l'information génétique dans des cellules de mammifères, ont de nombreuses applications tant dans le domaine de la recherche fondamentale que thérapeutique. Parmi les différentes catégories d'agents de livraison, celle utilisant des vésicules extracellulaires (VE) pseudotypées par la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (VSVG) s'est révélée prometteuse dans les dernières années. En effet, en combinaison avec un polymère cationique, ces particules (VE-VSVG) se sont montrées capables de livrer des acides nucléiques de type ADN et ARN dans différents types cellulaires. Malheureusement, les procédés de production actuels des VE-VSVG, impliquant l'utilisation de cellules HEK 293, sont difficiles à adapter à l'échelle industrielle notamment à cause de l'utilisation de cellules productrices adhérentes, de la présence de sérum dans le milieu de culture et de procédés de purification incomplets. Par conséquent, l'objectif de ces travaux de recherche a été de développer un procédé de fabrication des VE-VSVG, pouvant être plus facilement transposé à l'échelle industrielle. Cette thèse se divise en quatre chapitres. Le chapitre 1 constitue une revue de la littérature et fait un état des lieux des différentes méthodes de livraison d'acides nucléiques, ainsi que des procédés de production et de purification de particules biologiques pseudotypées par la protéine VSVG, incluant les VE-VSVG. Les trois chapitres suivants présentent les résultats obtenus au cours de ce doctorat. Le chapitre 2 regroupe les résultats d'une première publication dédiée à la mise en place d'un procédé de production de VE-VSVG par transfection transitoire de cellules HEK 293, cultivées en suspension sans sérum, ainsi que d'une méthode de purification, composée d'une phase de concentration par ultracentrifugation et d'une étape de séparation par chromatographie d'affinité. Le chapitre 3 présente les résultats d'une future publication, consacrée à l'analyse de l'effet de la production de VE-VSVG sur l'expression génique des cellules HEK 293, ainsi qu'à l'amélioration des rendements de production de ces particules, grâce à l'identification de différents gènes prometteurs au cours de cette étude transcriptomique. Finalement, le chapitre 4 regroupe des résultats consacrés à l'évaluation d'autres plateformes de fabrication (production et purification) des VE-VSVG. En conclusion, les nouvelles données et les procédés développés dans le cadre de cette thèse permettent d'améliorer significativement la production et la purification de cet agent de livraison d'acides nucléiques prometteur, dans un contexte industriel. / The market of nucleic acid delivery agents is growing rapidly and will reach more than $5 billion by 2030. These agents, used to deliver genetic information into mammalian cells, have numerous applications in both basic and therapeutic research. Among the different classes of delivery agents, the one using extracellular vesicles (EV) pseudotyped with the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) has shown promises in recent years. In combination with a cationic polymer, these particles (EV-VSVG) have been shown to be able to deliver DNA and RNA in different cell types. Unfortunately, current EV-VSVG production processes, involving the use of HEK 293 cells, are difficult to adapt to industrial scale, notably due to the use of adherent producer cells, the presence of serum in the culture medium and incomplete purification procedures. Therefore, the goal of this thesis was to develop a manufacturing process for EV-VSVG that could facilitate the transposition to industrial scale. This thesis is divided into four chapters. Chapter 1 is a review of the literature and presents an overview of the nucleic acid delivery methods, as well as processes for the production and purification of VSVG-pseudotyped biological particles, including EV-VSVG. The following three chapters present the results obtained during this Ph.D. Chapter 2 covers the results of a first publication dedicated to the development of a production process of EV-VSVG by transient transfection of HEK 293 suspension cells grown in serum-free media, as well as a purification method, composed of a concentration step by centrifugation and a separation step by affinity chromatography. Chapter 3 presents the results of a future publication, dedicated to the analysis of the effect of VSVG protein production on HEK 293 cell gene expressions, as well as to the improvement of those particles production yields, through the identification of various promising genes during this transcriptomic study. Finally, Chapter 4 brings together results devoted to the evaluation of alternative manufacturing platforms (production and purification) for EV-VSVG. In conclusion, the new data and processes developed in this thesis significantly improve the production and purification of this promising nucleic acid delivery agent, in an industrial context.

Titre de l'écran-titre (visionné le 26 avril 2023) / La cornée, transparente, agit comme le hublot de notre œil et transmet la lumière jusqu'à la rétine où l'image est reconstituée. En raison de sa localisation anatomique superficielle, la cornée est particulièrement vulnérable aux traumatismes de toutes sortes. Certaines blessures graves des retards dans le traitement ou des traitements inadéquats peuvent mener à des déficiences visuelles importantes pouvant aller jusqu'à la cécité. La guérison des plaies cornéennes est un mécanisme complexe faisant intervenir plusieurs processus cellulaires dont la migration, la prolifération, la différenciation et la communication cellule-cellule. Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés plus particulièrement à deux composantes que nous considérons importantes dans la guérison des plaies cornéennes, soit 1) la communication intracellulaire via les intégrines et 2) la communication intercellulaire entre les différentes couches de la cornée (épithélium, stroma et endothélium) via les exosomes. Pour ce faire, nous avons utilisé deux principaux modèles d'étude, soit un modèle en culture monocouche de cellules cornéennes primaires et un modèle 3D de cornée humaine reconstruite par génie tissulaire. Grâce à des études antérieures menées au sein du laboratoire, nous avons identifié trois médiateurs signalétiques en aval de la signalisation par les intégrines qui jouent un rôle important dans le processus de cicatrisation de la cornée, soit CREB, Akt et WNK1. Nous avons donc poursuivi l'étude de ces médiateurs signalétiques d'une part en approfondissant les mécanismes par lequel WNK1 exerce ses effets sur la guérison des plaies cornéennes, et d'autre part, en évaluant l'efficacité des nanoparticules d'or (AuNPs) comme vecteurs de relargage pour deux agents pharmacologiques ciblant CREB et Akt afin d'accélérer la guérison des plaies in vitro et in vivo. Les travaux présentés au chapitre I de cette thèse ont permis de démontrer que : i) la réduction de l'activité et de l'expression d'un grand nombre de facteurs de transcription, et ii) la régulation du patron d'expression génique dans les cellules épithéliales de cornée humaine étaient deux mécanismes majeurs pouvant expliquer pourquoi l'inhibition de WNK1 entraine un retard dans la guérison des plaies cornéennes. Les travaux présentés au chapitre II ont, quant à eux, été utiles afin de démontrer l'innocuité et l'efficacité des AuNPs in vitro. Nous nous sommes ensuite intéressés aux exosomes de la cornée humaine et à leur impact dans la guérison des plaies cornéennes. Les travaux présentés au chapitre III de cette thèse ont permis de démontrer qu'il est possible d'enrichir et de caractériser les exosomes des trois types cellulaires de la cornée. De plus, ils ont permis de mettre en lumière le potentiel intéressant qu'ont les exosomes à accélérer la vitesse de guérison de l'épithélium cornéen. Collectivement, ces résultats auront contribué à une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la cicatrisation des plaies cornéennes. Ces études auront aussi permis de confirmer le rôle de WNK1 et des exosomes dans la guérison des plaies cornéennes, en plus d'illustrer le potentiel des AuNPs à être utilisées comme vecteurs de médicaments en ophtalmologie.

Les plaquettes sont très abondantes dans le sang où elles ont un rôle dans l'hémostase, l’inflammation et l’immunité. Activées, elles vont subir un changement de conformation qui permet la libération de nombreuses molécules effectrices ainsi que la production de vésicules extracellulaires (EV). Les EV sont formées par le bourgeonnement de la plaquette et emportent une partie de son contenu, incluant des acides nucléiques, des protéines de surface et des organelles. Hétérogène, le contenu diversifié des EV de plaquettes suggère qu’elles peuvent exercer de nombreuses fonctions. Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes d’abord intéressés à l’utilisation de l’algorithme SPADE couplé à la cytométrie en flux pour améliorer la détection d’EV et mieux apprécier leur hétérogénéité dans des concentrés plaquettaires (PC) servant à la transfusion. Nous avons aussi évalué l’utilisation de cette approche pour le développement de biomarqueurs dans le cadre de l’analyse d’EV dans le liquide synovial de patients arthritiques. Cette étude a révélé que l’utilisation d’algorithmes couplés à la cytométrie en flux tels que SPADE pourrait faciliter la compréhension des fonctions des EV et le développement de leur étude comme biomarqueurs. Nous nous sommes ensuite intéressés à une première sous-catégorie d’EV de plaquettes, celles qui contiennent des mitochondries (mito⁺EV). Nous avons émis l'hypothèse que ces mito⁺EV représentent un réservoir d'ADN mitochondrial, signal de danger (motifs moléculaires associés aux dommages, DAMP) reconnu et présent dans de nombreuses conditions inflammatoires, et qu’elles pourraient être impliquées dans les réactions transfusionnelles. Nous avons observé que les mito⁺EV étaient plus abondantes dans les PC impliqués dans des réactions transfusionnelles et qu’elles corrèlent significativement avec l’ADN mitochondrial. Comme la majorité de l’ADN mitochondrial est encapsulée dans des EV, cette étude suggère que les EV peuvent être un biomarqueur utile pour la prédiction du risque potentiel de réactions transfusionnelles, bien que des investigations soient iii nécessaires pour déterminer s'il existe un rôle pathogène causal du DAMP mitochondrial encapsulé dans les EV par opposition à l'ADN mitochondrial en solution. Nous nous sommes enfin intéressés à une seconde sous-catégorie d’EV de plaquettes, celles qui contiennent du protéasome. Les plaquettes contiennent un protéasome actif et présentent des antigènes par l'intermédiaire du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I) ce qui leur confère une fonction dans l’immunité adaptative. Étant donné qu’il n’a jamais été examiné si le protéasome est également transféré dans les EV de plaquettes auparavant, nous avons émis l'hypothèse qu'une machinerie fonctionnelle pour l'apprêtement et la présentation de l'antigène est transférée aux EV de plaquettes. En utilisant une combinaison d'analyses moléculaires et fonctionnelles, nous avons montré la présence d'un protéasome 20S actif dans diverses conditions où les plaquettes sont activées, ainsi que du CMH I et des molécules de coactivation des lymphocytes. L’incubation d’EV de plaquettes avec l’ovalbumine (OVA) a mis en évidence, par l'activation et la prolifération des lymphocytes T CD8⁺ spécifiques de l'antigène OVA, qu’elles peuvent apprêter et présenter efficacement l’antigène. Ces résultats suggèrent que les EV de plaquettes contribuent à l'immunité adaptative. Dans l’ensemble, nous avons montré que les EV de plaquettes ont un rôle dans l’inflammation et l’immunité avec leur contenu en mitochondries et en protéasome. Elles sont hétérogènes et peuvent être utilisées comme biomarqueurs dans différents contextes. / Platelets are very abundant in the blood where they play a role in hemostasis, inflammation and immunity. Activated, platelets will undergo a change of conformation which allows the release of numerous effector molecules as well as the production of extracellular vesicles (EVs). EVs are formed by the budding of the platelet and bring some of its contents, including nucleic acids, surface proteins and organelles. Heterogeneous, the diverse content of platelet EVs suggests that they can perform many functions. As part of this thesis, we first looked at the use of the SPADE algorithm coupled with flow cytometry to improve the detection of EVs and allow a better appreciation of their heterogeneity in platelet concentrates (PC) used for transfusion. We also evaluated the use of this approach for the development of biomarkers in the analysis of EVs in the synovial fluid of arthritis patients. This study revealed that the use of algorithms such as SPADE coupled with flow cytometry could facilitate the understanding of the functions of EVs and the development of their studies as biomarkers. We then looked at a first subcategory of platelet EV, those that contain mitochondria (mito⁺EVs). We hypothesized that these mito⁺EVs represent a reservoir of mitochondrial DNA, a damage-associated molecular pattern (DAMP) recognized and present in many inflammatory conditions, and that they could be involved in transfusion reactions. We observed that mito⁺EVs were more abundant in PCs involved in transfusion reactions and that they correlate significantly with mitochondrial DNA. As the majority of mitochondrial DNA is encapsulated in EVs, this study suggests that EVs may be a useful biomarker for predicting the potential risk of transfusion reactions, although further investigation is needed to determine if there is a pathogenic role of mitochondrial DAMP encapsulated in EVs as opposed to mitochondrial DNA in solution. We finally focused on a second subcategory of platelet EVs, those that contain proteasome. Platelets contain an active proteasome and present antigens through the major histocompatibility complex I (MHC I), which gives them an important function in adaptive immunity. Whether the proteasome is also transferred into the v platelet EVs has never been examined. We hypothesized that a functioning machinery for the processing and presentation of the antigen is transferred to the platelet EVs. Using a combination of molecular and functional assays, we have demonstrated the presence of an active 20 S proteasome under various conditions where platelets are activated, as well as MHC I and lymphocyte coactivation molecules. Demonstrated by activation and proliferation of ovalbumin (OVA) antigen specific CD8⁺ T lymphocytes, EVs from platelets incubated with OVA can efficiently prepare and present antigen. These results suggest that platelet EVs contribute to adaptive immunity. Overall, we have shown that platelet EVs have a role in inflammation and immunity with their mitochondria and proteasome content. They are heterogeneous and can be used as biomarkers in different contexts.

Les cellules dendritiques (CDs) sont connues comme étant les cellules sentinelles du système immunitaire. En effet, par leur capacité à capturer et à présenter les antigènes du soi ou étrangers, elles ont la propriété de moduler la réponse immunitaire innée et acquise. Toutefois, elles sont aussi connues pour libérer des vésicules dans le milieu extra cellulaire, dont entre autres les exosomes. Les exosomes sont des microvésicules de 30 - 100 nm jouant un rôle important au sein de l'intercommunication cellulaire. L'état d'activation des CDs influence drastiquement la composition et le rôle des exosomes. D'après des résultats préliminaires obtenus au sein du laboratoire, nous avons observé que les CDs ainsi que les lymphocytes T CD4⁺ (LTCD4) mis en contact avec le virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) pouvaient libérer de plus grandes quantités d'exosomes. De plus, une préparation virale dépourvue en exosomes augmente la viabilité des LTCD4. Enfin, une analyse protéomique d'échantillons purifiés d'exosomes sur gradient d'optiprep a révélé un contenu enrichi en protéines jouant un rôle important dans la survie cellulaire : telle que, les protéines Death-Associated-Protein 3 (DAP3) et Apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF-1). Ces deux protéines sont connues pour participer à la voie d'activation des caspases entraînant l'apoptose. De ce fait, la présence de ces protéines dans les exosomes pourrait contribuer à l'élimination des LTCD4. En utilisant l'immunobuvardage nous avons mis en place le protocole et confirmé les résultats de l'analyse protéomique dans les cellules HEK-293T. Cependant, seulement la protéine DAP3 est détectée dans les exosomes isolés à partir de CDs mises en contact avec du virus atténué. De plus, il s'avère qu'une infection productive est nécessaire pour déceler la protéine. Finalement, en utilisant des ARN antisens anti-DAP3, nous avons favorisé la diminution de l'expression de la protéine DAP3. Ainsi, nous pouvons moduler l'expression de la protéine dans les CDs afin de vérifier éventuellement son impact sur la viabilité des LTCD4. En conclusion, tous les outils sont mis en place afin d'assurer la suite du projet qui pourrait nous permettre de mieux comprendre la depletion des LTCD4 lors de la primo-infection.

L'acide lysophosphatidique (LPA) est un lipide bioactif qui est formé dans le sang par l'autotaxine. Le LPA est un médiateur important du système vasculaire, notamment par sa modulation de l'immunité et de l'inflammation. Plusieurs espèces moléculaires de LPA existent en fonction de leur acide gras. Les espèces moléculaires de LPA ont des affinités différentes pour les récepteurs aux LPA. Il en résulte que les espèces moléculaires de LPA peuvent avoir des effets différents, même si elles ciblent une même cellule. Parmi ses nombreux effets, le LPA induit l'activation des plaquettes et est le seul activateur endogène connu des globules rouges (GR). L'activation des plaquettes et des GR induit la libération de vésicules extracellulaires (EV). Les EV de plaquettes (PEV) et les EV de GR (REV) ont des effets pro-inflammatoires et sont des acteurs importants de la coagulation. Le LPA est connu pour promouvoir la pathophysiologie de la polyarthrite rhumatoïde (PAR), une maladie rhumatismale auto-immune systémique (MRAS). Les patients touchés par les MRAS comme la PAR ou le lupus érythémateux disséminé (LED) présentent une inflammation vasculaire importante et sont plus à même de développer des maladies cardiovasculaires comme l'athérosclérose. Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité chez ces patients. Le LPA et les EV promeuvent tous deux l'inflammation vasculaire et le développement de maladies cardiovasculaires. Ils sont également impliqués dans la coagulation. L'hypothèse à l'origine des travaux de cette thèse est que le LPA via l'activation des GR peut promouvoir l'inflammation vasculaire et participer aux dommages vasculaires associés aux MRAS comme l'athérosclérose et la thrombose. Dans cette thèse, nous avons d'abord étudié l'action des principales espèces moléculaires de LPA trouvées dans le plasma sur les GR. Par des approches de cytométrie en flux à haute sensibilité, nous avons montré que certaines espèces moléculaires de LPA induisent l'exposition de la phosphatidylsérine (PS) par les GR et la libération de REV PS⁻ et PS⁺ similaire à celles trouvées dans le plasma de patients LED. Cependant, d'autres espèces moléculaires de LPA inhibent l'activation des GR. J'ai établi les principales voies de signalisation impliquées dans l'activation et l'inhibition des GR. De plus, nous avons mis en évidence que, même si elle est possible dans le plasma, l'activation des GR par le LPA dépend de son environnement. Notre deuxième focus était centré les potentielles associations entre l'autotaxine et les EV avec le risque de thrombose et le développement de l'athérosclérose chez des patients LED. Nous avons montré que l'autotaxine n'était pas augmentée ni associée avec l'activité de la maladie chez les patients LED. Et bien que les patients LED présentaient des quantités très importantes de PEV et de REV, elles n'étaient pas associées avec l'activité de la maladie. Cependant, les quantités de REV PS⁺ sont associées avec un risque plus élevé de thrombose chez les patients SLE. De plus, le groupe de patients avec des quantités élevées de REV PS⁺ présentait également des concentration d'autotaxine plasmatique plus élevées. Le travail présenté dans cette thèse approfondit la compréhension de l'effet du LPA sur l'activation des GR et leur libération de REV. Il met également en évidence l'implication potentielle du LPA et des REV dans les thromboses associées aux patients MRAS. / The lysophosphatidic acid (LPA) is a bioactive lipid which is formed by autotaxin in blood. LPA is an important mediator in the vascular system mainly through its modulation of immunity and inflammation. Several LPA species exist depending on the fatty acid. LPA species varies in their affinity for the LPA receptors, which means that LPA species may have different effects, even if they target a same cell. Among its numerous biological actions, LPA induces platelet activation and is the only known endogenous activator of red blood cells (RBCs). Both platelet and RBC activation lead to the liberation of extracellular vesicles (EVs). Platelet EVs (PEVs) and RBC EVs (REVs) are the two main populations of EVs found in blood. Both PEVs and REVs have been described as pro-inflammatory mediators and are important actors of the coagulation. LPA is a known promoter of the pathophysiology of rheumatoid arthritis (RA), a systemic autoimmune rheumatic disease (SARD). Patients affected by SARDs such as RA and systemic lupus erythematosus (SLE) present high vascular inflammation and are more prone to develop cardiovascular diseases for instance atherosclerosis. Cardiovascular diseases are the first cause of mortality for these patients. LPA and EVs are two mediators which promotes vascular inflammation and the development of cardiovascular diseases. Also, both are pro-coagulant factors. The hypothesis driving this thesis is that LPA through the activation of RBCs promotes vascular inflammation and participate to the vascular damages associated with MRAS patients such as atherosclerosis and thrombosis. In this thesis, we first focused our interest to study the action of major blood LPA species on RBCs. Through high sensitivity flow cytometry, we found that some LPA species induces the exposition of phosphatidylserine (PS) by RBCs and the liberation of PS⁻ and PS⁺ REVs similar to those found in the plasma of LED patients. However, other species were inhibitors of RBC activation. We have established the main LPA's signaling pathways involved in the activation and inhibition as well that even if it is possible in the plasma, RBC activation by LPA is affected by the environment. Our second focus was on the potential associations of autotaxin and EVs with thrombotic risk and the development of atherosclerosis in SLE patients. We found that autotaxin were not elevated in SLE patients nor associated with the disease activity. Even though, SLE patients presented high quantities of PEVs and REVs, they were not associated with the disease activity. However, we showed that the quantities of PS⁺ REVs were associated with a higher risk of thrombosis in SLE patients. Moreover, the group of patients with high quantities of PS⁺ REVs also presented higher quantities of plasmatic autotaxin. The work presented in this thesis brings a better understanding of LPA impact on RBC activation and REV liberation. It also highlights the potential implication of both LPA and REVs in thrombosis associated with SARD patients.

Les fibroblastes associés au cancer (CAF) constituent le type cellulaire le plus abondant du microenvironnement tumoral. In vivo, les tumeurs les plus agressives corrèlent avec un enrichissement en CAF et une matrice extracellulaire plus dense. En effet, les interactions dynamiques et réciproques entre les cellules cancéreuses et les CAF favoriseraient la progression tumorale. Cependant, les molécules impliquées dans ces interactions ainsi que leurs effets sur le devenir de la tumeur et sur le remodelage du microenvironnement sont mal connus. Or, mieux définir et comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans cette interaction est crucial afin de pouvoir développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Ainsi, nous avons étudié les interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales dans le microenvironnement du cancer de la vessie. Les exosomes sont une classe de vésicules extracellulaires d’origine endocytique de 30 à 200 nm de diamètre. Ils sont sécrétés par tous les types cellulaires et constituent, entre autres, un moyen de communication intercellulaire en transportant protéines, lipides et ARN d’une cellule à l’autre. Les cellules cancéreuses sécrètent une grande quantité d’exosomes et ces derniers joueraient un rôle dans la modulation du microenvironnement tumoral, notamment en activant les fibroblastes sains en CAF. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis de démontrer que les exosomes sécrétés par les cellules cancéreuses sont internalisés par les fibroblastes vésicaux sains et qu’ils favorisent la prolifération de ces derniers. De plus, les exosomes dérivés de cellules cancéreuses activent les fibroblastes sains en CAF grâce au TGFβ qu’ils contiennent. La neutralisation du TGFβ par des anticorps spécifiques confirme ces résultats. Une fois activés, les CAF augmentent la prolifération, la migration et l’invasion des cellules cancéreuses via une sécrétion soutenue de la molécule IL-6. D’ailleurs, le blocage de la voie de signalisation de l’IL-6 renverse les effets observés sur les cellules cancéreuses. Nous avons également démontré que les CAF diminuent la sensibilité des cellules cancéreuses à la mitomycine C. Enfin, les CAF remodèlent la matrice extracellulaire du microenvironnement tumoral notamment par une sécrétion accrue des protéines oncofétales ténascine C et EDA-fibronectine, ainsi qu’une activité LOX-1 et MMP augmentée. Par ailleurs, la matrice extracellulaire générée par les CAF favorise la transition épithéliomésenchymateuse des cellules urothéliales saines en inhibant le marqueur épithelial Ecadhérine au profit du marqueur mésenchymateux N-cadhérine. Ainsi, une communication étroite et complexe entre les cellules cancéreuses et les CAF favorise la progression tumorale. En secrétant des facteurs solubles à activité protumorale et des protéines de la matrice extracellulaire, les CAF favorisent la prolifération, l’invasion et la chimiorésistance des cellules cancéreuses. Globalement, nos travaux soutiennent l'idée que l’inhibition de la transdifférenciation des fibroblastes sains en CAF est une cible thérapeutique de choix dans le développement de nouveaux anticancéreux. / Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most abundant cell type of the tumor microenvironment. In vivo, aggressive tumors correlate with an enrichment of CAFs and a denser extracellular matrix. Indeed, the dynamic and reciprocal interactions between tumor cells and CAFs promote tumor progression. However, the molecules involved in these interactions, as well as their effects on the fate of the tumor and the remodeling of the microenvironment are poorly known. However, better define and understand the molecular mechanisms of this interaction is crucial to develop new treatments. Thus, we studied interactions between tumor cells and stromal cells in the microenvironment of bladder cancer. Exosomes are a class of extracellular vesicles with of endocytic origin measuring 30 to 200 nm in diameter. They are secreted by all types of cells and constitute, among others, a means of intercellular communication by transporting proteins, lipids and RNA from one cell to another. Cancer cells secrete a large amount of exosomes and these exert a role in the modulation of the tumor microenvironment, notably by activating healthy fibroblasts in CAFs. The work presented in this thesis has demonstrated that the exosomes secreted by cancer cells are internalized by vesical fibroblasts and promote their proliferation. In addition, exosomes derived from cancer cells activate healthy fibroblasts in CAFs using the TGFβ that they transport. The neutralization of TGFβ by specific antibodies confirms these results. Once activated, CAFs increase the proliferation, migration and invasion of cancer cells via a sustained secretion of the IL-6 molecule. Moreover, the blocking the IL-6 signaling pathway reverses the effects observed in cancer cells. We have also demonstrated that CAFs decrease the sensitivity of cancer cells to mitomycin C. Finally, CAFs remodel the extracellular matrix of the tumor microenvironment notably by an increased secretion of tenascin C and EDA-fibronectin oncofetal proteins, as well as a LOX-1 and MMP increased activity. In addition, the extracellular matrix generated by CAFs promotes the epithelio-mesenchymal transition of healthy urothelial cells by inhibiting the epithelial marker E-cadherin in favor of the mesenchymal marker N-cadherin. Thus, a close and complex communication between the cancer cells and the CAFs increases tumor progression. By secreting soluble factors with a pro-tumor activity and extracellular matrix proteins, CAFs promote the proliferation, invasion and chemoresistance of cancer cells. Overall, our work supports the idea that the inhibition of the transdifferentiation of healthy fibroblasts into CAFs is a therapeutic target of choice in the development of novel anticancer drugs.

Le muscle squelettique est le plus grand organe du corps humain. Il est maintenant admis que c'est un organe sécréteur de cytokines qui jouent un rôle important comme signaux paracrines et endocrines. Récemment, il a été démontré que le muscle squelettique sécrète aussi des nanovesicules appelées « exosomes ». Dans ce contexte, notre équipe a démontré que les exosomes sécrétés par les cellules musculaires avaient un effet paracrine et étaient impliqués dans la prolifération et la différenciation musculaire. Comme il est admis que la masse musculaire est affectée par différentes situations physiologiques (la nutrition et l'activité physique) ou pathologiques (obésité, le diabète et la sarcopénie), nous nous sommes demandés, dans un premier temps, quel était le rôle des exosomes dans la régulation de la masse musculaire et s'ils pouvaient modifier les dialogues muscle-organes insulino-sensibles au cours d'un régime riche en acide gras saturé. Ces travaux ont donné lieu à 2 articles publiés dans « Diabetologia ». Dans ces deux articles, nous avons démontré dans un modèle de souris que le muscle, en situation d'insulino-résistance due à un régime riche en acide gras saturé, sécrète plus d'exosomes. De plus, ces exosomes ont une composition modifiée en acides gras et en microARN. In vitro, cette nouvelle population d'exosomes affectent la prolifération des cellules receveuses i.e. ; cellules musculaires et cellules béta pancréatiques, in vitro, en régulant les gènes du cycle cellulaire et de différenciation dans les cellules musculaires receveuses et le gène pitx2 dans les cellules beta. Ces travaux suggèrent que les exosomes sécrétés par le muscle squelettique, perturbent l'homéostasie musculaire et pancréatique durant un régime riche en acide gras saturé.Dans un deuxième temps, nous avons réalisé une étude technique afin de déterminer les conditions optimales pour isoler la quantité maximale des exosomes, relarguées par les cellules musculaires. Cette étude, publiée dans « BMC Biotechnology », a démontré que cultiver des cellules musculaires dans un milieu sans exosomes de sérum de veau ou de cheval, ralentie leur prolifération et par conséquent leur différenciation. Ceci suggère que les exosomes des sérums des milieux de culture participent à la croissance des cellules musculaires. De façon intéressante, ce résultat mime le cross-talk entre myoblastes et myotubes précédemment démontré au laboratoire et laisse suggérer un rôle plus général des exosomes circulant dans les processus d'hypertrophie, hyperplasie mis en place durant le développement. De plus, ces résultats indiquent que les exosomes pourraient participer aux cross-talks entre espèces / Skeletal muscle (SkM) is considered as a secretory organ, it secretes cytokines named myokines that can act either locally (autocrine) or systemically (endocrine). In addition to myokines, SkM secretes nanovesicles named exosomes (SkM-Exos). Previous work from the laboratory have demonstrated that myotube- and myoblastderived exosomes were involved in the process of myogenesis and could transfer their content to target cells. In this work, we determined whether SkM-Exos wereinvolved in lipid-induced insulin resistance and participate in organ cross-talk during the development of obesity. Firstly, we determined the effect of high fat diet on SkM-Exo release and on their miRNA and lipid composition. In addition, we determined the biological effect of these exosomes on skeletal muscle and pancreatic recipient cells. Results are published in 2 separate papers in “Diabetologia”. In these two studies, exosomes were collected from quadriceps muscles of C57Bl/6 mice fed for 16 weeks with either a standard chow diet (SD) or an SD enriched with 20% palm oil (HP) or from C2C12 cells exposed to 0.5 mmol/l palmitate (EXO-Post Palm), oleate (EXO-Post Oleate) or BSA (EXO-Post BSA). We treated skeletal muscle cells or β pancreatic cells with these muscle-released exosomes. We found that exosomes from HP fed mice, EXO-Post Palm and EXO-Post Oleate induced myoblast and β pancreatic islet proliferation and modified the expressions of genes involved in cell cycle and muscle differentiation but did not alter insulin-induced Akt phosphorylation in muscle cells. Lipidomic analyses showed that exosomes from palmitate-treated cells were enriched in palmitate, indicating that exosomes likely transfer the deleterious effect of palm oil between muscle cells by transferring lipids. Also, we demonstrated that these exosomes likely transfer their miRNA contents resulting in beta pancreatic islet hypertrophy during type 2 diabetes mellitus (T2D). Moreover, muscle exosomes were incorporated into various tissues in vivo, including the pancreas and liver, suggesting that SkM could transfer specific signals through the exosomal route to key metabolic tissues in vivo. So, SkM derived exosomes altered muscle and β pancreatic cell homeostasis during lipid induced insulin resistant diet. Secondly, another work was conducted in order to answer to a technical problem about optimal conditions needed to obtain, in vitro, the highest concentration of exosomes from muscle cells when grown in a depleted-exosome medium. This work was published in “BMC Biotechnology”. In this study, we found that depleting culture media from exosomes affected skeletal muscle cell proliferation. In addition, removal of serum-EVs from culture medium affects gene and miRNA expressions and likely the proteome of the cells. Interestingly, our data showed that we can recapitulate the cross-talk between myoblast and myotubes previously demonstrated in the laboratory by using exosomes from serum as well. Indeed, serum derived-exosomes, like myotube derived-exosomes, can affect proliferation of myoblasts and induce their entrance in the differentiation process. This result implies that bovine exosomes can transfer specific signals to cells from unrelated species (i.e. ; to mice, rats and human) and thus that part of exosome composition is evolutionarily conserved between these lower and higher order mammalian species. Generally speaking, these results suggest that exosomes in body fluids could have an unsuspected function during embryogenesis and in the regulation of cellular adaptations that lead to hypertrophy, hyperplasia and metaplasia

Introduction:Un des problèmes du cancer du Pancréas (CP) est le temps de latence entre la suspicion du CP et la mise en place des traitements. Les méthodes de biopsie liquide pourraient accélérer la mise en évidence d’éléments tumoraux et le diagnostic.Objectif :L’objectif principal de l’étude était de comparer la performance diagnostique de plusieurs techniques de biopsie liquide chez des patients atteint d’un CP résécable d’emblé. L’objectif secondaire était la corrélation avec le taux de récidive post-opératoire.Méthodes:Tout d'abord, nous avons testé 2 méthodes d'enrichissement CTC pour estimer la sensibilité de la détection CTC avec des expériences de cell-spiking de deux lignées de cellules tumorales pancréatiques dans des échantillons de sang de 24 volontaires sains en utilisant la méthode en gradient de densité OncoQuick® et la méthode de sélection négative RosetteSep™. De plus, les mutations KRAS ont été quantifiées dans l'ADN génomique de cellules purifiées par digital droplet PCR (dd-PCR) avec des amorces spécifiques des allèles.Nous avons conçu un essai clinique prospectif (NCT03032913) visant à détecter les cellules tumorales circulantes (CTC), l’ADN tumoral circulant (ADNct) et les onco-exosomes chez les patients atteint de CP et chez les patients d’un groupe témoin. Pour les CTCs : enrichissement et détection de CTCs par la méthode CellSearch©, méthode d’enrichissement de CTCs RosetteSep® et OncoQuick® puis quantification de l’ADN tumoral par dd-PCR. Les exosomes ont été isolés puis caractérisés avec le taux d’expression de Glypican-1. Tous les patients de l’étude ont eu un prélèvement de sang périphérique, les patients du groupe CP ont eu un prélèvement de sang portal peropératoire.Résultats:La sensibilité analytique était de 100 % pour OncoQuick®, quelle que soit la lignée cellulaire, et se situait entre 70 et 100 % pour RosetteSep™. Le taux moyen de récupération des cellules était de 56±23% pour OncoQuick® contre 39±27% pour RosetteSep™ (p<0,001). Les cellules tumorales de la population de cellules sanguines enrichies ont été détectées par dd-PCR après enrichissement par RosetteSep™ et OncoQuick® La détection des allèles K-RAS mutants par ddPCR après enrichissement de RosetteSepTM était 3 à 4 fois plus sensible qu'après OncoQuick®. Ainsi, RosetteSep™ est plus fiable en termes d'efficacité de récupération et de détection des mutants KRAS que OncoQuick®.De février à novembre 2017, 22 patients atteints de CP résécable et 28 patients témoins ont été inclus. Tous les patients ont été détectés positifs par au moins une méthode. Les CTCs ont été détectées chez 9 patients avec la méthode cellsearch (70% dans le sang portal exclusif) et 13 avec la méthode Rosettesep (60%). Les onco-exosomes ont été détecté chez 14 patients sur 22. L’ADNct n’a été détecté que chez deux patients métastatiques. La détection combinée des CTCs et des onco-exosomes était significativement corrélée à la survie sans récidive.Conclusion:Cette étude suggère que la biopsie liquide combinée peut être un outil prometteur à fois diagnostique et pronostique dans le CP à un stade précoce. / Introduction:One of the problems of pancreatic ductal adenocarcinoma (PC) is the latency time between the suspicion of PC and the initiation of treatments, especially neo-adjuvants that require histological evidence. Liquid biopsy methods could be a companion test for diagnosis.Objective :The main objective of the study was to compare the diagnostic performance of several liquid biopsy techniques in patients with resectable pancreatic without neo-adjuvant therapy cancer. The secondary objective was the correlation between the quantification of liquid biopsy parameters and clinic-pathologic features.Methods:First, we tested 2 CTC enrichment methods to estimate the sensitivity of CTC detection with cell spiking experiments of two pancreatic tumour cell lines in blood samples from 24 healthy volunteers using the onco-specific density gradient OncoQuick® and the negative selection enrichment method RosetteSep™. Additionally, KRAS mutations were quantified in genomic DNA of purified cells by digital droplet Q-PCR (dd-PCR) with allele specific primers.We designed a prospective clinical trial (PANC-CTC# NCT03032913) to detect circulating tumour cells (CTC), circulating tumour DNA (ADNct) and onco-exosomes in patients with pancreatic cancer and in patients in a control group using different methods. For CTCs, it was the enrichment and detection of CTCs by the CellSearch© method (reference method), the RosetteSep® and OncoQuick® CTC enrichment method and the quantification of tumor DNA by dd-PCR. Exosomes were isolated and characterized with the expression rate of Glypican-1. All patients in the study had a peripheral blood sample, patients in the PDAC group had a portal blood sample during surgery.Results:Analytical sensitivity was 100% for OncoQuick®, regardless of the cell line, and ranged between 70 and 100% for RosetteSep™. Mean recovery rate of cells was 56±23% for OncoQuick® versus 39±27% for RosetteSep™ (p<0.001). Molecular detection of mutant K-RAS alleles by ddPCR after RosetteSepTM enrichment was 3- to 4-fold more sensitive than after OncoQuick®. Thus, RosetteSep™ is more reliable in terms of recovery efficiency and KRAS mutant detection than OncoQuick®.From February to November 2017, 22 patients with resectable pancreatic cancer and 28 control patients were included. All patients were positive by at least one method. CTCs were detected in 9 patients with the cellsearch method (70% in the exclusive portal blood) and 13 with the Rosettesep method (59%), Onco-exosomes were detected in 14 out of 22(64%) patients in peripheral and/or portal blood. DNAct was detected in only two metastatic patients. The combined detection of CTCs with cellsearch and onco-exosomes was significantly correlated with progression free survival and overall survival when CTC cluster were found.Conclusion: This study suggests that combined liquid biopsy can be a promising tool for both diagnosis and prognosis in early pancreatic cancer.

Les vésicules extracellulaires (EVs) apparaissent depuis une dizaine d'années comme de nouveaux biomarqueurs à fort potentiel pour des applications de biopsie liquide. En effet, les EVs portent la signature de leurs cellules émettrices, par le transport de matériel génétique et protéique cellulaire, qui peut être exploité comme outil de diagnostic précoce. L’une des principales limitations actuelles à l'utilisation clinique des EVs est la difficulté à extraire ces nano-objets à partir de biofluides complexes et à standardiser les protocoles de préparation d'échantillon. En effet, de nouvelles technologies sont requises pour effectuer un isolement efficace, bas coût et rapide de sous-populations d'EVs, sans altérer leur intégrité et à partir de faibles volumes d'échantillon. La technique microfluidique de Déplacement Latéral Déterministe (DLD) apparaît comme une des technologies prometteuses pour atteindre ces performances grâce à une purification passive et sans marquage. Les dispositifs de DLD mettent en oeuvre un réseau de piliers générant un tri en taille des particules, et dont les paramètres géométriques permettent de contrôler précisément le diamètre de séparation. Parmi les nombreuses applications de cette technologie dans le secteur biomédical, aucune ne permet pour le moment de réaliser l'extraction complète d'EVs directement à partir du biofluide d'intérêt, sans étapes de purification intermédiaires par centrifugation par exemple. Dans cette perspective, nos développements technologiques ont pour but d'améliorer la fiablilité, l'efficacité et l'intégration des dispositifs de DLD. A partir d'études numériques et expérimentales, nous proposons ici de nouveaux modèles pour anticiper au mieux le comportement des particules lors de la conception de réseaux de DLD. Par ailleurs, dans une approche orientée système, nous proposons également un packaging fluidique des dispositifs de DLD. Plusieurs étapes de tri étant généralement requises pour la purification d’échantillons biologiques, nos développements portent également sur la façon d’interconnecter ces modules au sein d'une configuration en série. Deux applications biologiques sont adressées et démontrent la versatilité de la technologie de DLD : l'isolement de bactéries E. coli à partir de prélèvements sanguins humains - en vue du diagnostic du sepsis - et l'extraction d'EVs dans des milieux de culture cellulaires - avec en perspective la détection d'EVs spécifiques par biopsie liquide. L'étape de préparation d'échantillon ne peut être dissociée de l'étape de caractérisation. C'est pourquoi, l'isolement des EVs devra dans un second temps être couplé à leur analyse au sein d'un dispositif intégré, portable et autonome, ce qui pourrait ouvrir de nouvelles perspectives vers l'application clinique des recherches actuelles sur les EVs. / Over the past decades, Extracellular Vesicles (EVs) have demonstrated strong potential as new biomarkers for liquid biopsy. Indeed, since EVs are fingerprints of parent cells, they can be exploited as early diagnostic tools. However, owing to their small size and high heterogeneity, EVs are challenging to extract from biofluids. In particular, reproducible and standardized protocols are required to perform fast, efficient, and cost-effective preparation of undamaged EV subpopulations from limited sample volumes. Deterministic Lateral Displacement (DLD) appears to be a promising microfluidic technology for this preparation by means of passive and label-free separation. DLD performs size-based separation of particles around a critical diameter that can be fine-tuned according to design parameters in an array of micropillars. Across the numerous biotechnological applications of DLD, none has yet successfully performed the complete extraction of EVs from unprocessed biofluids. This is the underlying motivation of this thesis, which outlines technological enhancements that make DLD separation more predictable, efficient, and easy-to-integrate. Based on both numerical and experimental developments, predictive models are proposed in order to anticipate particle behavior and to help in the design of efficient DLD devices. In addition to the optimization of single DLD devices, this thesis also addresses the issue of system integration. An innovative approach of serial connection between DLD modules is proposed to address the sequential sorting of particles from a complex biofluid and ensure that there is no loss of function of individual DLD devices when operated alone or in series. Two biological applications illustrate the potential of DLD-based sample preparation systems: the isolation of E. coli bacteria from human blood samples for sepsis diagnostics and the extraction of EVs from cell culture media with the perspective of liquid biopsy applications. And as sample preparation cannot be dissociated from detection or characterization, this thesis moreover highlights the potential integration of DLD in an all-in-one microfluidic device for both sample preparation and analysis of extracted EVs. Such a portable and autonomous device could overcome some of the current limitations with regard to the clinical use of EVs.