Orientadora: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Felipe Perecin / Banca: Lindsay Unno Gimenes / Banca: Mayra Elena Ortiz D'Avila Assumpção / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Resumo: Na bovinocultura de corte, a alimentação corresponde ao maior custo associado à produção de carne. A avaliação do consumo alimentar residual (CAR) tem sido uma ferramenta importante para direcionar a seleção de bovinos de corte e otimizar economicamente esta atividade. No entanto, alguns estudos mostram uma diminuição da motilidade, do perímetro escrotal, uma menor taxa de prenhez e parto em animais eficientes para CAR. Uma estratégia para solucionar tais problemas é a suplementação ácidos graxos poliinsaturados (AGPs) que não apenas aumentam a densidade energética da dieta, mas também atuam na melhoria do desempenho reprodutivo. No entanto, o ideal é que tais características de seleção para CAR e efeito da suplementação com AGPs sejam passadas à prole, assim o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito paterno da seleção para consumo alimentar residual (CAR) e da suplementação dos touros com AGs para a PIVE, o acúmulo de lipídio embrionário e a expressão de genes. Animais classificados em baixo CAR e alto CAR foram utilizados no experimento. O delineamento experimental obedeceu a um esquema fatorial 2 x 2 (CAR x Suplementação), a análise estatística foi realizada pelo programa JPM (versão 5.0.1, SAS Institute). Após a amostragem, os animais foram separados aleatoriamente em dois grupos: com suplementação de AGs protegido e com suplementação controle (sem AGs protegido). O experimento foi composto por quatro tratamentos, o sêmen dos touros foi congelado (4 tratamentos), sen... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In beef cattle, feed corresponds to the highest cost associated with meat production. The evaluation of the selection for residual feed intake (RFI) has been an important tool to direct the selection of beef cattle and economically optimize this activity. However, some studies show a decrease in motility, scrotal perimeter, a lower pregnancy and calving rate in efficient animals for RFI. One strategy to solve such problems is polyunsaturated fatty acid (PUFA) supplementation that not only increases the energy density of the diet, but also improves reproductive performance. However, the ideal is that these characteristics of selection for RFI and effect of the supplementation with PUFA are passed to offspring, so the aim of this work was to evaluate the paternal effect of selection for residual feed intake and supplementation of bulls with fatty acids for in vitro produced embryos (IVPE), accumulation of embryonic lipid and gene expression. Animals classified under low RFI and high RFI were used in the experiment. The experimental design was based on a 2 x 2 factorial scheme (RFI x Supplementation), the statistical analysis was performed by the JPM program (version 5.0.1, SAS Institute). The animals were randomly divided into two groups: with protected fatty acids supplementation and with control supplementation (without protected fatty acids). The experiment was composed of four treatments, the semen of the bulls was frozen (4 treatments), 6 animals were supplemented with pro... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A terapia celular baseada na utilização de células-tronco mesenquimais (CTMs) tem sido considerada uma estratégia promissora para regenerar o tecido ósseo. Apesar da medula óssea constituir a principal fonte de CTMs, o tecido adiposo tem sido investigado como uma fonte alternativa, devido a maior disponibilidade e facilidade de obtenção dessas células. Porém, as CTMs obtidas de fontes distintas podem exibir diferenças a nível molecular, que ainda não estão esclarecidas pela literatura e que poderiam influenciar o potencial regenerativo dessas células. Assim sendo, o objetivo desse estudo foi comparar os perfis de expressão gênica em larga escala de CTMs isoladas da medula óssea (CTMs-MO) e do tecido adiposo (CTMs-TA) de ratos, e de osteoblastos (OBs) diferenciados a partir dessas células (OBs-MO e OBs-TA, respectivamente). As células foram cultivadas em meio de crescimento para manutenção das características de CTMs ou em meio osteogênico para indução da diferenciação osteoblástica. O RNA total das células foi extraído e a análise genômica foi realizada pela tecnologia de microarray utilizando lâminas Agilent 4x44k. Os perfis de expressão gênica foram analisados pelo software GeneSpring 14.8 GX, considerando o tecido de origem (CTMs-TA vs CTMsMO e OBs-TA vs OBs-MO) e a diferenciação celular (OBs-MO vs CTMs-MO e OBs-TA vs CTMs-TA) como parâmetros de comparação entre os grupos (fold change 2.0; p 0.05). Os dados do microarray foram confirmados por PCR em tempo real para todos os genes de interesse avaliados. Os perfis de expressão gênica entre as CTMs obtidas de fontes distintas (CTMs-TA vs CTMs-MO) e entre os OBs diferenciados a partir destas células (OBs-TA vs OBs-MO) mostraram que as células provenientes da medula óssea apresentaram uma sobreexpressão de genes relacionados à osteogênese enquanto que, as células provenientes do tecido adiposo, uma sobre-expressão de genes relacionados à angiogênese, independente da diferenciação celular. Adicionalmente, as células provenientes do tecido adiposo (CTMs e OBs) apresentaram uma sobre-expressão de genes relacionados à diferenciação adipogênica. Esses resultados, em conjunto, mostraram que as células preservaram características do tecido de origem. As análises comparativas entre as células indiferenciadas e diferenciadas obtidas da mesma fonte (OBs-MO vs CTMs-MO e OBs-TA vs CTMs-TA) mostraram que as CTMs, independente do tecido de origem, apresentaram uma sobre-expressão de genes relacionados com os processos de angiogênese, diferenciação osteoblástica e morfogênese do osso, o que sugere que as CTMs podem estar mais envolvidas com os eventos iniciais que regem o processo regenerativo que os OBs. A análise do dendrograma mostrou que os OBs-TA apresentaram um padrão de expressão gênica mais próximo ao das CTMs, em termos de similaridade e, os OBsMO, um padrão mais distante, o que sugere que os OBs-MO possam ter atingido um estágio de diferenciação celular mais avançado que os OBs-TA. Os resultados mostraram diferenças moleculares entre as populações de células que poderiam implicar em utilizações terapêuticas específicas, sugerindo que as células provenientes do tecido adiposo seriam mais indicadas para terapias angiogênicas enquanto que, as células provenientes da medula óssea, mais indicadas para terapias osteogênicas / Cell therapy based on the use of mesenchymal stem cells (MSCs) has been considered a promising strategy to regenerate bone tissue. Although bone marrow represents the main source of MSCs, adipose tissue has been investigated as an alternative source due to the greater availability and ease of isolation of these cells. However, MSCs obtained from different sources may show differences at the molecular level, which are not yet established in the literature and that could influence the regenerative potential of these cells. Thus, the aim of this study was to compare the large-scale gene expression profiles of MSCs isolated from bone marrow (BMMSCs) and adipose tissue (AT-MSCs) of rats, and of the osteoblasts differentiated from these cells (BM-OBs and AT-OBs, respectively). Cells were cultured in growth medium to maintain the characteristics of MSCs or in osteogenic medium to induction of osteoblastic differentiation. Total RNA was extracted and genomic analysis was performed by microarray technology using Agilent 4x44k slides. The gene expression profiles were analyzed by GeneSpring 14.8 GX software, considering the source (AT-MSCs vs BM-MSCs and AT-OBs vs BM-OBs) and cell differentiation (BM-OBs vs BM-MSCs and AT-OBs vs AT-MSCs) as parameters of comparison between the groups (fold change 2.0; p 0.05). The microarray data were confirmed by real-time PCR for all the interest genes evaluated. The gene expression profiles between the MSCs obtained from different sources (AT-MSCs vs BM-MSCs) and between the OBs differentiated from these cells (AT-OBs vs BM-OBs) showed that the cells from the bone marrow presented an overexpression of genes related to osteogenesis whereas the cells from adipose tissue showed an overexpression of genes related to angiogenesis, independent of cell differentiation. In addition, cells from adipose tissue (MSCs and OBs) showed an overexpression of genes related to adipogenic differentiation. These results, together, showed that the cells preserved characteristics of the source. Comparative analyses between the undifferentiated and differentiated cells obtained from the same source (BM-OBs vs BM-MSCs and AT-OBs vs AT-MSCs) showed that MSCs, regardless of source, showed an overexpression of genes related to the angiogenesis, osteoblastic differentiation and bone morphogenesis process, suggesting that MSCs may be more involved with the early events that govern the regenerative process than OBs. Dendrogram analysis showed that AT-OBs had a gene expression profile closer to MSCs in terms of similarity and the BM-OBs had a more distant profile, suggesting that BM-OBs may have reached a stage of cell differentiation more advanced than AT-OBs. The results showed molecular differences between cell populations that could imply in specific therapeutic uses, suggesting that cells derived from adipose tissue would be better suited for angiogenic therapies, whereas bone marrow cells are more suitable for osteogenic therapies

O complexo antena é um complexo de proteínas associado a pigmentos, como clorofilas e carotenóides. Tem a função de coletar energia luminosa para a fotossíntese (Horton et al., 1996). A luz é um fator importante na produtividade das plantas; no entanto, pode ser um fator de estresse, quando é superior à capacidade fotossintética da planta (Gilmore, 1997). Portanto, as plantas no decorrer da evolução desenvolveram mecanismos de aclimatação e dissipação segura, evitando o excesso de energia (Horton et al., 1996); (Niyogi 1999). As proteínas Cab são as proteínas de maior abundância no complexo antena LHCIIb, e estes polipeptídeos são codificados por uma família multigênica: a família Lhc em plantas superiores (Anderson & Anderson 1988); (Bassi & Dainesse 1992), sendo este complexo fundamental para a resposta das plantas a flutuações de luz (Horton et al., 1994). O metabolismo do carbono encontra-se intimamente relacionado em diversos pontos com o metabolismo do nitrogênio (Geiger et al., 1999); (Stitt & Krapp 1999); (Huppe & Turpin 1994). Uma regulação muito precisa entre estes dois metabolismos é necessária para evitar conflitos pela disponibilidade de poder redutor e precursores orgânicos (Champigny 1995). Este trabalho tem o objetivo de estudar a regulação dos metabolismos do nitrogênio e carbono, em plantas transgênicas que produzem constitutivamente as proteínas Lhcb1∗2 de ervilha e a enzima nitrato redutase (EC 1.6.6.1). A avaliação do metabolismo do carbono foi feita|por estudos de assimilação de CO2, quantificação da clorofila a, clorofila b e razão entre as duas. O metabolismo do nitrogênio foi avaliado por análises da ativação da nitrato redutase e quantificação de aminoácidos. Os resultados mostraram que as plantas transgênicas apresentam uma maior quantidade e atividade da nitrato redutase, evidenciadas pela maior atividade total e seletiva dos transformantes. Estes eventos de transformação (continua) ) aparentemente provocaram uma alteração da fotorrespiração dos indivíduos transgênicos, evidenciados pela diminuição do aminoácido serina, também foi detectada uma drástica diminuição de treonina e um aumento no conteúdo total de aminoácidos em relação aos transformantes primários (transformados só com o gene Lhcb1∗2). / The antenna complex is a protein complex associated to pigments, as chlorophylls and carotenoids. Its function is to collect light energy for the photosynthesis (Horton et al., 1996). Light is an important factor on plant productivity; however, radiation can be a cause of stress if it is above the photosynthetic capacity of the plant (Gilmore, 1997). Thus, during evolution plants developed mechanisms of acclimation and safe dissipation, avoiding excess energy (Horton et al., 1996); (Niyogi 1999). Cab proteins are the more abundant proteins within the antenna complex, and this polipeptides are codified for a multigenic family, the family Lhc in superior plants (Anderson & Anderson, 1988); (Bassi & Dainesse, 1992). This complex is essential for the answer of plants to light fluctuation (Horton et al., 1994). Carbon metabolism is related in several points with nitrogen metabolism (Geiger et al., 1999); (Stitt & Krapp, 1999); (Huppe & Turpin, 1994). It is necessary a precise regulation between these two metabolisms to avoid conflicts for the availability of reducing power and organic precursors (Champigny, 1995). This work has the objective of studying the regulation of the metabolisms of nitrogen and carbon in transgenic plants that produce constitutively the proteins Lhcbl *2 of pea and the nitrate redutase enzyme (EC 1.6.6.1). The evaluation of the carbon metabolism was made through studies of CO2 assimilation, quantification of the chlorophylls a and b and their ratio between both. Nitrogen metabolism was evaluated through analysis of the activation of the nitrate redutase and quantification of aminoacids. Results showed that transgenic plants present more content and activity of the nitrate redutase, evidenced by a higher total and in vivo activity of the transforrners. These transformation events apparently caused an alteration of the fotorespiration of the transgenic plants, evidenced by the decrease of the serina aminoacid. It also was detected a drastic decrease of threonine and an increase in the total content of aminoacids in relation to the primitive transformers (transformed just with the gene Lhcb 1*2 ).

Orientador: Cíntia Duarte de Freitas Milagre / Banca: Isabele Rodrigues Nascimento / Banca: Lourdes Campaner dos Santos / Banca: Anita Jocelyne Marsaioli / Banca: Alvaro Takeo Omori / Resumo: Reações catalisadas enzimaticamente constituem uma alternativa ambientalmente atrativa em relação a catálise metálica e organometálica, pois utiliza catalisadores biodegradáveis e oriundos de fontes renováveis, oferecendo ferramentas apropriadas para a transformação de substâncias naturais ou sintéticas levando-se em conta os preceitos da Química Verde. Neste trabalho, foi realizada a clonagem do gene nitrila hidratase (subunidades α e β e gene ativador) de Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 e Klebisella oxytoca via metodologia de clonagem livre de restrição e posterior expressão em E. coli para realização de reações de biotransformação. A análise da especificidade do substrato da NHase tipo Fe de R. erythropolis ATCC 4277 indica que este aceita uma diversidade de nitrilas. As nitrilas alifáticas foram hidratadas com conversões acima de 99%, com exceção da acrilonitrila. As nitrilas aromáticas foram hidratadas com conversões que variaram de 1% a 88%. As células inteiras de E. coli recombinante hidrataram o 1,4-fenilenodiacetonitrila com elevada regiosseletividade, enquanto o excesso enantiomérico das nitrilas aromáticas 2-amino-2-(4-fluorofenil) acetonitrila e 2-fenilbutironitrila foram de 7% e 60%, respectivamente. A clonagem do gene NHase de Klebisella oxytoca não foi observada. A segunda etapa deste trabalho consistiu na síntese de 4-(cianometil)benzenoacetanamida, um intermediário importante na síntese de compostos de interesse industrial e utilizado como material de part... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Enzymatically catalyzed reactions are an environmentally attractive alternative for metal and organometallic catalysis, because it uses biodegradable catalysts and from renewable sources, offering appropriate tools for the transformation of natural substances or synthetic taking into account the precepts of Green Chemistry. This work was performed nitrile hydratase gene cloning (α- and β- subunits and activator gene) from Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 and Klebisella oxytoca via restriction-free cloning methodology and subsequent expression in E. coli to perform biotransformation reactions. The analysis of the substrate specificity of the Fe-type NHase of R. erythropolis ATCC 4277 indicates that it accepts a diversity of nitriles. The aliphatic nitriles were hydrated with conversions above 99%, with the exception of acrylonitrile. The aromatic nitriles were hydrated with conversions ranging from 1% to 88%. Whole cells of recombinant E. coli hydrated 1,4-phenylenediacetonitrile with high regioselectivity, while the enantiomeric excess of the aromatic nitriles 2-amino-2- (4-fluorophenyl)acetonitrile and 2-phenylbutyronitrile were 7% and 60%, respectively. The cloning of the gene NHase of Klebisella oxytoca was not observed. The second step of this work consisted in the synthesis of 4-(cyanomethyl)benzeneacetanamide an important intermediate in the synthesis of compounds of industrial interest and used as starting material in Grignard reactions and transamidation. A collecti... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Deilson Elgui de Oliveria / Banca: Lígia Niéro-Melo / Banca: Daniel Onofre Vidal / Banca: Alexandrona Sartori / Banca: Otávio Cesar Carvalho Guimarães Baiocchi / Resumo: Linfoma de Hodgkin clássico (LHc) é uma neoplasia maligna que apresenta um padrão aberrante de expressão de citocinas, incluindo IL-10 e TNF-a. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) nos genes codificadores de IL-10 e TNF-a ou de suas proteínas regulatórias, como NFkB, podem interferir na patobiologia do LHc. No presente estudo, SNPs nas regiões promotoras dos genes de IL-10 (SNP/pIL-10 -592, rs1800872; e SNP/pIL-10 -1082, rs1800896) e TNF-a (SNP/pTNF-a -238, rs361525; e SNP/pTNF-a -862, rs1800630), assim como na região intrônica do gene NFkB1 (SNP/iNFkB1, rs1585215) foram genotipados em 73 pacientes com LHc e avaliados em relação à sua associação com parâmetros prognósticos clínicos e laboratoriais da doença. SNPs/pIL-10 AA foram significativamente associados a maiores contagens de leucócitos e menores valores de linfócitos ao diagnóstico. No caso de TNF-a, SNP/pTNF-a -238 AG foi associado à presença de infecção pelo EBV enquanto SNP/pTNF-a -862 CC apresentou-se mais frequentemente com leucocitose. SNP/iNFkB1 AA associaramse à doença em estádio IV e padrão extranodal de apresentação. Entretanto, nenhum dos SNPs avaliados teve efeito no desfecho do tratamento. Esse estudo mostrou que alguns genótipos de SNPs nos genes de IL-10 e TNF-a estão associados a parâmetros prognósticos no LHc. Adicionalmente, pela primeira vez foram descritas associações entre SNP/iNFkB1 (rs1585215) e aspectos clínicos da doença / Abstract: Classic Hodgkin lymphoma (cHL) is a malignant lymphoid neoplasia that shows aberrant expression of cytokines, including IL-10 and TNF-a. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in genes encoding IL-10 and TNF-a or their regulatory proteins, such as NFkB, may impact cHL pathobiology. In this study, SNPs in the promoter regions of genes encoding for IL-10 (SNP/pIL-10 -592, rs1800872; and SNP/pIL-10 -1082, rs1800896), and TNF-a (SNP/pTNF-a -238, rs361525; and SNP/pTNF-a -862, rs1800630), as well as in the intronic region of the NFkB1 gene (SNP/iNFkB1, rs1585215) were genotyped in 73 patients with cHL and evaluated against clinical and laboratory prognostic parameters for the disease. SNPs/pIL-10 AA were significantly associated with higher leukocyte and lower lymphocyte counts at diagnosis. In case of TNF-a, SNP/pTNF-a -238 AG was associated with EBV infection while SNP/pTNF-a -862 CC presented more frequently with leukocytosis. SNP/iNFkB1AA generally had stage IV and extranodal disease at diagnosis. Nonetheless, none of the studied SNPs had effect on on treatment outcome. This study shows that some SNPs genotypes for IL-10 and TNF-a genes are associated with prognostic parameters in cHL; furthermore, this is the first time that the SNP/iNFkB1 (rs1585215) was implicated in clinical features of the disease / Doutor

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Flavia Lombardi Lopes / Coorientador: Daniel Robert Arnold / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Luiz Sérgio de Almeida Camargo / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Naiara Zoccal Saraiva / Resumo: Modificações pós-translacionais de histonas são importantes componentes do código epigenético, e contribuem para o controle da transcrição gênica de cada célula. O presente trabalho descreve a participação de duas modificações de histonas no desenvolvimento embrionário pré-implantacional: a acetilação de lisinas e a citrulinização de argininas. No capítulo 1, avaliamos a presença de duas modificações de histona H3, K9ac (permissiva) e K27me3 (repressiva) em embriões bovinos no ciclo de ativação do genoma embrionário (AGE), por imunofluorescência. Ambas as marcas estão presentes e apresentam alto coeficiente de correlação, e dois perfis de embriões (com alta e baixa variação dos níveis das modificações entre blastômeros) foram descritos. A acetilação de histonas está relacionada à ativação da expressão gênica, portanto no capítulo 2 hipotetizamos que a manipulação de seus níveis em embriões bovinos poderia influenciar a ativação do genoma embrionário, o desenvolvimento de blastocistos e a inativação do cromossomo X em fêmeas. Foram testadas concentrações do inibidor das histona desacetilases tricostatina A variando de 5 a 50nM, aplicadas por 12 a 144h, iniciando 70h após a FIV. Três protocolos foram selecionados: 5nM 48h, 5nM 144h e 15nM 48h. Após, foi utilizado sêmen sexado para estudar os efeitos da TSA sobre embriões fêmeas e machos separadamente. Por imunofluorescência para H3K9ac, foi observado aumento na acetilação de histonas em ambas as concentrações (5 e 15nM), sendo 5nM mais eficaz em fêmeas do que machos. O tratamento com 15nM 48h reduziu a produção de blastocistos em machos e fêmeas, e 5nM 144h em machos. A taxa de apoptose, avaliada pelo ensaio TUNEL, foi elevada em embriões fêmeas (grupos 5nM144h e 15nM48h), e em machos (grupo 15nM48h), mas tal aumento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Histone post translational modifications are important components of the epigenetic code, and contribute to the control of gene transcription in each cell. This work describes the participation of two histone modifications in embryonic preimplantation development: acetylation of lysines and citrullination of arginines. In chapter 1, we evaluated the presence of two modifications of histone H3, K9ac (permissive) and K27me3 (repressive) in bovine embryos in the cycle of embryonic genome activation (EGA), by immunofluorescence. Both marks are present and show a high correlation coefficient, and two profiles of embryos were described, displaying high and low variation of modifications level between blastomeres. The acetylation of histones is related to gene expression activation, so in Chapter 2 we hypothesized that the manipulation of acetylation levels in bovine embryos could influence embryonic genome activation, blastocyst development and X chromosome inactivation in females. Five concentrations of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA), ranging from 5 to 50nM beginning 70 hours after FIV were applied per 12 to 144h. Three protocols were selected: 5nM 48h, 5nM 144h and 15nm 48h. After, sexed semen was used to study the effects of TSA on male and female embryos separately. Immunofluorescence of H3K9ac showed increased histone acetylation at both concentrations (5 and 15nM). 5nM TSA was more effective in females than in males. Treatment with 15nM 48h reduced male and female blastocyst yield, and 5nM 144h reduced male blastocyst yield. Apoptosis rate was measured by the TUNEL assay. Female 5nM144h and 15nM48h groups, and male 15nM48h group displayed higher apoptosis levels, but this increase was not observed in low quality embryos. In female embryos, TSA did not affect... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Fábio Tebaldi Silveira Nogueira / Banca: Luiz Fernando Rolim de Almeida / Banca: Daniel Scherer de Moura / Banca: Maria Isabel Nogueira Cano / Banca: Paulo Mazzafera / Resumo: O desenvolvimento vegetal é influenciado por diferentes fatores como os microRNAs (miRNAs) e os fitohormônios, os quaisinteragem numa complexa rede de regulação. Entre os miRNAs, o miRNA156 (miR156) regula os fatores de transcrição SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like(SPL) afetando diferentes processos do desenvolvimento vegetal. Entre os fitohormônios, os brassinosteróides (BRs) participam na regulação dos eventos associados à fase juvenil da planta. A interação miR156/SPL-BRs não é conhecida, pelo qual, este estudo avaliou a interação destas duas vias durante o desenvolvimento juvenil de Arabidopsis thaliana. Formacaco da raiz principal (RP) e número de raizes laterais (RL) bem como o crescimento do hipocótilo foram utilizados como marcadores desta possivel interação. Foram utilizadas plantas de A. thaliana (Ecotipo Col-0) que expressam constitutivamente o miR156 (miR156-OE), plantas com níveis reduzidos do miR156 (Mimicry-156) e plantas selvagens (WT). Entre os BRs foi escolhido o 24-EpiBrassinolídeo (24-EBL) por ser o BR mais ativo. Plântulas miR156-OE apresentam maior comprimento da RP, maior número de RL e maior sensibilidade aos tratamentos com 24-EBL; fenótipos e comportamento opostosforam observados nas plântulas Mimicry-156. Além disso, plântulas miR156-OE apresentam maior comprimento do hipocótilo, enquanto as plântulas Mimicry-156 apresentam reduzido comprimento. Entre os genes SPLs que respondem ao tratamento com 24-EBL se encontram os SPL2, - 3, -4, -5, e -6. Entre os genes da via dos BRs foram observados alterações na expressão dos genes CPD, BZR1, BES1 e BAS1. Estes dados sugerem que a via genética do miR156/SPL interage com os BRs, e também contribuem para um melhor conhecimento da genética molecular do desenvolvimento de arabidopsis / Abstract: Plant development is affected by different factors such as micro-RNAs (miRNAs) and phytohormones which interact in a complex regulation network. Among miRNAS, miRNA156 (miR156) regulates SQUAMOSA Promoter- Binding Protein-Like (SPL) transcription factor family affecting different plant development processes. Among phytohormones, brassinosteroids (BRs) participate in regulation of vegetal juvenile processes. miR156/SPL-BRs interaction is unknown whereby the aim of this work was to evaluate the interaction between those two pathways during Arabidopsis thaliana juvenile development. Main root (RP), lateral root number (RL) and hypocotyl length were selected as markers of this interaction. A. thaliana (Col-0 ecotype) overexpressing miR156 (miR156-OE), plants with miR156 reduced activity (Mimicry-156) and wild type (WT) plants were used. 24-Epibrassinolide (24- EBL), the most active BRs, was selected. miR156-OE plants have longer RP length, more RL and 24-EBL sensitivity. Opossite phenotypes were observed on Mimicry-156 plants. Besides, miR156-OE plants have longer hypocotyl length while Mimicry-156 plants have shorter. SPLs genes, SPL2, -3, -4, -5, and -6 responded to 24-EBL treatment. BRs pathway genes, CPD, BZR1, BES1 and BAS1 had changes in gene expression. Our data suggest a interaction between the miR156/SPL and BRs pathways and help to understand the molecular genetics of Arabidopsis development / Mestre

As proteases FtsHs, encontradas em eubactérias e eucariotos, pertencem à família das proteínas AAA (ATPases associadas a diferentes atividades celulares) e são classificadas no grupo das metaloproteases. A proteína FtsH foi primeiro identificada em Escherichia coli em mutantes ftsH (filamentation temperature sensitive) como uma protease que age facilitando a degradação de proteínas intermembrânicas e citosólicas. Ortólogas a FtsH já foram encontradas em leveduras, metazoários e plantas. Nestas últimas, a FtsH pode estar localizada nos plastídeos, como uma proteína integral da membrana dos tilacóides ou na membrana interna das mitocôndrias, como em leveduras. Estudos sobre as isoformas plastidiais são abundantes e indicam a participação dessas proteases na renovação da proteína D1, componente do fotossistema II, na resposta hipersensível e na biogênese das membranas do tilacóide. Os estudos sobre as isoformas mitocôndriais são escassos e resumem-se a informações sobre o direcionamento subcelular dessas proteases e evidências de seu envolvimento no acúmulo da subunidade 9 da ATP-sintase na membrana interna. Com o objetivo de caracterizar a função da FtsH-m1 em plantas, foi realizada a transformação genética de Nicotiana tabacum via Agrobacterium tumefaciens contendo um plasmídeo em que o cDNA da FtsHm1 de cana-de-açúcar encontra-se sob o controle de um promotor transcricional constitutivo. Esse plasmídeo apresenta o gene seletivo nptII, que confere resistência à canamicina. As plantas regeneradas in vitro, 17 no total, foram aclimatadas e transferidas para a casa de vegetação até a produção de sementes. As plantas regeneradas foram testadas quanto à presença do cDNA da FtsH-m1 de cana-de-açúcar por meio da técnica de PCR. A seleção de plantas da geração T1 que possuíam o transgene de interesse foi conduzida em ensaios in vitro e em casa de vegetação baseados na resistência dessas plantas à canamicina. A presença do transgene foi confirmada por meio da técnica de PCR. A análise da expressão heteróloga foi realizada via RT-PCR e revelou níveis elevados de RNA mensageiro nas plantas transformadas. Ao todo, foram obtidas dez plantas de fumo em que a presença do transgene de interesse foi confirmada. Não foram observadas alterações fenotípicas marcantes nas plantas das gerações T0 e T1 que pudessem ser relacionadas à expressão heteróloga da FtsH-m1 de cana-de-açúcar. Devem ser realizadas análises mais finas, que podem incluir ensaios para a investigação de possíveis alterações na função mitocondrial, no metabolismo respiratório ou na ultraestrutura das mitocôndrias em plantas a partir da geração T2. / FtsH proteases of eubacteria and eucaryotes belong to the AAA protein family (ATPases associated with different celular activities) and are included among the metaloproteases. The FtsH protein was first described in ftsh (filamentation temperature sensitive) mutant of Escherichia coli as a protease involved in the degradation of transmembrane and cytosolic proteins. FtsH-ortologous proteins have been described in yeast, metazoa and plants. In the latter, FtsHs are localized to plastids, as an integral membrane protein of thylakoid or, as in yeast, to the inner mitochondrial membrane. The various studies on the plastid isoforms point to their involvement in the turnover of D1 protein, a member of the photosystem II, in hypersensitive response, and in thylakoid membrane biogenesis. On the other hand, data on the mitochondrial isoforms are scarce and restricted to their subcellular localization, and involvement in the accumulation of ATP-synthase subunit 9 in the inner membrane. With the aim of disclosing the function of FtsH-m1 in plants, Nicotiana tabacum plants were transformed by Agrobacterium tumefaciens carrying a designed plasmid containing the sugar-cane FtsH-m1 cDNA under the control of a constitutive-transcription promoter. This plasmid also contained the selectable kanamycin-resistance gene nptII. The seventeen plants obtained in vitro were acclimatized and kept in a greenhouse until seeding. These plants were then tested by PCR for the presence of the sugar-cane FtsH-m1 cDNA. Selection of T1 plants for the presence of the transgene of interest was carried out both in vitro and in the greenhouse, based on kanamycin resistance. The transgene carrier status of the selected plants was confirmed by PCR. Higher levels of FtsH-m1 messenger RNA were detected by RT-PCR in transformed T1 plants. A total of ten tobacco plants carrying the sugar-cane FtsH-m1 cDNA were obtained. T0 and T1 plants did not show conspicuous phenotype alterations which could be related to the heterologous gene expression. Refined analyses are needed in plants from T2 generation on, including the evaluation of mitochondrial structural abnormalities and disfunction, as well as respiratory alterations.

Xylella fastidiosa (Xf) é o agente etiológico causador de doenças em uma grande variedade de cultivos de grande importância econômica, causando a c1orose variegada dos citros, uma das doenças mais danosas à indústria de citros no Brasil. Os genomas de algumas cepas deste fitopatógeno foram completamente seqüenciados promovendo assim estudos funcionais do genoma em larga escala. Neste trabalho nós nos propusemos a investigar o perfil de transcrição de Xf através da técnica microarranjos (no título da dissertação microarrays, mas a partir de agora usaremos microaarranjos) de DNA usando todo o genoma do fitopatógeno e cultivando-a sob meio definido variando a concentração de glicose. O objetivo inicial deste trabalho era observar se Xf comportava-se da mesma forma que Xac, que tem a expressão de goma aumentada devido ao aumento da concentração de glicose do meio. Nossas análises revelaram que enquanto os transcritos relacionados à goma não se mostraram afetados com a concentração de glicose, genes que codificam para análogos a Colicina-V e precursores de fimbria foram induzidos em alta concentração de glicose. Baseados nestes resultados, nós propusemos um modelo de mecanismo de produção e defesa contra a Colicina em Xf. / Abstract not available.

O camundongo mdx, modelo murino para a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) possui uma mutação de ponto no gene da distrofina que resulta na ausência da proteína no músculo, porém seu fenótipo é brando o que o torna um bom modelo genético e molecular, mas não um bom modelo funcional. Esperando obter um modelo para DMD que tivesse um fenótipo mais fiel ao apresentado pelos pacientes humanos, optou-se por transferir a mutação mdx para o background 129/Sv. Através de cruzamentos sucessivos foram obtidas 3 gerações de animais mdx com background 129/Sv (mdx129) e cada geração foi avaliada funcionalmente por 6 meses. Desde a primeira geração é possível observar que os animais mdx129 são mais fortes do que os mdx originais em background C57BL (mdxC57BL), sendo o oposto do esperado no início dos experimentos. O estudo então foi redirecionado para tentar entender o motivo dessa melhora. Em relação ao padrão histológico, em geral há diferenças entre o mdxC57BL e mdx129. Observa-se também que os animais mdx129 entram no processo de degeneração mais tardiamente que os animais mdxC57BL e seu processo de regeneração se estende por mais tempo. Através de estudos de microarray foi possível observar que os animais 129/Sv apresentam poucos genes diferencialmente expressos (GDEs) em relação aos animais C57BL, portanto os dois backgrounds são muito semelhantes. O mdxC57BL apresenta muito mais GDEs em relação ao seu selvagem (C57BL) do que o mdx129 em relação ao 129/Sv, entretanto, ambos os modelos apresentam mais genes superexpressos do que subexpressos, indicando que as alterações distróficas e regenerativas estão mais associadas com a ativação do que a repressão de genes. Quando os GDEs de ambos os modelos de mdx são distribuídos em categorias funcionais, há o predomínio de genes ligados ao sistema imune e quando essa categoria é omitida para melhor visualização das restantes, observa se que ambos os modelos apresentam categorias funcionais semelhantes, porém com proporções diferentes. No modelo mdx129 se destaca a diminuição da participação da categoria de rota endo/exocítica (tráfego de vesículas) e homeostase e aumento da participação das categorias de matiz extracelular e atividade enzimática. Cada modelo apresenta genes exclusivos, destacando os genes SPP1 e IL1RN na comparação 129/Sv x mdx129F3. O gene SPP1 codifica a proteína osteopontina (OPN) e o polimorfismo rs28357094 neste gene é utilizado como biomarcador de prognóstico para DMD. O papel da OPN na progressão da distrofia não é bem conhecido. Alguns estudos afirmam que a ausência dessa proteína melhora a força muscular de camundongos mdx, enquanto outros apontam que sua participação é necessária para a regeneração muscular. Assim sendo, mais estudos serão necessários para verificar qual seria a via responsável pela melhora fenotípica do modelo mdx129. Já o gene IL1RN codifica a proteína IL-1Ra, a qual é um antagonista de interleucina 1 (citocina pró-inflamatória e pró fibrótica). Portanto o aumento da expressão do gene de seu antagonista sugere que os animais mdx129F3 podem estar mais protegidos do processo inflamatório causado por essas moléculas. Quando analisadas as listas filtradas para músculo esquelético das comparações C57BL x mdxC57BL e 129/Sv x mdx129F3 para a formação de vias metabólicas, foi gerada apenas uma via em ambas as comparações com número relevante de moléculas. A via gerada pela análise da lista C57BL x mdxC57BL possui mais moléculas do que a via gerada pela analise da lista 129/Sv x mdx129F3, porém, todas as moléculas presentes nesta via, estão presentes na via C57BL x mdxC57BL, indicando que mesmo com número diferente de moléculas envolvidas, os genes participam das mesmas vias. Tanto a comparação de cada geração de mdx129 com o 129/Sv como a comparação das gerações entre si mostram que os efeitos da mudança de background estão presentes desde a primeira geração e não se alteram significativamente com os cruzamentos sucessivos. / The mdx mouse, murine model for Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) has a point mutation in the dystrophin gene that results in the absence of the protein in the muscle, however its phenotype is mild, which makes it a good genetic and molecular model, but not a good functional model. Hoping to obtain a model for DMD with a phenotype that is more similar the patients\', it was chosen to transfer the mdx mutation to the 129/Sv background. Through successive breedings, 3 generations of mdx animals with 129/Sv background were obtained and each generation was functionally evaluated for 6 months. Since the first generation it is possible to observe that the mdx129 animals are stronger than the original mdx with C57BL background. The results were the opposite of what was expected in the beginning of the experiments, therefore the study was redirectioned to try to understand the reason of the improved phenotype. About the general histological pattern, there are differences between mdxC57BL and mdx129. It can be observed that the mdx129 animals enter the degenerative process later than the mdxC57BL animals and the regenerative process lasts longer. Through microarray studies it was possible to observe that the 129/Sv animals present few differentially expressed genes (DEGs) in comparison to the C57BL animals; therefore both backgrounds are very similar. The mdxC57BL presents many more DEGs in comparison to C57BL than mdx129 in comparison to 129/Sv, however both models present more super expressed genes than sub expressed, indicating that the dystrophic and regenerative alterations are more associated to the activation rather than the repression of genes. When the DEGs of both mdx models are distributed in functional categories, there is the predominance of genes related to the immune system and when this category is omitted for the better visualization of the remaining, it can be observed that both models present similar functional categories, but with different proportions. In the mdx129 model we can highlight the decrease in participation of the endo/exocytic pathway (vesicle traffic) and homeostasis categories, and increase in participation of the extracellular matrix and enzymatic activity categories. Each model presents exclusive genes, highlighting SPP1 and IL1RN in the comparison 129/Sv x mdx129F3. SPP1 encodes the protein osteopontina (OPN) and the polymorphism rs28357094 in this gene is used as a DMD prognostic biomarker. The role of OPN in the dystrophy progression is not well known. Some studies claim that the absence of OPN increases the muscle strength of the mdx mouse, while others indicate that its participation is necessary to muscle regeneration. More studies are needed to ascertain what pathway is responsible for the phenotypic improvement of the mdx129 model. The IL1RN gene encodes the protein IL-1Ra, and interleukin 1 antagonist, which is a pro-inflammatory and pro-fibrotic cytokine. Therefore, the increase in the expression of its antagonist suggests that the mdx129F3 animals may be more protected from the inflammatory process caused by these molecules. When the filtered lists for skeletal muscle of the comparisons C57BL x mdxC57BL e 129/Sv x mdx129F3 were analyzed for the formation of metabolic pathways, only one pathway was generated in both comparisons. The pathway generated in the analysis C57BL x mdxC57BL has more molecules that the one generated by the 129/Sv x mdx129F3 list, but all molecules present in the latter are also present in the former, indicating that even with different numbers of molecules involved, the genes participate in the same pathways. The comparisons of each generation of mdx129 with the 129/Sv and the comparison of the generations among each other show that the effects of the background change are present since the first generation and are not altered with the successive breedings.