Made available in DSpace on 2018-08-27T13:37:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12502_Tese - Lidiane Pignaton Agostini.pdf: 2963143 bytes, checksum: 76cc790c5543c25d309bc0feced39101 (MD5) Previous issue date: 2018-06-27 / O Glifosato [N-(fosfonometil)glicina] é um herbicida pós-emergente, não seletivo e sistêmico. No processo de criação das formulações comerciais de herbicidas a base de glifosato (GBHs, do inglês glyphosate-based herbicides), como o Roundup®, são adicionados surfactantes com o intuito de aumentar a eficiência do composto base. A rota prioritária de degradação do glifosato por micro-organismos no solo resulta na formação do ácido aminometilfosfônico (AMPA). As respostas moleculares ao glifosato têm sido extensivamente estudadas em espécies de plantas e em alguns vertebrados. Em humanos, apesar dos estudos até agora realizados, não se conhece exatamente quais os riscos e mecanismos de atuação que explicariam a toxicidade ao glifosato relatada em alguns experimentos. Sendo assim, a hipótese dessa tese é de que a exposição rápida ao Roundup® e ao AMPA leva à alterações de expressão gênica em importantes processos celulares. Dessa forma, o objetivo desse trabalho é identificar genes diferencialmente expressos (DEGs, do inglês differentially expressed genes) em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs, do inglês, peripheral blood mononuclear cells) humano submetidas à exposição rápida com herbicida à base de glifosato (Roundup®) e AMPA. O teste de MTT [3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio brometo], realizado em triplicatas, foi utilizado para avaliar a viabilidade celular e para a escolha das condições de tratamento utilizadas na técnica de microarray (GeneChip® Human Transcriptome Array 2.0, Affymetrix). As condições analisadas foram controle (3 chips), AMPA (10 mM; 3 chips) e Roundup® (0,05%; 2 chips), expostos durante 3 horas. Utilizando um valor de p<0,05 e fold-change de 1,5 foram identificados 5 DEGs no tratamento com o AMPA e 26 no tratamento com Roundup®. As análises de enriquecimento mostraram que os genes com expressão alterada após exposição ao Roundup® estavam associados a 33 processos celulares, principalmente relacionados à regulação destes processos. A plataforma digital Pathview foi utilizada para identificar a atuação dos DEGs após exposição ao Roundup® em diferentes vias. Os genes TNF, LTA, TAB2 e ATM foram relacionados à via de sinalização NF-kappa &#946;; BCL2L11 e ATM à via de sinalização FoxO; SESN3 e ATM à via de sinalização p53; e TNF, BCL2L11 e ATM à apoptose. Dessa forma, os resultados sugerem que o Roundup® altera o padrão de expressão gênica de diversos genes associados com o controle do ciclo celular, regulação de processos celulares e apoptose.

Made available in DSpace on 2018-08-23T21:50:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12426_Tese - Suzanny Oliveira Mendez.pdf: 3561701 bytes, checksum: 0f0fd989fd5e8dceb41830e39d57ae5c (MD5) Previous issue date: 2018-04-12 / O tabagismo é uma das principais causas de morte evitável do mundo e está relacionado ao surgimento de diversos tipos de tumores, dentre eles o câncer colorretal. Estudos com tumores sólidos mostram que a hipóxia é um importante fator preditor de resposta prognóstica e as vias de hipóxia, estresse oxidativo e imunossupressão podem atuar na progressão tumoral, influenciar a resposta ao tratamento e a resposta imunológica. Uma vez que estas vias podem ter a expressão de seus genes afetada tanto pela exposição à fumaça do cigarro quanto à radioterapia, o presente trabalho buscou investigar a influencia destes fatores de exposição na expressão das proteínas PHD3, HIF-1α, VEGF, RA2A e Foxp3 nos infiltrados intra e peritumorais de câncer colorretal induzido. Para tanto, foram utilizados 53 ratos Wistar, 5 com o intestino saudável como controle negativo (G0) e os 48 ratos restantes foram induzidos à tumorigênese colorretal com 1,2-dimetilhidrazina (DMH) e divididos em 4 grupos, Grupo DMH (G1), Grupo DMH/Radioterapia (G2), Grupo DMH/Fumaça (G3) e Grupo DMH/Fumaça/Radioterapia (G4). A exposição à fumaça do cigarro dos grupos G3 e G4 ocorreu em câmara de inalação e correspondeu a 12 cigarros por dia/grupo durante 20 semanas. Na 21ª semana, os animais do grupo G2 e G4 foram submetidos a três sessões de radioterapia na dose de 700 cGy cada, totalizando 2500 cGy. Na 22ª semana, os animais foram eutanasiados e as lesões fixadas, processadas e coradas com hematoxilina e eosina para diagnóstico. As lesões classificadas como Adenocarcinoma Tubular foram submetidas à Imunohistoquímica para as proteínas PHD3, HIF-1α, VEGF, da via de hipóxia, SOD-1 da via de estresse oxidativo e RA2A e Foxp3 da via de imunossupressão. Todas as amostras tumorais e controles foram analisadas nos infiltrados intra e peritumoral de forma semi-quantitativa e avaliados quanto à exposição à fumaça do cigarro e radioterapia na modulação da expressão destas proteínas. A resposta à radioterapia também foi avaliada pelo índice apoptótico através do anticorpo da caspase-3 clivada nas amostras pertencentes aos grupos G2 e G4. Os resultados mostraram uma relação entre a exposição à fumaça do cigarro e radioterapia com alteração da expressão das proteínas nos infiltrados inflamatórios intra e peritumorais. A expressão das proteínas pode diferir entre os tipos de infiltrado inflamatório, bem como da expressão em células tumorais, mostrando a importância da função diferencial destas células no microambiente tumoral. Além disso, o grupo exposto à fumaça e radioterapia apresentou melhores características histopatológicas em relação à malignidade e melhor resposta terapêutica. Assim concluímos que os ratos expostos à fumaça do cigarro e tratados com radioterapia apresentaram melhores parâmetros histoquímicos dos marcadores de morte celular, inflamação, progressão tumoral, estresse oxidativo e resposta à radioterapia do que os não expostos à fumaça do cigarro. Uma vez que a fumaça é consagrada como indutora de tumor em vários estágios da tumorigênese, e que nossos resultados mostraram características opostas, sugerimos a necessidade de novos estudos que confirmem o real impacto do tabagismo nos processos de tumorigênese, inflamação e na resposta ao tratamento radioterápico.

Orientador : Laura Maria Mariscal Ottoboni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T10:28:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_EdnaLobo_M.pdf: 8817376 bytes, checksum: b4419889c5d139f715652a53bb461fa3 (MD5) Previous issue date: 2001 / Mestrado

Orientador: Claudio Fernandes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-28T13:59:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_TaniaReginaBarbosade_M.pdf: 14927643 bytes, checksum: c8c42a656b08bdc1068fe05d1d28500c (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: O presente trabalho sobre a corporeidade de pacientes esquizofrênicos crônicos tem como objetivo principal o estudo da linguagem corporal, na qual o corpo é um veículo de expressão da psique e, no caso da doença mental, do conflito psíquico, lide algo que o indivíduo aprisionou, por uma série de razões, e não conseguiu trazer à consciência, nem verbalizar" (Barbosa, 1996). Para a apreensão do objeto de estudo, a linguagem corporal, e após a revisão da literatura, foram selecionados 15 pacientes que constituíram um grupo de observação, tendo estes pacientes preenchido os seguintes critérios: a) de inclusão: diagnóstico de esquizofrenia; idade atual entre 30 e 60 anos; evidência de ser um enfermo crônico; vontade de participar do estudo; e b) de exclusão: evidência de doença neurológica ou retardo mental. O método: foi realizada uma Pesquisa Qualitativa Fenomenológica, utilizando o Método Clínico. Instrumentos e Procedimentos: a pesquisa foi realizada em quatro etapas, onde foram estudados: A) Pesquisa documental, a história psiquiátrica e o quadro clínico; B) As Histórias de Vida, através de entrevista semi-estruturada; C) O Exame Psicomotor . dos pacientes; e D) a Observação Direta ou Participante das atividades motoras e expressivas. Resultados: 1. História de múltiplas intemações psiquiátricas; 2. Surgimento dos primeiros sinais da doença na adolescência (entre 15 - 18 anos); 3. Antecedentes familiares, incluindo alcoolismo e desagregação familiar; 4. Quadro clínico estável com episódios recorrentes de alucinações auditivas e visuais e atividade delirante; 5. Dificuldades em conquistar e manter amizades; 6. Fobias, pesadelos, tabagismo e alcoolismo; 7. Tfrnidez excessiva em relação ao sexo oposto; 8. Incapacidade para exercer atividades produtivas; 9. Incapacidade para relacionamentos conjugais; 10. Alienação importante quanto ao quadro clínico; 11. Marcha em bloco; 12. Postura cifótica com protusão de ombros; 13. Inexpressividade facial e gestual; e 14. Esquema corporal e ritmo comprometidos. Conclusão. Sobre os aspectos considerados: a) Existe uma relação importante entre história de vida, incluindo a história psiquiátrica e expressão corporal nos pacientes esquizofrênicos crônicos estudados; e b) A relação entre o uso de medicamentos psicotrópicos e hospitalização a longo prazo e a expressividade corporal é também um dado considerável / Abstract: The purpose of this research on corporeality of chronic schizophrenic patients was to study the body language, wherein the body is the vehicle of psychic expression and conflicts, "for various reasons something was imprisoned deep inside the individual, which he couldn 't make known " (Barbosa, 1996). A literary review was fIrst carried out and then 15 patients were selected for observation. These patients had to fulfill the following criteria: a) to be included - diagnosis of schizophrenia; ages between 30 years to 60 years; chronic infirmity; desire to participate in the study and b) to be excluded - evidence of a neurological disease or mental retardation. Method: The Clinical Method was utilized to conduct a Qualitative Phenomenological Research. Tools and Procedures: The study was conducted in four stages: A) Documentary Research - psychiatric history and clinical conditions; B) Life History - obtained through semi-structured interviews; C) A Psychomotor Examination of the patient; D) Direct Observation or Participation in expressive and motor activities. Results: 1. History of multiple Psychiatric hospitalizations; 2. The first symptoms of the disease appeared during adolescence (between the age of 15 years to 18 years); 3. Family Antecedents were present, which included alcoholism and separations; 4. Stable clinical condition with recurring episodes of audible and visual hallucinations and deliriums; 5. Difficulty in making and maintaining friendships; 6. Phobias, nightmares, smoking and alcoholism; 8. Excessive timidity regarding. the opposite sex; 9. Incapable of conjugal relationships; 10. The clinical condition showed an important degree of mental derangement; 11. Rigid walk; 12. Posture: humpback with protruding shoulders; 13. Inexpressive facial expression as well as gestures; 14. Body scheme and rhythm affected. Conclusion: Considering the aspects studied: a) The chronic schizophrenic patients chosen here showed that there was a relationship between life history which included psychiatric history and corporeal expression; and b) another important factor which was the relationship between the use of psychotropic medication and long periods of hospitalization / Mestrado / Saude Mental / Mestre em Ciências Médicas

Com o objetivo de compreender os mecanismos que regulam a formação da simbiose entre fungos micorrízicos arbusculares e raízes de plantas, procurou-se identificar e clonar genes com expressão diferencial na interação através da técnica do"display"diferencial de cDNAs. Raízes de fumo (Nicotiana tabacum) não colonizadas e colonizadas pelo fungo Glomus intraradices foram coletadas, após um período experimental de oito semanas, para a extração de RNA. Em seguida, iniciadores com base na seqüência poliadenílica do RNA mensageiro de eucariotos (oligo-dTs) foram utilizados para a síntese de cDNA. Iniciadores aleatórios ou combinações de iniciadores aleatórios e oligo-dTs foram utilizadas para amplificar, por PCR, a primeira fita de cDNA. Três produtos de amplificação presentes somente em amostras de raízes colonizadas foram identificados e clonados. Os clones foram seqüenciados e suas seqüências comparadas às seqüências de genes conhecidos. O clone NtGil apresentou 55 a 70% e 33 a 66% de identidade em nível de nucleotídeos e aminoácidos, respectivamente, com genes que codificam proteínas acessórias da urease (UreG), de várias bactérias e Arabidopsis. O clone NtGi2 também apresentou alta homologia (55 a 66% em nível de nucleotídeos e 41 a 65% em nível de aminoácidos) com proteínas UreG de várias bactérias. Esse clone é praticamente idêntico à NtGil, diferindo apenas por uma inserção de 74 nucleotídeos, entre as posições 534 e 607. A seqüência de nucleotídeos do clone NtGi3 é idêntica à sequência de NtGil, exceto pelo fato do clone NtGil abranger uma porção maior da região 3’ do gene. A análise da seqüência de aminoácidos deduzida revelou a presença de sítios putativos de N-glicosilação (NYSR e NKTD), de ligação ATP/GTP (GPVGSGKT,"P-loop") e de fosforilação por quinase-tirosina (RELADYIIY). Os sítios de glicosilação e de ligação ATP/GTP são conservados entre as proteínas UreG armazenadas nos bancos de dados. No entanto, o sítio de fosforilação é específico para os cDNAs isolados. Com base nos resultados obtidos, é possível que as proteínas UreG estejam envolvidas no metabolismo do nitrogênio durante a simbiose ou ainda com a infectividade do fungo. / not available

O sistema coletor de luz (LHC) é o principal complexo de proteínas associado a carotenóides e clorofilas, localizado nas membranas dos tilacóides nas plantas e algas superiores. O LHC atua como um sistema antena para o fotossistema I e o fotossistema II e tem um papel chave na captação da energia luminosa para a fotossíntese (Horton et aI, 1996). Os processos de transporte de elétrons, fixação do CO2 e assimilação do nitrato estão relacionados às necessidades de ATP, poder redutor e cofatores proteicos como, ferredoxina ou tiorredoxinina. Existe uma forte correlação entre o metabolismo do carbono e nitrogênio em plantas superiores, pois os esqueletos carbônicos e a energia, produtos da fotossíntese, são necessários à assimilação do nitrato direta ou indiretamente, através da síntese de sacarose (Ferrario-Mery, 1998; Foyer et al., 1998). A regulação deste processo é necessária para prevenir uma competição potencial da disponibilidade de poder redutor e precursores orgânicos, necessários para às vias biossintéticas (Champigny, 1995). A assimilação do nitrato para a biossintese de amino ácidos e outras moléculas necessita de ferredoxina reduzida (Durnford & Falkowski, 1997). Neste trabalho nós investigamos a regulação do metabolismo fotossintético e a assimilação do nitrato, em plantas trangênicas de tabaco que produzem uma proteína da ervilha de 28kDa do sistema principal do complexo LHCII. As análises foram conduzidas em condições de baixa luminosidade. Os resultados demostraram um aumento na assimilação de nitrogenio das plantas transgênicas, evidenciado pelo maior estado de ativação da nitrato redutase, maior atividade da glutarnina sintetase e mudanças no conteúdo de amino ácidos. Glutamato e Glutarnina aumentaram nas folhas das plantas transgênicas, enquanto Treonina teve uma severa diminuição. / not available

La lecture qu\'Hegel fit de l\'ontologie spinozienne a eu une influence majeure sur des générations entières de lecteurs, qui ont lu Spinoza à partir de la représentation hégélienne des supposées vertus et défauts de celui-ci. L\'effet le plus évident de la force qu\'a eue cette interprétation fut la tendance commune à classifier Spinoza comme étant un philosophe idéaliste. Tendance qui a dérivé au point que des figures clefs de la pensée critique du vingtième siècle finirent par ignorer ses apports. Et cela parce qu\'il était jugé comme faisant partie d\'une tradition étrangère aux aspirations d\'émancipation avec lesquelles diverses philosophies se sont identifiées, à partir des nouvelles fondations instituées par l\'oeuvre de Marx. En prétendant ouvrir des dialogues, à partir de Spinoza, avec des auteurs plus ou moins associés à la tradition dialectique, nous défendons la légitimité d\'une lecture de l\'Éthique dans une perspective matérialiste. Comment peut-on penser la singularité et l\'histoire au sein d\'une philosophie de l\'immanence qui s\'appuie sur l\'affirmation de l\'existence éternelle d\'une unique substance infinie? Tandis que l\'ontologie spinozienne pose, en premier lieu, l\'existence d\'une unique substance absolument infinie, toute une tradition de lecteurs dont fit partie Hegel a fait de la question relative à la détermination des êtres finis l\'axe de la critique au spinozisme. La difficulté à comprendre la conception spinozienne, assez particulière, de la totalité (en tant que substance), celle de l\'effectivité qui réalise (la causalité immanente), ainsi que celle des différentes formes de réalité, de production et de détermination qui la constituent (les attributs, les modes infinis et les modes finis) fut alors une source prolifique de polémiques autour d\'un problème que nous pourrions résumer ainsi: quelle serait la manière la plus appropriée de penser la détermination au sein d\'une totalité infinie? Une lecture matérialiste de la pensée spinozienne de l\'infini positif s\'avère nécessaire afin de tenter de répondre à cette question. / A leitura que Hegel fez da ontologia espinosana teve uma influência maiúscula em gerações inteiras de leitores, que leram Espinosa a partir da representação hegeliana de suas supostas virtudes e defeitos. O efeito mais evidente da força que teve essa interpretação foi a difundida tendência a classificar Espinosa como um filósofo idealista. E isso, por sua vez, derivou em que importantes expoentes do pensamento crítico do século XX ignorassem seus aportes, por julgá-lo parte de uma tradição alheia às aspirações de emancipação com as quais se identificaram diversas filosofias logo da fundação teórica que a obra de Marx significou. Pretendendo abrir diálogos, a partir de Espinosa, com autores mais ou menos associados com a tradição dialética, defendemos a legitimidade de uma leitura da Ética sob uma perspectiva materialista. Como pensar a singularidade e a história no interior de uma filosofia da imanência que se sustenta sobre a afirmação da existência eterna de uma única substância infinita? Enquanto a ontologia espinosana coloca, em primeiro lugar, a existência de uma única substância absolutamente infinita, toda uma tradição de leituras da qual Hegel formou parte fez da questão relativa à determinação dos seres finitos o eixo da crítica ao espinosismo. A dificuldade para compreender a peculiar concepção espinosana da totalidade (enquanto substância), da efetividade que realiza (causalidade imanente), e das formas diversas de realidade, de produção e de determinação que a constituem (atributos, modos infinitos e modos finitos) foi, então, uma fonte prolífica de polêmicas em torno a um problema que poderíamos sintetizar assim: qual é a forma mais apropriada de pensar a determinação no interior de uma totalidade infinita? Uma leitura materialista da concepção espinosana do infinito positivo é necessária para responder essa questão.

Foi produzida a proteína recombinante do domínio extracelular da subunidade 2 do receptor do IFN-alfa em forma de proteína de fusão com a glutatione-S-transferase (GST-IFNAR2cEC) em E. coli, com o objetivo de avaliar seu efeito bloqueador sobre a ação do IFN-alfa. A GST-IFNAR2cEC de forma solúvel, com peso molecular 54 kDa, foi obtida quando a proteína recombinante foi expressa a 25 graus C por indução de IPTG e foi lisada por French Press. A avaliação do efeito bloqueador da GST-IFNAR2cEC foi feita utilizando-se 3 métodos: 1) Ensaio antiproliferativo com células Daudi, 2) ensaio antiviral com células Hep 2/c e vírus encefalomiocarditis, e 3) expressão gênica semi-quantitativa do STAT 1 (transdutor de sinal e ativador de transcrição) e da 2',5'-oligoadenilato sintetase (OAS) pela RT-PCR duplex nas células Daudi e Hep 2/c. A GST-IFNAR2cEC, mesmo a 420 nM, não inibiu as atividades antiproliferativa e antiviral de 24,5 pM e 49 pM de rIFN-alfa2 provavelmente devido à sua ineficiência na competição com o IFNAR da superfície celular durante o longo período de incubação nos ensaios realizados. A expressão gênica do STAT 1 não foi inibida pela GST-IFNAR2cEC nas células Daudi e Hep 2/c, porém inibiu-se a da 2’, 5’-OAS. Estes resultados sugerem que a expressão gênica do STAT 1 é independente da ligação do IFN-alfa com a IFNAR 2c, e que a da 2’, 5’-OAS é dependente dessa ligação nessas células

Orientador: Carmen Lucia Soares / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Educação / Made available in DSpace on 2018-08-02T03:46:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Terra_ViniciusDemarchiSilva_M.pdf: 9457718 bytes, checksum: 2a4702f8ddb965df81a6de666850ae5c (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Conduzidos inicialmente pela cronofotografia de Etienne-Jules Marey, percorremos os caos metodológicos desse fisiologista Francês em suas análises de ecomposição do movimento, buscando persistências de um suposto programa de educação visual do corpo urbano na memória das representações visuais da ciência médica do final do século XIX e na arte do começo do século XVI. A pesquisa teve como fontes inspiradoras as imagens de Marey em seu esforço de captação, decomposiçâo e síntese gráfica do movimento corporal, e seguiu em busca das persistências desta forma de olhar o corpo nos estudos anatômicos e pictóricos de Leonardo Da Vinci. Pudemos perceber, neste arcabouço de imagens, uma mudança nas formas de representação e estudo visual do corpo (e da alma): nelas o corpo, mecânico e termodinâmica, devidamente harmonizado cm qualidades médias e prudentes, serve como modelo das nossas formas de imaginar o real e de reproduzi-lo. Envolvido nesta trama, encontramos Georges Demeny, assistente de Marey e fundador do Método de Ginástica lèacional, o projeto pedagógico-laboratorial que sistematizaria os conceitos visuais que estudamos num notável modelo de Educação Física, que, por sua vez, se encarnaria nos corpos do trabalho, da nação, da urbes. Atravessando toda a nossa escrita, lampeja a máquina fotográfica, uma alegoria da cidade. Este complexo aparato urbano é entendida, também, como lugar de educação da memória. Ela (a máquina) é uma imagem em potência que em suas preciosas fagulhas ajuda-nos a entender os lastros pedagógicos que emanam da urbes: caixa-preta de tácitos mecanismos, ela conserva a memória, filtra a luz, comprime as aberturas, regula as velocidades da cidade. Enfim: educa os corpos, em sua sensibilidade mecânica e poética / Abstract: Initially based on the Etienne-Jules Marey¿s chronophotography, we went through the methodological research of this French physiologist about the analysis of the fagmentation of the movement, searching for a persistence of a supposed ¿visual educational program of the urban body¿ in the memory of visual representation in the late nineteenth century medical science and in the art of the beginning of sixteenth century.Present research had as inspiration Marey¿s images -- which were result of Marey effort to capture, decompose and graphically summarize body movement -- and it aimed to relate this way of describing the body with Leonardo da Vince¿ anatomical and pictorial studies. It was possible to notice, in this set of images, a change in the representation and in the visual study of the body (and soul): the body, mechanical and thermodynamic, accurately harmonized with medium and prudent qualities, is a model of our ways of imagine the reality and reproduce it. Involved in this study, we could find Georges Demeny, Marey¿s assistant and founder of the ¿Rational Gymnastics Method¿, the pedagogic-investigative project that systematized the visual concepts that we study, creating a notable model of Physical Education, which influenced the current concept of body of work, nation and urbes. Throughout this study, it flashes the camera, an allegory of the city. This complex urban device is understood, also, as a place of education of memory. The camera is a potential image that help us to understand the pedagogic traces drawn by the urbes: black box of tacit mechanisms, it preserves the memory, filters the light, compresses the apertures, regulates the speed of the city. Finnaly, it educates mechanically and poetically the bodies / Mestrado / Educação, Conhecimento, Linguagem e Arte / Mestre em Educação

Orientador : Antonio Condino Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T11:21:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Motta_PericlesMendoncaDiasda_D.pdf: 28986078 bytes, checksum: 7671ac8cbb611b4ea7ab9230a9d96ae6 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A anemia falciforme é uma alteração genética das hemácias, caracterizada por hemólise crônica e episódios de crises de oclusão vascular. O defeito genético consiste em uma mutação na posição 6 da cadeia f3da hemoglobina, que confere às hemácias alterações na sua forma e estrutura, tornando-as mais rígidas, deformadas e distorcidas, com tendência para a formação de polúneros e conseqüente obstrução do fluxo sanguíneo. Um simples ponto de mutação transforma a anemia falciforme em uma entidade clínica heterogênea, sugerindo a idéia de que diferentes mecanismos possam estar envolvidos. O mecanismo exato, pelo qual o fluxo sanguíneo normal é interrompido pelas hemácias, ainda não é totalmente esclarecido. Numa doença como a anemia falciforme, na qual a velocidade da passagem das hemácias rígidas pelos vasos sanguíneos tem importância relevante, o tônus e a regulação vascular assumem papel primordial, sendo este controle mediado, em parte, pelo óxido nítrico, cuja ação é inibidapelo superóxido. Diversos estudos têm indicado o envolvimento da lesão endotelial e do processo inflamatório subclínico no desencadeamento e progressão dos processos da oclusão vascular. A participação dos leucócitos no dano aos tecidos dos pacientes com anemia falciforme é objeto de investigação, sendo a leucocitose um fator de mau prognóstico na doença. Investigou-se inicialmente a liberação do óxido nítrico pelos leucócitos, analisando sua capacidade de inibir a agregação de plaquetas lavadas induzida pela trombina. Os resultados mostram que os granulócitos de pacientes com anemia falciforme (n=9) liberam óxido nítrico de maneira similar aos granulócitos de controles sadios (n=9), pois foi necessário um número semelhante de células para inibir a agregação plaquetária (mediana de 4,4 x 106e 4,3 x 106,respectivamente). Na ausência de SOD, não foi detectada liberação de óxido nítrico pelos leucócitos mononucleares de pacientes com anemia falciforme (n=9), pois eles não afetaram a agregação de plaquetas nesta situação. Na presença de SOD, não houve diferença na liberação do óxido nítrico entre leucócitos mononucleares de pacientes com anemia falciforme e controles, pois o número de leucócitos mononucleares necessário para inibir a agregação de plaquetas foi semelhante entre os pacientes (mediana de 3,4 x lO6ml, n=9) e os controles sadios (mediana de 3,3 x lO6ml,n=9). Os fagócitos contêm uma nicotinamida adenina inuc1eotídeofosfato (NADPH) oxidase (forma reduzida) associada à sua membrana citoplasmática, que gera superóxido e outros reativos intermediários tóxicos do oxigênio, os quais apresentam potencial de injúria aos tecidos. O sistema NADPH-oxidase é composto por cinco subunidades: p40-pho / Abstract: Sickle cell anemia is a genetic disorder of red blood cells characterized by chronic hemolysis and episodic vaso-oclusive crisis. The molecular defect is caused by a point mutation at the 6thposition ofthe f3chain ofhemoblobin, which leads erythrocytes to abnormal sickle shape, rigidity, deformability and distortion with consequent blood flow obstruction. A single point mutation leads sickle cell disease to a clínical heterogenous disorder, supporting the idea that a different set of mechanisms might be involved in this disease. It is still not completely understood how sickle erythrocytes interrupt blood flow. Current evidence indicate that endothelium damage, and a subclínical inflammatoryprocess take place in the initiation and progression of vascular occlusion. The role of leukocytes in the tissue injury of sickle cell anemia patients is a current subject of investigation. The NADPH-oxidase system of professional phagocytes catalyzes the production of superoxide by the one-eletron reduction of oxigen (respiratory burst). This is the starting point for the production of reactive oxidants species, which are potential tissueinjury mediators. The NADPH-oxidase system is composed by tive components: p40-Phox p4TPh°x,p6Tphoxexist in the cytosol as a complexoThe other two components gp91-phoxandp22-PhOX form the cytocrome b558in the cell membrane and function as the terminal electron carrier ofthe oxidase. Afier activation, the cytosolic complex migrate to membrane binding to citocrome b558and assemblythe active oxidase. The involvement of the leukocyte NADPH-oxidase system has not been investigated before in sickle cell anemia. The experimental approach was focused on: a) the release of nitric oxide by neutrophils and mononuclear leukocytes ITom sickle cell anemia patients. It was assayed by the ability of leukocytes to inhibit thrombin-induced washed platelet aggregation. Neutrophils ITom sickle cell anemia patients released nitric oxide in a similar manner to those ITomhealthy controls. The inhibition of platelet aggregation by neutrophils ftom sickle cell anemia or ftom hea1thycontrols was blocked by L-NAME (300JlM), but not by D-NAME (300JlM), and was reversed by L-arginine (lmM). Additionaly, a similar number of neutrophils ftom sickle cell anemia patients and írom healthy controIs was required to inhibit platelet aggregation. Mononuc1ear leukocytes írom sickle cell anemia patients inhibited platelet aggregation only in the presence of superoxide dismutase (60 U rnl-I) b) the release of superoxide by neutrophils and mononuc1earsickle cell anemia leukocytes. lt was assassed by the SOD specific inhibition of cytochrome c reduction assay. PMA (30nM) or ZYM (100 partic1es/cell)-induced release of superoxide by mononuc1ear leukocytes :lTomsickle cell anemia patients was significant1yhigher than that observed in mononuc1ear leukocytes írom healthy controIs (p<0,001 e p<O,Ol, respectively, Mann-Whitney test). The levels of superoxide released by neutrophils írom sickle cell anemia patients was similar to those írom healthy controIs. c) the activity of SOD or cellular glutathione peroxidase in neutrophils and mononuc1ear leukocytes írom sickle cell anemia patients was assayed by the xantine-oxidase induced cytochrome c reduction and the cellular glutathione peroxidase activity was asseyed by the NADPH oxidation induces by tbuthyl hydroperoxide. The activites of SOD and GHS-Px in neutrophils and mononuc1ear sickle cell anemia leukocytes were similar to those ITom healthy controIs d) the gene expression of gp91-phox, p22-phoxand p6Tphoxin mononuc1ear sickle cell anemia leukocytes. Monocytes' RNA :lTom steady state sickle cell disease patients and healthy control subjects were used in a quantitativerelative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). The results revealed that gp91-phoxrelative gene expression in mononucIear leukocytes írom sickle cell anemia patients (n=21) was significant1yhigher compared to healthy controIs (n=23, p=0,03, Mann-Whitney test) and that p2Tphox(n=24 patients, 24 controls) and p6Tphox(n=22 patients, 22 controls) relative gene expression in mononuc1ear sickle cell anemia leukocytes was similar to healthy controIs.e) the phosphorylation of a group of 47kDa cell proteins. It was assayed by the incorporation of 32P-Labeledby sickle cell (n=4, 4 x1O7cells/rnl) or healthy controls (n=6, 4 xl07 cells/rnl) mononuclear leukocytes, in basal state or after stimulation with PMA (30nM). We found a higher phosphorylation in 47kDa protein sickle cell mononuclear leukocytes than in healthy controls. Conclusions The results have shown that leukocytes :&om sickle cell anemia patients released nitric oxide in a similar manner to those :&omhealthy controls; sickle cell anemia mononuclear leukocytes release more superoxide, when stimulated with PMA or ZYM, than mononuclear leukocytes ITom healthy controls; gp91-PhoXgene expression is upregulated in monocytes :&omsickle cell patients compared to healthy controls, and the phosphorylation of 47kDa proteins in sickle cell anemia mononuclear leukocytes is more intense than healthy controls. The NADPH-system is activated in sickle cell anemia mononuclear leukocytes and may be responsible, at least in part, for the inactivation of nitric oxide. This may contribute to inflammationand vascular dysregulation in sickle cell disease / Doutorado / Pediatria / Doutor em Saude da Criança e do Adolescente