Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2015-05-26T15:12:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Leandro, Danilo de Carvalho. Doutorado Acadêmico em Biologia.pdf: 5056189 bytes, checksum: 0f4442baabaf84edda19f8013a0c4012 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-26T15:12:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Leandro, Danilo de Carvalho. Doutorado Acadêmico em Biologia.pdf: 5056189 bytes, checksum: 0f4442baabaf84edda19f8013a0c4012 (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / FACEPE / O mosquito Aedes aegypti, devido à sua importância na transmissão do vírus dengue, vem sendo estudado para compreensão de aspectos relacionados à competência vetorial. Os ovários, importante órgão envolvido na reprodução do vetor e implicado na transmissão viral transovariana, tem sido negligenciados nas análises de infecção viral. Diante disso, o presente trabalho analisou diversos aspectos da transmissão transovariana, como a cinética de infecção dos ovários pelo vírus Dengue, as taxas de transmissão transovariana na primeira geração filial (F1), a influência viral na fertilidade e fecundidade vetorial, os aspectos citopatológicos e ultraestruturais provocados pelo vírus no tecido ovariano, bem como a expressão diferencial de genes de resposta imune e pró-apoptóticos em ovários de A. aegypti. Experimentos de infecção artificial com vírus Dengue sorotipo 2 (DENV-2) foram conduzidos em laboratório, utilizando a população de A. aegypti proveniente de campo (Petrolina). Para as análises de cinética de infecção ovariana ao 7º, 14º, 21º e 28º dia após a infecção (dpi), dois grupos experimentais foram analisados: grupo alimentação única (AU) e grupo múltiplas alimentações (MA). Investigações das taxas de transmissão viral transovariana foram conduzidas a partir da detecção viral em mosquitos machos e fêmeas, oriundos de ovos de insetos que receberam alimentação sanguínea infectada. Experimentos de fertilidade e fecundidade foram conduzidos em fêmeas que realizaram o repasto sanguíneo infectado, e posteriormente foram individualizadas para coleta de ovos. Ovários foram coletados ao 14º dpi e submetidos a processamento e análise histopatológica e ultraestutural. Análises da expressão diferencial dos genes Relish-1 (via Toll), Hop (Via JAK-STAT), Argonaute 2 (mecanismo de RNA de interferência), e dos genes envolvidos na via apoptótica Caspase 16, AeDronc, Ae IAP1, foram conduzidas em ovários de fêmeas do grupo infectado positivas para o DENV-2, no grupo infectado negativo para o DENV-2, no grupo controle, e posteriormente comparadas pelo método ΔΔCt. A positividade para o DENV-2 no tecido ovariano foi registrada ao 14º, 21º e 28º dpi nos dois grupos (AU e MA). A quantificação viral das amostras positivas para DENV-2 apresentou resultados muito similares, com exceção do 28º dpi do grupo MA. A transmissão transovariana na F1 foi registrada apenas em machos ao 14° e 21º dia após a emergência, com 13,3% e 20% de positividade, respectivamente. Nenhuma diferença significativa foi observada nos padrões reprodutivos (fecundidade e fertilidade) nas fêmeas infectadas. Nas análises histopatológicas, observou-se uma invaginação do epitélio folicular dos oócitos do grupo infectado. Nenhuma alteração a nível ultraestrutural foi observada. A expressão de todos os genes avaliados foi maior nos ovários do grupo infectado positivo para o DENV-2, quando comparado a ovários do grupo infectado negativo e controle. A infecção ovariana e a transmissão transovariana ocorrem a níveis muito reduzidos, porém, quando o vírus está presente no tecido ovariano, os títulos virais são muito similares a outros órgãos relatados na literatura. A expressão de genes envolvidos na resposta imune do hospedeiro ao vírus justifica a baixa infectividade, uma vez que se observa no ovário do grupo infectado, a expressão aumentada de todos os genes avaliados. Diante disso, concluímos que a transmissão transovariana é um evento raro e que não causa alterações importantes na biologia reprodutiva do vetor, porém, não deve ser negligenciada, uma vez que é a principal forma da permanência viral nas populações de mosquitos. / The mosquito Aedes aegypti, due to its importance in the transmission of the dengue virus, has been studied for the comprehension of aspects related to vector competence. The ovaries, important organ involved in the reproduction of the vector and implied in the viral transovarian transmission, have been neglected in the analysis of viral infection. Accordingly, the present study analyzed several aspects of the transovarian transmission as the kinetics of the ovaries infection by the dengue virus, the taxes of the transovarian transmission in the first filial generation (F1), the viral influence in the vector fertility and fecundity, the cytopathological and ultrastructural aspects motivated by the virus in the ovarian tissue, as well as the differential expression of the genes of immune response and pro-apoptotic in A. aegypti ovaries. Experiments of the artificial infection with the Dengue virus serotype 2 (DENV-2) were performed in laboratory by A. aegypti population derived from the field (Petrolina). For the analysis of the kinetics of ovarian infection to the 7th, 14th, 21st and 28th day post the infection (dpi), two experimental groups were analyzed: unique alimentation group (UA) and multiple alimentations group (MA). Investigations of the taxes of transovarian transmission were conducted starting from the viral detection in male and female mosquitoes coming from the eggs of insects which received infected blood alimentation. Fertility and fecundity experiments were directed in females which reached the infected blood repast and subsequently were individualized for the eggs collection. Ovaries have been collected to the 14th dpi and submitted to the process and histopathology and ultra-structural analysis. Analysis of differential gene process Relish-1 (Toll pathway), Hop (JAK-STAT pathway), Argonaute 2 (mechanism of the RNA interference), and of the genes involved in the via apoptotic Caspase 16, AeDronc, Ae IAP1 were conducted to the ovaries of females in the infected group positive for DENV-2 in the group infected negative for the DENV-2 and in the control group and afterwards compared by the method ΔΔCt. The positivity for the DENV-2 in the ovarian tissue was registered to the 14th, 21st and 28th dpi in the two groups (UA and MA).The viral quantification of the positive samples for DENV-2 presented similar results, with the exception of 28th dpi from the group MA. The transovarian transmission in the F1 was registered only in males in their 14th and 21st after the emergency, with 13,3% and 20% of positivity respectively. No significant difference was observed in the reproductive standards (fertility and fecundity) in the infected females. In the histopathology analysis, it was observed an invagination of the follicular epithelium of the oocytes of the infected group. No alteration to the level ultrastructural was observed. The expression of all evaluated genes was bigger in the ovaries from the infected group positive for the DENV-2, when compared to the ovaries of the infected group negative and control. The ovarian infection and the transovarian transmission happen in vey reduced levels, but if the virus is present in the ovarian tissue, the viral titles are very similar to the other organs related to the literature. The expression of the genes involved in the immune response of the host to the virus justifies the low infectivity, once it was observed in the ovary of the group infected, the expanded expression of all evaluated genes. Faced with this, we may conclude that the transovarian transmission is a rare event and that cannot cause important alterations in the vector reproductive biology, but it should not be neglected, once it is the main way of the viral permanence in the mosquitoes’ populations.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:06:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6506_1.pdf: 1303562 bytes, checksum: 762b52076d825e4670c862275fa8ebbf (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A simbiose ectomicorrízica resulta da expressão de vários genes cujas seqüências e funções devem ser conhecidas para uma melhor exploração desta simbiose. Utilizando microarranjos de cDNA para observar o padrão de transcrição fúngica nos estágios inicias da colonização, identificou-se o gene PtSRR1, cuja porção 3 foi parcialmente seqüenciada e caracterizada. Esta EST de função desconhecida é similar a uma seqüência do fungo Pisolithus microcarpus, obtida aos 21 dias de interação com Eucalyptus e depositada no GenBank. O peptídeo putativo traduzido (75 Aa) corresponde a uma molécula de origem fúngica sobrexpressa em baixa disponibilidade de nitrogênio. Este trabalho teve como objetivos a obtenção da ORF mais provável do gene PtSRR1, através da técnica RACE 5 e a caracterização in silico da proteína codificada por este gene. Para tal, discos de meio cobertos de micélio de P. tinctorius foram repicados em meio MNM líquido e após obtenção da biomassa o RNA total foi extraído e submetido à RACE 5 . O maior fragmento (~400 pb) foi selecionado, purificado e clonado. Os produtos de PCR dos clones foram seqüenciados utilizando-se iniciadores específicos para as regiões que flanqueiam o sítio de clonagem. A seqüência consenso obtida pela junção da nova seqüência (porção 5 ) com a previamente conhecida (porção 3 ) gerou um novo fragmento de 636 pb. O peptídeo traduzido da ORF mais viável (127 Aa) foi analisado através de ferramentas de bioinformática. A análise estrutural preliminar revelou quatro locais potenciais de alterações póstraducionais: dois sítios de N-glicosilação e dois sítios de fosforilação, aliados a uma forte probabilidade de que a proteína PtSRR1 seja transmembranar, composta por uma alfa-hélice hidrofóbica e uma região predominantemente hidrofílica com seis fitas-beta intercaladas por loops. Dado que o peptídeo não possui domínios conservados clássicos de proteínas previamente caracterizadas e que não há estrutura cristalizada similar depositada em bancos de dados, não foi possível prever a estrutura tridimensional da PtSRR1. Os resultados apontam para a necessidade de estudos adicionais sobre o gene da PtSRR1 como um possível controlador/marcador de desenvolvimento fúngico durante os estágios iniciais da interação ectomicorrízica

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Diferentes algoritmos têm sido usados para agrupar dados de expressão gênica, porém não há um único algoritmo que possa ser considerado o melhor independentemente dos dados a serem analisados. Neste trabalho, aplicamos técnicas de Meta-aprendizado para relacionar características de conjuntos de dados de expressão gênica ao desempenho de algoritmos de agrupamento. No nosso contexto, cada meta-exemplo representa características descritivas de uma base de dados de expressão gênica e um rótulo indicando o algoritmo de agrupamento que obteve os melhores resultados quando aplicado aos dados. Um conjunto destes metaexemplos é fornecido como entrada para um algoritmo de aprendizado (o meta-aprendiz), que, por sua vez, é responsável por adquirir conhecimento relativo às características descritivas e os melhores algoritmos. Neste trabalho, realizamos experimentos em um estudo de caso no qual um meta-aprendiz foi utilizado para discriminar entre três algoritmos de agrupamento candidatos, bem como para extrair conhecimento interpretável a partir dos experimentos. O conhecimento extraído pelo meta-aprendiz foi útil para o entendimento da aplicabilidade de cada algoritmo de agrupamento para problemas específicos

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1983_1.pdf: 1880375 bytes, checksum: 3e607e8a193587ce0ea6508c676eef4e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O volume de dados de expressão gênica vem crescendo exponencialmente nos ultimos anos devido as novas tecnologias da Biologia Molecular, que permitem medir a expressão de milhares de genes ao mesmo tempo. A analise computacional desses dados tem grande importância na Biologia e na Medicina. Ela permite, por exemplo, a descoberta de novas classes de câncer biologicamente e clinicamente significantes e a identificação de novas funções dos genes. As tecnicas de Aprendizado de Maquina não-supervisionado fazem parte da metodologia de analise usada pelos especialistas. Existem diversos algoritmos de agrupamento de dados, cada um procurando particionar os dados de uma maneira especifica. A escolha desse algoritmo e fundamental para a qualidade do agrupamento e, portanto, para a analise adequada dos resultados. Propomos uma metodologia de meta-aprendizado para a escolha dos algoritmos de agrupamento de dados no contexto de dados de expressão gênica de celulas cancergenas. Ate o momento, o meta-aprendizado vinha sendo utilizado apenas no contexto supervisionado. Nesta Dissertação, estendemos esse conceito para problemas não-supervisionados. Usamos bases de dados de diferentes experimentos com microarrays de varios estudos sobre câncer. Extraimos caracteristicas relevantes de cada base de dados a fim de emprega-las no aprendizado de Redes Neurais, k- Vizinhos Mais Proximos e Maquinas de Vetores Suporte, utilizados como meta-aprendizes. Esses metodos foram usados como sistemas de aprendizado para predizer a ordem de desempenho dos algoritmos de agrupamento, bem como selecionar o melhor algoritmo, de acordo com essas caracteristicas. Realizamos um conjunto de experimentos para validar o uso de cada meta-aprendiz. Nesse contexto, mostramos que, em media, os rankings sugeridos pelas Maquinas de Vetores Suporte são significativamente mais correlacionados com o ranking ideal do que aqueles obtidos com o ranking default. Conseguimos realizar um estudo inovador que pode ser expandido para dados de outros contextos, servindo como ponto de partida para novas abordagens

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo91_1.pdf: 688649 bytes, checksum: c8705aa51d4c00966aae21e02d8d5a4d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Lectinas são proteínas ou glicoproteínas de origem não-imune que são capazes de reconhecer e ligar-se a carboidratos de forma especifica e reversível. O isolamento e a caracterização de novas lectinas revelam propriedades que são de importância prática para diferentes áreas da pesquisa biológica. No reino vegetal, estas proteínas são abundantes em sementes, raízes, frutos, flores e folhas. A espécie Eugenia malaccensis L., conhecida popularmente no Brasil como jambo vermelho, tem sido empregado na medicina popular para diversos fins. O objetivo do trabalho foi clonar um gene de lectina em genótipo de E. malaccensis, bem como analisar a expressão gênica em diferentes tecidos da planta pela técnica RT-PCR semiquantitativo e quantitativo (q-PCR). As sequências de genes de lectinas vegetais apresentam domínios protéicos conservados em diferentes espécies. Para a clonagem do gene de lectina de E. malaccensis, foi realizado alinhamento de sequências desse gene de espécies vegetais e obtido o desenho do oligonucleotídeos para as regiões conservadas. Foram realizadas amplificações do gene, a partir do DNA gênomico, por PCR. As reações de PCR foram aplicadas em gel de agarose (1,2%) e os fragmentos obtidos foram purificados e clonados em vetor TOPO TA e sequenciados. O RNA total foi extraído utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) dos tecidos de folhas, sementes, raízes e caule e analisado a sua expressão gênica pela técnica RT-PCR semiquantitativo e PCR quantitativo (q-PCR). O conjunto de oligonucleotídeos desenhados para a clonagem do gene da lectina de E. malaccensis, amplificou um fragmento de, aproximadamente, 320 pares de bases (pb) e após o sequenciamento foi comprovada a identidade com outras sequência de genes de lectinas de plantas onde foi identificado um domínio de ligação a maose. Esse gene parcial de lectina foi denominado de EmLec1. A estratégia de clonagem gênica utilizada foi eficiente para o isolamento e caracterização do gene parcial de lectina com ligação a glicose/manose de E. malaccensis (gene EmLec1). A análise de expressão do gene EmLec1 mostrou sua síntese em diferentes tecidos vegetais, como folhas, sementes, raízes e caule em E. malaccensis. Portanto, o presente trabalho promoveu o primeiro relato sobre clonagem de gene parcial de lectina com ligação a glicose/manose de E. malaccensis, sendo o ponto inicial para futuras investigações sobre a sua função biológica

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:01:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8461_1.pdf: 682988 bytes, checksum: d7fff8575726440e9671293cfc34d7f6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Este trabalho investiga o impacto do uso de comitês de agrupamentos para a análise de dados de expressão gênica. Mais especificamente, é realizada uma comparação dos desempenhos obtidos com algoritmos de combinação (comitês) com aqueles dos algoritmos de agrupamento individuais (algoritmos base). Para isso, são utilizados três métodos de comitês de agrupamento mais estabelecidos na literatura: matriz de co-associação, re-rotulagem e votação e comitês baseados em particionamento de grafos. As técnicas de agrupamento individuais escolhidas para realizar a comparação são: k-médias, mistura finita de gaussianas e o algoritmo hierárquico. Além de representarem diferentes paradigmas de agrupamento, estes algoritmos estão sendo muito utilizados no contexto de expressão gênica. Os resultados obtidos indicam que os algoritmos de comitê conseguem recuperar melhor a estrutura real dos dados, quando comparados aos algoritmos individuais. Outro aspecto observado na análise desenvolvida é que os comitês homogêneos conseguem, em geral, um melhor desempenho do que os comitês heterogêneos. De forma geral, os resultados dos experimentos indicam que, tanto os algoritmos individuais, quanto as técnicas de comitê apresentaram pequenas diferenças entre o número de grupos gerados, para os melhores desempenhos, e o número real de classes existentes nos dados

Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-04-24T17:32:02Z No. of bitstreams: 1 TESE Larissa Melo do Nascimento.pdf: 4960362 bytes, checksum: 493832b0899c2f0c2bbe63199de0769e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-24T17:32:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Larissa Melo do Nascimento.pdf: 4960362 bytes, checksum: 493832b0899c2f0c2bbe63199de0769e (MD5) Previous issue date: 2016-09-06 / CAPES / As leishmanioses são um conjunto de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania da família Trypanosomatidae. Tais enfermidades atingem populações pobres de países subdesenvolvidos e sua incidência está associada, em parte, à ausência de quimioterápicos efetivos, o que enfatiza a importância de estudos focados na biologia desses patógenos. Nos tripanossomatídeos o controle da expressão gênica ocorre, predominantemente, a nível pós-transcricional, envolvendo a regulação da síntese proteica através dos fatores de iniciação da tradução eucarióticos (eIFs). Em mamíferos, a regulação global da tradução ocorre majoritariamente através do complexo heterotrimérico eIF2 (constituído de eIF2α, eIF2β e eIF2γ), o qual é responsável pela interação com o tRNA iniciador, GTP e a subunidade ribossomal 40S. No presente trabalho, objetivou-se contribuir na caracterização do complexo eIF2 em L infantum. Inicialmente, confirmou-se a expressão constitutiva da subunidade eIF2α durante o crescimento e diferenciação do parasito, bem como, sua associação funcional com a subunidade menor ribossomal. Mais ainda, demonstrou-se sua associação com as subunidades eIF2β e eIF2γ e com os parceiros diretos eIF2B e eIF5, nesse momento confirmando a identificação do complexo eIF2B em Leishmania. Nos tripanossomatídeos, a subunidade eIF2α apresenta uma extensão N-terminal característica, a qual se mostrou importante nas interações com eIF2B, eIF5 e ribonucleoproteínas. Interessantemente, identificou-se um novo parálogo da subunidade eIF2γ, sendo denominado aqui eIF2γ-2. Evolutivamente, o eIF2γ-2 surgiu após provável evento de duplicação exclusivo na família Trypanosomatidae e derivou acumulando características singulares em sua sequência gênica. O eIF2γ-2 é capaz de interagir com eIF2α, eIF2β, na formação de um segundo complexo eIF2 exclusivo de tripanossomatídeos, assim como, com o eIF2B e eIF5. Através de ensaios de deleção e complementação gênica, confirmou-se a essencialidade de eIF2γ e se demonstrou a incapacidade de substituição deste pelo seu parálogo eIF2γ-2. Estes resultados demonstram novos aspectos inéditos na identificação e função do eIF2 dos tripanossomatídeos, não observados em outros organismos. / Leishmaniasis is a group of diseases caused by protozoa from the genus Leishmania of the Trypanosomatidae family. These diseases affect poor people in developing countries and its incidence is associated, in part, to the absence of effective chemotherapy, which emphasizes the importance of studies focused on the biology of these pathogens. In trypanosomatids the control of gene expression occurs predominantly at post-transcriptional level involving the regulation of protein synthesis through the eukaryotic initiation factors (eIFs). In mammals, the global translation regulation is mostly controlled by the heterotrimeric complex eIF2 (formed by eIF2α, eIF2β and eIF2γ), which is responsible for the interaction with the initiator tRNA, GTP and 40S ribosomal subunit. In the present study, by characterizing the eIF2 complex in L infantum, we confirmed the constitutive expression of the eIF2α subunit during the growth and differentiation of the parasite, as well as, their functional association with the minor ribosomal subunit. Furthermore, while demonstrating the association of eIF2α with eIF2β and eIF2γ subunits and with the direct partners eIF2B and eIF5, we confirmed the identification of Leishmania eIF2B complex. Herein, we also showed that eIF2α subunit in trypanosomatids has a unique N-terminal extension that is important for interaction with eIF2B, eIF5 and ribonucleoproteins. Interestingly, a paralog of eIF2γ subunit, named here eIF2γ-2, was identified for the first time. Evolutionarily, the eIF2γ-2 gene arose most likely after a duplication event in the Trypanosomatidae family and further accumulated singular characteristics in its coding sequence. The eIF2γ-2 is able to interact with eIF2α and eIF2β, acting during the formation of a second eIF2 complex exclusive to trypanosomatids, as well as with eIF2B and eIF5. By gene deletion and complementation assays, we confirmed the essentiality of eIF2γ and demonstrated the inability to replace it by eIF2γ-2. Altogether, our data demonstrate novel features of eIF2 function of trypanosomes, not seen in other organisms.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-08-29T20:51:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Paula Ferreira Campos.pdf: 2091702 bytes, checksum: 206e041438756822063cb0f534cef65e (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-09-10T19:33:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Paula Ferreira Campos.pdf: 2091702 bytes, checksum: 206e041438756822063cb0f534cef65e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-10T19:33:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Paula Ferreira Campos.pdf: 2091702 bytes, checksum: 206e041438756822063cb0f534cef65e (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / CAPES / Os papilomavírus incluem vírus de DNA circular, geralmente envolvidos em lesões benignas do epitélio e mucosas. No entanto, alguns papilomavírus apresentam potencial oncogênico levando ao desenvolvimento de doenças como a papilomatose bovina. Atualmente, é sabido que a proteína L2 que compõe a estrutura do capsídeo, e alguns de seus epítopos são capazes de induzir a produção de anticorpos neutralizantes. Além disso, a oncoproteína E5 é responsável pelo crescimento e transformação celular, sendo o principal gene de transformação em bovinos. Entretanto, não existe disponível vacina comercial eficaz contra a infecção pelo BPV. Dessa forma, o presente trabalho consiste na construção de candidatos vacinais por meio de vacina de DNA contra a infecção por BPV. Para tal, tivemos como objetivo específico a construção de vetores vacinais a partir do plasmídeo pCI-neo e avaliamos in vitro a expressão dos respectivos antígenos em células de mamíferos. Os genes escolhidos para o estudo, L2 selvagem e o seu epítopo contido entre os aminoácidos 11 a 200, além do oncogene E5 selvagem, foram amplificados por PCR, clonados individualmente no vetor plasmidial pGEM-T easy e propagados em Escherichia coli (linhagem DH5α). Em seguida, os genes de trabalho foram previamente digeridos e subclonados no vetor pCI-neo para expressão em células de mamífero, incluindo o gene E5 sintético códon otimizado. Ambas as sequências foram avaliadas por digestão enzimática e por sequenciamento. A avaliação da funcionalidade das construções foi realizada pela expressão das mesmas em cultura de células embrionárias do Rim Humano (HEK-293 - Human embrionic kidney cell) seguida por análise da expressão gênica via RT-PCR e dos extratos proteicos por SDS-PAGE e Western-Blot. Os resultados obtidos apresentaram a expressão dos genes L2ʷᵗ, L2¹¹⁻²⁰⁰ e E5ᵒᵗⁱᵐⁱᶻᵃᵈᵒ confirmada por RT-PCR. No entanto, a produção das respectivas proteica não foi detectada pela análise via immunoblotting, demonstrando que melhorias no protocolo são necessárias. / Papillomaviruses are circular DNA viruses, generally involved in benign lesions of the epithelium and mucous membranes. However, some papillomaviruses present oncogenic potential leading to the development of diseases such as bovine papillomatosis. Currently, it is known that the viral capsid L2 protein and some of its epitopes are capable of inducing the production of neutralizing antibodies. In addition, the E5 oncoprotein is responsible for cell growth and transformation, being the main transformation gene in cattle. However, no effective commercial vaccine against BPV infection is available. Thus, the present work consists of the construction of vaccine candidates by means of DNA vaccine against BPV infection. For this propose, we specifically aimed to construct vaccine vectors from the plasmid pCI-neo and evaluated the expression of the respective antigens in vitro in mammalian cells. The genes chosen for the study, the entire L2 sequence and its epitope contained between the amino acids 11 to 200 and the wild-type E5 oncogene, were amplified by PCR, individually cloned into the pGEM-T easy vector and propagated in Escherichia coli (strain DH5α). Then, the working genes were pre-digested and subcloned into the pCI-neo vector for expression in mammalian cells, including the synthetic codon optimized E5 gene. Both sequences were evaluated by enzymatic digestion and sequencing. The evaluation of the functionality of the constructs was performed by gene expression in Human Kidney embryo cell (HEK-293) followed by analysis of the gene transcription via RT-PCR and of protein extract via SDS-PAGE and Western Blot. The results obtained showed the expression of the genes L2ʷᵗ, L2¹¹⁻²⁰⁰ and E5ᵒᵖᵗⁱᵐⁱᶻᵉᵈ confirmed by RT-PCR. However, production of the respective proteins was not detected by immunoblotting analysis, demonstrating that improvements in the protocol are required.

ARAUJO, Antônio Roberto Lucena de, também é conhecido em citações bibliográficas por: LUCENA ARAUJO, Antônio Roberto / Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-08-29T20:27:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Jéssica Vitória Gadelha de Freitas Batista.pdf: 1325693 bytes, checksum: 4544a28b935d533b1a17b98ce4822801 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-09-10T19:36:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Jéssica Vitória Gadelha de Freitas Batista.pdf: 1325693 bytes, checksum: 4544a28b935d533b1a17b98ce4822801 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-10T19:36:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Jéssica Vitória Gadelha de Freitas Batista.pdf: 1325693 bytes, checksum: 4544a28b935d533b1a17b98ce4822801 (MD5) Previous issue date: 2017-02-14 / CNPq / A anemia falciforme (AF) é uma doença marcada por grande heterogeneidade clínica. Diante disso, muitos genes são investigados a fim de avaliar sua possível modulação no curso clínico da doença: dentre eles, o KLOTHO (KL), que está envolvido na biologia do óxido nítrico, estresse oxidativo e adesão vascular. Com o objetivo de avaliar o papel de polimorfismos em KL na clínica dos indivíduos com AF, investigamos os SNPs rs211239 (A>G) e rs685417 (G>A) e sua possível associação com algumas complicações clínicas da doença. Também investigamos os níveis de expressão de KL, para avaliar possíveis diferenças entre os genótipos dos SNPs estudados e entre as complicações clínicas analisadas. O estudo foi conduzido por comparação de grupos (casos e controles). Após análise de 703 pacientes, não foram encontradas associações do SNP rs211239 com nenhuma das complicações. Em contrapartida, os portadores dos genótipos GA e AA para o SNP rs685417 apresentaram maior frequência de crises vaso-oclusivas (p=0,006), de doença cerebrovascular (DCV) (p=0,017), maior número de complicações (p=0,029) e menor tempo para desenvolvimento de DCV (p=0,004) quando comparados aos indivíduos com genótipo selvagem (GG). No que concerne aos níveis de expressão, não foram encontradas diferenças entre os diferentes genótipos dos polimorfismos nem com as complicações. Por outro lado, houve diferença entre indivíduos com AF (HbSS) e sem AF (HbAA) (p=0,0001). Dessa forma, pôde-se perceber que os genótipos GA e AA do SNP rs685417 parecem indicar um pior prognóstico ao paciente, embora não tenham se mostrado como fator que altera os níveis de expressão. / Sickle cell anemia (SCA) is a disease characterized by high clinical heterogeneity. Therefore, many genes are investigated in order to evaluate their possible modulation in the clinical course of the disease: among them, KLOTHO (KL), which is involved in the biology of nitric oxide, oxidative stress and vascular adhesion. In order to evaluate the role of KL polymorphisms in the clinical setting of individuals with SCA, we investigated the SNPs rs211239 (A>G) and rs685417 (G>A) and their possible association with some clinical complications of the disease. We also investigated KL expression levels to evaluate possible differences between the genotypes of the studied SNPs and between the clinical complications analyzed. The study was conducted by performing a comparison of groups (cases and controls). The analysis of 703 patients showed no associations of the SNP rs211239 with any of the complications. On the other hand, patients with GA and AA genotypes for the rs685417 SNP had a higher frequency of vaso occlusive crises (p = 0.006), cerebrovascular disease (CVD) (p = 0.017), a greater number of complications (p = 0.029), and a shorter time to develop CVD (p = 0.004) when compared to individuals with wild genotype (GG). Regarding the levels of expression, no differences were found neither between the different genotypes of the polymorphisms nor with the complications. On the other hand, a notable difference was seen between subjects with SCA (HbSS) and without SCA (HbAA) (p = 0.0001). Thus, the genotypes GA and AA of the SNP rs685417 seem to indicate a worse prognosis for the patient, although they have not yet been shown as factors that change levels of expression.

Made available in DSpace on 2018-08-23T21:50:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12426_Tese - Suzanny Oliveira Mendez.pdf: 3561701 bytes, checksum: 0f0fd989fd5e8dceb41830e39d57ae5c (MD5) Previous issue date: 2018-04-12 / O tabagismo é uma das principais causas de morte evitável do mundo e está relacionado ao surgimento de diversos tipos de tumores, dentre eles o câncer colorretal. Estudos com tumores sólidos mostram que a hipóxia é um importante fator preditor de resposta prognóstica e as vias de hipóxia, estresse oxidativo e imunossupressão podem atuar na progressão tumoral, influenciar a resposta ao tratamento e a resposta imunológica. Uma vez que estas vias podem ter a expressão de seus genes afetada tanto pela exposição à fumaça do cigarro quanto à radioterapia, o presente trabalho buscou investigar a influencia destes fatores de exposição na expressão das proteínas PHD3, HIF-1α, VEGF, RA2A e Foxp3 nos infiltrados intra e peritumorais de câncer colorretal induzido. Para tanto, foram utilizados 53 ratos Wistar, 5 com o intestino saudável como controle negativo (G0) e os 48 ratos restantes foram induzidos à tumorigênese colorretal com 1,2-dimetilhidrazina (DMH) e divididos em 4 grupos, Grupo DMH (G1), Grupo DMH/Radioterapia (G2), Grupo DMH/Fumaça (G3) e Grupo DMH/Fumaça/Radioterapia (G4). A exposição à fumaça do cigarro dos grupos G3 e G4 ocorreu em câmara de inalação e correspondeu a 12 cigarros por dia/grupo durante 20 semanas. Na 21ª semana, os animais do grupo G2 e G4 foram submetidos a três sessões de radioterapia na dose de 700 cGy cada, totalizando 2500 cGy. Na 22ª semana, os animais foram eutanasiados e as lesões fixadas, processadas e coradas com hematoxilina e eosina para diagnóstico. As lesões classificadas como Adenocarcinoma Tubular foram submetidas à Imunohistoquímica para as proteínas PHD3, HIF-1α, VEGF, da via de hipóxia, SOD-1 da via de estresse oxidativo e RA2A e Foxp3 da via de imunossupressão. Todas as amostras tumorais e controles foram analisadas nos infiltrados intra e peritumoral de forma semi-quantitativa e avaliados quanto à exposição à fumaça do cigarro e radioterapia na modulação da expressão destas proteínas. A resposta à radioterapia também foi avaliada pelo índice apoptótico através do anticorpo da caspase-3 clivada nas amostras pertencentes aos grupos G2 e G4. Os resultados mostraram uma relação entre a exposição à fumaça do cigarro e radioterapia com alteração da expressão das proteínas nos infiltrados inflamatórios intra e peritumorais. A expressão das proteínas pode diferir entre os tipos de infiltrado inflamatório, bem como da expressão em células tumorais, mostrando a importância da função diferencial destas células no microambiente tumoral. Além disso, o grupo exposto à fumaça e radioterapia apresentou melhores características histopatológicas em relação à malignidade e melhor resposta terapêutica. Assim concluímos que os ratos expostos à fumaça do cigarro e tratados com radioterapia apresentaram melhores parâmetros histoquímicos dos marcadores de morte celular, inflamação, progressão tumoral, estresse oxidativo e resposta à radioterapia do que os não expostos à fumaça do cigarro. Uma vez que a fumaça é consagrada como indutora de tumor em vários estágios da tumorigênese, e que nossos resultados mostraram características opostas, sugerimos a necessidade de novos estudos que confirmem o real impacto do tabagismo nos processos de tumorigênese, inflamação e na resposta ao tratamento radioterápico.