Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2017-06-22T17:56:36Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2017JayseAlves.pdf: 4506420 bytes, checksum: dedcd5eff39e84090c374a45682030f9 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2017-06-26T18:45:35Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2017JayseAlves.pdf: 4506420 bytes, checksum: dedcd5eff39e84090c374a45682030f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-26T18:45:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2017JayseAlves.pdf: 4506420 bytes, checksum: dedcd5eff39e84090c374a45682030f9 (MD5) Previous issue date: 2017-06 / CAPES / Doenças onco-hematológicas são um grupo heterogêneo de neoplasias, originadas da expansão clonal de uma célula da linhagem linfoide ou mieloide, com capacidade proliferativa e auto-replicativa aumentada, e que possuem alta morbi-mortalidade no Brasil e no mundo. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer, neoplasias malignas têm constituído um sério problema de saúde pública e, apesar das evoluções no tratamento, a maioria dos pacientes tem sua qualidade de vida comprometida e futuro incerto quanto a possíveis recidivas da doença. Assim, estudos sobre os mecanismos moleculares destas doenças são fundamentais para o desenvolvimento de terapias eficazes, rápidas e seletivas, visto que poucas estratégias terapêuticas têm sucesso em serem eficazes sem desencadear toxicidades ou efeitos tardios debilitantes. O presente estudo teve por objetivo verificar alterações na expressão de genes envolvidos no fenótipo maligno de doenças onco-hematológicas, mediante ao tratamento com quimioterápicos clássicos e agente desmetilante decitabina. Para realização dos experimentos, foram utilizadas as linhagens celulares KASUMI-1 (leucemia mieloide aguda), K-562 (leucemia mieloide crônica) e RAJI (linfoma não Hodgkin). As células foram plaqueadas a uma densidade de 3 x 104 células/poço e tratadas com diferentes concentrações de diferentes quimioterápicos utilizados na clínica. Após 24 e 48 horas de tratamento, foi avaliado o crescimento, a viabilidade e a sobrevivência celular e, na última avaliação, foi feita a extração de RNA total das células. A síntese de cDNA foi realizada com 100 ng de RNA e a expressão gênica dos genes IDH2, TET2, EZH2, e KDM2B foi avaliada através de qPCR utilizando o gene da actina e GAPDH como controle de expressão. Foi possível observar modulação da expressão gênica antes de mudança de fenótipo na cultura celular para os genes testados nos quimioterápicos utilizados. Ainda, foi possível demonstrar que existe uma diferença entre a associação do quimioterápico com a decitabina isolada. Os genes testados podem apresentar um possível potencial como biomarcadores em resposta e acompanhamento de tratamento de doenças onco-hematológicas.

Salmonella é um dos principais agentes de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) em todo o mundo. No Rio Grande do Sul, uma cepa de Salmonella Enteritidis vem sendo identificada como o principal agente causador de DTA na última década, a qual foi nominada SE86. Quando comparada com outros sorovares de Salmonella, a SE86 demonstrou maior capacidade de adaptação ácida e térmica, além de maior resistência contra diferentes sanificantes. O presente estudo teve como objetivo investigar o envolvimento dos genes rpoS e dps na resistência ao hipoclorito de sódio e do gene ompR na adaptação ácida e resistência térmica da cepa S. Enteritidis SE86. Os genes avaliados foram atenuados pela técnica de Knockout e a expressão dos mesmos foi investigada pela técnica Epitope Tagging - 3 x FLAG. Os resultados demonstraram que a cepa mutante SE86, sem a presença do gene dps ( dps), demonstrou uma maior sensibilidade em relação à cepa SE86 Wild Type (WT), após a exposição ao hipoclorito de sódio a 200 ppm. As proteínas Rpos e Dps foram ativamente expressas nas mesmas condições de exposição ao hipoclorito de sódio, demonstrando assim a relação destes genes com o estresse oxidativo provocado por hipoclorito de sódio na SE86. O envolvimento do gene ompR na resistência térmica foi investigado após a adaptação ácida de SE86 WT e do mutante ompR. As células ácido adaptadas do mutante ompR foram completamente inativadas após 240 minutos de exposição a temperatura de 52º C, enquanto que as células WT resistiram até 300 minutos de exposição. A expressão da proteína OmpR foi observada por Western blotting e confirmou a relação da adaptação ácida com a maior resistência térmica da SE86. / Salmonella is one of the main agents of foodborne diseases worldwide. In Rio Grande do Sul, a clone of Salmonella Enteritidis has been identified as the main cause of foodborne diseases in the last decade, which was named SE86. The the present study aimed to investigate the involvement of rpoS and dps genes in resistance to sodium hypochlorite and ompR gene in acid adaptation and thermal resistance of the strain S. Enteritidis SE86. The genes evaluated were attenuated by knockout technique and their expression was determined by tagged (3XFLAG) strains. The results demonstrated that strain S. Enteritidis SE86 without the presence of dps gene ( dps) showed a higher sensitivity to the wild type strain SE86 (WT) when exposed to sodium hypochlorite at 200 ppm. Furthermore, RpoS and Dps proteins were actively expressed in these experimental conditions, thus demonstrating the relationship of these genes with oxidative stress in S. Enteritidis SE86 caused by sodium hypochlorite. The involvement of ompR gene in thermal resistance was observed after the acid adaptation of S. Enteritidis SE86 WT and ompR since cells adapted acid without the presence of ompR have been completely inactivated when exposed to 240 min at temperature of 52 °C, while WT cells resisted until 300 min of exposure. The expression of the OmpR protein by western blotting confirmed the necessity of the acid adaptation for that S. Enteritidis SE86 resists to high temperatures.

A prática de exercício físico de mulheres nos períodos de preconcepção e gestação causa uma série de efeitos benéficos no desenvolvimento da prole. Pouco se sabe, no entanto, sobre a influência do exercício físico masculino sobre seus descendentes. Como a espermatogênese é um processo contínuo, as experiências de vida dos pais poderiam reprogramar o genoma dos espermatozoides por meio de processos epigenéticos, por exemplo, que poderiam interferir no desenvolvimento da prole. A presente dissertação tem como objetivo estudar essa hipótese. Examinamos os efeitos do exercício físico paterno sobre os seguintes parâmetros de desenvolvimento da prole: maturação corporal, desempenho cognitivo, expressão do BDNF muscular, no hipocampo e córtex frontal; e metilação global do DNA no hipocampo. Para tanto, ratos Wistar machos foram divididos em dois grupos: sedentários e exercitados. O protocolo de exercício físico consistiu de corrida na esteira por um período de 8 semanas. Após, os animais foram expostos às fêmeas em período fértil e não-treinadas. Os filhotes de ambos os grupos de pais foram submetidos a testes para avaliação do ganho de peso e medidas de crescimento, do primeiro dia pós-natal (P1) até o P21 A partir do P46, foram realizadas a medida indireta do consumo máximo de oxigênio e a avaliação da aprendizagem espacial e memória, até o P52. Os animais foram submetidos à eutanásia; os músculos dos membros posteriores, os testículos, as glândulas adrenais e a gordura gonadal foram pesados. Os resultados mostram que a prole de pais treinados e de não-treinados não diferem quanto às medidas físicas, desempenho físico, avaliação cognitiva e expressão do fator trófico. No entanto, houve uma diminuição significativa no peso dos testículos e da gordura gonadal na prole de pais treinados. O nível de metilação do DNA no hipocampo de filhos de pais exercitados apresentou uma diminuição, comparada ao grupo de filhos de pais sedentários. Esse resultado aponta para uma maior expressão gênica no grupo exercitado. Embora no presente estudo os mecanismos pelos quais o exercício paterno influencia o desenvolvimento da prole não tenham sido estabelecidos, reforça-se o papel essencial que a atividade física tem em um estilo de vida saudável e na prevenção de doenças, além de não gerar prejuízos ao desenvolvimento dos descendentes. / The physical exercise of women in the pre-conception and gestation periods causes a series of beneficial effects on offspring development. Little is known, however, about the influence of male physical exercise on their offspring. As spermatogenesis is a continuous process, the life experiences of the fathers could reprogram the sperm genome by means of epigenetic processes, for example, which could interfere in the development of the offspring. The present dissertation aims to study this hypothesis. We examined the effects of paternal physical exercise on the following parameters of offspring development: body maturation, cognitive performance, hippocampus, cortex and muscle BDNF expression, and global DNA methylation in the hippocampus. Thus, male Wistar rats were divided into two groups: sedentary and exercised. The physical exercise protocol consisted of running on the treadmill for a period of 8 weeks. Afterwards, the animals were exposed to females at a fertile and untrained. The pups of both groups of parents were submitted to tests to evaluate the weight gain and growth measures from the first postnatal day (P1) to P21. From P46, the indirect measurement of maximum oxygen consumption and the evaluation of spatial learning and memory were made until P52 The animals were submitted to euthanasia; the muscles of the hindlimbs, the testicles, the adrenal glands and the gonadal fat were weighed. The results showed that the offspring of trained and untrained fathers did not differ in physical measures, physical performance, cognitive evaluation and trophic factor expression. However, there was a significant decrease in testicles weight and gonadal fat in the offspring of trained parents. The level of DNA methylation in the hippocampus of pups of exercised fathers presented a decrease, compared to the group of pups of sedentary fathers. This result points to a greater gene expression in the exercised group. Although in the present study the mechanisms by which paternal exercise influences the development of the offspring have not been established, the essential role that physical activity has in a healthy lifestyle and in the prevention of diseases is reinforced, and it does not cause the offspring development any harm as well.

O desenvolvimento de doenças que acometem a próstata está associado ao eixo de sinalização androgênica, o qual é altamente dependente do receptor de androgênios (AR) e dos níveis de androgênios circulantes. O AR atua como fator de transcrição, mediando a ativação ou repressão da transcrição de inúmeros genes. Deste modo, o AR apresenta um importante papel na regulação da proliferação e diferenciação de células prostáticas. Nesse estudo, buscamos identificar a expressão gênica de diversos genes associados à via de sinalização androgênica em amostras microdissecadas de tecido epitelial de hiperplasia prostática benigna (HPB) (n=3) e câncer de próstata (CaP) (n=3) através do ensaio TaqManArrayHumanAndrogens pela técnica de RT-qPCR, além da expressão proteica de alguns genes diferentemente expressos. A expressão gênica mostrou que 17 genes (AIG1, APPL1, BRCA1, BRCA2, CDC25B, ESR2, HSD17B3, HSD17B8, IL8, MED17, MED24, PAK6, PIM1, POR, SHH, SOAT1 e WDR19) apresentaram expressão somente no grupo CaP, 7 genes (MED13, SPDEF, RDH11, CALR, NKX3-1, KLK4 e PMEPA1) apresentaram expressão aumentada no grupo CaP em relação ao grupo HPB, 40 genes (HSD11B1, TGFB1I1, BCL2, UGT2B17, SRY, UGT2B15, MED1, RCHY1, PA2G4, KAT2B, FOXO3, MED14, SUMO1, PIAS2, CALCOCO1, HSD17B6, DAXX, MED4, PARK7, PATZ1, NR2C1, TMPRSS2, PIAS1, AR, MED12, SCARB1, PART1, PIAS3, NSD1, MED16, AOF2, ZMIZ1, NCOA1, MYST2, IGFBP5, SART3, CREBBP, TGIF1, CLDN3 e FKBP4) apresentaram expressão diminuída no grupo CaP em relação ao grupo HPB, 21 genes (AKR1C4, BMX, CRISP1, CYP11A1, CYP11B1, CYP19A1, CYP21A1, DHRS9, FGF8, GPX5, GRP, HSD3B1, IL4, INFG, SHBG, STS, SPAG11B, TGM4, UGT1A8, UGT2A1 e UGT2B7) não apresentaram expressão em nenhum dos grupos e 7 genes (ESR1, IL6, NCOA2, NCOA4, PDS5B, SRD5A1 e SRD5A2) apresentaram expressão em ambos os grupos, mas não foi possível analisá-los. Na expressão proteica do AR encontramos que este está mais expresso no núcleo de células hiperplásicas e no citoplasma em células tumorais. O BRCA1 predomina no citoplasma de células tumorais, enquanto uma pequena fração de células hiperplásicas apresenta positividade no núcleo e o NKX3-1 apresenta maior expressão citoplasmática no CaP e semelhante expressão no núcleo de ambos os grupos. Assim, este trabalho mostra a grande heterogeneidade tumoral através da variação na expressão gênica e proteica tanto de genes que favorecem como que os que impedem a permanência tumoral no tecido tumoral específico, e, acredita-se que por se tratar de um CaP primário, ainda estejam ativadas vias regulatórias que tendem a contensão tumoral. / The development of diseases affecting the prostate is associated with the androgenic signaling axis, which is highly dependent on the androgen receptor (AR) and circulating levels of androgens. The AR acts as a transcription factor, mediating the activation or repression of the transcription of innumerable genes. Thus, AR plays an important role in the regulation of prostate cell proliferation and differentiation. In this study, we sought to identify the gene expression of several genes associated with the androgenic signaling pathway in microdissected samples of benign prostatic hyperplasia (BPH) (n = 3) and prostate cancer (PC) (n = 3) by RT-qPCR , as also the protein expression of some differentially expressed genes. Gene expression showed that 17 genes (AIG1, APPL1, BRCA1, BRCA2, CDC25B, ESR2, HSD17B3, HSD17B8, IL8, MED17, MED24, PAK6, PIM1, POR, SHH, SOAT1 and WDR19) Presented expression only in the CaP group Seven genes (MED13, SPDEF, RDH11, CALR, NKX3-1, KLK4 and PMEPA1) presented increased expression in the CaP group compared to the HPB group; 40 genes (HSD11B1, TGFB1I1, BCL2, UGT2B17, SRY, UGT2B15, MED1, RCHY1, PA2G4, KAT2B, FOXO3, MED14, SUMO1, PIAS2, CALCOCO1, HSD17B6, DAXX, MED4, PARK7, PATZ1, NR2C1, TMPRSS2, PIAS1, AR, MED12 , SCARB1, PART1, PIAS3, NSD1, MED16, AOF2, ZMIZ1, NCOA1, MYST2, IGFBP5, SART3, CREBBP, TGIF1, CLDN3 and FKBP4) had decreased expression in the CaP group compared to the HPB group; 21 genes (AKR1C4, BMX, CRISP1, CYP11B1, CYP19A1, CYP21A1, DHRS9, FGF8, GPX5, GRP, HSD3B1, IL4, INFG, SHBG, STS, SPAG11B, TGM4, UGT1A8, UGT2A1 and UGT2B7) did not show expression in any of the groups and 7 genes (ESR1, IL6, NCOA2, NCOA4, PDS5B, SRD5A1 and SRD5A2) presented expression in both groups, but it was not possible to analyze them. In the protein expression of AR we find that it is more expressed in the nucleus of hyperplastic cells and in the cytoplasm in tumor cells. BRCA1 predominates in the cytoplasm of tumor cells, whereas a small fraction of hyperplastic cells is positive in the nucleus, and NKX3-1 shows greater cytoplasmic expression in CaP and similar expression in the nucleus of both groups. Thus, this work shows the great tumor heterogeneity through the variation in the gene and protein expression of both genes that favor as well as those that prevent tumor permanence in the specific tumor tissue, and it is believed to be the primary CaP, regulatory pathways that tend to contain tumor are activated.

Glioblastoma (GB) é o tumor cerebral humano mais frequente e maligno. O prognóstico dos pacientes com GB permanece alarmante, principalmente devido à baixa eficácia das estratégias terapêuticas atuais além da natureza invasiva desse tipo de câncer. Uma característica de tumores sólidos é apresentar áreas hipóxicas. Microambientes hipóxicos contribuem para a progressão do câncer, resistência ao tratamento e ao prognóstico ruim da doença. Dessa forma, neste trabalho, desenvolvemos um modelo in vitro que se aproxima ao microambiente hipóxico tumoral in vivo. Nossos resultados sugerem que a privação de oxigênio (PO) em combinação com ausência de soro forneceu um ambiente favorável à desdiferenciação das células C6 em células tronco tumorais (CTT). A doxazosina (DOX), um antihipertensivo utilizado na clínica, apresenta efeitos antitumorais em diversos tipos de câncer. Assim, avaliamos o efeito antitumoral da doxazosina em linhagens de glioma de rato (C6) e humano (U138-MG) e a toxicidade do fármaco em culturas primárias de astrócitos e culturas organotípicas de hipocampo. A doxazosina induziu morte celular nas linhagens de glioma e apresentou baixa neurotoxicidade. Além disso, o fármaco inibiu a via da PI3K/Akt e ativou GSK-3β e p53, resultando em indução de apoptose e parada no ciclo celular na fase G0/G1. Considerando a importância da mitocôndria na plasticidade de células tumorais e a resistência ao tratamento apresentada pelos GB, nós analisamos os efeitos da DOX nas interações entre núcleo e mitocôndrias. A DOX induziu biogênese mitocondrial e apoptose nas células C6 e diminuiu secreção de TNF-α. Ao analisar a estrutura química da DOX, encontramos diversas características que indicam que ela possui autofluorescência. Dessa forma, caracterizamos a autofluorescência da DOX em diversos meios. Observamos que há um padrão de distribuição do fármaco nas células C6: ele se encontra ao redor do núcleo e parece estar vesiculado. A superexpressão do receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) está relacionada às formas mais malignas e resistentes de GBs. Portanto, analisamos se a ação antiglioma da DOX está envolvida com EGFR. O tratamento com DOX foi capaz de diminuir os níveis de p-EGFR. O co-tratamento de DOX e AG1478 (inibidor de receptores de tirosina cinase) diminuiu a fosforilação de EGFR e causou necrose. Em vista disso, nossos resultados sugerem que o mecanismo de ação da DOX envolve sinalização de EGFR. Por fim, nós avaliamos os efeitos da DOX livre e nanoencapsulada (DOX-NC) em modelos in vitro e in vivo de glioma. Demonstramos que a DOX-NC induziu morte celular em linhagem de glioma em concentrações 100 vezes menores do que as que utilizamos para a DOX na sua forma livre. Além disso, analisamos o efeito da DOX-NC em culturas organotípicas de hipocampo e, da mesma maneira que o observado com a DOX, a DOX-NC demonstrou baixa toxicidade e diminuiu a área tumoral in vivo, sendo seletiva para células cancerosas. Nesta tese, alteramos o microambiente in vitro de células de glioma, avaliamos os efeitos antitumorais da doxazosina em sua forma livre e nanoencapsulada. Além disso, utilizamos modelos de glioma in vitro e in vivo e em diversos parâmetros celulares, descrevemos a autofluorescência do fármaco e também utilizamos essa característica para avaliar a captação e a distribuição da doxazosina em células de glioma. Nossos resultados contribuíram para aproximar os modelos de estudo com o que ocorre em gliomas in vivo e para evidenciar o potencial terapêutico da doxazosina como um agente antiglioma com baixa toxicidade neural e sistêmica. / Glioblastoma (GB) is the most frequent and malignant human brain tumor. The prognosis of patients with GB remains dismal, mainly due to the low effectiveness of current therapeutic strategies and the invasive nature of this type of cancer. A characteristic of solid tumors is the presence of hypoxic areas. Hypoxic microenvironments contribute to cancer progression, resistance to treatment, and poor prognosis of the disease. Thus, we developed an in vitro model that approximates the hypoxic tumor microenvironment found in vivo. Our results suggest that OD in combination with absence of serum provided an environment favorable to the dedifferentiation of C6 cells in cancer stem cells. Doxazosin (DOX), an antihypertensive used in the clinic, has antitumor effects in several types of cancer. Thus, we evaluated the antitumor effect of DOX on rat (C6) and human (U138-MG) glioma cell lines and drug toxicity in primary astrocyte cultures and organotypic hippocampal cultures. DOX induced cell death in glioma lines and showed low neurotoxicity. In addition, the drug inhibited the PI3K/Akt pathway and activated GSK-3β and p53, resulting in induction of apoptosis and cell cycle arrest in the G0/G1 phase. Considering the importance of mitochondria in the plasticity of tumor cells and the resistance to treatment presented by glioblastomas, we analyzed the effects of DOX the interactions between nucleus and mitochondria. DOX induced mitochondrial biogenesis and apoptosis in C6 cells, and decreased TNF-α secretion. When analyzing the chemical structure doxazosin, we find several characteristics that indicate that it has autofluorescence. Thus, we characterized the autofluorescence of DOX in several media. We observed that there is a pattern of distribution of the drug in the cell: it is around the nucleus and appears to be vesiculated. Overexpression of the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is related to the more malignant and resistant forms of GBs. Therefore, we analyzed whether the antiglioma action of DOX is involved with EGFR. DOX treatment was able to decrease p-EGFR levels. Co-treatment of DOX and AG1478 (a receptor tyrosine kinase inhibitor) decreased EGFR phosphorylation and caused necrosis. Thus, our results suggest that the mechanism of action of doxazosin involves EGFR signaling. We evaluated the effects of free and nanoencapsulated doxazosin (DOX-NC) in in vitro and in vivo models of glioma. We demonstrated that nanoencapsulated doxazosin (DOX-NC) induced cell death in a glioma line at concentrations 100 times lower than those used for doxazosin in its free form. In addition, we analyzed the effect of DOX-NC on organotypic hippocampal cultures and, in the same way as observed with DOX, DOX-NC demonstrated low toxicity and decreased tumor area in vivo, being selective for cancer cells. In this dissertation, we altered the in vitro microenvironment of glioma cells, we evaluated the antitumor effects of doxazosin in its free and nanoencapsulated form. In addition, we used glioma models in vitro and in vivo and analyzed several cellular parameters, we described the autofluorescence of the drug and also used this characteristic to evaluate the uptake and distribution of doxazosin in glioma cells. Our results have contributed to approximate the study models with what occurs in gliomas in vivo and to evidence the therapeutic potential of doxazosin as an antiglioma agent with low neural and systemic toxicity.

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Lindsay Unno Gimenes / Banca: Beatriz da Costa Aguiar Alves Reis / Resumo: Os procedimentos durante a sexagem pelo citômetro de fluxo garantem a acuidade de 85%, mas causam danos na viabilidade espermática que levam a baixa taxa de prenhez após os 90 dias. Os objetivos dessa Dissertação foram: 1) caracterizar a expressão gênica diferencial em transcriptoma de espermatozoides congelados pelo método convencional, sexados por centrifugação em gradiente de densidade ou sexados por citometria de fluxo; 2) comparar as taxas de clivagem e de blastocistos produzidos in vitro de bovinos utilizando sêmen convencional, sexado por citometria de fluxo ou por centrifugação em gradiente de densidade. Os grupos experimentais para sêmen e embriões foram: 1) grupo controle: sêmen convencional submetido ao gradiente de PercollTM 45/90% e respectivos embriões produzidos com esse sêmen; 2) grupo gradiente: centrifugação em gradiente de densidade e respectivos embriões produzidos com esse sêmen; 3) grupo citometria: sêmen sexado pelo citometro de fluxo, submetido ao mini gradiente de PercollTM 45/90% e respectivos embriões produzidos com esse sêmen. O RNA total foi extraído dos espermatozoides (20 x 10 6 células) obtendo-se 400 ng RNA/ 20 x 10 6 células/ animal, ou seja, 20 fg RNA por espermatozoide. Entretanto, não foi posível a construção da biblioteca de cDNA, provavelmente, devido ao alto grau de degradação do RNA. Os Complexos cumulus oócito (COCs) classificados como graus 1, foram aspirados de folículos antrais de 3 a 8 mm de diâmetro a partir de ovários de abatedouros e maturados durante 18 horas em estufa a 38,5°C, 100% de umidade e atmosfera de 5% de CO2 em ar. Os oócitos maturados serão colocados em contato com os espermatozoides previamente preparados para fecundação e incubados por 20 horas em 5% de CO2, na temperatura de 38,5°C. Os prováveis zigotos serão lavados por três vezes em meio SOF (meio sintético de fluido de oviduto) sem SFB e sem glicose e cultivados e transferidos... / Abstract: The procedures for sexing by flow cytometry guarantee the accuracy of 85%, but cause damage in sperm viability leading to lower pregnancy rate after 90 days of pregnancy. The objectives of this study were: 1) to characterize differential gene expression in transcriptome of spermatozoa frozen by conventional method, sexed by density gradient centrifugation, by flow cytometry. 2) Compare blastocyst and cleavageratesproduced in vitro by conventional semen sexed by flow cytometry and by density gradient centrifugation. The experimental groups for semen and embryos were: 1) control group: conventional semen subjected to PercollTM gradient of 45/90% and their embryos produced with this semen, 2) gradientgroup: centrifugation in density gradient and their embryos produced with this semen, 3) cytometry group: semen sexed by flow cytometer, subjected to PercollTMmini gradient 45/90% and their embryos produced with this semen. Total RNA was extracted from sperm (20 x 10 6 cells) and it was possible to extract 400 ngRNA/ 20x10 6 cells/animal or it means, 20 fg of RNA per spermatozoa. However cDNA libraries were not built, probably due a high RNA degradation. The cumulus oocyte complexes (COCs) were classified as grade 1, aspirated from antral follicles with 3-8 mm in diameter, ovariesfromslaughterhouse were used and matured for 18 hours in an incubator at 38.5°C, 100% humidity and atmosphere of 5% of CO2 in air. The matured oocytes are going to be placed in contact with the prepared spermatozoa for fertilization and incubated for 20 hours in 5% CO2 at a temperature of 38.5 °C. Presumptive zygotes are going to be washed three times in SOF (half synthetic oviduct fluid) without FBS and without glucose, cultivated and transferred to plates with four wells containing 500 ul of the same medium used for washing zygotes after fertilization. Embryonic development was evaluated 7-8 days after fertilization. The cleavage and blastocysts rates were ... / Mestre

Orientador: Eunice Oba / Coorientador: Alicio Martins Júnior / Banca: Fernanda da Cruz Landin / Banca: Yeda Fumie Watanabe / Resumo: O objetivo deste estudo foi verificar o efeito de diferentes meios e tempos de refrigeração sobre o desenvolvimento e expressão gênica de embriões bovinos produzidos in vitro. Para tanto, blastocistos D7 foram divididos em três grupos: controle, embriões mantidos em meio SOFaa, em incubadora de CO2, por 6 e 48h; refrigerados, embriões mantidos a 5 °C, em Meio 199, por 24 (M199-24h) e 48h (M199-48h) ou em meio BotuEmbryo®, por 24 (BE-24h) e 48h (BE-48h). Após a refrigeração, os embriões foram cultivados sob as mesmas condições do grupo controle para avaliação da viabilidade embrionária às 6 e 48h, e das taxas de reexpansão e eclosão, às 24 e 48h, respectivamente. Às 6h de cultivo parte dos embriões foi retirada e armazenada para posterior análise de qPCR e TUNEL. Menor porcentagem (P<0,05) de blastocistos viáveis, às 6 e 48h, foi observada no grupo M199-48 em relação ao grupo controle. A taxa de reexpansão não diferiu entre os embriões refrigerados e o grupo controle, porém, menor (P<0,05) taxa de eclosão foi observada nos grupos M199-48h e BE-48h do que no grupo controle. Maior (P<0,05) porcentagem de células apoptóticas foi observada no grupo BE-48h do que nos grupos controle e BE-24h. Os meios e tempos utilizados não alteraram a expressão dos genes HSPA1A, PRDX1, SOD1 e SLC2A1. Portanto, de modo geral, o meio e o tempo de refrigeração não promoveram efeito potencial adverso sobre a viabilidade embrionária, taxa de reexpansão e eclosão, número de células apoptóticas e expressão gênica, sugerindo o emprego do meio BotuEmbryo®, o qual é disponível comercialmente / Abstract: This study was carried out to investigate the effects of different media and cooling times on the development and gene expression of in vitro-derived bovine embryos. Therefore, blastocysts D7 were divided into three groups: control, embryos kept in SOFaa medium, under CO2 incubation, for 6, 24 and 48 hours; cooled embryos, kept in Medium 199, for 24 (M199-24h) and 48 hours (M199-48h) or in BotuEmbryo® medium, for 24 (BE-24h) and 48 hours (M199-48h). After cooling, the embryos were cultured under the same conditions used for the control group for evaluation of embryo viability at 6 and 48 hours, and of re-expansion and hatching rates, at 24 and 48 hours, respectively. At 6h of culture part of the embryos was removed and stored for later analysis of qPCR and TUNEL. Low percentage (P<0.05) of viable blastocysts, at 6 and 48 hours, was observed in group M199-48h than for control group. Re-expansion rate did not differ between cooled embryos and control group, however, lower (P<0.05) hatching rate was observed in M199-48h and BE-48h groups than for control group. Higher (P<0.05) percentage of apoptotic cells was found in BE-48h compared with control and BE-24h groups. Media and cooling times used did not alter the expression of genes HSPA1A, PRDX1, SOD1 and SLC2A1. Thus, overall, medium and cooling time did not promoted potential adverse effect on the embryonic viability, re-expansion and hatching rate, number of apoptotic cells and gene expression, suggesting the use of BotuEmbryo® medium, which is commercially available / Mestre

Orientador: Mirela Tinucci Costa / Coorientador: Renée Laufer Amorim / Banca: Felipe Augusto Ruiz Sueiro / Banca: Noeme Sousa Rocha / Banca: Geovanni Dantas Cassali / Banca: Andrigo Barboza De Nardi / Resumo: Tumores mamários são muito comuns em cadelas e apresentam comportamento biológico semelhante aos que ocorrem nas mulheres, tornando a cadela um excelente modelo de estudo comparativo. A transição epitélio-mesênquima (EMT) facilita a migração celular, favorecendo a ocorrência de metástases, fator que tem influência direta no prognóstico das pacientes com neoplasia mamária. Assim, este estudo objetivou avaliar, pela técnica de imuno-histoquimica, marcadores de EMT em tumores mamários caninos (E-caderina, β-catenina, Vimentina e Citoceratina), além da expressão gênica e protéica de dos genes WNT5A e APC pelas técnicas de RT-qPCR e imuno-histoquímica. Para isto foram utilizadas 98 cadelas, sem predileção por raça ou idade, além de glândulas mamárias normais. Quatro grupos foram formados: (G1) 5 amostras de mamas normais sem alterações histopatológicas; (G2) 28 alterações mamárias benignas; (G3) 56 carcinomas mamários sem metástase e (G4) 14 carcinomas mamários com metástase. Ambos os genes (APC e WNT5A) mostraram maior expressão entre as mamas normais, sem diferença entre neoplasias benignas e malignas (com e sem metástase). O fenótipo de EMT foi identificado pela análise multivariada, pois neoplasias benignas foram fortemente associadas à β-catenina em membrana, escore elevado de citoceratina e negatividade para vimentina nas células epiteliais, enquanto os carcinomas metastáticos foram associados à β-catenina nuclear, baixo escore de E-caderina e positividade para vimentina em suas células epiteliais neoplásicas. Como a presença de β-catenina nuclear é característica da ativação da via de sinalização do Wnt/β-catenina, é possível concluir que esta via está ativada entre as neoplasias mamárias caninas e que o processo de EMT está ocorrendo visto a transformação das células epiteliais das neoplasias benignas em um fenótipo mesenquimal como o observado nas neoplasias ... / Abstract: Mammary tumors are very common in bitches and have a very similar biological behavior to the ones that occur in women, turning it an excellent model for comparative studies. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) facilitate migration and the occurrence of metastasis, factor that have direct influence on prognosis. Thus, this study aimed to evaluate, by immunohistochemistry (IHC), EMT markers in canine mammary tumors (e-cadherin, β-catenin, vimentin and cytokeratin). In addition, gene and protein expressions of two genes WNT5A and APC were evaluated by qRT-PCR and immunohistochemistry. To this, 98 bitches with no breed or age predilection, besides normal mammary glands without neoplastic lesions were used to form four groups: (G1) 5 normal mammary samples; (G2) 28 benign mammary lesions; (G3) 56 non-metastatic mammary carcinomas and (G4) 14 metastatic carcinomas. Both genes, APC and WNT5A show higher expression between normal mammary samples and no difference among benign and malignant tumors (metastatic and non-metastatic). EMT phenotype was identified by multivariate analysis, because benign tumors were stongly associated with membranous β-catenin, high scores of Cytokeratin and no vimentin expression in epithelial cells and metastatic carcinomas were strongly associated to nuclear β-catenin, low E-cadherin expression and vimentin positivity in neoplastic epithelial cells. As nuclear localization of β-catenin is characteristic of Wnt/β-catenin signaling pathway aberrant activation, we can conclude that Wnt/β-catenin signalling pathway is activated among canine mammary tumors and EMT is occuring since benign epithelial cells have been transformed in mesenchymal cells in metastatic tumors. Those findings provide data for a better understanding of cancer progression and open new perspectives about research not only in mammary tumors, but also in other neoplastic types in dogs, facilitating to identify new prognostic factors and ... / Doutor

Introdução: O Meduloblastoma (MB) é o tumor sólido maligno mais comum do sistema nervoso central em crianças. Corresponde a aproximadamente 20% de todos os tumores intracranianos pediátricos, surge no cerebelo e sua origem é embrionária, sendo altamente invasivo. Como tratamento padrão usa-se a ressecção cirúrgica do tumor, quimioterapia e radioterapia crânio-espinhal; porém, a taxa de sobrevida livre de eventos (SLE) em cinco anos para os pacientes de baixo risco é de aproximadamente 70% e a maioria dos pacientes que sobrevivem sofre de efeitos secundários a longo prazo. Portanto, crescem as buscas por novos tratamentos que apresentem menores efeitos colaterais ou que diminuam/eliminem a necessidade de radiação. Vários fatores contribuem para o desenvolvimento e progressão da doença, entre eles, a regulação da expressão gênica por microRNAs (miRNAs). Essas moléculas regulam diversos processos biológicos, exercendo regulação gênica negativa a nível pós-transcricional; no entanto, seu papel em MB ainda é pouco explorado. Objetivo: Avaliar o perfil de expressão de miRNAs diferencialmente expressos em amostras de pacientes portadores de MB e correlacionar seus níveis de expressão com características clínicas dos pacientes, assim como identificar possíveis marcadores de prognóstico. Metodologia: Foram selecionados 15 miRNAs a partir de dados prévios obtidos pela técnica de microarranjo. Foi realizada a expressão desses miRNAs por PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) e feita a comparação com as características clínicas, utilizando amostras de pacientes portadores de MB adultos e pediátricos (N=51) e amostras de cerebelos não neoplásicos fetais (N=10) e não fetais (N=7). A comparação entre os grupos foi feita por teste de Mann-Whitney e a análise de sobrevida livre de eventos (SLE) e sobrevida global (SG) por curvas de Kaplan-Meier e teste log-rank. A análise multivariada por modelo de regressão de Cox foi utilizada para avaliação dos fatores prognósticos. Resultados: Os miRNAs miR-329, -383, -433, -485-3p, -485-5p, -491-5p, -512-3p, -539-5p estão hipoexpressos nos tumores em relação aos cerebelos fetais e não fetais; o miR-31-5p está hipoexpresso e o miR-199a-5p está hiperexpresso nos tumores em relação ao cerebelos não fetais; o miR-202-3p e o miR-650 estão hipoexpressos nos tumores em relação aos cerebelos fetais. Além disso, os miRNAsmiR-199a-5p e -329 estãoshipoexpressos em pacientes menores que 3 anos, com relação aos maiores de 3 anos; os miRNAs miR-202-3p, -329, -491-4p e -512-3p estão hipoexpressos em pacientes que tiveram grau de ressecção completo do tumor, em comparação aos que tiveram grau incompleto; e os miRNAs miR-202-3p e -512-3p estão hipoexpressos em pacientes classificados como baixo risco em comparação aos classificados como alto risco. Adicionalmente, o miR-211-5p está hipoexpresso nos pacientes com menor sobrevida global e livre de eventos; e o miR-512-3p está hiperexpresso nos pacientes com menor sobrevida global e livre de eventos. Expressão do miR-211-5p foi fator prognóstico independente para SLE quando analisada com as variáveis expressão do miR-512-3p e grupo de risco por modelo de regressão de Cox. Conclusão: É possível observar um padrão diferencial de expressão desses miRNAs no MB, podendo ser biomarcadores importantes para esta doença. Estudos futuros serão realizados para investigar o papel desses miRNAs na progressão desse tumor. / Introduction: Medulloblastoma (MB) is the most common malignant solid tumor of the central nervous system in children,and it arises in the cerebellum with an embrionary origin. MB corresponds to approximately 20% of all pediatric intracranial tumors, and it is highly invasive. The standard treatment relies on tumor surgical resection, chemotherapy and craniospinal radiotherapy; however, the five years event-free survival for low-risk patients is approximately 70%, and most survival patients suffer from long-term side effects. Thus, the search for new treatments with fewer side effects or aiming to reduce/eliminate radiation is of great interest. Several factors contribute to the development and progression of this disease, among them the regulation of gene expression by microRNAs (miRNAs). These molecules regulate diverse biological processes, exerting negative regulation in gene expression at posttranscriptional level, however its role in MB is still poorly explored. Objective: Evaluate the profile of differentially expressed miRNAs in MB samples, correlate their expression levels with patients clinical features, and identify potential prognostic markers. Material and methods: 15 miRNAs were selected based on previous data obtained from a large-scale gene expression analysis using the microarray assay. It was performed their expression and compared with the clinical features of the patients by RT-qPCR. For this, it was used pediatric and adult patients samples (n=51) diagnosed with MB and non-neoplastic fetal (n=10) and non fetal (n=7) cerebellum samples. The comparison between groups was performed by Mann-Whitney test and event-free survival (EFS) analysis and overall survival (OS) by Kaplan-Meier and log-rank test. Multivariate analysis by Cox regression model was used to evaluate the prognostic factors. Results: The miRNAs miR-329, -383, -433, -485-3p, -485- 5p, -491-5p, -512-3p, -539-5p are downregulated in tumors when compared to fetal and nonfetal cerebellum; miR-31-5p is downregulated and miR-199a-5p is upregulated only in tumors compared to non-fetal cerebellum; miR-202-3p and miR-650 are downregulated in tumors only when compared to fetal cerebellum. In addition, miR-199a-5p and miR-329 are downregulated in patients under 3 years old compared to those who are higher than 3 year; miR-202-3p,miR-329, miR-491-5p and miR-512-3p are downregulated in patients who had complete tumor resection compared to those who had incomplete tumor resection; and miR- 202-3p and miR-512-3p are downregulated in low risk patients compared to high risk patients. In addition, miR-211-5p is downregulated and miR-512-3p is upregulated in patients with a poorer event-free survival and overall survival. The expression of miR-211-5p was an independent prognostic factor for EFS when analyzed with the variables miR-512-3p expression and risk group by Cox regression model Conclusion: It is possible to observe a differential pattern of expression of these miRNAs in MB and they may be important biomarkers for this disease. Further studies will be conducted to investigate the role of these miRNAs in the progression of this tumor.

Os gliomas são os tumores mais fatais do sistema nervoso central, para os quais ainda não há tratamento eficaz. Para analisar as bases celulares e moleculares da ação do agente diferenciador e antitumoral ácido retinóico (ATRA) sobre gliomas, foi utilizado, como modelo, a linhagem STl de glioma de rato. Propôs-se: a) analisar os efeitos de ATRA sobre a morfologia, proliferação e morte celular; b) isolar, identificar e caracterizar genes induzidos por ATRA em células STl. Verificou-se que o tratamento com ATRA promove achatamento celular e inibição da síntese de DNA e do crescimento em suspensão de agarose, caracterizando uma completa reversão fenotípica tumoral-normal, a qual não é acompanhada de indução de apoptose. Os genes induzidos por ATRA foram isolados através da construção de bibliotecas subtraídas de cDNA por: RDA (\"Representational Diference Analysis\") e SSH (\"Suppressive Subtractive Hybridization\") acoplados a rastreamento em \"macroarrays\". Foram identificados 10 genes regulados por ATRA durante a reversão fenotípica das células STl: p450rai2, spi3, vegf, cdv-3a, okl38, eya2, gem, retSDR1, aldose redutase-like, e um gene novo, com 61 % de identidade com uma fosfatase de galinha. Este estudo permitiu a caracterização dos efeitos de ATRA sobre STl e identificou novos alvos para futuro desenvolvimento de novas drogas e terapia gênica. / Gliomas are the most fatal central nervous system tumors, for which efficient treatment is still not available. To analyze the cellular and molecular bases for the action of the differentiating and anti-tumor agent retinoic acid (ATRA) in gliomas, the rat glioma STl cell line was used as a model. We proposed: a) to analyze the effects of ATRA in STl cells morphology, growth and apoptosis; b) to isolate, identify and characterize the ATRA-induced genes in STl cells. We demonstrated that ATRA promotes cellular flattening and inhibition of DNA synthesis and growth in agarose suspension, characterizing a complete tumoral to normal phenotypic reversion, which is not accompanied by apoptosis. Subtracted cDNA libraries were generated, using 2 different methodologies: RDA (Representational Difference Analysis) and SSH (Suppressive Subtractive Hybridization) followed by macroarray screening. This allowed identification of 10 ATRA induced genes which are up regulated by ATRA during STl cells phenotypic reversion, namely: p450rai2, spi3, vegf, cdv-3a, okl38, eya2, gem, retSDR1, aldose redutase-like and a new gene with 61 % identity with chicken phosphatase. This study characterized the cellular and molecular effects of ATRA upon STl cells and allowed identification of new targets for future development of new drugs and gene therapy.