Septinas são proteínas que ligam GTP e interagem entre si formando heterocomplexos, os quais formam filamentos e estruturas de maior nível de organização. Tais filamentos, além de se mostrarem importantes durante a citocinese também podem estar envolvidos em outros processos celulares tais como determinação da polaridade celular e reorganização do citoesqueleto. As septinas, inicialmente descobertas em Saccharomyces cerevisiae, já foram identificadas também em fungos, algas-verdes, mamíferos, porém nunca em plantas. Tipicamente, septinas apresentam três domínios estruturais compostos por um domínio central de ligação ao GTP flanqueado por um N-terminal variável e um C-terminal que pode conter sequências do tipo coiled-coil. Este trabalho teve como objetivo a caracterização do domínio de ligação a GTP da septina 8 humana (SEPT8G) por meio de estudos biofísicos. Nesse sentido, SEPT8G foi eficientemente produzida em E. coli, tendo seu estado dimérico em solução confirmado por cromatografia de exclusão molecular. Diferentemente das outras septinas já reportadas, mesmo dimérica a SEPT8G apresentou-se na forma apo. Ensaios de atividade GTPásica foram realizados, confirmando a incapacidade dessa septina em hidrolisar o GTP. Ainda, análises de estabilidade térmica por Dicroísmo Circular revelaram que a presença do íon magnésio leva à diminuição de sua estabilidade estrutural. Baseando-se em resultados prévios de interação obtidos pela técnica do duplo-híbrido em leveduras, estudos voltados à análise da interação entre as septinas 7 e 8 e, posteriormente, entre as septinas 5, 7 e 8 foram realizados. A co-purificação do complexo formado pelas septinas 7 e 8 mostrou-se dependente da região C-terminal completa de SEPT7 de modo que, quando ausente, a interação mostrou-se expressivamente prejudicada. Já o complexo formado pelas septinas 5/7/8 foi obtido contendo as três proteínas em frações equimolares e solúveis, disponibilizando assim um novo heterocomplexo de septinas para ensaios funcionais e estruturais. / Septins are GTP-binding proteins that interact with each other to form heterocomplexes, which form filaments and higher order structures. These filaments are important for cytokinesis and may be involved in other cellular processes such as the determination of cell polarity and cytoskeleton reorganization. The septins, initially discovered in Saccharomyces cerevisiae, have also been identified in fungi, green algae, mammals but not in plants. Typically, septins have three structural domains comprising a central GTP binding domain flanked by a variable N-terminal and a C-terminal which can contain coiled-coil structures. This work sought to characterize the GTP-binding domain of the human septin 8 (SEPT8G) through biophysical studies. Accordingly, SEPT8G was efficiently produced in E. coli, and its dimeric state in solution was confirmed by size exclusion chromatography. Compared to other septins previously reported, the dimeric SEPT8G presented itself as an apo-protein. GTPase activity assays were performed, confirming the inability of this septin to hidrolyse GTP. Additionally, thermal stability analyses by Circular Dichroism showed that the presence of the magnesium ion leads to a decrease of structural stability. Considering previous results of septins interactions from yeast two-hybrid experiments, we have analyzed the interaction between the septins 7, 8 and subsequently among septins 5, 7 and 8. Co-purification of the complex formed by the septins 7 and 8 showed to be dependent on the complete SEPT7 C-terminal region so that, when absent, the interaction was significantly impaired. The obtained complex formed by septins 5/7/8 contained the three proteins in soluble and equimolar fractions, providing a new septin heterocomplex for functional and structural studies.

Neste trabalho foi transfectada uma linhagem de células embrionárias de rim humano (HEK293) com os genes das subunidades α e β da tireotrofina humana (hTSH), hormônio glicoproteico secretado pela hipófise. Após 5 dias de cultivo obteve-se uma concentração de hTSH no meio condicionado de 0,95μg/mL. O material foi concentrado e purificado utilizando uma estratégia envolvendo duas etapas, uma cromatografia de troca catiônica e uma cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa, que permitiu uma recuperação de 55% e uma pureza >90%. O produto purificado (hTSH-HEK) foi analisado e comparado a uma preparação comercial obtida em células CHO (hTSH-CHO) e a uma preparação hipofisária (hTSH-Pit). A identidade e a pureza do hTSH-HEK foram avaliadas por métodos físicoquímicos e imunológico (espectrometria de massa MALDI-TOF, HPLC de exclusão molecular e de fase reversa, SDS-PAGE e ensaio imunoradiométrico). A porção glicídica do hTSH-HEK foi avaliada pela análise do perfil dos N-glicanos e o comportamento biológico deste hormônio foi avaliado por bioensaio in vivo e estudo farmacocinético. As 3 preparações apresentaram pureza equivalente (97%) e a massa molecular relativa do hTSH-HEK foi 2,1% menor do que a do hTSH-CHO e 2,7% maior do que a do hTSH-Pit. A maior hidrofobicidade relativa, avaliada por RP-HPLC, foi a do hTSH-HEK. Os N-glicanos identificados no hTSH-HEK foram do tipo complexo, apresentando predominantemente estruturas tri-antenárias, enquanto no hTSH-CHO e no hTSH-Pit as estruturas bi-antenárias foram predominantes. Foram detectadas diferenças significativas relacionadas à composição dos carboidratos para estas preparações, um teor muito menor de ácido siálico e muito maior de fucose foram observados no hTSHHEK. Foi confirmada a atividade biológica das 3 preparações, sendo a bioatividade do hTSHHEK 39% e 16% inferior à do hTSH-CHO e hTSH-Pit, respectivamente. A meia-vida circulatória do hTSH-HEK foi menor (1,5 X) que a do hTSH-CHO e a do hTSH-Pit (1,2 X). De acordo com esses resultados o hTSH-HEK pode ser considerado uma alternativa viável para aplicações clínicas especialmente por sua origem humana e composição de carboidratos. / In this work a strain of embryonic human kidney cells (HEK293) was transfected with the genes of the α and β subunits of human thyrotropin (hTSH), a glycoproteic hormone secreted by the pituitary gland. After 5 days of culture, the concentration of hTSH in conditioned medium was 0.95μg/mL. The material was concentrated and purified utilizing a strategy involving two steps, a cation-exchange chromatography and a reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), providing an overall yield of 55% and a purity level > 90%. The purified material (hTSH-HEK) was analyzed and compared to a recombinant commercial preparation obtained from CHO cells (hTSH-CHO) and to a human pituitary preparation (hTSH-Pit). Identity and purity of hTSH-HEK were evaluated through physicochemical and immunological methods (MALDI-TOF mass spectrometry, size exclusion HPLC, reversed-phase HPLC, SDS-PAGE, immunoradiometric assay). Glycidic portion of hTSHHEK was evaluated by N-glycoprofiling analysis and the biological behavior of this hormone was evaluated by an in vivo bioassay and via a pharmacokinetic study. The 3 preparations showed equivalent purity (97%) and hTSH-HEK molecular mass was 2.1% lower than hTSHCHO mass and 2.7% higher than hTSH-Pit mass. The highest relative hydrophobicity, evaluated by RP-HPLC, was shown by hTSH-HEK. Remarkable differences related to the carbohydrate moiety were found for these preparations, a much lower sialic acid content and a higher fucose content being observed in hTSH-HEK. Biological activity was confirmed for the three preparations, the hTSH-HEK bioactivity being 39% and 16% lower than hTSH-CHO and hTSH-Pit, respectively. The hTSH-HEK circulatory half-life (t1/2) was lower than that of hTSHCHO (1.5-fold) and hTSH-Pit (1.2-fold). According to these findings, HEK293-derived hTSH can be considered useful for clinical applications, also in view of its human origin and particular N-glycan composition.

Toda medida, desde que feita por um instrumento real, tem uma imprecisão associada. Neste trabalho, abordamos a questão das imprecisões em experimentos de microarranjos de cDNA de dois canais, uma tecnologia que tem sido muito explorada nos últimos anos e que ainda é um importante auxiliar nos estudos de expressões gênicas. Dezenas de milhares de representantes de genes são impressos em uma lâmina de vidro e hibridizados simultaneamente com RNA mensageiro de duas amostras diferentes de células. Essas amostras são marcadas com corantes fluorescentes diferentes e a lâmina, após a hibridização, é digitalizada, obtendo-se duas imagens. As imagens são analisadas com programas especiais que segmentam os locais que estavam os genes e extraem estatísticas dos píxeis de cada local. Por exemplo, a média, a mediana e a variância das intensidades do conjunto de píxeis de cada local (o mesmo é feito normalmente para uma área em volta de cada local, chamada de fundo). Estimadores estatísticos como o da variância nos dão uma estimativa de quão precisa é uma certa medida. Uma vez de posse das estimativas das intensidades de cada local, para se obter a efetiva expressão de um gene, algumas transformações são feitas nos dados de forma a eliminar variabilidades sistemáticas. Neste trabalho, mostramos como podem ser feitas as análises a partir de uma medida de expressão gênica com um erro estimado. Mostramos como estimar essa imprecisão e estudamos, em termos de propagação da imprecisão, os efeitos de algumas transformações realizadas nos dados, por exemplo, a remoção do viés estimado pelo método de regressão local robusta, mais conhecido como \\textit{lowess}. Uma vez obtidas as estimativas das imprecisões propagadas, mostramos também como utilizá-las na determinação dos genes diferencialmente expressos entre as amostras estudadas. Por fim, comparamos os resultados com os obtidos por formas clássicas de análise, em que são desconsideradas as imprecisões das medidas. Concluímos que a modelagem das imprecisões das medidas pode favorecer as análises, já que os resultados obtidos em uma aplicação com dados reais de expressões gênicas foram condizentes com os que encontramos na literatura. / Any measurement, since it is made for a real instrument, has an uncertainty associated with it. In the present paper, we address this issue of uncertainty in two-channel cDNA Microarray experiments, a technology that has been widely used in recent years and is still an important tool for gene expression studies. Tens of thousands of gene representatives are printed onto a glass slide and hybridized simultaneously with mRNA from two different cell samples. Different fluorescent dyes are used for labeling both samples. After hybridization, the glass slide is scanned yielding two images. Image processing and analysis programs are used for spot segmentation and pixel statistics computation, for instance, the mean, median and variance of pixel intensities for each spot. The same statistics are computed for the pixel intensities in the background region. Statistical estimators such as the variance gives us an estimate of the accuracy of a measurement. Based on the intensity estimates for each spot, some data transformations are applied in order to eliminate systematic variability so we can obtain the effective gene expression. This paper shows how to analyze gene expression measurements with an estimated error. We presented an estimate of this uncertainty and we studied, in terms of error propagation, the effects of some data transformations. An example of data transformation is the correction of the bias estimated by a robust local regression method, also known as \\textit{lowess}. With the propagated errors obtained, we also showed how to use them for detecting differentially expressed genes between different conditions. Finally, we compared the results with those obtained by classical analysis methods, in which the measurement errors are disregarded. We conclude that modeling the measurements uncertainties can improve the analysis, since the results obtained in a real gene expressions data base were consistent with the literature.

Orientador: Rosa Monteiro Paulo / Resumo: As Tecnologias Digitais (TD) e as suas potencialidades na produção do conhecimento tem sido tema de pesquisas em distintas áreas do conhecimento, desperta o nosso interesse e possibilita a pesquisa de doutorado explícita neste texto, cujo objetivo é a constituição e a produção do conhecimento matemático do sujeito, o matemático, quando ele está junto ao computador. Para dar conta desse desejo de querer saber interrogamos “como o matemático que produz matemática com o computador expressa o modo pelo qual compreende a presença dessa tecnologia em sua produção?”. O interrogar, em uma postura fenomenológica, possibilitou compreender a constituição e a produção do conhecimento matemático com o computador, como ela é vista pelo matemático da área pura ou aplicada. Para expor o compreendido apresentamos, neste texto, a região de inquérito da pesquisa dizendo do significado das Tecnologias Digitais, do ser-com-as-Tecnologias-Digitais, da produção do conhecimento, do ser-com-o-computador e da produção do conhecimento quando se está com o computador. Partindo de autores como Borba e Villareal, que criaram o constructo teórico seres-humanos-com-mídias, pudemos, em uma perspectiva fenomenológica, destacar a vivência da pessoa que produz conhecimento com o computador. Esse destaque é feito ouvindo o matemático da área pura ou aplicada que, no diálogo, expõe o modo pelo qual vê sua produção com o computador. Orientados pela postura fenomenológica interpretamos a fala dos sujeitos e apresen... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The potential of Digital Technologies (TD) for the production of knowledge has been the subject of research in different areas of knowledge; make us interested and makes possible the research of doctorate explicit in this text, whose objective is the constitution and the production of the mathematical knowledge of the subject when he is with the computer. To advance the research we ask: "how does the mathematician who produces mathematics with the TD express the way in which he understands the presence of these technologies in his production?". The interrogation, in a phenomenological posture, made it possible to understand the constitution and production of mathematical knowledge with the computer as it is understood by the pure or applied area mathematician. In this text we present, to say of the investigated the meaning of Digital Technologies, of being-with-Digital Technologies, of the production of knowledge, of being-with-the-computer and of the production of when you have the computer. Starting with authors such as Borba and Villareal, who created the theoretical human-media construct, we emphasize, in a phenomenological perspective, to highlight the experience of the person who produces knowledge with the computer. This distinction is made by listening to the mathematician, from the pure or applied area, who in the dialogue exposes the way in which he sees his production with the Digital Technologies. Guided by the phenomenological posture we interpret the subjects' s... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientadores : Luiz Carlos Zeferino, Maria Salete Costa Gurgel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-11-09T15:57:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Menezes_MarcusViniciusMartinsde_M.pdf: 4462397 bytes, checksum: 19e649c8f79ccdfab39e8019f7d69049 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Este estudo teve como objetivo avaliar a associação entre a expressão das proteínas bcl-2, c-erbB-2 e p53 com o tecido mamário não-neoplásico, o carcinoma ductal in situ e o carcinoma invasivo da mesma mama, através da imuno-histoquímica, e verificar se há um padrão de variação identificável da expressão destas proteínas com a gravidade das lesões. Foram incluídas 56 mulheres que apresentaram na mesma mama carcinoma invasivo associado com carcinoma in situ. Foram utilizados anticorpos monoclocais específicos para bcl-2 (MxH, clone 124, DAKO, código M0887-1, diluição 1:40), c-erbB-2 (RxH, DAKO, código A0485-1, diluição 1 :300) e p53 (MxH, D0-7, DAKO, código M7001-1, diluição 1:100). Foi considerado como expressão positiva quando pelo menos 1% das células corou. A prevalência da expressão da proteína bcl-2 foi de 98%, 75% e 64%, respectivamente, no tecido não-neoplásico, carcinoma in situ e carcinoma invasivo e estas diferenças foram estatisticamente significantes. O odds ratio mostrou que a magnitude destas diferenças foi maior entre o tecido não-neoplásico e o carcinoma in situ. Não houve expressão da proteína c-erbB-2 no tecido não-neoplásico e a prevalência da expressão foi de 68% e 61%, respectivamente, para o carcinoma in situ e carcinoma invasivo. A diferença observada entre o tecido não-neoplásico e carcinoma in situ foi estatisticamente significante. A prevalência da expressão da proteína p53 foi de 2%, 18% e 16%, respectivamente, no tecido não-neoplásico, carcinoma in situ carcinoma invasivo e estas diferenças foram estatisticamente significantes entre os dois primeiros componentes. A expressão da proteína bcl-2 foi mais freqüente no carcinoma in situ do subtipo não-comedo e grau nuclear 1 ou 2 e no carcinoma invasivo grau nuclear 1 ou 2. A expressão da proteína c-erbB-2 foi mais freqüente no carcinoma in situ grau nuclear 3 e a expressão da proteína p53 foi mais freqüente no carcinoma invasivo grau nuclear 3. Sessenta e quatro porcento das mulheres apresentaram expressão da proteína bcl-2 nos três componentes e 23% apresentaram apenas no componente não-neoplásico. Sessenta e um porcento das mulheres apresentaram expressão da proteína cerbB- 2 apenas nos componentes carcinoma in situ e carcinoma invasivo e 32% não apresentaram expressão em nenhum dos componentes. Setenta e oito porcento das mulheres não apresentaram expressão da proteína p53 em nenhum dos componentes e 14% apresentaram apenas nos componentes in situe invasivo. Os resultados deste estudo permitem inferir que os genes Bcl-2, C-erbB-2 e P53 estão envolvidos nas fases mais iniciais da carcinogênese mamária, ou seja, na transformação do dueto não-neoplásico em carcinoma in situ. Uma vez instalada a lesão intra-epitelial, a progressão para a forma invasiva dependeria de outros genes / Abstract: The present study aims to evaluate the association among the expression of the proteins bcl2, c-erbB-2 and p53 and the non-neoplasic mammary tissue, the ductal carcinoma in situ and the invasive carcinoma of the same breast using the immunohistochemical technique. Through this evaluation it aims to find out if there is an identifiable pattern of variation of the expression of these proteins with the gravity of the lesions. Fifty six women were included in this study and ali of them had, in the same breast, the association between invasive carcinoma and carcinoma in situ. lt has been used specific monoclonal antibodies for bcl-2 (MxH, clone 124, DAKO, code M0887-1, dilution 1:40), cerbB- 2 (RxH, DAKO, code A0485-1, dilution 1:300) and p53 (MxH, D0-7, DAKO, code M7001-1, dilution 1:100). Positive expression has been considered when, at least 1% of the cells dyed. The prevalence of the expression of the protein bcl-2 was 98%, 75% and 64%, respectively in the non-neoplasic tissue, carcinoma in situ and invasive carcinoma and these differences were statistically significant. The odds ratio confirmed that the magnitude of these differences was higher between the non-neoplasic tissue and the carcinoma in situ. There was no expression of the protein c-erbB-2 in the non-neoplasic tissue and the prevalence of expression of this protein was 68% and 61%, respectively in carcinoma in situ and invasive carcinoma. The difference found between the non-neoplasic tissue and the carcinoma in situ was statistically significant. The prevalence of expression of protein p-53 was 2%, 18% and 16%, respectively in the non-neoplasic tissue, carcinoma in situ and invasive carcinoma and these differences were statistically significant between the two formers only. The expression of the protein bcl-2 was more frequent in carcinoma in situ noncomedo type, nuclear degrees 1 or 2 and in invasive carcinoma nuclear degrees 1 or 2. The expression of protein c-erbB-2 was more frequent in carcinoma in situ nuclear degree 3 and the expression of protein p53 was more frequent in invasive carcinoma nuclear degree 3. Sixty four per cent of women studied showed expression of protein bcl-2 in ali three components and 23% of women showed it only in the non-neoplasic component. Sixty one per cent of women showed expression of protein c-erbB-2 only in carcinoma in situ and invasive carcinoma and 32% did not show expression at ali. Sixty eight per cent of women did not show expression of protein p53 in none of the components and 14% showed it only in the components 'in situ' and 'invasive'. The results of the present study allow us to conclude that the genes Bcl-2, C-erbB-2 and P53 are linked to the initial stages of mammary carcinogenesis, in other words, they are linked to the transformation of the non-neoplasic duct in carcinoma in situ. Once the intra-epithelial lesion has started, the progression to invasive form would depend on other genes / Mestrado / Tocoginecologia / Mestre em Tocoginecologia

Submitted by Natalia Vieira (natalia.vieira@famerp.br) on 2016-05-20T18:11:47Z No. of bitstreams: 1 aneliserusso_tese.pdf: 3261901 bytes, checksum: 7194c2477e2a3932223f1bf8aaa91f60 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-20T18:11:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 aneliserusso_tese.pdf: 3261901 bytes, checksum: 7194c2477e2a3932223f1bf8aaa91f60 (MD5) Previous issue date: 2015-11-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Introduction: Susceptibility to enviromental agents as well as its adverse effects health depend on the personal genetic profile. Some individuals can present increased risk to develop cancer due to differences in biometabolism. Changes in the biotransformation mechanism of endogenous and exogenous compounds by oxidation reactions may be related to the tumorigenesis process. Differential expression of the genes involved in this xenobiotic metabolizing, such as cytochrome P450 (CYP) family members and others oxygenases, can change the activation process of toxic agents and lead to the oral cavity tumor development. Therefore, the individual differences of gene expression of this pathway associated to smoking and drinking can present significant risk factor for neoplasia. Objective: To identify the pattern of the gene expression involved in the biotransformation mechanism of endogenous and xenobiotic compounds in oral cavity tumors, aiming at identifing susceptibility biomarkers to this cancer type. Methods: Eight tissue samples of patients with oral cavity squamous cell carcinoma and eight adjacent non-tumor tissue samples were used. Expression of 92 genes CYP450 family and other oxygenases was quantifited by duplicate reactions of real time qPCR using “TaqMan® Array Human CYP450 and other Oxygenases 96-well fast plate” (Applied Biosystems). For statistical analysis was performed D'Agostino & Pearson omnibus normality test, followed by One-sample T test (data that showed normal distribution), and Wilcoxon signed rank test (data that did not present normal distribution) using GraphPad Prism v.5 program. Correction for multiple testing of Benjamini-Hochberg False Discovery Rate was applied to correct false positives. Bioinformatics tool was used to understand the biological system functions and to associate the differential expressed genes with specific metabolic pathways. Results: Of the 96 investigated genes involved in biotransformation mechanism (excepting the four reference genes), 12 genes showed differential expression in carcinoma tissue of oral cavity squamous cell type compared to non-tumor tissue (p<0.05). Only CYP27B1 gene presented increased expression in the oral cavity tumors, whereas CYP27A1, CYP2E1, CYP2R1, CYP2J2, CYP2U1, CYP4F12, CYP4X1, PTGIS, ALOX12, CYP4B1 and MAOB genes showed reduced expression. After correction by multiple tests, only PTGIS gene presented differential expression, with reduced expression. After data survey bioinformatics, five proteins were observed involved in the metabolism of arachidonic acid associated with important inflammatory processes in carcinogenesis (CYP2E1, CYP2J2, CYP2U1, ALOX12 and PTGIS). Conclusion: Genes involved in the carcinogens oxidation reactions showed differential expression in tumors of oral cavity. The enzymes encoded by these genes play an important role in the arachidonic acid metabolism, only pathway related to PTGIS enzyme, significant after analysis of statistical correction. The arachidonic acid and/or metabolites derived this pathway may modulate others metabolisms in which these enzymes are involved and can influence the regulation of important physiological mechanisms in tumorigenesis process. / Introdução: A suscetibilidade aos agentes ambientais e seus efeitos adversos à saúde dependem do perfil genético individual. Alguns indivíduos podem apresentar risco aumentado de desenvolver o câncer devido às diferenças no biometabolismo. Alterações no mecanismo de biotransformação de compostos endógenos e exógenos por reações de oxidação podem estar relacionadas com o processo de tumorigênese. Expressão diferencial de genes envolvidos nesse metabolismo de xenobióticos, tais como, os membros da família do citocromo P450 (CYP) e outras oxigenases, podem alterar o processo de ativação de agentes tóxicos e levar ao desenvolvimento do tumor de cavidade oral. Desse modo, as diferenças individuais de expressão gênica desta via associadas ao tabagismo e etilismo podem apresentar-se como significante fator de risco para neoplasias. Objetivo: Identificar o padrão de expressão de genes envolvidos no mecanismo de biotransformação de compostos endógenos e xenobióticos em tumores de cavidade oral, visando identificar biomarcadores de suscetibilidade para este tipo de câncer. Casuística e Métodos: Foram analisadas oito amostras de tecido de pacientes com diagnóstico patológico de carcinoma espinocelular de cavidade oral e oito amostras de tecidos não-tumorais adjacentes. A expressão de 92 genes da família CYP450 e outras oxigenases foi quantificada por reações em duplicata de PCRq em tempo real por meio do ensaio TaqMan® Array Human CYP450 and other Oxygenases 96-well fast plate (Applied Biosystems). Para análise estatística, foi realizado teste de normalidade de D'Agostino & Pearson omnibus normality test, seguido dos testes One-sample T test (dados com distribuição normal) e Wilcoxon signed rank test (dados que não apresentaram distribuição normal) no programa GraphPad Prism v.5. A correção para múltiplos testes de Benjamini-Hochberg False Discovery Rate foi aplicada para corrigir falsos positivos. Foram utilizadas ferramentas de bioinformática para compreender as funções do sistema biológico e associar os genes diferencialmente expressos com vias metabólicas específicas. Resultados: Dentre os 96 genes investigados envolvidos no mecanismo de biotransformação (excetuando-se os quatro genes de referência), 12 genes apresentaram expressão diferencial em tecido de carcinoma do tipo escamoso de cavidade oral, comparado ao tecido não-tumoral (P<0,05). Somente o gene CYP27B1 apresentou expressão aumentada nos tumores, enquanto os genes CYP27A1, CYP2E1, CYP2R1, CYP2J2, CYP2U1, CYP4F12, CYP4X1, PTGIS, ALOX12, CYP4B1 e MAOB apresentaram expressão reduzida. Após a correção para múltiplos testes, apenas o gene PTGIS apresentou expressão diferencial nos tumores. Após o levantamento de bioinformática, foram observadas cinco proteínas envolvidas no metabolismo do ácido araquidônico, associado com processos inflamatórios importantes na carcinogênese (CYP2E1, CYP2J2, CYP2U1, ALOX12 e PTGIS). Conclusão: Genes que participam de reações de oxidação de carcinógenos apresentam expressão diferencial em tumores de cavidade oral. Enzimas codificadas por esses genes possuem papel importante no metabolismo do ácido araquidônico, única via relacionada à enzima PTGIS, significante após análise de correção estatística. O ácido araquidônico e/ou os metabólitos provenientes desta via podem modular outros metabolismos, nos quais essas enzimas atuam e podem influenciar a regulação de mecanismos fisiológicos importantes no processo de tumorigênese.

Submitted by (ana.araujo@ufrpe.br) on 2017-02-07T17:26:10Z No. of bitstreams: 1 Elizabeth Amelia Alves Duarte.pdf: 531566 bytes, checksum: 30a6ba5dcefc32c0b3e28c56510a6913 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-07T17:26:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elizabeth Amelia Alves Duarte.pdf: 531566 bytes, checksum: 30a6ba5dcefc32c0b3e28c56510a6913 (MD5) Previous issue date: 2008-02-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Peanut is a worldwide important product for food industries. In Brazil this crop is quite representative due its high consume. Most part of production is concentrated in the Southeast, Center-West and Northeast regions. In this last one, the wheather is a limiting factor for the crop; however, some botanical types present tolerance to prolonged dry conditions. The aim of this work was to identify genes differentially expressed in a peanut cultivar submitted to water stress which could aid on selective processes in the improvement programs carried out with this crop in the Northeast region. The cv. Senegal 55437 was chosen for this study due its recognizable tolerance to drought. It was submitted to five days of water stress under greenhouse conditions. The total RNA was collected from foliar tissues when plants reached 50% stomatic closure. RT-PCR assays were performed using ten ISSR primers and the c- DNAs obtained were re-amplified, purified and cloned into Escherichia coli, INFα cell (Invitrogen). A total of twenty-nine cDNA fragments were obtained, being seventeen at the down regulated condition, two at over regulated and ten activated. These later, only found in stressed samples, were sequenced. Sequences obtained were compared into databanks, focusing on Arabidobis thaliana and Arachis banks, andfour showed homology with genes which are involved in metabolic routes to abiotic and biotic factors. One of these sequences, with about 700pb, showed homology with Arabinogalactan protein 10 of A. thaliana. This structural protein present in the leaves, stems and roots is associated to regulatory processes initiated during the water loss by the cell, which genes increase protection to the cytoplasm, organelles,cell membranes, cellular osmotic potential alteration and improve better regulation in the expression of other genes. The result here obtained suggests a possible relation of this gene with the response routes to water stress. / O amendoim é um produto de grande importância mundial para a indústria de alimentos, sendo bastante representativo no Brasil que é um dos maiores produtores e consumidores dessa oleaginosa. Grande parte da produção está concentrada nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste. Nesta última região, o clima é um fator limitante ao seu cultivo, embora alguns tipos botânicos apresentem tolerância às condições de estiagem prolongada. O presente trabalho teve como objetivo identificar genes diferencialmente expressos em amendoim, submetido a estresse hídrico, que possam auxiliar nos programas de melhoramento genético da cultura na região Nordeste. Para este estudo a cultivar Senegal 55437, de reconhecida tolerância à seca, foi submetida a cinco dias de estresse hídrico em condições de casa de vegetação. O RNA total foi coletado a partir de tecidos foliares, quando as plantas atingiram 50% de fechamento estomático. Para a identificação de genes diferencialmente expressos, procedeu-se ensaios de RT-PCR utilizando-se primers ISSR. Os c-DNAs obtidos foram reamplificados, purificados, ligados em vetor pGEMT-Easy e clonados em Escherichia coli, célula INFα (Invitrogen). Foram obtidos vinte e nove fragmentos de cDNA dos quais dezessete na condição de subregulados,dois super-regulados e dez ativados, estes últimos encontrados apenas nas amostras estressadas, os quais foram seqüenciados. As seqüências obtidas foram comparadas em bancos de dados, evidenciando os bancos de Arabidobis thaliana e Arachis. Dentre as seqüências, quatro apresentaram homologia com genes conhecidos e envolvidos em rotas metabólicas de resposta a fatores abióticos e bióticos. Uma dessas seqüências com cerca de 700 pb apresentou homologia com a proteína Arabinogalactana 10 de A. thaliana. Essa proteína estrutural presente nas folhas, caules e raízes dos vegetais esta associada a processos regulatórios iniciados durante a perda de água pela célula, cujos genes envolvidos promovem aumento da proteção do citoplasma, organelas, membranas celulares, alterações do potencial celular osmótico e maior regulação da expressão de outros genes. O resultado aqui obtido sugere uma possível relação desse gene no envolvimento das rotas de resposta ao estresse hídrico.

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Heloisa Sobreiro Selistre de Araujo / Banca: Ana Paula Ulian de Araujo / Resumo: Neste trabalho foi realizado o isolamento do cDNA e do gene que codifica a proteína semelhante à Pho85p de Saccharomyces cerevisiae, em Neurospora crassa. Um fragmento de 1,1 kb correspondendo à seqüência nucleotídica do gene em N. crassa foi amplificado e confirmado por sequenciamento, o qual foi utilizado no rastreamento de uma biblioteca de cDNA de N. crassa, resultando em um plasmídeo contendo a ORF que codifica a Ncpho85 e as seqüências upstream e downstream à ORF. Este inserto foi seqüenciado, a ORF isolada apresentou 1014 bp, a região upstream contém 304 bp e a downstream 561 nucleotídeos. Após sequenciamento do cDNA, a seqüência polipeptídica da proteína foi comparada com outras proteínas semelhantes à Pho85p de fungos miceliares, leveduriformes além de S. cerevisiae. Esta ORF isolada foi utilizada no rastreamento de uma biblioteca genômica de N. crassa, possibilitando o isolamento de um plasmídeo contendo a seqüência genômica, o qual foi submetido a sequenciamento. No inserto foi possível confirmar a presença do intron (de 89 bp) no nucleotídeo 69, confirmando os dados existentes no banco de dados de N. crassa. A expressão do gene foi analisada ao longo do crescimento do fungo, em diferentes meios de cultivo, através de experimentos de Northern blot. A presença de duas bandas de hibridização, uma de 2,2 kb e uma 2,7 kb foi observada em todos os experimentos realizados. Um pico de expressão dos dois transcritos ocorreu no tempo de 12 horas, sendo mais evidente para o transcrito de menor tamanho, o qual seria o transcrito do cDNA isolado anteriormente. Resultados preliminares da expressão da proteína ao longo do crescimento do fungo foram obtidos por Western blot. Apenas uma banda da proteína foi observada, a qual apresentou o tamanho aproximado de 40 kDa, próximo ao tamanho da proteína NcPHO85, deduzida a partir da seqüência do cDNA. / Abstract: In this study we performed the isolation of the cDNA and the gene that codes for the Pho85p-like protein from Saccharomyces cerevisiae in Neurospora crassa. A fragment of 1.1 kb corresponding to the nucleotide sequence of the gene from N. crassa was amplified by PCR and confirmed by DNA sequencing. This fragment was used to screen a N. crassa cDNA library resulting in a plasmid containing the ORF plus and the upstream and downstream regions. The insert from the plasmid was sequenced and the ORF showed to have 1014 bp, whereas the upstream and downstream regions had 304 bp and 561 bp, respectively. After sequencing the cDNA, the polypeptide sequence was compared to the same protein from mycelial fungi and yeasts. The isolated ORF was used to screen a N. crassa genomic library leading to the isolation of a plasmid containing the genomic sequence. After DNA sequencing the insert showed the presence of an intron (89 bp) starting at nucleotide 69. This result was in agreement with the information from the N. crassa database. Gene expression analysis during the vegetative growth in different media was performed by Northern blot. Two hybridization bands were observed in the experiments, one of 2.2 kb and another one of 2.7 kb. The maximum expression of both transcripts happened at 12 h of growth, this was more pronounced for the smaller transcript, which probably is the transcript of the isolated cDNA. Preliminary results of protein expression during vegetative growth were obtained by Western blot analysis. Only one band with approximately 40 kDa was observed, the expected size for the NcPHO85 protein sequence deduced from the cDNA sequence. In order to evaluate the role of this protein in glycogen metabolism and in other cellular functions in N. crassa we started the gene inactivation. / Mestre

Orientador: Paula Rahal / Banca: Ana Carolina Gomes Jardim / Banca: Wilson Araújo da Silva Júnior / Banca: Ana Elizabete Silva / Banca: Sônia Maria Oliani / Resumo: GPC3 (Glipican-3) é membro de uma família de proteoglicano de heparina sulfatada (HSPG). O GPC3 pode atuar controlando a migração celular, regulação negativa do crescimento celular e indução de apoptose. Esse gene é relatado por estar hipoexpresso em vários tipos de cânceres, o que pode resultar no crescimento celular descontrolado e contribuir para o fenótipo maligno de alguns tumores. O objetivo desse estudo foi analisar o mecanismo de ação do gene GPC3 em carcinoma renal de células claras (CCRCC). Primeiramente, foi construído o vetor de expressão e transfectado nas linhagens celulares de carcinoma renal ACHN e 786-O. A expressão de GPC3 foi analisada usando qRT-PCR e imunohistoquímica. A proliferação celular foi avaliada usando o MTT e o ensaio de formação de colônia. Análises de apoptose e ciclo celular foram avaliadas por citometria de fluxo. Foi observado que o gene GPC3 estava com baixa expressão em amostras de carcinoma renal de células claras e nas linhagens celulares quando comparado com amostras renais normais. Foi observado que a expressão de RNAm e os níveis de proteína GPC3 aumentaram após a transfecção com o vetor de expressão contendo a ORF de GPC3 nas linhagens celulares. A taxa de proliferação celular diminuiu nas células superexpressando GPC3 em ambas as linhagens, ACHN e 786-O (p<0,01). A apoptose não foi observada nas linhagens celulares de carcinoma renal superexpressando GPC3 (p > 0,05); entretanto, ocorreu um aumento na população de células na fase G1 do ciclo celular (p< 0,05). Esses resultados sugerem que o gene GPC3 reduz a taxa de proliferação celular por meio da parada do ciclo celular na fase G1 em carcinoma renal / Abstract: Background: GPC3 (Glypican 3) is a member of the family of glypican heparan sulfate proteoglycans (HSPG). The GPC3 gene may play a role in controlling cell migration, negative regulation of cell growth and induction of apoptosis. This gene is reported to be downregulated in several cancers, which can result in uncontrolled cell growth and which can also contribute to the malignant phenotype of some tumors. The purpose of this study was to analyze the mechanism of action of the GPC3 gene in clear cell renal cell carcinoma (CCRCC). Methods: First, we constructed the expression vector and transfected renal carcinoma cell lines. GPC3 expression was analyzed using qRT-PCR and immunohistochemistry. We evaluated cell proliferation using MTT and colony formation assays. Apoptosis and cell cycle analyses were evaluated using flow cytometry. Results: We observed that the GPC3 gene was downexpressed in the clear cell renal cell carcinoma samples and in cell lines, which were both compared to normal renal samples. We observed that GPC3 mRNA expression and protein levels increased after the transfection into ACHN and 786-O cell lines. We found that the cell proliferation rate decreased in cells overexpressing GPC3 in both cell lines, ACHN and 786-O (p < 0.01). Also, apoptosis in the renal cell carcinoma cell line was not observed in cells overexpressing GPC3 (p > 0.05), but there was an increase in the cell population during the G1 phase in the cell cycle (p< 0.05). Conclusion: We suggest that the GPC3 gene reduced the cell proliferation rate through cell cycle arrest during the G1 phase in renal cell carcinoma / Doutor

Na gestação, a expressão das moléculas HLA-E ocorre principalmente nos trofoblastos extravilosos da placenta e estão associados com a inibição do sistema imune resultando na imunotolerância ao feto. Esta inibição da resposta imunológica pode ser benéfica em condições fisiológicas como a gestação, mas prejudicial na vigência de tumores e infecções. Nessa condição, tem sido descrito que o HIV infecta células trofoblásticas e utiliza a molécula HLA-E como mecanismo de escape, aumentando sua expressão para inibir a atuação de células citotóxicas. Entretanto, apesar da continua exposição viral, o fato de a maioria dos recém-nascidos não serem verticalmente infectados sugere a existência de barreiras naturalmente protetoras que previnem a transmissão materno-infantil (TMI) do HIV. Frente à escassez de estudos avaliando as moléculas HLA-E na interação imunológica materno-fetal, mais especificamente na infecção do HIV-1, e à importância que este tema tem perante a prevenção da TMI, este projeto teve o objetivo de avaliar a expressão de HLA-E em tecidos placentários de mulheres infectadas ou não pelo HIV-1. Trata-se de um estudo transversal, ao qual foram submetidos ao processamento imunohistoquímico tecido placentário parafinado de 106 mulheres infectadas pelo HIV-1 e de 100 mulheres não infectadas. A expressão da molécula HLA-E foi analisada por um patologista e classificada qualitativamente como leve, moderada ou intensa e quantitativamente como negativa (<5% de marcação), 1+ (6-25%), 2+ (26-50%), 3+ (51-75%) e 4+ (>75%). Os resultados sociodemográficos apontam que as gestantes infectadas pelo HIV-1 eram mulheres não vivendo em união conjugal (p<0,0001) e com baixa escolaridade (p=0,0004). Na análise imunohistoquímica, ficou evidente que a expressão do HLA-E ocorreu principalmente na região do trofoblasto extraviloso e em células endoteliais, mas não nas vilosidades da placenta. Os testes de estatísticos utilizados foram Qui-quadrado e exato de Fisher. Os resultados mostraram que em mulheres portadoras da infecção pelo HIV-1, a expressão das moléculas HLA-E estava significantemente menor entre as que apresentavam carga viral indetectável (p=0,03), e não houve associação entre a expressão das moléculas HLA-E com outras condições como presença ou não da infecção pelo HIV, ocorrência de aborto em gestações anteriores, número de células CD4+ e terapia antirretroviral utilizada. Estes resultados sugerem que o HIV-1 induz a expressão de HLA-E em células placentárias, podendo ser utilizado como mecanismo de escape do sistema imunológico. Entretanto outros trabalhos com polimorfismos genéticos e microRNAs são necessários para ampliar o conhecimento sobre a molécula, sua atuação na infecção pelo HIV- 1 e seu papel na TMI / During pregnancy, the expression of HLA -E molecules occurs mainly in extravillous trophoblasts of the placenta and are associated with the inhibition of the immune system resulting in immune tolerance to the fetus. This inhibition of the immune response may be beneficial in physiological conditions such as pregnancy, but harmful in the presence of tumors and infections. In this condition, it has been reported that HIV infects trophoblast cells and uses the HLA -E as an escape mechanism, increasing its expression to inhibit the activity of cytotoxic cells. However, despite the continued viral exposure, the fact that most newborns are not vertically infected suggests the existence of naturally protective barriers that prevent mother to child transmission (MTCT) of HIV. Due to the lack of studies evaluating HLA-E in the maternal-fetal immunological interaction, specifically in HIV-1 infection, and the importance that this topic has towards the prevention of MTCT, this project aimed to evaluate the expression of HLA-E in placental tissues of infected women or not by HIV-1. It is a cross sectional study, which were submitted to immunohistochemical processing the paraffin- embedded placental tissue of 106 women infected with HIV-1 and 100 uninfected women. The expression of HLA-E was analyzed by a pathologist and classified qualitatively as mild, moderate or severe and quantitatively as negative (<5% markup), 1+ (6-25 %), 2+ (26-50%), 3+ (51-75%) and 4+ (>75%). The sociodemographic results indicate that pregnant women infected with HIV-1 were not women living in marital union (p<0,0001) and have lower education (p=0,0004). In immunohistochemical analysis, it became evident that the expression of HLA-E occurred mainly in the extravillous trophoblast and endothelial cells, but not in the villi of the placenta. The statistical tests used were chi-square and Fisher exact tests. The results showed that in women with the HIV-1 infection, the expression of HLA-E was significantly lower among those who had undetectable viral load (p=0,03), and there was no association between the expression of HLA- E with other conditions such as the presence or absence of HIV infection, miscarriage in previous pregnancies, number of CD4+ cells and antiretroviral therapy used. These results suggest that HIV-1 induces the expression of HLA-E placental cells, using it as a mechanism to escape the immune system. However other studies with genetic polymorphisms and microRNAs are needed to increase knowledge about the molecule, its role in HIV-1 infeccion and its role in MTCT