Orientador: Daisy Maria Fávero Salvadori / Resumo: Atualmente, o procedimento mais utilizado para o tratamento das lesões coronarianas é a angioplastia com implante de stent. Embora existam vantagens com esse procedimento, a reestenose continua sendo um dos principais limitadores do sucesso terapêutico. Sabe-se que inflamação, com acúmulo de células mononucleares ativadas, pode contribuir para o desenvolvimento da reestenose. Assim, estratégias para a identificação de biomarcadores de risco e para a redução das taxas de reestenose representam desafios na área da cardiologia intervencionista. Desta forma, o presente estudo teve como objetivos a identificação de possíveis marcadores genéticos de risco (polimorfismo dos genes MMP-2, MMP-3, MMP-9 -1562, MMP-9 Arg 279 Gln, CYP2C19*2, NOS3 e IL-6), bem como a avaliação de eventos moleculares e bioquímicos (lesões oxidativas no DNA, perfil de expressão gênica e de citocinas) que possam estar envolvidos no desenvolvimento da reestenose. Foram avaliados 330 indivíduos, 220 pacientes coronarianos com e sem reestenose após implante de stent e 110 indivíduos controles (sem implante de stent e com obstrução coronariana menor que 20%). Os resultados mostraram aumento significativo de danos no DNA de células do sangue periférico nos pacientes com reestenose intra-stent, mas nenhuma alteração nos níveis plasmáticos de citocinas (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α). Com relação aos polimorfismos gênicos, os dados mostraram que o alelo G do gene MMP-9 (Arg279Gln) foi mais frequente nos pac... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Danillo {UNESP] Pinhal / Resumo: A tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) possui importância econômica na piscicultura mundial. Com a finalidade de atender à demanda do mercado consumidor, foram desenvolvidas várias linhagens com maior viabilidade econômica, dentre elas a Chitralada, que possui rápido crescimento, e a Red Stirling, com filé de cor rosado, mais apreciado pelo consumidor. Com o objetivo de combinar estas características, foi desenvolvido um híbrido, que apresentou heterose. A pesquisa genética em peixes mostrou a interferência direta e indireta de vários genes no desempenho animal, principalmente os genes relacionados ao eixo GH/IGF e a miostatina (MSTN). Além disso, uma classe de RNAs não-codificadores, os microRNAs (miRNAs), possuem papel fundamental na regulação de vários pontos em vias biológicas conhecidas, principalmente na modulação de genes codificadores de proteínas relacionadas ao crescimento. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica dos genes relacionados ao eixo GH/IGF e MSTN; determinar os miRNAs envolvidos e seus alvos; e avaliar o conjunto de proteínas relacionando-as aos respectivos fenótipos. Amostras biológicas foram coletadas das linhagens Chitralada e Red Stirling e do híbrido (7/8 Chitralada). Para a análise de expressão gênica por RT-qPCR, foram coletadas amostras de cérebro, fígado e músculo branco. Para a análise de miRNAs por RNA-seq, foram utilizados pools das amostras de músculo branco, assim como para a análise por ESI-q-TOF e shotgun. Os ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Marcos Aparecido Gimenes / Resumo: O gênero Arachis possui 81, espécies distribuídas em nove seções taxonômicas, sendo o amendoim (A. hypogaea L.) a principal espécie, devido ao seu alto valor nutricional. O gênero possui também outras espécies de interesse econômico, que têm sido utilizadas em programas de melhoramento do amendoim (espécies da seção Arachis) e espécies forrageiras de outras seções do gênero. Com relação às demais espécies, o germoplasma da grande maioria está disponível para a caracterização e pode, sem dúvida, contribuir para seu uso futuro. O gênero Arachis é um dos poucos que produzem o resveratrol, uma fitoalexina que, além de ser uma resposta da planta contra estresses, também tem ação antioxidante, sendo indicado para prevenção de cânceres e cardiopatias. A avaliação do potencial de produção de resveratrol foi realizada somente em algumas espécies da seção Arachis, faltando avaliação em outras espécies do gênero e nos tetraploides sintéticos que estão sendo utilizados para facilitar a transferência de alelos de espécies silvestres para a cultivada. Assim, o objetivo desse trabalho foi ampliar o conhecimento sobre resveratrol no gênero Arachis. Para tanto foram analisados 21 acessos de espécies silvestres de cinco diferentes seções do gênero Arachis, oito poliploides sintéticos e três cultivares de amendoim. A produção de resveratrol em um conjunto menor de cinco espécies foi acompanhada também de avaliação da expressão do gene que codifica a enzima resveratrol sintase, RS, para entende... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Arachis genus comprises 81 species divided into nine taxonomic sections, being peanut (A. hypogaea L.) the main species due to its high nutritional value. The genus also has other species of economic interest, which have been used in breeding programs for peanut (species of Arachis section) and to forage production. Regarding the other species of Arachis, germplasm of most of them is available and their characterization could undoubtedly contribute to their future use. Arachis genus is one of the few that produces resveratrol, a phytoalexin that is synthesized by the plant due to a stress and it is also a antioxidant that has been used to prevention of cancers and heart diseases. The resveratrol evaluation in Arachis was carried out mainly in Arachis hypogaea and in some species of the section Arachis, lacking the evaluation in other species of the genus and in the synthetic tetraploids that have been used to facilitate the transfer of alleles from wild species to the cultivated one. Therefore, the objective of this study was to increase the knowledge about resveratrol in the genus Arachis. Twenty one accessions of wild species from five different sections of the genus Arachis, eight synthetic polyploids and three peanut cultivars were analyzed. The production of resveratrol in a smaller set of five species was also accompanied of evaluation of resveratrol synthase to try to understand the variation observed in the resveratrol content among the species. Since each experim... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Este trabalho foi dividido em duas seções, a primeira teve o objetivo de avaliar a ação da metformina sobre a expressão proteica e gênica dos receptores de insulina (IR) e IGF-1 (IGF-1R), como também proteínas da via de sinalização destes receptores, Akt/PKB, ERK, PI3K e GLUT4, em cultura primária de células estromais endometriais hiperandrogênicas e hiperinsulinêmicas, simulando características da Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP). A segunda seção verificou a expressão de semaforina da classe 3 (SEMA3A-F) nas fases do ciclo menstrual e a ação da metformina, em diferentes concentrações, na expressão desta semaforina em cultura primária de células estromais endometriais. No primeiro estudo foram realizadas culturas primárias de células estromais endometriais em diferentes grupos estimulados com estrogênio, progesterona, insulina e androgênios (características da SOP), e tratados com metformina por 10 min, 24 e 48 h. Após 14 dias foram extraídos RNA e proteína para realização das técnicas de qRT-PCR, para avaliar IR e IGF-1R, e Western blot, para avaliar IR, IGF-1R, Akt/PKB, ERK, PI3K e GLUT4. Houve aumento da expressão gênica de IR nos grupos tratados com insulina, e uma potencialização deste efeito quando a metformina foi associada. Enquanto que o androgênio diminuiu a expressão de IGF-1R e a metformina reverteu este efeito. Quanto à expressão proteica, observou-se que a interação da metformina com a insulina aumentou a expressão do IR em relação aos outros grupos. O IGF-1R sofreu efeito principalmente da insulina, que causou o aumento da expressão deste receptor, e a metformina não influenciou em sua expressão. PI3K e GLUT4 apresentaram uma maior expressão nos grupos estimulados com insulina, e ainda maior quando tratados com insulina e metformina. A proteína ERK não sofreu influência da metformina, enquanto a fosforilação da Akt/PKB foi diminuída significativamente pela ação da metformina. No segundo estudo foram coletadas biópsias endometriais nas fases proliferativa e secretória do ciclo menstrual e por qRT-PCR e ELISA foi quantificada a expressão de SEMA3A-F comparando estas fases do ciclo menstrual. Também em culturas primárias de células estromais endometriais foi observado o efeito da metformina, em diferentes concentrações, sobre a expressão desta classe de semaforina. Foi observado uma maior expressão das semaforinas 3A, 3C, 3D e 3E na fase proliferativa do ciclo menstrual comparado com a fase secretória. Em cultura de células, altas doses de metformina inibiram a expressão das semaforinas 3A, 3D e 3E. Como conclusão, a metformina tem efeito sobre células estromais endometriais atuando sobre fatores de crescimento e proteínas de suas vias de sinalização, normalmente aumentando sua expressão, quando associada à insulina. A fosforilação da Akt/PKB foi inibida pela metformina possivelmente por sua ação antiproliferativa. A semaforina de classe 3 está relacionada com a proliferação de células endometriais, e a metformina, em altas doses, diminui sua expressão. / This study has two sections, the first aimed to evaluate the effect of metformin on gene and protein expression of insulin receptor (IR) and IGF-1 receptor (IGF-1R), as well as proteins of the pathway signaling of growth factors; Akt/PKB, ERK, PI3K and Glut4 in primary cultures hyperinsulinemic and hyperandrogenism of endometrial stromal cells, simulating polycystic ovary syndrome (PCOS). The second section to evaluate the expression of the class 3 semaphorin (SEMA3A-F) on phases of the menstrual cycle, and the effect of metformin on expression of this semaphorin in endometrial stromal cells. Method: At first, primary cultures of endometrial stromal cells were performed in different groups stimulated with estrogen, progesterone, insulin and androgens (PCOS characteristics) and metformin for 10 minutes, 24 and 48 hours. After 14 days were extracted RNA and protein for qRT-PCR to evaluate IR and IGF-1R, and Western blot to assess IR, IGF-1R, Akt/PKB, ERK, PI3K, and Glut4. In the second, were collected endometrial biopsies in proliferative and secretory phases of the cycle, and by qRT-PCR and ELISA observed the expression of SEMA3A-F comparing these phases of the menstrual cycle. Also in primary cultures of endometrial stromal cells was observed effects of metformin on the expression of semaphorin class. Results: In the first section, the gene expression of IR showed an increase in the groups treated with insulin, and a more effect when metformin was associated, whereas androgen decreased expression of IGF-1R and metformin reversed this state. Regarding protein expression, it was observed that the interaction of metformin with insulin increased the expression of IR; and of IGF-1R, insulin affected mainly by increasing expression of this receptor, and metformin did not affect expression. Glut4 and PI3K showed higher expression in insulin-stimulated groups, and even greater when treated with insulin and metformin. The protein ERK was not affected by metformin, while the phosphorylation of Akt/PKB was significantly decreased by metformin action. In the second section, we observed a higher expression of semaphorin 3A, 3C, 3D and 3E in the proliferative phase of the menstrual cycle compared with the secretory phase. In cell culture, high doses of metformin inhibited the expression of semaphorin 3A, 3D, and 3E. Conclusions: Metformin has an effect on endometrial stromal cell acting on growth factors and their proteins signaling pathways, usually increasing expressions when combined with insulin. Phosphorylation of Akt/PKB was inhibited by metformin possibly for its antiproliferative action. The semaphorin class 3 is related to the proliferation of endometrial cells, and metformin (high doses), decreases its expression.

Orientador: Ricardo Antonio Polanczyk / Banca: Celso Omoto / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Daniel Ricardo Sosa-Gomez / Banca: Guilherme Duarte Rossi / Resumo: Plutella xylostella é uma praga de grande importância para as crucíferas em todo o mundo. Embora seja controlada com inseticidas sintéticos e biológicos, ela pode desenvolver resistência rapidamente a uma variedade de inseticidas. Os biopesticidas mais comuns utilizados para controlar P. xylostella são baseados na bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis. Embora muitos estudos tenham sido realizados com Bt, o modo de ação ainda não é totalmente compreendido. Uma grande diversidade de genes é diferencialmente expressa no intestino médio de insetos resistentes, o que sugere que vários processos celulares podem estar envolvidos na resistência. Descobertas recentes mostraram que as mutações no gene que codifica o transportador ABCC2 são responsáveis pela resistência às toxinas Bt em diferentes espécies de insetos. O objetivo desta pesquisa foi testar a hipótese de que a susceptibilidade de P. xylostella a Bt se correlaciona com o nível de expressão dos componentes desse regulador de estresse. Os níveis de expressão dos genes ALP, APN, CDKAL 1, MAP4K4 e ABCC2 foi comparado utilizando qPCR, entre populações suscetíveis e resistentes de P. xylostella. A investigação da sequência de DNA do cDNA do ABCC2 foi realizada, por PCR e sequenciamento, para testar a hipótese de que a susceptibilidade de P. xylostella a Bt se correlaciona com mutações no gene ABCC2. Foram realizados retrocruzamentos entre populações suscetíveis e resistentes e cruzamentos de complementação entre popula... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Plutella xylostella is a major insect pest of cruciferous crops worldwide. Although controlled with both synthetic and biological insecticides it can rapidly evolve resistance to a variety of insecticides. The most common biopesticides used to control P. xylostella are based on the entomopathogenic bacterium Bacillus thuringiensis. Although many studies have been performed on Bt, the mode of action is still not fully understood. A wide diversity of genes are differentially expressed in the midgut of resistant insects, this suggests that a variety of cell processes may be involved in the preservation of resistance. Recent discoveries have shown that mutations in the gene encoding an ABCC2 transporter are responsible for resistance to Bt toxins in various different insect species. The aim of this research was to test the hypothesis that the susceptibility of P. xylostella to Bt correlates with the level of expression of components of this putative stress-response regulon. The level of expression of ALP, APN, CDKAL 1, MAP4K4 and ABCC2 genes were compared using qPCR, between susceptible and resistant P. xylostella populations. The investigation of the DNA sequence of ABCC2 cDNA was performed, through PCR and sequencing, to test the hypothesis that the susceptibility of P. xylostella to Bt correlates with mutations on the ABCC2 gene. Backcrosses between susceptible and resistant populations and complementation cross between resistant populations were performed. Our research demons... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Ney Lemke / Coorientador: Marcio Luis Acencio / Banca: Cesar Martins / Banca: Lucas Bleicher / Resumo: Fatores de transcrição são proteínas que interagem com sequências nucleotídicas específicas situadas nas regiões promotoras de genes e, através dessa interação, regulam a transcrição dos genes. Devido a essa função reguladora, a identificação e a caracterização da rede de interações entre fatores de transcrição e seus genes alvos são importantes por que essa rede representa o arcabouço molecular através do qual os estímulos ambientais são convertidos em expressão diferencial dos genes. Como essa expressão diferencial, por sua vez, determina o comportamento da célula em resposta a um certo estímulo, a rede de interações de regulação transcricional pode, portanto, fornecer uma compreensão sistêmica de como os comportamentos celulares emergem a partir dos estímulos ambientais. A primeira etapa para a construção de uma rede de regulação transcricional consiste na coleta de dados relacionados às interações entre os fatores de transcrição e seus genes alvos. Porém, como esses dados são encontrados de forma dispersa na literatura ou em bancos de dados pagos, essa etapa demanda muito tempo. Com o objetivo de centralizar esses dados de forma a facilitar sua coleta e, consequentemente, a construção da rede de interações de regulação transcricional, desenvolvemos um banco de dados relacional chamado Human Transcriptional Regulation Interaction Database (HTRIdb). Desenvolvido em PostgreSQL e Java, o HTRIdb contém uma coleção de milhares de interações de regulação transcricional experimentalmente verificadas em seres humanos que podem ser acessadas e obtidas gratuitamente por toda a comunidade científica. Além do acesso gratuito e livre permissão para a obtenção dos dados, o HTRIdb oferece... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Transcription factors are proteins that interact with specific nucleotide sequences located in promoter regions of genes and, through this interaction, regulate gene transcription. Due of this regulatory function, the identification and characterization of the network of interactions between transcription factors and their target genes are important since this network represents the molecular framework that explains how environmental stimuli are converted into differential expression of genes. This network provides a systemic understanding of how cellular behaviors emerge from the environmental stimuli. The first step for the transcriptional regulatory network construction is the collection of data about interactions between transcription factors and their target genes. This step is very time-consuming as these data are found dispersed on the literature or in commercial databases. In an effort to provide researchers with a repository of transcriptional regulatory interactions from which such interactions can be directly and easily extracted, we developed a relational database called the Human Interaction Database Transcriptional Regulation (HTRIdb). HTRIdb was implemented using PostgreSQL and Java and contains a collection of thousands of experimentally verified human transcriptional regulation interactions. HTRIdb can be freely accessed by the scientific community and offers a visualization tool for the regulatory network and provides a communication interface between users and developers to enhance... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A endometriose caracteriza-se pela presença de tecido endometriótico – glândulas e estroma – fora da cavidade uterina. A doença acomete superfícies peritoniais da pélvis, ovários e septo rectovaginal, sendo mais comum a endometriose pélvica. Embora os dados sobre a prevalência exata de endometriose sejam incertos, as evidências indicam uma prevalência em torno de 5 a 10% das mulheres em idade reprodutiva. Dor, dismenorréia, dispareunia e infertilidade são sintomas freqüentes da doença. Além de apresentar dependência aos hormônios sexuais, a endometriose está associada a um conjunto de desordens de diferentes etiologias, sendo considerada uma doença multifatorial de caráter genético e imune. Neste sentido, a carência de respostas imunológicas adequadas, aliada a um provável desequilíbrio entre os processos de proliferação e apoptose celular, pode ter um papel importante na instalação e manutenção das lesões endometrióticas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a expressão de genes relacionados aos processos de proliferação e diferenciação celular em implantes endometrióticos e endométrio eutópico de mulheres inférteis sem e com endometriose, através da análise semiquantitativa por RT-PCR. Foram estudadas 34 pacientes consultando por infertilidade e submetidas à laparoscopia diagnóstica. Quinze pacientes (31,7 ± 1,5 anos) apresentavam endometriose e 19 (32,9 ± 0,9 anos) foram consideradas controles inférteis sem endometriose. Os dois grupos apresentaram IMC e SHBG similares. As biópsias de endométrio foram realizadas, em fase folicular, nas pacientes do grupo controle (C) e nas pacientes com endometriose (endométrio eutópico (EUT) e ectópico (ECT)). A presença do mRNA para os receptores de estrogênio e progesterona detectada nos 3 grupos estudados, sustenta a existência de sensibilidade tecidual local aos hormônios sexuais. Nas condições experimentais do presente estudo não foi observada diferença estatística na expressão gênica de bcl2 entre os grupos. A expressão do gene do ER endometrial também foi similar entre os grupos controle, eutópico e ectópico. Contudo, o endométrio ectópico apresentou níveis de mRNA mais elevados para PR-A (0,84  0,02 UA) em relação aos grupos controle e eutópico (0,60  0,04 UA e 0,63  0,04 UA; p < 0,05). A expressão gênica do PR-B não foi estatisticamente diferente entre os grupos do presente trabalho. Porém, houve forte correlação negativa entre a expressão dos genes bcl2 e PR-B nas amostras de endométrio sem e com endometriose (r = - 0,795 e p = 0,018), sugerindo que um papel anti-proliferativo do PR-B possa ser operativo neste modelo de estudo. / Endometriosis is characterized as the presence of endometrial glands and stroma outside of the uterine cavity. The disorder attacks the surfaces on the pelvic peritoneum, ovaries and rectovaginal septum, been commonly the pelvic endometriosis. Although the exact prevalence remains uncertain, 5 to 10% of women of reproductive age are estimated to have endometriosis. Pain, dysmenorrhea, dyspareunia and infertility are frequent symptoms of the disorder. Endometriosis is a hormonal-dependent disease and has been considered as a multifactorial disorder with genetic and immune characteristics. Thus, changes on immunologic responses associated to a potential disequilibrium between proliferative and apoptotic process, seems to play a main role in the development and maintenance of the endometriotic lesions. The aim of this study was to characterize the expression of genes related to cellular proliferation and differentiation in endometriotic lesions and eutopic endometrium from infertile women with and without endometriosis by RT-PCR semiquantitative analysis. Thirty four patients consulting for infertility and submitted to diagnostic laparoscopy were studied. Fifteen patients (31.7 ± 1.5 years old) presented endometriosis and 19 (32.9 ± 0.9 years old) were considered as control, free from the disease. Both groups presented similar BMI and SHBG. Endometrial biopsies were collected during the follicular phase, from patients of the control group (C) and those from the endometriosis group (eutopic (EUT) and ectopic (ECT) endometrium). Estrogen and progesterone receptor gene expression was detected in the 3 groups, supporting the existence of a local sensitivity to sexual hormones. No statistical differences were observed in bcl2 gene expression between the groups. The gene expression of ERα was also similar among control, eutopic and ectopic groups. In turn, ectopic endometrium showed higher PR-A gene expression (0.84 ± 0.02 AU) than control and eutopic groups (0.60 ± 0.04 AU e 0.63 ± 0.04 AU; p < 0.05). The PR-B gene expression did not differ among the groups. However, a strong and significant negative correlation between bcl2 and PR-B levels was demonstrated in the endometrial samples from patients presenting or not endometriosis (r = - 0.795 and p = 0.018), suggesting that an anti-proliferative role of PR-B could be operating trough this model of study.

Os hormônios da tireóide (HT) têm sido descritos agindo em sítios nucleares e extranucleares, induzindo respostas celulares através de diversos mecanismos. Também tem sido reportado que as proteínas do citoesqueleto são alvos para os HT durante o desenvolvimento do testículo e do sistema nervoso. Os efeitos dos HT durante o desenvolvimento são mediados principalmente por receptores nucleares modulando a expressão gênica. Entretanto, há diversas evidências de mecanismos não genômicos dos HT associados a vias de sinalização ativadas por Ca2+ e proteínas quinases. Nesse contexto, nosso estudo investigou as ações genômicas e não genômicas dos HT em células testiculares e neurais durante o desenvolvimento. Nós inicialmente demonstramos o envolvimento de mecanismos mediados por Ca2+ na fosforilação da vimentina induzida por T3 em testículos de ratos imaturos através de mecanismos independentes da síntese de proteínas. Também observamos um acúmulo de vimentina fosforilada em testículos de ratos hipertireoideos, podendo ser conseqüência da ativação da ERK regulando o citoesqueleto. Nós ainda demonstramos um aumento no metabolismo basal através da medida do consumo de O2 e dos níveis de TBARS. Além disso, as defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas modificaram-se aparentemente de acordo com o aumento no consumo de O2. E Esses resultados corroboram com a idéia de que um aumento na geração de ROS induz estresse oxidativo e pode ser responsável pelas alterações bioquímicas envolvidas no aumento da capacidade metabólica em testículos de ratos hipertireoideos. Além disso, o hipotireoidismo inibiu a atividade das NTPDases em culturas de células de Sertoli sem alterar a expressão das NTPDases 1, 2 e 3. Os HT modificaram a atividade NTPDásica, provavelmente através de mecanismos não genômicos e, consequentemente, podem influenciar a função reprodutiva durante o desenvolvimento. Considerando-se os efeitos dos HT em células neurais, nós primeiramente demonstramos que T3 e T4 estimularam a fosforilação dos filamentos intermediários (FI) através de mecanismos GABAérgicos via PKA e PKCaMII em córtex cerebral de ratos de 10 dias de idade. A dependência de PKA, PKC e canais de Ca2+ tipo-L e -T também foi evidenciada no efeito dos HT sobre a captação de 45Ca2+. Surpreendentemente, em córtex cerebral de ratos de 15 dias de idade, apenas o T4 estimulou a fosforilação dos FIs. Os mecanismos envolvidos na ação do T4 sobre o citoesqueleto dependem da ativação de um receptor acoplado a proteínas Gi, além da participação da PLC, PKC, MAPK, PKCaMII e níveis intracelulares de Ca2+. Estes dados demonstram que o T4 tem importantes funções fisiológicas modulando o citoesqueleto de células neurais durante o desenvolvimento. Nós também demonstramos a reorganização e a fosforilação do citoesqueleto induzidas por HT em células de glioma C6 e astrócitos, e a participação da via de sinalização da RhoA mediando a ação hormonal. Concluindo, nossos resultados evidenciaram ações genômicas e não genômicas dos HT promovendo a fosforilação dos FI, reorganização do citoesqueleto, influxo de Ca2+ e modulação da atividade das NTPDases via mecanismos mediados por Ca2+ e proteínas quinases. Estes resultados podem contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos nas desordens observadas no hipo e hipertireoidismo durante o desenvolvimento e maturação do cérebro e do testículo. / Thyroid hormones (TH) have been shown to act at nuclear and extra nuclear sites, inducing cell responses by several mechanisms. It has also been reported that cytoskeletal proteins are a target for TH during hormone-induced differentiation and development of nervous system and testicular cells. The developmental effects of TH are mainly mediated by nuclear receptors regulating gene expression. However, there are increasing evidences of nongenomic mechanisms of TH associated with kinase- and Ca2+-activated signaling pathways. In this context, our study investigated the genomic and nongenomic actions of TH on testicular and neural cells from developing rats. We first described the involvement of Ca2+-mediated mechanisms on vimentin phosphorylation induced by T3 in immature rat testis. This effect was demonstrated to be independent of protein synthesis. Furthermore, we observed an accumulation of phosphorylated vimentin in hyperthyroid rat testes, which could be a consequence of the extracellular-regulated kinase (ERK) activation regulating the cytoskeleton. We also demonstrate increased basal metabolic rate, measured by tissue oxygen consumption, as well as, increased TBARS levels. Moreover, the enzymatic and non-enzymatic antioxidant defences were modified apparently to respond according to the augmented oxygen consumption. These results support the idea that an increase in mitochondrial ROS generation, underlying cellular oxidative damage, is a side effect of hyperthyroid-induced biochemical changes by which rat testis increase their metabolic capacity. In addition, hypothyroidism inhibited NTPDase activity in Sertoli cell cultures from young rats without alter the expression of NTPDase 1, 2 and 3. Our findings also demonstrate that TH modifies the NTPDase activities, probably via non-genomic mechanisms and consequently may influence the reproductive function throughout development. Concerning the effect of TH on neural cells, we first demonstrate that T3 and T4 stimulate the intermediate filament (IF) phosphorylation through PKA, PKCaMII and GABAergic mechanisms in cerebral cortex of 10 day-old rats. The dependence of PKA, PKC, L- and T-type Ca2+ channels were also evidenced on the effect of TH on 45Ca2+ uptake. Surprisingly, in cerebral cortex of 15 day-old rats, only T4 stimulate IF phosphorylation. The mechanisms underlying the action of T4 involve the activation of a Gi-protein coupled receptor. Moreover, we showed the participation of PLC, PKC, MAPK, PKCaMII and intracellular Ca2+ levels mediating the effects of T4 on the cytoskeleton. These findings demonstrate that T4 have important physiological roles modulating the cytoskeleton of neural cells during development. We further demonstrate that TH induce cytoskeleton reorganization and phosphorylation in C6 glioma cells and astrocytes and the participation of RhoA signaling pathway mediating this action. In conclusion, our results evidence genomic and nongenomic actions of TH promoting IF phosphorylation, cytoskeletal reorganization, Ca2+ influx and modulation of NTPDase activity by Ca2+- and kinase-mediated mechanisms. These results may contribute to a better knowledge of the mechanisms involved in the disorders observed in hyper and hypothyroidism during brain and testis maturation and development.

Introdução. O câncer de próstata (CaP) é o mais comum em homens nos Estados Unidos. Em 2010, formam estimados 192.280 novos casos de CaP e 27.360 mortes nos Estados Unidos. A incidência estimada de CaP no Brasil é de 52.350 novos casos em 2010, principalmente na região sul. A hiperplasia prostática benigna (HPB) é uma anormalidade proliferativa associada à idade em homens. A prevalência de HPB é em torno de 14% entre 40 e 50 anos e 43% acima de 60 anos. A patogênese do desenvolvimento tumoral tem sido associada com a ação dos hormônios esteróides. Os efeitos dos androgênios são mediados pela testosterona e pela dihidrotestosterona (DHT) nas células alvo. Suas ações têm sido demonstradas na morfogênese, diferenciação, proliferação e secreção da glândula prostática. A ligação do androgênio promove a ativação do receptor de androgênio (AR), recrutamento de cofatores, promovendo a transcrição dos genes alvos hormônio-dependentes. Numerosos correguladores do AR têm sido descritos como sendo essenciais para a ativação do AR durante a progressão da doença. SHP, FHL2 e o complexo P160 (SRC1, GRIP1 e AIB1) parecem ser importantes correguladores do AR. O polimorfismo CAG e GGC do AR pode alterar a transcrição dos genes responsivos aos androgênios e, potencialmente, atuar no desenvolvimento da HPB e do CaP. Objetivo. 1. Investigar a associação entre o número de repetições CAG e GGC do AR, os níveis de testosterona e a chance de desenvolver CaP ou HPB em nossa população. 2. Investigar a expressão de SHP, FHL2, do complexo P160 e do AR em tecidos HPB, CaP e ZPU (zona periuretral proveniente das amostras CaP). Materiais e Métodos. Foram analisados 344 pacientes oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, sendo 130 CaP, 126 HPB e 88 controles, para analisar o polimorfismo CAG e GGC. O DNA foi extraído a partir do sangue periférico e o gene do AR foi analisado através de análise de fragmento. Cento e dois pacientes submetidos à cirurgia foram utilizados para avaliar as expressões gênicas. Foram avaliados 36 HPB, 66 CaP e 33 ZPU. O RNA foi extraído e as expressões gênicas foram analisadas por PCR em tempo real. Os protocolos e os termos de consentimento foram aprovados pelo comitê de ética local e nacional. Resultados. As médias do número de repetições CAG e GGC foram semelhantes entre os grupos CaP, HPB e controles. A chance de desenvolver CaP nos indivíduos que possuem um longo alelo para o polimorfismo GGC (GGC > 18 e GGC >19) é de 1,96 e 3,30 vezes maior do que o alelo curto (GGC ≤ 18 e GGC ≤ 19) (p=0,035 e p=0,007), respectivamente. A chance de desenvolver HPB em indivíduos que possuem o alelo longo para o polimorfismo GGC (GGC > 18) é 2,33 vezes maior (p=0,008) do que o alelo curto (GGC ≤ 18). O risco de desenvolver CaP e HPB em pacientes com a testosterona total < 4ng/mL foram de 2,80 (P=0,005) e 2,78 vezes maior (P=0,002), respectivamente, comparado com os pacientes com testosterona total > 4ng/mL. Os níveis séricos de testosterona total em pacientes com GGC > 19 foram significativamente menor comparados com pacientes com GGC ≤ 19 (P=0,001). A expressão gênica de AR foi maior no grupo ZPU e CaP em relação ao grupo HPB (P=0,033 e P<0.001, respectivamente). A expressão de SHP foi maior no grupo CaP comparado com o HPB (P=0,039). A expressão de FHL2 foi maior no grupo ZPU comparado com o CaP e HPB (P<0.001 e P=0.007, respectivamente). Dos genes que formam o complexo P160, a expressão de SRC1 foi maior no grupo ZPU comparado com o CaP (P<0.001) e HPB (P=0,005). GRIP1 foi mais expresso nos grupos CaP e ZPU em relação ao grupo HPB (P<0,001 e P=0.006, respectivamente) e a expressão de AIB1 foi maior nos grupos CaP e ZPU comparados ao grupo HPB (P=0,030 e P=0.001, respectivamente). A expressão protéica de FHL2 foi maior no grupo CaP comparado com o grupo HPB (P=0.023). As análises moleculares de AR, GRIP1 e AIB1, monstraram melhores parâmetros diagnósticos do que a análise dos níveis séricos de PSA. Conclusões. A presença de um número de repetições GGC>18 e GGC>19 do AR foi associada com o aumento da chance de desenvolver CaP. As repetições de GGC>18 também foram associadas com a chance de desenvolver HPB. Níveis baixos de testosterona sérica foram encontrados nos grupos CaP e HPB comparados com os controles. Baixos níveis de testosterona podem aumentar a chance de desenvolver CaP e HPB. Este estudo demonstra a participação dos genes AR, SHP, FHL2 e do complexo P160 no aumento de proliferação da glândula prostática. AR, FHL2, SRC1, GRIP1 e AIB1 poderão ser uma boa alternativa para acompanhar os pacientes que possuem níveis elevados de PSA, toque alterado e biópsia negativa. / Introduction. Prostate cancer (PCa) is the most common cancer in men within the U.S. In 2010, 192,280 new cases were estimated in the U.S., and 27,360 deaths were due to this disease. The estimated incidence of prostate cancer in Brazil is of 52,350 new cases in 2010, mainly in southern regions. Benign Prostatic Hyperplasia (BPH) is a very frequent age-related proliferative abnormality in men. The prevalence of BPH is around 14 % at the age of 40 to 50 years, and 43% among those 60+. The pathogenesis of tumor development has been closely associated to the action of steroid hormones. The androgenic effects are mediated by testosterone and dihydrotestosterone (DHT) in the target cells and their action have been demonstrated in morphogenesis, differentiation, cell proliferation and secretions of the prostate gland. The androgen binding promotes the activation of the androgen receptor, recruitment of co-factors, promoting the transcription of hormone-dependent target genes. Several AR-associated coregulators have been shown to be essential for AR activation during disease progression. SHP, FHL2 and P160 complex (SRC1, GRIP1 and AIB1) has been shown as important AR coregulators. Polymorphic CAG and GGC repeats in the androgen receptor (AR) can alter transactivation of androgen-responsive genes and, potentially, act over BPH and PCa risks. Purposes. 1. To investigate the association between CAG and GGC repeat length, testosterone levels and the risks of PCa and BPH in a case-control study from a Brazilian population. 2. To investigate the SHP, FHL2, P160 and AR expressions in BPH, PCa and PUZ (periurethral zone tissue from PCa sample) tissues. Material and Methods. At Hospital de Clínicas de Porto Alegre, 344 patients were evaluated; 130 PCa, 126 BPH and 88 healthy controls, to analyze CAG and GGC polymorphisms. DNA was extracted from peripheral leukocytes and the AR gene was analyzed by fragment analysis. Hazard Ratio (HR) and 95% confidence limits were estimated. 102 men undergoing surgical removal were evaluated to analyze gene expressions; 36 BPH, 66 PCa and 33 PUZ. RNA was extracted and gene expression was analyzed by real time RT-PCR. Protocols and informed consent were approved by the local and national ethics committee. Results. CAG and GGC mean lengths were not different between PCa, BPH and controls. The risk of developing PCa in individuals who have the long allele for GGC polymorphism (GGC > 18 and GGC >19) was 1.96 and 3.30 times higher compared to the short allele (GGC ≤ 18 and GGC ≤ 19) (P=0.035 and P=0.007), respectively. The risk of developing BPH in individuals who have the long allele for GGC polymorphism (GGC > 18) was 2.33 times higher compared to the short allele (GGC ≤ 18) (P=0.008). The risk of developing PCa and BPH in individuals who have the total testosterone < 4ng/mL were 2.80 (P=0.005) and 2.78 times higher (P=0.002), respectively, compared to individuals with testosterone levels > 4ng/mL. The total testosterone level in patients with GGC >19 was significantly lower in comparison to patients with GGC ≤ 19 (P=0.001). AR mRNA level was higher in PCa and PUZ group than BPH (P=0.033 and P<0.001, respectively). SHP level was higher in PCa group compared to BPH (P=0.039). FHL2 level was higher in PUZ group compared to PCa and HPB (P<0.001 and P=0.007, respectively). SRC1 showed no difference between PCa and BPH, but PUZ group SRC1 levels was higher compared to PCa (P<0.001) and BPH (P=0,005). GRIP1 levels were higher in PCa and PUZ group than BPH (P<0.001 and P=0.006, respectively). AIB1 level was higher in PCa and PUZ group compared to BPH (P=0.030 and P=0.001, respectively). FHL2 protein expression was higher in PCa group compared to HPB (P=0.023). Molecular analysis of AR, GRIP1 and AIB1 demonstrated better diagnosis parameters compared to serum PSA levels. Conclusions. Our data suggest that the presence of a long number of GGC polymorphic repeats in the androgen receptor gene is associated with the increased risk of developing PCa and BPH. Serum testosterone levels were lower in PCA and BPH groups when compared to control groups. Low levels of testosterone can increase the risk of PCa and BPH. This study indicates a larger participation of AR, SHP, FHL2 and P160 genes in the prostate proliferation. AR, FHL2, SRC1, GRIP1 and AIB1 might be analyzed on the future to accomplish some patients who have higher PSA levels, altered digital rectal examination, and negative biopsy.

A síndrome dos ovários policísticos (polycystic ovary syndrome – PCOS) constitui o distúrbio endócrino mais comum em mulheres em idade reprodutiva, afetando cerca de 5 a 10% das mulheres em todo o mundo. Caracteriza-se por hiperandrogenismo e disfunção ovariana, incluindo oligo-anovulação e/ou ovários policísticos na ausência de outras doenças que causem hiperandrogenismo. Também importante é o reconhecimento da PCOS como uma disfunção metabólica, manifestada por obesidade abdominal, resistência à insulina, dislipidemia e hipertensão. Estes fatores aumentam o risco para diabetes tipo 2 e, provavelmente, doença cardiovascular. O tecido adiposo secreta adipocinas e pode mediar inúmeros processos fisiológicos. Entre as adipocinas, a leptina e a adiponectina têm sido associadas com índice de massa corporal (IMC), ação da insulina e metabolismo da glicose. Além disso, o tecido adiposo armazena, mobiliza e forma esteróides a partir de interconversões de vários metabólitos hormonais. A aromatase é a enzima-chave para a síntese de estrogênios a partir de androgênios e está presente no tecido adiposo. Evidências indicam associações entre hormônios sexuais e hipertensão arterial sistêmica. Nas mulheres com PCOS, a hipertensão tem sido relacionada ao excesso de androgênios e à resistência à insulina. No presente estudo, avaliamos os níveis séricos de leptina e adiponectina, calculamos a relação leptina/adiponectina (L/A), bem como determinamos a expressão gênica de leptina, adiponectina e aromatase no tecido adiposo subcutâneo de mulheres com PCOS e de mulheres controles não hirsutas, com ciclos ovulatórios e pareadas para IMC. Encontramos níveis mais elevados de leptina sérica nas pacientes PCOS com sobrepeso/obesidade em relação com mulheres de peso normal, enquanto que as concentrações de adiponectina foram semelhantes em todos os subgrupos. A relação L/A foi maior nos subgrupos sobrepeso/obesidade quando comparados com o grupo controle de peso normal. A expressão gênica de leptina no tecido adiposo subcutâneo foi maior nas mulheres PCOS com sobrepeso/obesidade em relação às controles de peso normal, enquanto que a expressão gênica de adiponectina foi semelhantes entre os grupos. Na análise de regressão múltipla, o percentual de gordura corporal contribuiu significativamente para a relação L/A em PCOS, independentemente do IMC e do índice de androgênios livres. O RNAm da aromatase no tecido adiposo foi significativamente mais elevado no grupo de PCOS hipertensas (NCEP/ATP III 2001) quando comparado com as PCOS normotensas e com o grupo controle. Uma correlação positiva entre a expressão gênica de aromatase e a pressão arterial sistólica e diastólica foi observada nas pacientes com PCOS. Em conclusão, os dados do presente estudo sugerem que as alterações observadas na secreção de adipocinas parecem estar mais relacionadas à adiposidade do que ao excesso de androgênios na PCOS. Além disso, o excesso de androgênios e a hiperinsulinemia podem ter algum papel nos mecanismos moleculares que ativam a transcrição do RNAm da aromatase no tecido adiposo de mulheres com PCOS. / Polycystic ovary syndrome (PCOS), the most prevalent endocrine disorder in women of reproductive age, affects 5 to 10% of women worldwide. It is characterized by hyperandrogenism and ovarian dysfunction, including oligo-anovulation and/or polycystic ovaries in the absence of other diseases affecting pituitary and/or adrenal glands. Also important is the recognition of PCOS as a metabolic disorder, manifested by abdominal obesity, insulin resistance, dyslipidemia and hypertension. These factors increase the risk for type 2 diabetes and probably for cardiovascular disease. Adipose tissue has been recognized as an active endocrine organ and a secretory mediator of numerous physiological processes. The adipokines leptin and adiponectin have been associated with body mass index (BMI), insulin action, and glucose metabolism. In addition, adipose tissue is a reservoir of steroids, a center of sexual hormone conversion and a source of estrogen. Aromatase is the key enzyme for estrogen synthesis from androgens and is present in adipose tissue. Evidences indicate there are associations between sex hormones and arterial hypertension. In women with PCOS, hypertension has been linked to androgen excess and insulin resistance. In the present study, we assessed leptin and adiponectin serum levels and the leptin to adiponectin (L/A) ratio and evaluated the gene expression of leptin, adiponectin and aromatase in subcutaneous adipose tissue from PCOS and BMI-matched non-hirsute, ovulatory control women. We found higher leptin serum levels in overweight/obese PCOS patients than in normoweight women, while adiponectin concentrations were similar in all subgroups. L/A ratio was higher in overweight/obese subgroups than in normoweight controls. Subcutaneous leptin gene expression was higher in overweight/obese PCOS women than in normoweight controls, while the adiponectin gene expression was similar in all groups. On multiple regression analysis, percentage of body fat contributed significantly to L/A ratio in PCOS, independently of BMI and free androgen index. Subcutaneous aromatase mRNA was significantly higher in the hypertensive (NCEP/ATP III 2001) PCOS than in normotensive PCOS and control groups. A positive correlation between aromatase gene expression in subcutaneous fat with systolic and diastolic blood pressure was observed in PCOS patients. In conclusion, results from our study suggest that altered adipocyte secretion seems to relate to adiposity rather than to androgen excess in PCOS. In addition, our data suggest that androgen excess and hyperinsulinemia may play a role on the molecular mechanisms that activate aromatase mRNA transcription in abdominal fat tissue in women with PCOS.