Made available in DSpace on 2015-04-22T22:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 jorge felipe.pdf: 400342 bytes, checksum: fda0d3451f06f6d3a8aa76dbf9190171 (MD5) Previous issue date: 2009-03-06 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The effects of short and long-term contamination by effluent from an urban stream of Manaus on eggs and tadpoles of Osteocephalus taurinus (Anura, Hylidae) werw evaluated. To evaluate the acute effects of contamination a test CL5096h was done , which exposed eggs and tadpoles in Gosner stage 25 to a gradient of increasing concentrations established in geometric progression over a period of 96 hours. Eggs were less resistant to contamination than the tadpoles. The CL5096h for tadpoles was 47.63 mL/L while for the eggs was 25.19 mL/L. At lower concentrations of the experiment with eggs in which no mortality occurred, the tadpoles showed abdominal edema after 96h. To evaluated the effects of chronic exposure to low concentrations of urban sewage, tadpoles in Gosner stage 25 were exposed to three concentrations (9, 18 and 36 mL/L) of effluent until they reach metamorphosis. There were significant differences in growth rate and the size of metamorphosis between control and treatment. There were no significant differences in the number of survivors and length of time larvae. A concentration of 25 mL/L of effluent tested caused deleterious effects on eggs of Osteocephalus taurinus. A concentration of 36 mL/L caused changes in the parameters of developing larvae, and susceptibility to contamination ranged from egg masses. A concentration of 47mL/L caused deleterious effects on tadpoles free swimming. Concentrations of up to 16 mL/L can cause an increase in the average size of tadpoles / Foram avaliados os efeitos em curto e em longo prazo da contaminação por efluentes urbanos de um igarapé de Manaus sobre ovos e girinos de Osteocephalus taurinus (Anura, Hylidae). Para a avaliação de efeitos agudos de contaminação foi realizado um teste CL5096h, que expos ovos e girinos em estágio 25 de Gosner a um gradiente crescente de concentrações estabelecidas em progressão geométrica por um período de 96 horas. Ovos foram menos resistentes à contaminação do que os girinos. A CL5096h para girinos foi de 47,63 mL/L enquanto para os ovos foi de 25,19 mL/L. Nas concentrações mais baixas do experimento com ovos nas quais não ocorreu mortalidade, os girinos apresentaram edemas abdominais após 96h. Para avaliação dos efeitos crônicos da exposição a baixas concentrações de esgoto urbano, girinos no estadio 25 de Gosner foram expostos a três concentrações (9, 18 e 36 mL/L) de efluente até alcançarem a metamorfose. Houve diferenças significativas na taxa de crescimento e no tamanho de metamorfose entre o controle e o tratamento. Não houve diferenças significativas no número de sobreviventes e na duração do período larvário. Uma concentração de 25 mL/L do efluente testado causou efeitos deletérios sobre ovos de Osteocephalus taurinus. Uma concentração de 36 mL/L causou alterações nos parâmetros de desenvolvimento larvário, e a suscetibilidade à contaminação variou entre desovas. Uma concentração de 47mL/L causou efeitos deletérios sobre girinos livre-natantes. Concentrações de até 16 mL/L podem causar um aumento no tamanho médio dos girinos.

Oligodendroglial tumours originate from oligodendrocytes usually arising in the white matter and could be classified into grade-II oligodendrogliomas (OD) and anaplastic oligodendrogliomas (AOD, grade-III) according to the 2016 World Health Organization (WHO) grading scheme. ODs1 could be diagnosed by pathological and immunohistochemical analyses, however recent evidence suggests that they could be better diagnosed on the basis of defined genetic entities, such as the combined loss of chromosome 1p and 19q arms and IDH mutation. 1p/19q co-deletion is molecular hallmark of ODs and is clinically associated with better prognosis, response to chemo/radio-therapy and overall survival. Typical oligodendroglial histological features are strongly associated with 1p/19q loss and IDH mutation, which is critically important as diagnostic point of view. The examining of exclusive molecular signatures and transcriptome expression profiles added to histological class could compliment the classification of OD subtypes. In this regard, microRNAs (miRNAs, miRs) profiles could serve classifier signatures for tumour subsets. MiRNAs are 22nt short non-coding RNAs which are expressed endogenously and regulate diverse cellular process through negative control on gene expression at the posttranscriptional level by direct or imperfect interaction with their target mRNAs. MiRNAs are involved in regulating human tumorigenesis acting as either tumour suppressors or oncogenes. During the passage of tumorigenesis miRNA expression level is significantly increased or decreased compared to corresponding normal tissue. The same is observed with their mRNAs. Therefore, transcriptome profiling of human tumours could identify signatures associated with progression, diagnosis, prognosis and response to therapy. However, until recently the information regarding the expression of miRNAs and mRNA in oligodendroglial tumours is scarce. In this study we performed miRNA and mRNA differential expression profiling between grade II and grade III ODs using microarray based expression profiling platforms (723 transcripts and 41,000 genes, respectively). 7 cases for OD grade-II, and 7 for AOD grade-III, and 15 non neoplastic white matter (nnWM) samples were used after microdissection with no previous history of treatment. We performed a systematic evaluation of miRNAs and mRNAs expressions and determined miRNAs and putative target genes that are differentially expressed in grade III AOD, but not in grade II OD and in non-neoplastic white matter (nnWM). 1 ODs when used with ,,s\" will represent both OD and AOD. 50 miRNAs were overexpressed and 43 were down regulated in AOD-III, whereas 7 miRNAs showed significant reduction in expressions in OD-II group. 3 miRNAs were commonly down regulated in comparisons of both groups. The hsa-miR-23a was strongly upregulated and hsamiR-27a was strongly downregulated in AOD-III. The functions of hsa-miR-23a and hsa-miR- 27a were tested in human adult fibroblasts for cell proliferation assay and apoptosis detection. Cells treated with pre-miR-23a and pre-miR-27a showed 20% reduction in cell proliferation as compared with controls. Further, the functional relevance of miRNAs to their target mRNAs was validated for each group, using real time qPCR. 10 key-miRNAs from AOD were subjected to validation by qPCR. We were able to confirm 7 miRNAs (p? 0.05). Among these, 5 miRs (miR- 193a-3p, miR-24, miR-27a, miR-30a-5p and miR-30c) showed reduced expression whose target genes (CCND1, HDAC2, PDGFA and RAB-26) were upregulated. Whereas, 2 miRNAs likewise miR-301b and miR-378 were overexpressed whose target genes BCL2, FGF2, CD44 and PPP4R4 confirmed by qPCR (p? 0.05). Bioinformatics based gene ontology (GO), and networking analysis revealed that differential expression and targets are attributed to differentiation of embryonic stem cells, cell adhesion, angiogenesis and neurogenesis, resistance to apoptosis, protein-protein interactions and cell proliferation. It was possible to identify and validate miRNAs and their mRNA-targets potentially involved in the progression of oligodendrogliomas particularly in grade III-AOD. Collectively, this analysis provides new insights to malignant progression of oligodendroglial tumours and could compliment WHO-2016 diagnosis scheme and may provide predictive outcome in patients as well as decision to therapy. / Oligodendrogliomas originários de oligodendrócitos que geralmente surgem na substância branca podendo ser classificados em grau oligodendroglioma (II-OD), e anaplastic oligodendrogliomas (grau III-AOD). Os ODs2 podem ser diagnosticados por análises patológicas e imuno-histoquímicas, porém evidências recentes sugerem que poderiam ser melhor diagnosticados com base em assinaturas moleculares, como a deleção combinada dos cromossomas 1p e 19q - marcadores moleculares dos OD associados clinicamente a um melhor prognóstico, resposta à terapia e melhor sobrevida. As características histológicas típicas dos oligodendrogliomas também estão fortemente associadas à deleção de 1p/19q, que é criticamente importante como ponto de vista diagnóstico. Assim, os subtipos de gliomas podem ser fortemente diferenciados não somente em relação ao seu perfil histológico mas também com base em seu perfil de expressão genica e suas assinaturas moleculares exclusivas. Os microRNAs (miRNAs, miRs) emergiram como assinaturas moleculares para os diferentes graus. Os miRNAs são RNAs não codificantes, contendo em torno de 22 nucleótidos. São expressos endogenamente e regulam diversos processos celulares através do controle negativo da expressão gênica em nivel pós-transcricional e por interacção directa ou imperfeita com o RNAm-alvo. Os miRNAs estão envolvidos na regulação da tumorigenese humana atuando como supressores de tumour ou oncogenes. Durante o processo da tumorigenese o nível de expressão dos miRNAs é aumentado ou diminuído significativamente em comparação com tecido normal correspondente. O perfil de expressão de miRNA de tumores humanos poderia identificar assinaturas associadas com progressão, diagnóstico, prognóstico e resposta à terapia. Contudo, até recentemente a informação sobre a expressão de miRNAs em oligodendrogliomas é escassa. Neste estudo, avaliamos o perfil de expressão diferencial de miRNA e RNAm em ODs graus II e III usando plataformas de perfis de expressão baseadas em microarray (723 transcritos e 41.000 genes, respectivamente). Foram utilizados 14 casos de ODs microdissecados, sendo 7 OD grau II, e 7 AOD grau III (anaplasicos) sem histórico prévio de tratamento, além de 15 amostras de substancia branca não neoplásica (nnSB). Por meio de avaliações sistemáticas foram determinados miRNAs e mRNAs expressos em AOD grau III, mas não em OD grau II e em substancias brancas não neoplásicas (nnSB). 2 ODs when used with ,,s\" will represent both OD and AOD. Assim, foram encontrados 50 miRNAs com alta expressão e 43 miRNAs com baixa expressão em AOD-III, enquanto que 7 miRNAs apresentaram expressões reduzidas no grupo OD-II. Na comparação entre os dois grupos, 3 miRNAs apresentaram baixa expressão. A hsa-miR-23a mostrou alta expressão e a hsa-miR-27a apresentou uma diminuição de expressão importante em AOD III. A atividade dos hsa-miR-23a e hsa-miR-27a foram testadas em células de fibroblastos adultos humanos usando ensaios de proliferação celular e detecção de apoptose. As células tratadas com pre-miR-23a e pre-miR-27a mostraram 20% redução de proliferação celular em comparação com os controles. Para cada grupo, a relevância funcional dos miRNAs e seus mRNAs alvos foi validada utilizando qPCR. Dos 10 miRNAs submetidos a validação em grau III, foi possivel confirmar 7 miRNA(p<0,05). Entre esses, 5 miRs (miR-193a-3p, miR-24, miR- 27a, miR-30a-5p e miR-30c) mostraram expressão reduzida, cujos genes alvos (CCND1, HDAC2, PDGFA e RAB-26) apresentavam alta expressão. Enquanto que, 2 miRNAs como miR-301b e miR-378 apresentaram alta expressão cujos genes alvo BCL2, FGF2, CD44 e PPP4R4 foram confirmados por qPCR (p<0,05). Ferramentas de bioinformática (Gene Ontology) e a análises em rede revelaram que a expressão diferencial e os alvos são atribuídos à diferenciação de células-tronco embrionárias, adesão de celular, angiogênese e neurogênese, resistência à apoptose, interações proteína-proteína e proliferação celular. Foi possível identificar e validar miRNAs e RNAm-alvos potencialmente envolvidos na progressão de oligodendrogliomas. Coletivamente, esta análise fornece novos achados relacionados a progressão maligna de tumores oligodendrogliais e poderia facilitar o diagnóstico preciso e mais restritivo, o desfecho preditivo em pacientes, bem como auxiliar na decisão da terapia.

Neste trabalho foi transfectada uma linhagem de células embrionárias de rim humano (HEK293) com os genes das subunidades &alpha; e &beta; da tireotrofina humana (hTSH), hormônio glicoproteico secretado pela hipófise. Após 5 dias de cultivo obteve-se uma concentração de hTSH no meio condicionado de 0,95&mu;g/mL. O material foi concentrado e purificado utilizando uma estratégia envolvendo duas etapas, uma cromatografia de troca catiônica e uma cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa, que permitiu uma recuperação de 55% e uma pureza >90%. O produto purificado (hTSH-HEK) foi analisado e comparado a uma preparação comercial obtida em células CHO (hTSH-CHO) e a uma preparação hipofisária (hTSH-Pit). A identidade e a pureza do hTSH-HEK foram avaliadas por métodos físicoquímicos e imunológico (espectrometria de massa MALDI-TOF, HPLC de exclusão molecular e de fase reversa, SDS-PAGE e ensaio imunoradiométrico). A porção glicídica do hTSH-HEK foi avaliada pela análise do perfil dos N-glicanos e o comportamento biológico deste hormônio foi avaliado por bioensaio in vivo e estudo farmacocinético. As 3 preparações apresentaram pureza equivalente (97%) e a massa molecular relativa do hTSH-HEK foi 2,1% menor do que a do hTSH-CHO e 2,7% maior do que a do hTSH-Pit. A maior hidrofobicidade relativa, avaliada por RP-HPLC, foi a do hTSH-HEK. Os N-glicanos identificados no hTSH-HEK foram do tipo complexo, apresentando predominantemente estruturas tri-antenárias, enquanto no hTSH-CHO e no hTSH-Pit as estruturas bi-antenárias foram predominantes. Foram detectadas diferenças significativas relacionadas à composição dos carboidratos para estas preparações, um teor muito menor de ácido siálico e muito maior de fucose foram observados no hTSHHEK. Foi confirmada a atividade biológica das 3 preparações, sendo a bioatividade do hTSHHEK 39% e 16% inferior à do hTSH-CHO e hTSH-Pit, respectivamente. A meia-vida circulatória do hTSH-HEK foi menor (1,5 X) que a do hTSH-CHO e a do hTSH-Pit (1,2 X). De acordo com esses resultados o hTSH-HEK pode ser considerado uma alternativa viável para aplicações clínicas especialmente por sua origem humana e composição de carboidratos. / In this work a strain of embryonic human kidney cells (HEK293) was transfected with the genes of the &alpha; and &beta; subunits of human thyrotropin (hTSH), a glycoproteic hormone secreted by the pituitary gland. After 5 days of culture, the concentration of hTSH in conditioned medium was 0.95&mu;g/mL. The material was concentrated and purified utilizing a strategy involving two steps, a cation-exchange chromatography and a reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), providing an overall yield of 55% and a purity level > 90%. The purified material (hTSH-HEK) was analyzed and compared to a recombinant commercial preparation obtained from CHO cells (hTSH-CHO) and to a human pituitary preparation (hTSH-Pit). Identity and purity of hTSH-HEK were evaluated through physicochemical and immunological methods (MALDI-TOF mass spectrometry, size exclusion HPLC, reversed-phase HPLC, SDS-PAGE, immunoradiometric assay). Glycidic portion of hTSHHEK was evaluated by N-glycoprofiling analysis and the biological behavior of this hormone was evaluated by an in vivo bioassay and via a pharmacokinetic study. The 3 preparations showed equivalent purity (97%) and hTSH-HEK molecular mass was 2.1% lower than hTSHCHO mass and 2.7% higher than hTSH-Pit mass. The highest relative hydrophobicity, evaluated by RP-HPLC, was shown by hTSH-HEK. Remarkable differences related to the carbohydrate moiety were found for these preparations, a much lower sialic acid content and a higher fucose content being observed in hTSH-HEK. Biological activity was confirmed for the three preparations, the hTSH-HEK bioactivity being 39% and 16% lower than hTSH-CHO and hTSH-Pit, respectively. The hTSH-HEK circulatory half-life (t1/2) was lower than that of hTSHCHO (1.5-fold) and hTSH-Pit (1.2-fold). According to these findings, HEK293-derived hTSH can be considered useful for clinical applications, also in view of its human origin and particular N-glycan composition.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-04-08T15:22:01Z No. of bitstreams: 1 Emily Pansera Waczuk.pdf: 1582858 bytes, checksum: b6530e7a5d41da951557fd7d3947c87d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-08T15:22:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Emily Pansera Waczuk.pdf: 1582858 bytes, checksum: b6530e7a5d41da951557fd7d3947c87d (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 / A Euphorbia tirucalli, popularmente conhecida como avelós, é uma planta tóxica, tradicionalmente usada como um chá na medicina popular brasileira para o tratamento de várias doenças, demonstrando atividades antibacteriana, antiviral e anticarcinogênica. No entanto, não há nenhum relatório científico dos efeitos tóxicos podem surgir a partir de consumo desta planta, bem como os mecanismos pelos quais ela induz sua toxicidade. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar in vitroa genotoxicidade e citotoxicidade do extrato aquoso de E. tirucalliem leucócitos humanos usando os testes do ensaio cometa e azul de tripan, respectivamente. Adicionalmente, o efeito do extrato aquoso de E. tirucalli sobre a fragilidade osmótica foi investigada em eritrócitos humanos. Além disso, avaliamos a expressão de genes que codificam enzimas antioxidantes (SOD2, CAT e GPx4)através de qRT-PCR. Os nossos resultados demonstraram que a exposição de E. tirucalli em leucócitos humanos provocou aumentos significativos de danos no DNA nas concentrações mais elevadas testadas (100-150 µg/mL), que foi associada a uma diminuição significativa da viabilidade celular em concentrações de 10 a 150µg/mL. Por outro lado, a E. tirucalli não induziu a hemólise de eritrócitos humanos em todas as concentrações testadas. A exposição de leucócitos humanosàE. tirucalli(10-50µg/mL) causouregulação positiva significativa sobre no RNAm da SOD2 e expressões dos genes daCAT, e diminuiu significativamente o RNAm da GPx4 nas concentrações mais elevadas (100-150µg/mL).Adicionalmente, a expressão genica do gene da SOD2 foi regulada negativamente na maior concentração testada (150 µg/mL). Em resumo, com base nos resultados de genotoxicidade observados em nosso estudo, recomendamos cautela no uso agudo ou crônico deste preparado caseiro.Com todos estes aspectos, nossos resultados sugerem que o extrato da E. tirucalliinduz genotoxicidade e citotoxicidade em leucócitos humanos, possivelmente através da interação com o sistema enzimático antioxidante, assim, aumentando a formação de ROS e diminuindo o nível de tolerância celular para os constituintes químicos desta planta. / Euphorbia tirucalli, popularly known as avelós, is a toxic plant traditionally used as a tea in the Brazilian folk medicine for the treatment of various diseases, by presentingantibacterial, antiviral and anticarcinogenicproperties. However, there is no scientific report regardingthe toxic effects of this plant in human cells which may occurfrom its consumption, as well as the mechanisms by which it induces its toxicity. Therefore, the objectiveof the present study was to evaluate in vitrothe genotoxicity and cytotoxicity potential of aqueous extract of E. tirucalliin human leukocytes using comet assay and trypan blue exclusion respectively. In addition, the effect of the aqueous extract of E. tirucalli on osmotic fragility was investigated in human erythrocytes. Furthermore, we evaluated the qRT-PCR expressions of selected antioxidant mRNA genes (SOD2, CAT and GPx4). Our results demonstrated that exposure of E. tirucalli to human leukocytes caused significant increase in DNA damage at the higher concentrations tested (100-150 µg/mL), which was associated with a significant decrease of cellular viability at concentrations 10 to 150 µg/mL. In contrast, E. tirucallidid not induce hemolysis of human erythrocytes at all the concentrations tested. Exposure of E. tirucalli (10-50µg/mL)to human leukocytes significantly up-regulated the mRNA of SOD2 and CAT genes expressions, and significantly decreasedthe mRNA of GPx4 at higher concentrations (100-150 µg/mL). In addition, the mRNA gene expression of SOD2 was down-regulated at the highest concentration tested (150 µg/mL).In summary, based in the results of genotoxicity observed in our study, we recommend caution in the acute or chronic use of thishomemade prepared.Taken together, our results suggest that the extract aqueous of E. tirucalliinduces genotoxicity and cytotoxicity to human leukocytes, possibly by interacting with the antioxidant enzyme system, thereby, increasing the formation of ROSand decreasing the cellular tolerance level to chemical constituents of this plant. Therefore, we recommend caution in the acute or chronic use of this plant.

Introdução: O câncer de próstata atinge cerca de três quartos da população masculina acima de 65 anos, sendo esta neoplasia o sexto tipo de câncer mais comum no mundo, e o mais prevalente em homens. O receptor de androgênios (AR) desempenha um papel crítico no desenvolvimento normal da próstata, bem como no câncer prostático. Sua atividade transcricional é regulada através da interação com diversas proteínas. O NCoR1 (correpressor de receptores nucleares) está envolvido na diminuição da atividade do AR sobre a transcrição de genes alvo. Objetivos: Desenvolver um modelo de cultura celular de câncer prostático a partir de fragmentos tumorais; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar os efeitos do silenciamento do AR e seu corregulador, NCoR1, sobre a proliferação celular e expressão gênica de PSA, um gene alvo do AR, em células de cultura primária e em células de uma linhagem de câncer prostático (LNCaP – Lymph Node Carcinoma of the Prostate). Métodos: Fragmentos de tumores prostáticos coletados após prostatectomia radical ou prostatovesiculectomia foram plaqueados e mantidos em cultivo. As células que proliferaram a partir dos explants foram testadas para marcadores de epitélio (citoqueratinas) e de malignidade (racemase). Após 10 dias, as células foram silenciadas para o AR e, posteriormente, lisadas para a extração de RNA total ou de proteínas. Células LNCaP foram mantidas em cultura e silenciadas para o AR e o NCoR1, sendo avaliada também a proliferação celular nesta última condição. O cDNA obtido a partir das culturas primárias de CaP foi usado para a amplificação do mRNA de oito genes candidatos a normalizadores, além dos mRNAs do AR e PSA. O cDNA das células LNCaP foi usado para amplificação do mRNA do PSA, e o sobrenadante das células coletado para a dosagem do PSA secretado. Resultados: Apenas 47,7% do total de culturas primárias apresentaram adesão dos fragmentos e proliferação de células. Não foi observada associação entre a adesão dos fragmentos e o escore de Gleason dos tumores. As células cultivadas apresentaram positividade para os marcadores de células epiteliais e de malignidade de células prostáticas, indicando que as células em cultivo se tratavam de células tumorais prostáticas. Para análise da expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão foi o gene SDHA, e a melhor combinação de dois genes sugerida neste estudo foi SDHA e ALAS1. O silenciamento do receptor de androgênios foi observado 48 horas após a transfecção com siRNAs, sendo observada uma diminuição nos níveis do mRNA já em 24 horas após a transfecção. Observou-se uma diminuição da expressão gênica do PSA em 24 horas, em resposta à diminuição dos níveis do AR, tanto em cultura primária de CaP quanto na linhagem LNCaP. Em células LNCaP, a transfecção com siRNAs específicos para o NCoR1 não depletou completamente os níveis proteicos, porém estes diminuíram em 24, 48 e 72 horas após a transfecção. Foi verificado um aumento da expressão gênica de PSA 48 horas após o silenciamento do NCoR1, em células tradadas com diidrotestosterona. Não foi observado aumento da secreção de PSA no sobrenadante das células em cultivo 48 horas após o silenciamento. A proliferação das células LNCaP foi diminuída nos grupos transfectados com siRNAs específicos para o NCoR1 e siRNAs inespecíficos, em relação com grupo controle. Conclusões: O modelo de cultura celular a partir de fragmentos tumorais prostáticos é viável, e proporciona uma boa amostragem de células para análises moleculares de câncer de próstata sob diferentes condições experimentais. No entanto, a taxa de sucesso dos cultivos é moderada. Neste modelo, em que foram testados diversos genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene SDHA apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência sem nenhuma análise prévia de sua expressão, como beta-actina, GAPDH e beta-2-microglobulina. Assim, o SDHA, ou ainda a combinação SDHA e ALAS1, é indicado para as estratégias de normalização neste tipo de amostra. O silenciamento do AR em células tumorais prostáticas diminuiu a expressão gênica de PSA, como esperado. O silenciamento de seu correpressor, NCoR1, aumentou os níveis de mRNA do PSA, indicando que sua ausência resulta em um aumento da atividade transcricional do AR. A menor taxa de proliferação nos grupos transfectados pode estar mais relacionada ao estresse da transfecção do que à ausência de NCoR1 nas células. Mais análises poderão confirmar os efeitos da ausência deste correpressor sobre a resposta das células tumorais prostáticas, o que abrirá caminho para um melhor entendimento da fisiopatologia dos tumores prostáticos. / Introduction: Prostate cancer (PCa) occurs in seventy-five percent of men over 65 years old, and it is the sixth most common type of cancer in the world and the most prevalent in men. Androgen receptor (AR) plays a critical role in normal prostate gland development and also in prostate cancer. Its transcriptional activity is regulated by protein interaction and NCoR1 (nuclear receptor co-repressor) decreases the AR activity on target genes transcription. Objectives: To develop a prostate cancer cell culture model from tumor fragments; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in that cultured cells; to evaluate the effects of AR and NCoR1 silencing on cell proliferation and PSA gene expression, a AR target gene, in cells of primary culture of PCa and in a prostate cancer cell line, LNCaP. Methods: PCa fragments obtained from radical prostatectomy or prostatovesiculectomy were plated and maintained in culture. Proliferating cells were tested for markers of epithelium (cytokeratin) and malignancy (racemase). After ten days, cells were transfected with AR siRNAs and then lysed for total RNA or protein extraction. LNCaP cells were silenced for AR and NCoR1, and proliferation rate was also measured in the last condition. cDNA obtained from primary culture was used to amplify eight candidate to housekeeping genes mRNA, and also AR and PSA mRNA. cDNA from LNCaP cells was used to amplify PSA mRNA, and the cells supernatant was collected to dose secreted PSA. Results: Only 47.7% of the total number of primary cultures had fragment adhesion and cell proliferation. There was no association between explants adhesion and tumor Gleason’s score. Cells were positive for epithelium and malignancy markers, confirming the growth of prostate cancer cells. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was SDHA, and the best combination of two genes was SDHA and ALAS1. AR silencing was observed in 48 hours after siRNA transfection, with a decrease of mRNA levels in 24 hours after transfection. There was a decrease of PSA gene expression in 24 hours, either in primary culture or in LNCaP cells. In LNCaP cells, transfection with NCoR1 siRNA did not depleted entirely the protein levels. However, the levels of NCoR1 decreased in 24, 48, and 72 hours after transfection in relation to control group. There was an increase of PSA gene expression in 48 hours after NCoR1 siRNA transfection in cells treated with dihydrotestosterone. There was no increase in PSA secretion in cells supernatant in response to NCoR1 silencing. LNCaP cell proliferation was decreased in both transfected groups, the specific siRNA to NCoR1 and the unspecific control, in relation to control group. Conclusions: the culture cell model from explants of prostate cancer is practicable, and provides a good cell sampling to molecular analysis of prostate cancer under different experimental conditions. Nevertheless, the successful rate of cultures is moderate. In this model, several genes were tested for expression stability, and SDHA had presented the best values, unlike others classical housekeeping genes, as beta-actin, GAPDH and beta-2-microglobulin. Thus, SDHA, or the combination of SDHA and ALAS1, is indicated to normalization strategies in these samples. The silencing of AR in prostate cancer cells had decreased PSA gene expression, as expected. The silencing of its co-repressor, NCoR1, had increased the PSA mRNA levels, indicating that the absence of this coregulator results in an increase of AR transcriptional activity. The smaller proliferation of transfected groups in relation to control group could be related to the transfection stress, more than to the absence of NCoR1. More analysis can confirm the effects of NCoR1 silencing on tumor cells proliferation rate, and contribute to a better understanding of prostate tumors pathophysiology.

Orientador: Humberto Tonhati / Coorientador: Daniele Fernanda Jovino / Coorientador: Larissa Fernanda Simielli Fonseca Noronha / Banca: Marcia Cristina de Sena Oliveira / Banca: Rodrigo Pelicioni Savegnago / Resumo: A mastite é a principal doença que acomete os rebanhos leiteiros e promove grandes perdas na produção devido a alterações na composição do leite e prejuízos na saúde do animal, aumentando assim os custos de produção. Caracteriza-se pela resposta inflamatória da glândula mamária a agentes infecciosos, alterando sua fisiologia e metabolismo. Estudo de expressão gênica vem sendo empregado em vários organismos com a finalidade de identificar genes relacionados com características economicamente importantes como resistência a doenças. Com o objetivo de compreender melhor os mecanismos de resposta imune envolvidos no fenótipo de resistência/susceptibilidade à mastite, foi realizada a quantificação da expressão relativa dos genes do Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos 3 (CSF3) e Lactoperoxidase (LPO), em leite de búfalas mestiças saudáveis e com mastite, por meio da técnica de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Para isso, foi realizada a extração de RNA total, com Trizol, de células somáticas do leite de doze animais diagnosticados com mastite e de doze animais livres da infecção. Foram realizadas análises de qualidade e quantificação do RNA total e das contaminações por DNA genômico para garantir a integridade das amostras. A quantificação da expressão gênica foi realizada por meio do método do Delta Delta Ct. Os genes GAPH, HPRT1, EEF1A1 e RPLP0, foram selecionados na literatura, e testados como genes de referência. As análises referentes às quanti... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Not available / Mestre

Orientador: Humberto Tonhati / Coorientador: Daniele Fernanda Jovino Gimenez / Coorientador: Nedenia Bonvino Stafuzza / Banca: Eliane Gasparino / Banca: Lucia Galvão de Albuquerque / Banca: Luciana Correia de Almeida Regitano / Banca: Tiago Santana Balbuena / Resumo: A mastite em búfalas leiteiras causa perdas econômicas devido à diminuição da produção de leite, além de ter um efeito negativo no bem-estar dos animais. Deste modo, foram realizados dois estudos: o objetivo do estudo I foi avaliar o nível de expressão dos genes da lactoferrina (LTF), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-1 beta (IL-1β), interleucina-8 (IL-8), e toll-like receptors 2 (TLR-2) e 4 (TLR-4) em búfalas Murrah com e sem mastite subclínica. Amostras de leite de 12 búfalas com mastite e 12 de búfalas sem mastite foram coletadas, para a extração de RNA, síntese de cDNA e validação dos perfis de expressão por qRT-PCR. O ΔΔCt foi estimado utilizando contrastes ortogonais da expressão dos genes alvo corrigidos para a expressão dos genes housekeeping entre os tratamentos. A expressão dos genes TLR-2, TLR-4, TNF-α, IL-1β e IL-8 foi regulada positivamente em búfalos com mastite, enquanto que o gene LTF não apresentou expressão diferencial. O estudo desses genes da função imune que são ativos na glândula mamária é importante para o desenvolvimento de estratégias destinadas a preservar a saúde do úbere. O objetivo do estudo II foi avaliar as proteínas presentes no soro do leite de búfalas com e sem mastite subclínica, utilizando uma abordagem proteômica para identificar proteínas diferencialmente expressas e potencial biomarcador para a doença. Para isso, 16 amostras de leite de búfalas Murrah foram coletadas, sendo oito animais com e oito animais sem mastite su... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mastitis in dairy buffalo causes economic losses due to decreased milk production, along with having a negative effect on the animals' welfare. Thus, two studies were performed: the objective of study I was to evaluate the expression levels of lactoferrin (LTF), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin-1 beta (IL-1β), interleukin- 8 (IL-8) and toll-like receptors 2 (TLR-2) and 4 (TLR-4) in Murrah buffaloes with and without subclinical mastitis. Milk samples were collected from 12 buffaloes with mastitis and 12 buffaloes without mastitis for RNA extraction, cDNA synthesis, and validation of expression profiles by qRT-PCR. The ΔΔCt was estimated using orthogonal contrasts of the target genes expression adjusted for the expression of the housekeeping genes between both treatments. The expression of the TLR-2, TLR-4, TNF-α, IL-1β and IL-8 genes were upregulated in buffaloes with mastitis, while the LTF gene showed no differential expression. The study of these immune function genes that are active in the mammary gland is important for the development of strategies aimed at preserving the health of the udder. The objective of study II was to evaluate the proteins present in the milk whey from buffaloes with and without subclinical mastitis, using a proteomic approach to identify differentially expressed proteins and potential biomarkers for the disease. For this, 16 samples of Murrah buffalo milk were collected, comprised of eight animals with and eight animals without sub... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Edvaldo Aparecido Amaral da Silva / Coorientador: Renake Nogueira Teixeira / Banca: João Nakagawa / Banca: Maria Marcia Pereira Sartori / Banca: Ivan de Godoy Maia / Banca: Heloísa Oliveira dos Santos / Resumo: As principais condições ambientais, que afetam a degradação de clorofila em sementes de soja, são a seca e temperaturas extremamente altas, que acompanham as mudanças climáticas verificadas nas últimas décadas em algumas regiões do Brasil. O objetivo desse estudo foi realizar uma caracterização fisiológica em lotes de sementes de soja com diferentes porcentagens de sementes verdes, avaliar os efeitos da retenção de clorofila na qualidade fisiológica (germinação, vigor e longevidade) e na qualidade do óleo de sementes de soja além de avaliar a expressão de genes relacionados com esse fenômeno, considerando influências genéticas e ambientais. Foram avaliados 37 lotes de sementes de soja que apresentaram sementes verdes, de cultivares produzidas por produtores rurais (condições não controladas) em diferentes municípios do Brasil na safra 2014/2015. Os lotes com as maiores e as menores porcentagens de sementes verdes de cada cultivar foram selecionados com a finalidade de realizar uma caracterização fisiológica nas sementes dos lotes. Posteriormente, cinco lotes foram selecionados e organizados em duas combinações (Influência Ambiental e Influência Genotípica) e, após a classificação e divisão em amostras de sementes verdes e amarelas, foram avaliados quanto a qualidade fisiológica das sementes (viabilidade inicial, germinação, vigor e longevidade), parâmetros bioquímicos durante o armazenamento, qualidade do óleo (teor de óleo, teor de tocoferóis e tocotrienóis, teor de clorofil... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The main environmental conditions affecting the degradation of chlorophyll in soybean seeds are drought and extremely high temperatures that accompany the dramatic climatic changes observed in the last decades in some regions of Brazil. The aim of this study was to perform a physiological characterization in soybean seed lots with different percentages of green seeds, to evaluate the effects of chlorophyll retention on physiological quality (germination, vigor and longevity) and soybean oil quality and to evaluate the expression of genes related to this phenomenon, considering genetic and environmental influences. Overall, 37 soybean seed lots that presented green seeds of cultivars produced under real growing conditions (uncontrolled conditions) in different cities of Brazil in the 2014/2015 harvest season were evaluated. Lots with the largest and smallest percentages of green seeds of each cultivar were selected with the purpose of performing a physiological characterization in seed lots. Subsequently, five lots were selected and organized into two combinations (Environmental Influence and Genotypic Influence) and, after classification and division into green and yellow seed samples, the physiological quality of seeds (initial viability, germination, vigor and longevity) (tocopherol and tocotrienol, oil and total chlorophyll contents and oxidative stability), and expression of genes associated with chlorophyll retention (D1, D2, PPH2 and NYC1_1). The results showed that, regardless of cultivar or production region, lots with higher percentage of green seeds have lower physiological quality. In addition, it was verified that seeds with chlorophyll retention showed lower physiological quality (initial viability, germination, vigor and longevity), lower oil quality, with presence of residual chlorophylls, lower oxidative stability and lower tocopherol index and expression of D1, D2 ... / Doutor

O objetivo inicial deste trabalho foi estudar a expressão de genes regulados por cAMP durante o desenvolvimento do eucarioto inferior Dictyostelium discoideum. Foram analisados vários clones de uma biblioteca de cDNA construída a partir de mRNAs de células estimuladas com cAMP. A análise de um destes clones revelou que este codificava para a proteína de adesão celular gp80, que é expressa durante a fase de agregação no início do desenvolvimento. A regulação da expressão do gene da gp80 foi então estudada. Baixas concentrações de cAMP induzem o aparecimento de mRNA para gp80. A indução ocorre via o receptor de cAMP da superfície celular, e por um mecanismo que não envolve mudanças de cAMP intracelular. Por outro lado, altas concentrações de cAMP, que levam à \"down-regulation\" do receptor de cAMP, causam uma rápida desestabilização do mRNA para gp80 em células competentes para agregação. O mecanismo pelo qual cAMP em altas concentrações desestabiliza o mRNA para gp80 foi investigado. Foi observado que este tratamento, também causa um aumento da tomada de Ca2+. Devido à esta observação, nós procuramos um papel para Ca2+ como um mensageiro secundário na degradação do mRNA para gp80. Mudanças nos níveis de mRNA foram examinadas após tratamento das células com compostos que alteram a concentração intracelular de Ca2+. A soma dos dados sugere que um influxo de cálcio através da membrana celular, em oposição à liberação de cálcio de compartimentos intracelulares, ativa a degradação do mRNA para gp80. Além disso, incubação das células com um inibidor da proteína quinase C previne parcialmente a ação do cAMP, sugerindo um papel para proteína quinase C neste fenômeno. A regulação por cAMP da estabilidade do mRNA para gp80 foi também estudada durante o crescimento vegetativo de uma linhagem de D. discoideum que expressa constitutivamente o cDNA para gp80. Os resultados indicam que, assim como as células da fase de agregação, as células da fase de crescimento também possuem os elementos necessários para degradar a mensagem para gp80 em resposta a um aumento na concentração intracelular de cálcio. Contudo, estas células não são capazes de degradar a mensagem em resposta a altas concentrações de cAMP. / The initial goal of the present work was the study of gene expression regulated by cAMP in Dictyostelium discoideum development. For this, several cDNA clones, from a Iibrary constructed using mRNA of cells stimulated with cAMP, were analyzed. Analysis of one of this clones showed that it corresponded to gp80, a cell adhesion molecule expressed during cell aggregation in early development. gp80 gene regulation was then studied. Low concentrations of cAMP induces gp80 mRNA expression. The induction seems to be via the cell surface cAMP receptor and by a mechanism that does not involve changes in intracellular cAMP. Interestingly, high concentrations of cAMP, which down-regulate the cell surface cAMP receptor, elicit destabilization of gp80 mRNA in agregation competent cells. The mechanism by which high concentrations of cAMP selectively destabilize the gp80 mRNA was investigated. This treatment which leads to down-regulation of the cAMP receptor was found to also cause an increase in calcium uptake. Given this observation, we sought a role for calcium as a second messenger in the degradation of the gp80 mRNA. Changes in the mRNA leveis were examined after treating cells with compounds known to alter the intracellular Ca2+ concentrations. The sum of the data suggest that it is the cAMP-induced influx of Ca2+ across the plasma membrane, as apposed to a cAMP-mediated release of Ca2+ from intracellular stores, that initiates gp80 mRNA degradation. Also, cell incubation with staurosporin partially prevents the action of cAMP, implicating a possible role of protein kinase C. Regulation by cAMP of the message stability during vegetative growth was also studied in cells which constitutively express the gp8ü cDNA. The results indicate that like aggregation competent cells, these cells are able to evoque destabilization of the mRNA in response to a raise in intracellular calcium concentration. However, they are unable to induce the mRNA degradation after cAMP treatment.

Existem alguns assuntos que mesmo tendo relevância do ponto de vista jornalístico muitas vezes não fazem parte dos noticiários. Por interesses ideológicos, econômicos ou políticos ocorre um processo de silenciamento sobre temas que passam a não figurar em reportagens ou mesmo em pequenos textos noticiosos nas páginas dos jornais. Por meio desta pesquisa de dissertação, procurou-se investigar especificamente os conteúdos relacionados ao sistema prisional brasileiro publicados nas primeiras páginas dos jornais Folha de S. Paulo e O Globo. Durante um período de três anos consecutivos, todas as capas foram analisadas, bem como suas respectivas matérias jornalísticas das páginas internas que faziam referência ao esse sistema. A partir daí foi possível identificar ausências, lacunas ou omissões de tópicos importantes para a compreensão e contextualização da complexidade do universo que compõe os procedimentos legais de investigação, julgamento e execução penal, tanto quanto as condições em que isso é realizado. Tal identificação se deu através do cruzamento das informações contidas nas matérias analisadas com as informações, na íntegra, das fontes de domínio público que eventualmente fizeram parte desses textos. / There are some issues that even having a journalistic relevance are often not part of the news. By ideological, economic or political interests, a process of silencing takes place on subjects that do not appear in reports or even in small news texts on the pages of newspapers. Through this dissertation research, we sought to investigate specifically the contents related to the Brazilian prison system published in the first pages of the newspapers Folha de S. Paulo and O Globo. During a period of three consecutive years, all the covers were analyzed, as well as their respective journalistic articles of the internal pages that made reference to this system. From that point on, it was possible to identify absences, or omissions of important topics for understanding and contextualizing the complexity of the universe that makes up the legal procedures for investigation, prosecution and criminal execution, as well as the conditions in which this is done. Such identification took place through the crossing of the information contained in the analyzed material with the information of the sources of public domain that occasionally became part of these journalistic texts.