Base teórica: Suplementos dietéticos são comumente empregados para prevenir e tratar a deficiência de vitamina D, apesar disso, o mecanismo de absorção intestinal da vitamina D é pouco compreendido até o momento. Objetivo: Avaliar o impacto do ezetimibe na absorção da vitamina D em indivíduos saudáveis e, com isso, determinar se o transportador de colesterol Niemann–Pick C1-Like 1 participa deste processo. Métodos: Ensaio clínico randomizado, controlado e duplo-cego (ClinicalTrials.gov: NCT02234544), realizado no Hospital de Clínicas de Porto Alegre, onde 51 médicos residentes foram randomizados para ezetimibe 10 mg ou placebo por cinco dias. No quinto e no décimo nono dias, foram coletadas, em jejum, amostras de sangue para dosagem de 25-hidroxicolecalciferol (25OHD), hormônio paratireoidiano (PTH), cálcio e albumina. Após a primeira coleta de sangue, todos os participantes receberam uma dose única oral de 50.000 UI de colecalciferol com um lanche contendo 15 gramas de gordura. Níveis plasmáticos de 25OHD foram dosados pelo imunoensaio Diasorin Liaison®. Medidas foram comparadas por regressão linear múltipla e corrigidas pelo teste de Bonferroni. Resultados: Níveis séricos basais de 25OHD foram <30 ng/mL e <20 ng/mL em, respectivamente, todos e 82,3% dos participantes. Quatorze dias após dose única de colecalciferol 50.000 UI, a média (DP) das variações de 25OHD foi similar entre o grupo que recebeu ezetimibe e o grupo placebo, respectivamente, 8,7 (3,7) ng/mL versus 10,0 (3,8) ng/mL, p = 0,26, após ajuste para IMC e 25OHD basal. A média dos níveis séricos de 25OHD, PTH, cálcio e albumina permaneceram semelhantes em ambos os grupos. Conclusão: Conclui-se que o ezetimibe não influenciou a variação nas médias de 25OHD após consumo de dose única de colecalciferol 50.000UI, nestes jovens saudáveis. / Background: Oral supplements are important to prevent and treat vitamin D deficiency. Despite the growing number of prescriptions, vitamin D's absorptive mechanisms are not clearly elucidated. Objective: By evaluating the effect of ezetimibe on vitamin D absorption, we aimed to determine if the cholesterol transporter Niemann–Pick C1-Like 1 transporter contributes to it. Methods: This randomized, double-blind, placebo-controlled trial (ClinicalTrials.gov NCT02234544) was developed in a South Brazilian University Hospital. Fifty-one medical students were randomized to ezetimibe 10 mg/day for 5 days or placebo. On the fifth and 19th days, blood samples for 25-hydroxycholecalciferol (25OHD), parathyroid hormone (PTH), calcium, and albumin were collected. After the first blood sample collection, all participants received a single oral 50,000 IU cholecalciferol dose during a 15 g-fat meal. Serum 25OHD levels were measured by the immunoassay Diasorin Liaison®. Measurements were compared in a general linear model adjusted for multiple comparisons by the Bonferroni test. Results: Before cholecalciferol administration, 25OHD was <30 ng/mL and <20 ng/mL, respectively, in all and in 82.3% of the participants. Fourteen days after a single 50,000 IU oral dose of cholecalciferol, mean (SD) changes in serum 25OHD were similar in both groups, after adjustment to BMI and 25OHD levels, before cholecalciferol administration (p = 0.26): 8.7 (3.7) ng/mL in the ezetimibe group, versus 10.0 (3.8) ng/mL in the placebo group. Mean serum 25OHD, PTH, calcium and albumin levels remained similar in both groups. Conclusion: We concluded that ezetimibe had no effect on the mean change in serum 25OHD after a single oral dose of cholecalciferol, in healthy and young adults.

Base teórica: Suplementos dietéticos são comumente empregados para prevenir e tratar a deficiência de vitamina D, apesar disso, o mecanismo de absorção intestinal da vitamina D é pouco compreendido até o momento. Objetivo: Avaliar o impacto do ezetimibe na absorção da vitamina D em indivíduos saudáveis e, com isso, determinar se o transportador de colesterol Niemann–Pick C1-Like 1 participa deste processo. Métodos: Ensaio clínico randomizado, controlado e duplo-cego (ClinicalTrials.gov: NCT02234544), realizado no Hospital de Clínicas de Porto Alegre, onde 51 médicos residentes foram randomizados para ezetimibe 10 mg ou placebo por cinco dias. No quinto e no décimo nono dias, foram coletadas, em jejum, amostras de sangue para dosagem de 25-hidroxicolecalciferol (25OHD), hormônio paratireoidiano (PTH), cálcio e albumina. Após a primeira coleta de sangue, todos os participantes receberam uma dose única oral de 50.000 UI de colecalciferol com um lanche contendo 15 gramas de gordura. Níveis plasmáticos de 25OHD foram dosados pelo imunoensaio Diasorin Liaison®. Medidas foram comparadas por regressão linear múltipla e corrigidas pelo teste de Bonferroni. Resultados: Níveis séricos basais de 25OHD foram <30 ng/mL e <20 ng/mL em, respectivamente, todos e 82,3% dos participantes. Quatorze dias após dose única de colecalciferol 50.000 UI, a média (DP) das variações de 25OHD foi similar entre o grupo que recebeu ezetimibe e o grupo placebo, respectivamente, 8,7 (3,7) ng/mL versus 10,0 (3,8) ng/mL, p = 0,26, após ajuste para IMC e 25OHD basal. A média dos níveis séricos de 25OHD, PTH, cálcio e albumina permaneceram semelhantes em ambos os grupos. Conclusão: Conclui-se que o ezetimibe não influenciou a variação nas médias de 25OHD após consumo de dose única de colecalciferol 50.000UI, nestes jovens saudáveis. / Background: Oral supplements are important to prevent and treat vitamin D deficiency. Despite the growing number of prescriptions, vitamin D's absorptive mechanisms are not clearly elucidated. Objective: By evaluating the effect of ezetimibe on vitamin D absorption, we aimed to determine if the cholesterol transporter Niemann–Pick C1-Like 1 transporter contributes to it. Methods: This randomized, double-blind, placebo-controlled trial (ClinicalTrials.gov NCT02234544) was developed in a South Brazilian University Hospital. Fifty-one medical students were randomized to ezetimibe 10 mg/day for 5 days or placebo. On the fifth and 19th days, blood samples for 25-hydroxycholecalciferol (25OHD), parathyroid hormone (PTH), calcium, and albumin were collected. After the first blood sample collection, all participants received a single oral 50,000 IU cholecalciferol dose during a 15 g-fat meal. Serum 25OHD levels were measured by the immunoassay Diasorin Liaison®. Measurements were compared in a general linear model adjusted for multiple comparisons by the Bonferroni test. Results: Before cholecalciferol administration, 25OHD was <30 ng/mL and <20 ng/mL, respectively, in all and in 82.3% of the participants. Fourteen days after a single 50,000 IU oral dose of cholecalciferol, mean (SD) changes in serum 25OHD were similar in both groups, after adjustment to BMI and 25OHD levels, before cholecalciferol administration (p = 0.26): 8.7 (3.7) ng/mL in the ezetimibe group, versus 10.0 (3.8) ng/mL in the placebo group. Mean serum 25OHD, PTH, calcium and albumin levels remained similar in both groups. Conclusion: We concluded that ezetimibe had no effect on the mean change in serum 25OHD after a single oral dose of cholecalciferol, in healthy and young adults.

Base teórica: Suplementos dietéticos são comumente empregados para prevenir e tratar a deficiência de vitamina D, apesar disso, o mecanismo de absorção intestinal da vitamina D é pouco compreendido até o momento. Objetivo: Avaliar o impacto do ezetimibe na absorção da vitamina D em indivíduos saudáveis e, com isso, determinar se o transportador de colesterol Niemann–Pick C1-Like 1 participa deste processo. Métodos: Ensaio clínico randomizado, controlado e duplo-cego (ClinicalTrials.gov: NCT02234544), realizado no Hospital de Clínicas de Porto Alegre, onde 51 médicos residentes foram randomizados para ezetimibe 10 mg ou placebo por cinco dias. No quinto e no décimo nono dias, foram coletadas, em jejum, amostras de sangue para dosagem de 25-hidroxicolecalciferol (25OHD), hormônio paratireoidiano (PTH), cálcio e albumina. Após a primeira coleta de sangue, todos os participantes receberam uma dose única oral de 50.000 UI de colecalciferol com um lanche contendo 15 gramas de gordura. Níveis plasmáticos de 25OHD foram dosados pelo imunoensaio Diasorin Liaison®. Medidas foram comparadas por regressão linear múltipla e corrigidas pelo teste de Bonferroni. Resultados: Níveis séricos basais de 25OHD foram <30 ng/mL e <20 ng/mL em, respectivamente, todos e 82,3% dos participantes. Quatorze dias após dose única de colecalciferol 50.000 UI, a média (DP) das variações de 25OHD foi similar entre o grupo que recebeu ezetimibe e o grupo placebo, respectivamente, 8,7 (3,7) ng/mL versus 10,0 (3,8) ng/mL, p = 0,26, após ajuste para IMC e 25OHD basal. A média dos níveis séricos de 25OHD, PTH, cálcio e albumina permaneceram semelhantes em ambos os grupos. Conclusão: Conclui-se que o ezetimibe não influenciou a variação nas médias de 25OHD após consumo de dose única de colecalciferol 50.000UI, nestes jovens saudáveis. / Background: Oral supplements are important to prevent and treat vitamin D deficiency. Despite the growing number of prescriptions, vitamin D's absorptive mechanisms are not clearly elucidated. Objective: By evaluating the effect of ezetimibe on vitamin D absorption, we aimed to determine if the cholesterol transporter Niemann–Pick C1-Like 1 transporter contributes to it. Methods: This randomized, double-blind, placebo-controlled trial (ClinicalTrials.gov NCT02234544) was developed in a South Brazilian University Hospital. Fifty-one medical students were randomized to ezetimibe 10 mg/day for 5 days or placebo. On the fifth and 19th days, blood samples for 25-hydroxycholecalciferol (25OHD), parathyroid hormone (PTH), calcium, and albumin were collected. After the first blood sample collection, all participants received a single oral 50,000 IU cholecalciferol dose during a 15 g-fat meal. Serum 25OHD levels were measured by the immunoassay Diasorin Liaison®. Measurements were compared in a general linear model adjusted for multiple comparisons by the Bonferroni test. Results: Before cholecalciferol administration, 25OHD was <30 ng/mL and <20 ng/mL, respectively, in all and in 82.3% of the participants. Fourteen days after a single 50,000 IU oral dose of cholecalciferol, mean (SD) changes in serum 25OHD were similar in both groups, after adjustment to BMI and 25OHD levels, before cholecalciferol administration (p = 0.26): 8.7 (3.7) ng/mL in the ezetimibe group, versus 10.0 (3.8) ng/mL in the placebo group. Mean serum 25OHD, PTH, calcium and albumin levels remained similar in both groups. Conclusion: We concluded that ezetimibe had no effect on the mean change in serum 25OHD after a single oral dose of cholecalciferol, in healthy and young adults.

A ezetimiba e a sinvastatina são fármacos hipolipidêmicos. A ezetimiba pertence à nova classe das 2 - azetidinona, inibidores e bloqueadores do colesterol intestinal. A sinvastatina pertence à classe dos inibidores competitivos da hidroxi-3-metilglutarilcoenzima A redutase (HMG-CoA), que é a última etapa regulada na síntese do colesterol. O objetivo do trabalho foi desenvolver e validar métodos por cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) e eletroforese capilar (CE), rápidos, seletivos e confiáveis para determinação dos hipolipidêmicos em formulações farmacêuticas. A separação cromatográfica foi realizada usando coluna Nano separation technologies (NST) Cianopropril (CN) (150 mmx 4,6 mm, com partícula 3,5 &#181;m), e eluição isocrático usando água purificada: acetonitrila (48:52, v/v); vazão 0,8 mL/min e volume de injeção de 20 &#181;L. A temperatura da coluna foi de 35 ºC e a detecção foi realizada com detector na região do UV em 238 nm. O método por cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) foi desenvolvido utilizando capilar de sílica fundida 30 cm (comprimento efetivo) x 50 &#181;m d.i. e eletrólito constituído de tetraborato de sódio (TBS) 20 mmol L-1: dodecil sulfato de sódio (SDS) 30 mmol L-1, pH 9,0 ajustado com 10% ácido fosfórico: acetonitrila 12% v/v. O tempo de injeção foi de 3 segundos com pressão hidrodinâmica de 20 mbar, voltagem aplicada de 30 kV e detecção no UV em 238 nm. Os métodos analíticos foram validados de acordo com os requerimentos vigentes da ANVISA, ICH e Farmacopéia Americana. Portanto, os métodos propostos demonstraram ser lineares, precisos, exatos e adequados para quantificação simultânea da ezetimiba e sinvastatina em formas farmacêuticas sólidas. / Ezetimibe and simvastatin are hipolipidemic drugs. Ezetimibe belongs to a new class of 2 - azetidione, inhibitors and blockers of intestinal chrolesterol. Simvastatin belongs a class of competitive inhibitors of 3-hydroxymethylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase, which is the last regulated step in the cholesterol synthesis. The aim of this project was to develop and validate fast, selective and reliable chromatographic and electrophoretic methods, to determine hypolipidemic drugs in pharmaceutical formulations. The chromatographic separation was carried out on a Nano separation technologies (NST) Cyanpropyl (CN) (150 mm x 4,6 mm, 3,5 &#181;m), isocratic elution using purified water: acetonitrila (48:52 v/v), the flow rate was 0,8 mL/min and the injection volume was 20 &#181;L. The column temperature was kept at 35 ºC and detection wavelength was set at 238 mn. The micellar electrokinetic chromatographic method was developed using a fused silica capillary column 30 cm (effective length) x 50 &#181;m i.d, the electrolyte was constituted of 20 mmol L-1 tetraborate buffer solution: 30 mmol L-1 sodium dodecyl sulphate (SDS), pH 9.0 adjusted with 10% phosphoric acid: 12 % v/v acetonitrile. The injection time was 3 s at 20 mbar, the applied voltage was 30 kV and detection was set at 238 nm. The both methods were developed and validated according to ANVISA, ICH and US Pharmacopeia guidelines. Therefore, the proposed methods proved to be linear, precise, accurate and suitable for simultaneous quantitation of ezetimibe and simvastatin in solid pharmaceutical formulations.

O processo inflamatório tem um papel fundamental na gênese e desenvolvimento da aterosclerose, sendo que a disfunção endotelial é considerada um dos estágios iniciais da aterogênese. Por meio da inibição da enzima hidroxi-metil-glutaril coA redutase (HMGCR), as estatinas reduzem a biossíntese do colesterol e a formação de isoprenóides, produtos intermediários da síntese do colesterol que são importantes na modificação pós-transcricional de GTPases pequenas que estão envolvidas na disfunção endotelial e inflamação vascular. A ezetimiba é um inibidor da absorção do colesterol através da inibição da proteína NPC1L1. Com a finalidade de esclarecer os mecanismos moleculares da inibição da síntese e da absorção do colesterol sobre a modulação de biomarcadores inflamatórios e de adesão celular foram utilizados modelos in vitro com células endoteliais (HUVEC) e monócitos (células THP-1), e in vivo com células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de indivíduos hipercolesterolêmicos (HC). O efeito das estatinas, atorvastatina e sinvastatina, e da ezetimiba na expressão de RNAm e proteínas de moléculas de adesão endoteliais e moduladores do processo inflamatório, como citocinas e óxido nítrico (NO), foi estudado em células HUVEC. O efeito desses fármacos sobre a expressão de moléculas de adesão monocitárias foi estudado em células THP-1. O efeito da terapia hipolipemiante sobre essas moléculas foi também estudada em CMSP de HC tratados com ezetimiba (10 mg/dia/4 semanas), sinvastatina (10 mg/dia/8 semanas) e sinvastatina combinada com ezetimiba (10 mg de cada/dia/4 semanas). A expressão de RNAm foi avaliada por RT-qPCR. A expressão de moléculas de adesão na superfície de células THP-1 e HUVEC foi estudada por citometria de fluxo. A quantificação de citocinas secretadas no sobrenadante de células HUVEC e no plasma dos HC foi analisada pela tecnologia Milliplex. A quantificação do perfil lipífico, Proteína C reativa ultra-sensível (PCRus) e NO foi realizada por métodos laboratoriais convencionais. O papel do NO na modulação dos marcadores inflamatórios pelas estatinas foi também estudada, usando modelo de células HUVEC com NOS3 silenciado por interferência de RNAm e também por meio do uso do inibidor da síntese do óxido nítrico, L-NAME. Também foi avaliado o efeito de hipolipemiantes na expressão dos microRNAs (miRs) 221, miR-222 e miR-1303 em células HUVEC por meio do stem-loop RT-qPCR. O tratamento com atorvastatina e sinvastatina reduziu a expressão de RNAm e proteínas das moléculas de adesão LSelectina, PSGL-1 e VLA-4, em células THP-1 pré-tratadas com TNF&#945; por 12 h. A ezetimiba reduziu a expressão de L-Selectina apenas no nível transcricional. Em células HUVEC, as estatinas diminuíram a expressão de RNAm de IL1B e SELP, entretanto aumentaram a de VCAM1. A ezetimiba reduziu a expressão de RNAm do IL1B. Entretanto as expressões de SELE, MMP9, IL6 e MMP9 não foram afetadas pelos tratamentos. A expressão das proteínas ICAM-1 e P-Selectina, na superfície de células HUVEC, foi diminuída pelo tratamento com as estatinas, mas não pela ezetimiba. Da mesma forma, a secreção das citocinas IL-6 e MCP-1 foram reduzidas pelas estatinas, entretanto a secreção de IL-8 não foi modificada por nenhum dos tratamentos. A expressão de NOS3 e a liberação de NO em células HUVEC foi aumentada pelas estatinas, porém não foi estimulada pela ezetimiba. Entretanto, os efeitos antiinflamatórios exercidos pelas estatinas foram independentes dessa via devido a que estes efeitos foram mantidos em células HUVEC com NOS3 silenciado por interferência de RNAm. Apesar de que o efeito sobre ICAM-1 e MCP-1 foi atenuado quando as células foram simultaneamente tratadas com L-NAME, os efeitos das estatinas parecem ser independentes da liberação de NO. As estatinas e a ezetimiba reduziram a expressão do miR-221, em células HUVEC. A expressão do miR-222 foi reduzida só pelo tratamento com atorvastatina. A expressão do miR-1303 não foi modulada pelos tratamentos hipolipemiantes. Em pacientes HC, a terapia de associação da sinvastatina e ezetimiba demonstrou melhorar o perfil lipídico de forma mais efetiva que ambas monoterapias. Da mesma forma, o tratamento combinado resultou em maior beneficio pela redução da expressão de RNAm em CMSP e da concentração plasmática das proteínas IL-1 &#946;, MCP-1, IL-8 e TNF&#945;. A expressão de ICAM1 foi diminuída apenas no nível transcricional, entretanto a expressão de RNAm mas não da proteína do TNF&#945; foi também reduzida pela sinvastatina em monoterapia. Não houve modulação de RNAm ou proteínas de outros marcadores estudados no modelo in vivo. Por outro lado, os efeitos anti-inflamatórios observados nos indivíduos HC foram independentes da modulação de PCRus e NO que não foram modificados pelos tratamentos hipolipemiantes. Neste estudo, foram confirmados os propostos efeitos pleiotrópicos das estatinas em modelos células de monócito e endotélio vascular in vitro e em pacientes HC. Por outro lado, apesar de ser menos potente que as estatinas foi mostrado que a inibição da absorção do colesterol tem também um efeito anti-inflamatório. A redução adicional do colesterol causado pela combinação das terapias hipolipemiantes outorga um maior beneficio cardiovascular em pacientes hipercolesterolêmicos. / The inflammatory process has a key role in the genesis and development of atherosclerosis and the endothelial disfunction is considered as a first step in atherogenesis. By inhibiting the hydroxyl-methyl-glutaryl coA reductase (HMGCR)m statins reduce the cholesterol synthesis and isoprenoid generation, which are intermediary products of cholesterol synthesis with important role in posttranscriptional modifications of small GTPases that are involved in endothelial disfunction and vascular inflammation. The ezetimibe is an inhibitor of cholesterol absorption by inhibiting the NPC1L1 protein. To clarify the molecular mechanisms of the inhibition of cholesterol synthesis and absorption modulating inflammatory and cell adhesion biomarkers we used in vitro models of endothelial cells (HUVEC) and monocytes (THP-1), and an in vivo model of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from hypercholesterolemic (HC) patients. The effect of the statins, atorvastatin and simvastatin, and the ezetimibe on mRNA and protein expression of endothelial adhesion molecules and modulators of the inflammatory process, as citokynes and nitric oxide (NO), was analyzed in HUVEC. The effect of these drugs on the expression of monocyte adhesion molecules was also studied in THP-1. The influence of hypolipemiant therapy on the adhesion molecules was also analyzed in PBMC from HC treated with ezetimibe (10 mg/day/4-weeks), simvastatin (10 mg/day/8-weeks) and simvastatin combined with ezetimibe (10 mg each/day/4-weeks). The mRNA expression was evaluated by RT-qPCR. The expression of adhesion molecules on the surface of THP-1 and HUVEC cells was analyzed flow cytometry. The citokynes in the supernatants of HUVEC were quantified using the milliplex technology. The Lipid profile, high-sensivity PCR (hsPCR) and NO were determined by conventional laboratory methods. The role of the NO on the statin-modulation of inflammatory markers was also studied using a model with silenced NOS3 by interference of mRNA and by the use of the inhibitor of NO synthesis, L-NAME. The effect of hypolipemiants on the expression of microRNAs (miRs) 221, miR-222 and miR-1303 was also evaluated in HUVEC using the stem-loom RT-qPCR. Atorvastatin and simvastatin reduced the mRNA and protein expression of the adhesion molecules L-Selectin, PSGL-1 and VLA-4 in THP-1 cells pre-treated with TNF&#945; for 12 h. The ezetimibe reduced the L-Selectin expression only at transcriptional level. In HUVEC, statins diminished IL1B and SELP mRNA expression, whereas VCAM1 was increased. The ezetimibe reduced the IL1B mRNA expression. However, SELE, MMP9, IL6 and MMP9 mRNA expressions were not affected by the treatments. The protein expression of ICAM-1 and P-Selectin on the surface of HUVEC was reduced by statins, but not by the ezetimibe. Similarly, IL-6 and MCP-1 secretion were reduced by statins, whereas IL-8 secretion was not modified by the treatments. The NO release and NOS3 expression in HUVEC was increased by the statins, however it was not stimulated by ezetimibe. Moreover, the anti-inflammatory statin effects were independent of this pathway due to statin effects were maintained in HUVEC with silenced NOS3. Although the statin effect on ICAM-1 and MCP-1 were attenuated by L-NAME co treatment, the statin effects seem to be independent of NO release. Statins and ezetimibe reduced miR221 in HUVEC. miR-222 expression was reduced only by atorvastatin. miR-1303 was not affected by the treatments. In HC patients, the improvement of the lipid profile simvastatin combined with ezetimibe was more efficient than both monotherapies. Similarly, the association therapy was better in reducing the mRNA expression in PBMC and plasma concentration of IL-1&#946;, MCP-1, IL-8 and TNF&#945;. ICAM1 expression was reduced only at transcriptional level, whereas mRNA but not protein expression of TNF&#945; was also reduced by the simvastatin monotherapy. There was no modulation mRNA or protein expression of other studied markers in the in vivo model. Additionally, the anti-inflammatory effects observed in the HC were independent of PCRus or NO modulation, which were not altered by the hypolipemiant treatments. In this study, the proposed plitropic effects of statins were confirmed in monocytes and endothelial cells in vitro and in HC patients. Moreover, although it was less potent than statins, an anti-inflammatory effect was also observed for the inhibition of cholesterol absorption. An additional reduction of the cholesterol caused by combined hypolipemiant therapies gives a greater cardiovascular beneffict in hypercholesterolemic patients.

Introdução: As CYP3A4 e CYP3A5 são enzimas do citocromo P450 responsáveis pela biotransformação de esteróides endógenos e vários fármacos, entre eles as estatinas. Polimorfismos nos genes CYP3A4 e CYP3A5 (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D) foram associados com diferenças na resposta hipolipemiante de indivíduos tratados com atorvastatina e sinvastatina. Neste estudo foram avaliados os efeitos de hipolipemiantes sobre a expressão e a atividade de CYP3A4 e CYP3A5, em linhagens celulares HepG2 e Caco-2 e em CMSP de indivíduos hipercolesterolêmicos, e sua relação com variantes de CYP3A4 e CYP3A5. Métodos: Foram analisados 99 indivíduos normolipidêmicos (NL) e 139 hipercolesterolêmicos (HC). Os HC foram tratados com atorvastatina (10 mg/dia/4 semanas). A genotipagem das variantes CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D foi feita por PCR-RFLP ou sequenciamento. A análise da expressão de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 foi avaliada por PCR em tempo real quantitativo (PCRq). As proteínas totais de HepG2 foram avaliadas por Western Blotting. A atividade de CYP3A4 e CYP3A5 in vivo foi avaliada pela relação entre cortisol e seu metabólito, 6&#946;-hidróxicortisol, na urina (razão 6&#946;OH-cortisol/cortisol), por CLAE. Resultados: O perfil de expressão basal de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 é diferente entre HepG2 e Caco-2. Caco-2 expressa 31 vezes mais CYP3A4 e 122 vezes mais CYP3A5 que HepG2. Em células HepG2 tratadas por 12 h, a atorvastatina 20 &#181;M aumentou a expressão de CYP3A4 em 10 vezes, em relação ao controle (p=0,006). Após 24 h de tratamento, atorvastatina (1-20 &#181;M) aumentou a expressão de CYP3A4 em 5 a 8 vezes, nas HepG2 (p< 0,001). Para CYP3A5, a exposição por 12 h à atorvastatina 20 &#181;M aumentou a expressão em 4 vezes em relação ao controle ( p<0,001). A exposição à sinvastatina 1,0 &#181;M por 24 h aumentou a expressão de CYP3A4, em 2 vezes (p<0,01), em HepG2. Também se observou que, nesse tempo de tratamento, a sinvastatina (0,1 &#181;M a 10 &#181;M) aumentou a expressão de CYP3A5 em 2 a 4 vezes (p<0,05). A linhagem HepG2 apresenta alelos funcionais (CYP3A4*1A e CYP3A5*1A) em homozigose. A linhagem Caco-2 apresenta os alelos não funcionais CYP3A5*3C e CYP3A5*1D, em heterozigose. Também foi avaliada a expressão das proteínas CYP3A4 e CYP3A5 por Western Blotting, em células HepG2, após atorvastatina (0,1 a 20 &#181;M) e sinvastatina (0,01 a 10 &#181;M) por 12 e 24 h. O perfil de expressão das proteínas não diferiu com os tratamentos. Nas células mononucleares do sangue periférico (CMSP), a expressão de RNAm basal de CYP3A4 é cerca de 2,5 a 9,6 vezes maior que a expressão de CYP3A5 (p< 0,05). Observou-se correlação da expressão de CYP3A4 e CYP3A5 nessas células, antes (r2 = 0,22; p< 0,0001) e após o tratamento (r2 = 0,58; p<0,0001) com atorvastatina. A expressão basal de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 é maior nos indivíduos (NL) que nos indivíduos (HC) (p<0,05). A atorvastatina não influenciou a expressão de CYP3A4 e CYP3A5 em CMSP (p> 0,05). Os indivíduos NL apresentam atividade de CYP3A4 e CYP3A5 basal maior que os indivíduos HC- (p<0,0001). O tratamento com atorvastatina não alterou a atividade de CYP3A4 e CYP3A5 nos HC (p>0,05). As variantes gênicas estudadas (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D) como grupos haplotípicos não afetaram a resposta ao tratamento, a expressão de RNAm ou a atividade de CYP3A4 e CYP3A5, embora o haplótipo AGT tenha expressão basal de RNAm de CYP3A5 menor que os portadores de haplótipos GAT e GAC (p<0,005). Conclusão: Os resultados deste trabalho nos permitem concluir que a atorvastatina e a sinvastatina, mas não a ezetimiba, influenciam a expressão de CYP3A4 e CYP3A5 in vitro, em linhagem derivada de hepatócitos (HepG2), e que este efeito não foi reproduzido em linhagem derivada de enterócitos (Caco-2). A expressão de CYP3A4 e CYP3A5 tem grande variabilidade interindividual, independente do grupo haplotípico de cada indivíduo, e que não é influenciada pela atorvastatina. / Background: CYP3A4 and CYP3A5 are enzymes from the cytochrome P450 resposible for the biotransformation of endogenous steroids and several drugs, e.g. statins. Polymorphisms in CYP3A4 and CYP3A5 (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C and CYP3A5*1D) have been associated with variation of lipid-lowering response in individuals treated with atorvastatin and simvastatin. In this study we evaluated the effect of hypolipemiants on expression and activity of CYP3A4 and CYP3A5, in HepG2 and Caco-2 cell lines as well as peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in hypercholesterolemic individuals, and their relationship with CYP3A4 and CYP3A5 variants. Methods: We analyzed 99 normolipidemic individuals (NL) and 139 hypercholesterolemic (HC). HC subjects were treated with atorvastatin (HC, 10 mg/day/4 weeks). Analysis of CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D variants was performed with PCR-RFLP or sequencing assays and mRNA expression of CYP3A4 and CYP3A5 with Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) was performed . Total protein content was extracted from HepG2 for Western Blotting experiments. Activity of CYP3A4 and CYP3A5 in vivo was evaluated by 6&#946;OH-cortisol and cortisol ratio in urine samples, by HPLC-UV method. Results: Baseline mRNA expression is different for HepG2 and Caco-2. Caco-2 expresses 31 times more CYP3A4 and 122 times more CYP3A5 than HepG2. In HepG2 cells treated for 12h, atorvastatin 20 &#181;M increased CYP3A4 expression in 10 times, when compared to the control (p=0.006). After 24h treatment, atorvastatin (1-20 &#181;M) increased CYP3A4 mRNA expression in 5 to 8 times, in HepG2 (p< 0.001). To CYP3A5, exposure for 12h to atorvastatin 20 &#181;M increased expression in 4 times when compared to the control (p<0.001). Exposure to simvastatin 1.0 &#181;M for 24 h increased CYP3A4 expression in 2 times, (p<0.01), in HepG2. With the 24h treatment,simvastatin (0.1 &#181;M - 10 &#181;M) CYP3A5 showed increased mRNA expression in 2 to 4 times (p<0.05). HepG2 cell line carries homozygous functional alleles (CYP3A4*1A e CYP3A5*1A). Caco-2 carries heterozygous CYP3A5*3C and CYP3A5*1D. We evaluated the protein expression of CYP3A4 and CYP3A5 with Western Blotting in HepG2 cells, after atorvastatin (0.1 - 20 &#181;M) and simvastatin (0.01 - 10 &#181;M) for 12 and 24 h. The proteins profile did not change with statins treatment. In PBMC, baseline mRNA expression of CYP3A4 is approximately 2.6 to 9.5 times higher than CYP3A5 (p< 0.05). There was a correlation in expression between CYP3A4 and CYP3A5, before (r2 = 0.22; p< 0.0001) and after treatment (r2 = 0.58; p<0.0001) with atorvastatin. Baseline mRNA expression of CYP3A4 and CYP3A5 is higher in (NL) than in (HC) (p<0.05). Atorvastatin treatment did not increase CYP3A4 and CYP3A5 mRNA in PBMC (p>0.05). CYP3A4/5 activity was higher in NL subjects than in HC (p<0.0001). Atorvastatin treatment did not affect CYP3A4/5 activity in HC (p>0.05). The studied variants CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D analyzed as a haplotype block did not affect response to treatment, mRNA expression or activity of CYP3A4 and CYP3A5. However, AGT haplotype showed lower CYP3A5 mRNA expression levels when compared to GAC and GAT haplotypes at baseline (p<0.05). Conclusion: The results of this study allow us to conclude that atorvastatin and simvastatin, but not ezetimibe, influence the expression of CYP3A4 and CYP3A5 mRNA in vitro in HepG2 cell line, but this effect was not reproduced in Caco-2 cell line or PBMC. CYP3A4 and CYP3A5 present great interindividual variability, despite the individual´s haplotype and is not influenced by atorvastatin.

FINALIDADE: Defeitos na depuração plasmática de quilomícrons e seus remanescentes (QM) predispõem à doença arterial coronária (DAC). QM ligam-se a seus receptores hepáticos específicos (RLP) e aos receptores de LDL (LDL-r). As estatinas reduzem o LDL-colesterol (LDL-C) e melhoram a depuração plasmática de QM, aumentando a expressão hepática do LDL-r. A ezetimiba (EZE), um bloqueador da absorção do colesterol, também aumenta a expressão de LDL-r nos seres humanos. Este estudo avaliou os efeitos isolados da EZE na depuração plasmatica de QM artificial em pacientes DAC. Também foram testados os efeitos da associação da sinvastatina em dose baixa com EZE em comparação com a máxima dose de sinvastatina sobre depuração plasmática de QM. MÉTODOS: 25 pacientes com DAC estável (idade 61 ± 5 anos), após um período de seis semanas de washout de estatinas, foram randomizados para um ou outro tratamento com 10 mg EZE (grupo 1, n = 13) ou sinvastatina 20 mg (grupo 2, n = 12). Os pacientes evoluíram para 10mg + 20mg de sinvastatina com EZE ou sinvastatina 80 mg, respectivamente. Os estudos cinéticos foram realizados no início e após 6 e 12 semanas de cada braço do tratamento. A emulsão lipídica de QM marcada com 14C-CE (que mede a remoção QM e remanescente) e 3H-TG (que mede a lipólise de QM) foi injetada e amostras de sangue foram coletadas durante 60 minutos para determinar taxas de remoção fracionária de radioisótopos (TFR) por análise compartimental. As comparações foram feitas por analise de medidas repetidas (ANOVA). RESULTADOS: Não houve diferenças nas características clínicas e laboratoriais entre os grupos. As TFR de 14C-CE (1/min) no grupo 1 foram 0,005 ± 0,004, 0,011 ± 0,007 e 0,018 ± 0,004 e no grupo 2 foram 0,004 ± 0,002, 0,011 ± 0,008 e 0,019 ± 0,007, respectivamente, à admissão, 6 e 12 semanas ( p <0,05 e ns, respectivamente, para comparações de tempo e grupo). As TFR de 3H-TG (1/min) no grupo 1 foram de 0,017 ± 0,01, 0,024 ± 0,011 e 0,042 ± 0,013 e no grupo 2 foi de 0,01 ± 0,016, 0,022 ± 0,009 e 0,037 ± 0,011, respectivamente, no início do estudo, 6 e 12 semanas ( p <0,05 e ns, respectivamente, para comparações de tempo e grupo). Mudanças semelhantes também foram encontradas para o LDL-C (mg/dL): 142 ± 22,113 ± 19, 74 ± 17 para grupo1 e 119 ± 22, 92 ± 15 e 72 ± 15 para o grupo 2, respectivamente, na admissão, 6 e 12 semanas (p <0,05 para o tempo e ns para o grupo). CONCLUSÃO: EZE isolada aumentou a remoção do plasma de QM e remanescentes e a associação com a sinvastatina aumentou os seus efeitos. A sinvastatina em dose baixa associada à EZE apresentou efeitos favoráveis semelhantes tanto na depuração plasmática de QM quanto na redução de LDL-C em comparação com 80mg de sinvastatina / PURPOSE: Defects on plasma clearance of chylomicrons and their remnants (CM) predispose to coronary heart disease (CHD). CM bind both to their specific liver receptors (LRP) and to the LDL receptors (LDL-r). Statins reduce LDL-cholesterol (LDL-C) and improve the plasma clearance of CM by increasing the expression of hepatic LDL-r. Ezetimibe (EZE), a cholesterol absorption blocker, also increases LDL-r expression in humans. This study evaluated the isolated effects of EZE on the plasma clearance of artificial CM in CHD subjects. We also tested the effects of the association of low dose simvastatin with EZE in comparison with maximal simvastatin dose upon CM plasma clearance. METHODS: 25 stable CHD patients (age 61 ± 5 years, 98%men) after a 6 week statin washout period were randomized for either treatment with EZE 10 mg (group 1, n= 13) or simvastatin 20 mg (group 2 n=12). Patients were progressed to 10mg EZE+ simvastatin 20mg or simvastatin 80 mg, respectively. Kinetic studies were done at baseline and after 6 and 12 weeks of each treatment arm. The CM emulsion labelled with 14C-CE (that measures CM and remnant removal) and 3H-TG (that measures CM lipolysis) was injected and blood samples were collected during 60 minutes to determine radioisotopes fractional catabolic rates (FCR) by compartmental analysis. Comparisons were made repeated measurements ANOVA. RESULTS: There were no differences in clinical and laboratory characteristics between the groups. The 14C-CE FCR (1/min) in group 1 were 0.005±0.004, 0.011±0.007 and 0.018±0.004 and in group 2 were 0.004±0.002, 0.011±0.008 and 0.019±0.007 respectively at baseline, 6 and 12 weeks (p<0.05 and n.s respectively for time and group comparisons). The 3H-TG FCR (1/min) in group 1 were 0.017±0.01, 0.024±0.011 and 0.042±0.013 and in group 2 were 0.01± 0.016, 0.022±0.009 and 0.037±0.011 respectively at baseline, 6 and 12 weeks (p <0.05 and n.s respectively for time and group comparisons). Similar changes were also found for LDL-C (mg/dL):142 ± 22,113 ± 19, 74 ± 17 for group1 and 119 ± 22, 92 ± 15, and 72 ± 15 for group 2 respectively at baseline, 6 and 12 weeks (p<0.05 for time and n.s. for group). CONCLUSION: EZE alone increased the removal from plasma of CM and remnants, the association with simvastatin increased its effects. The low dose simvastatin associated with EZE showed similar favourable effects in both CM plasma clearance and LDL-C in comparison with 80 mg simvastatin

FINALIDADE: Defeitos na depuração plasmática de quilomícrons e seus remanescentes (QM) predispõem à doença arterial coronária (DAC). QM ligam-se a seus receptores hepáticos específicos (RLP) e aos receptores de LDL (LDL-r). As estatinas reduzem o LDL-colesterol (LDL-C) e melhoram a depuração plasmática de QM, aumentando a expressão hepática do LDL-r. A ezetimiba (EZE), um bloqueador da absorção do colesterol, também aumenta a expressão de LDL-r nos seres humanos. Este estudo avaliou os efeitos isolados da EZE na depuração plasmatica de QM artificial em pacientes DAC. Também foram testados os efeitos da associação da sinvastatina em dose baixa com EZE em comparação com a máxima dose de sinvastatina sobre depuração plasmática de QM. MÉTODOS: 25 pacientes com DAC estável (idade 61 ± 5 anos), após um período de seis semanas de washout de estatinas, foram randomizados para um ou outro tratamento com 10 mg EZE (grupo 1, n = 13) ou sinvastatina 20 mg (grupo 2, n = 12). Os pacientes evoluíram para 10mg + 20mg de sinvastatina com EZE ou sinvastatina 80 mg, respectivamente. Os estudos cinéticos foram realizados no início e após 6 e 12 semanas de cada braço do tratamento. A emulsão lipídica de QM marcada com 14C-CE (que mede a remoção QM e remanescente) e 3H-TG (que mede a lipólise de QM) foi injetada e amostras de sangue foram coletadas durante 60 minutos para determinar taxas de remoção fracionária de radioisótopos (TFR) por análise compartimental. As comparações foram feitas por analise de medidas repetidas (ANOVA). RESULTADOS: Não houve diferenças nas características clínicas e laboratoriais entre os grupos. As TFR de 14C-CE (1/min) no grupo 1 foram 0,005 ± 0,004, 0,011 ± 0,007 e 0,018 ± 0,004 e no grupo 2 foram 0,004 ± 0,002, 0,011 ± 0,008 e 0,019 ± 0,007, respectivamente, à admissão, 6 e 12 semanas ( p <0,05 e ns, respectivamente, para comparações de tempo e grupo). As TFR de 3H-TG (1/min) no grupo 1 foram de 0,017 ± 0,01, 0,024 ± 0,011 e 0,042 ± 0,013 e no grupo 2 foi de 0,01 ± 0,016, 0,022 ± 0,009 e 0,037 ± 0,011, respectivamente, no início do estudo, 6 e 12 semanas ( p <0,05 e ns, respectivamente, para comparações de tempo e grupo). Mudanças semelhantes também foram encontradas para o LDL-C (mg/dL): 142 ± 22,113 ± 19, 74 ± 17 para grupo1 e 119 ± 22, 92 ± 15 e 72 ± 15 para o grupo 2, respectivamente, na admissão, 6 e 12 semanas (p <0,05 para o tempo e ns para o grupo). CONCLUSÃO: EZE isolada aumentou a remoção do plasma de QM e remanescentes e a associação com a sinvastatina aumentou os seus efeitos. A sinvastatina em dose baixa associada à EZE apresentou efeitos favoráveis semelhantes tanto na depuração plasmática de QM quanto na redução de LDL-C em comparação com 80mg de sinvastatina / PURPOSE: Defects on plasma clearance of chylomicrons and their remnants (CM) predispose to coronary heart disease (CHD). CM bind both to their specific liver receptors (LRP) and to the LDL receptors (LDL-r). Statins reduce LDL-cholesterol (LDL-C) and improve the plasma clearance of CM by increasing the expression of hepatic LDL-r. Ezetimibe (EZE), a cholesterol absorption blocker, also increases LDL-r expression in humans. This study evaluated the isolated effects of EZE on the plasma clearance of artificial CM in CHD subjects. We also tested the effects of the association of low dose simvastatin with EZE in comparison with maximal simvastatin dose upon CM plasma clearance. METHODS: 25 stable CHD patients (age 61 ± 5 years, 98%men) after a 6 week statin washout period were randomized for either treatment with EZE 10 mg (group 1, n= 13) or simvastatin 20 mg (group 2 n=12). Patients were progressed to 10mg EZE+ simvastatin 20mg or simvastatin 80 mg, respectively. Kinetic studies were done at baseline and after 6 and 12 weeks of each treatment arm. The CM emulsion labelled with 14C-CE (that measures CM and remnant removal) and 3H-TG (that measures CM lipolysis) was injected and blood samples were collected during 60 minutes to determine radioisotopes fractional catabolic rates (FCR) by compartmental analysis. Comparisons were made repeated measurements ANOVA. RESULTS: There were no differences in clinical and laboratory characteristics between the groups. The 14C-CE FCR (1/min) in group 1 were 0.005±0.004, 0.011±0.007 and 0.018±0.004 and in group 2 were 0.004±0.002, 0.011±0.008 and 0.019±0.007 respectively at baseline, 6 and 12 weeks (p<0.05 and n.s respectively for time and group comparisons). The 3H-TG FCR (1/min) in group 1 were 0.017±0.01, 0.024±0.011 and 0.042±0.013 and in group 2 were 0.01± 0.016, 0.022±0.009 and 0.037±0.011 respectively at baseline, 6 and 12 weeks (p <0.05 and n.s respectively for time and group comparisons). Similar changes were also found for LDL-C (mg/dL):142 ± 22,113 ± 19, 74 ± 17 for group1 and 119 ± 22, 92 ± 15, and 72 ± 15 for group 2 respectively at baseline, 6 and 12 weeks (p<0.05 for time and n.s. for group). CONCLUSION: EZE alone increased the removal from plasma of CM and remnants, the association with simvastatin increased its effects. The low dose simvastatin associated with EZE showed similar favourable effects in both CM plasma clearance and LDL-C in comparison with 80 mg simvastatin

Introdução: As CYP3A4 e CYP3A5 são enzimas do citocromo P450 responsáveis pela biotransformação de esteróides endógenos e vários fármacos, entre eles as estatinas. Polimorfismos nos genes CYP3A4 e CYP3A5 (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D) foram associados com diferenças na resposta hipolipemiante de indivíduos tratados com atorvastatina e sinvastatina. Neste estudo foram avaliados os efeitos de hipolipemiantes sobre a expressão e a atividade de CYP3A4 e CYP3A5, em linhagens celulares HepG2 e Caco-2 e em CMSP de indivíduos hipercolesterolêmicos, e sua relação com variantes de CYP3A4 e CYP3A5. Métodos: Foram analisados 99 indivíduos normolipidêmicos (NL) e 139 hipercolesterolêmicos (HC). Os HC foram tratados com atorvastatina (10 mg/dia/4 semanas). A genotipagem das variantes CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D foi feita por PCR-RFLP ou sequenciamento. A análise da expressão de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 foi avaliada por PCR em tempo real quantitativo (PCRq). As proteínas totais de HepG2 foram avaliadas por Western Blotting. A atividade de CYP3A4 e CYP3A5 in vivo foi avaliada pela relação entre cortisol e seu metabólito, 6&#946;-hidróxicortisol, na urina (razão 6&#946;OH-cortisol/cortisol), por CLAE. Resultados: O perfil de expressão basal de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 é diferente entre HepG2 e Caco-2. Caco-2 expressa 31 vezes mais CYP3A4 e 122 vezes mais CYP3A5 que HepG2. Em células HepG2 tratadas por 12 h, a atorvastatina 20 &#181;M aumentou a expressão de CYP3A4 em 10 vezes, em relação ao controle (p=0,006). Após 24 h de tratamento, atorvastatina (1-20 &#181;M) aumentou a expressão de CYP3A4 em 5 a 8 vezes, nas HepG2 (p< 0,001). Para CYP3A5, a exposição por 12 h à atorvastatina 20 &#181;M aumentou a expressão em 4 vezes em relação ao controle ( p<0,001). A exposição à sinvastatina 1,0 &#181;M por 24 h aumentou a expressão de CYP3A4, em 2 vezes (p<0,01), em HepG2. Também se observou que, nesse tempo de tratamento, a sinvastatina (0,1 &#181;M a 10 &#181;M) aumentou a expressão de CYP3A5 em 2 a 4 vezes (p<0,05). A linhagem HepG2 apresenta alelos funcionais (CYP3A4*1A e CYP3A5*1A) em homozigose. A linhagem Caco-2 apresenta os alelos não funcionais CYP3A5*3C e CYP3A5*1D, em heterozigose. Também foi avaliada a expressão das proteínas CYP3A4 e CYP3A5 por Western Blotting, em células HepG2, após atorvastatina (0,1 a 20 &#181;M) e sinvastatina (0,01 a 10 &#181;M) por 12 e 24 h. O perfil de expressão das proteínas não diferiu com os tratamentos. Nas células mononucleares do sangue periférico (CMSP), a expressão de RNAm basal de CYP3A4 é cerca de 2,5 a 9,6 vezes maior que a expressão de CYP3A5 (p< 0,05). Observou-se correlação da expressão de CYP3A4 e CYP3A5 nessas células, antes (r2 = 0,22; p< 0,0001) e após o tratamento (r2 = 0,58; p<0,0001) com atorvastatina. A expressão basal de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 é maior nos indivíduos (NL) que nos indivíduos (HC) (p<0,05). A atorvastatina não influenciou a expressão de CYP3A4 e CYP3A5 em CMSP (p> 0,05). Os indivíduos NL apresentam atividade de CYP3A4 e CYP3A5 basal maior que os indivíduos HC- (p<0,0001). O tratamento com atorvastatina não alterou a atividade de CYP3A4 e CYP3A5 nos HC (p>0,05). As variantes gênicas estudadas (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D) como grupos haplotípicos não afetaram a resposta ao tratamento, a expressão de RNAm ou a atividade de CYP3A4 e CYP3A5, embora o haplótipo AGT tenha expressão basal de RNAm de CYP3A5 menor que os portadores de haplótipos GAT e GAC (p<0,005). Conclusão: Os resultados deste trabalho nos permitem concluir que a atorvastatina e a sinvastatina, mas não a ezetimiba, influenciam a expressão de CYP3A4 e CYP3A5 in vitro, em linhagem derivada de hepatócitos (HepG2), e que este efeito não foi reproduzido em linhagem derivada de enterócitos (Caco-2). A expressão de CYP3A4 e CYP3A5 tem grande variabilidade interindividual, independente do grupo haplotípico de cada indivíduo, e que não é influenciada pela atorvastatina. / Background: CYP3A4 and CYP3A5 are enzymes from the cytochrome P450 resposible for the biotransformation of endogenous steroids and several drugs, e.g. statins. Polymorphisms in CYP3A4 and CYP3A5 (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C and CYP3A5*1D) have been associated with variation of lipid-lowering response in individuals treated with atorvastatin and simvastatin. In this study we evaluated the effect of hypolipemiants on expression and activity of CYP3A4 and CYP3A5, in HepG2 and Caco-2 cell lines as well as peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in hypercholesterolemic individuals, and their relationship with CYP3A4 and CYP3A5 variants. Methods: We analyzed 99 normolipidemic individuals (NL) and 139 hypercholesterolemic (HC). HC subjects were treated with atorvastatin (HC, 10 mg/day/4 weeks). Analysis of CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D variants was performed with PCR-RFLP or sequencing assays and mRNA expression of CYP3A4 and CYP3A5 with Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) was performed . Total protein content was extracted from HepG2 for Western Blotting experiments. Activity of CYP3A4 and CYP3A5 in vivo was evaluated by 6&#946;OH-cortisol and cortisol ratio in urine samples, by HPLC-UV method. Results: Baseline mRNA expression is different for HepG2 and Caco-2. Caco-2 expresses 31 times more CYP3A4 and 122 times more CYP3A5 than HepG2. In HepG2 cells treated for 12h, atorvastatin 20 &#181;M increased CYP3A4 expression in 10 times, when compared to the control (p=0.006). After 24h treatment, atorvastatin (1-20 &#181;M) increased CYP3A4 mRNA expression in 5 to 8 times, in HepG2 (p< 0.001). To CYP3A5, exposure for 12h to atorvastatin 20 &#181;M increased expression in 4 times when compared to the control (p<0.001). Exposure to simvastatin 1.0 &#181;M for 24 h increased CYP3A4 expression in 2 times, (p<0.01), in HepG2. With the 24h treatment,simvastatin (0.1 &#181;M - 10 &#181;M) CYP3A5 showed increased mRNA expression in 2 to 4 times (p<0.05). HepG2 cell line carries homozygous functional alleles (CYP3A4*1A e CYP3A5*1A). Caco-2 carries heterozygous CYP3A5*3C and CYP3A5*1D. We evaluated the protein expression of CYP3A4 and CYP3A5 with Western Blotting in HepG2 cells, after atorvastatin (0.1 - 20 &#181;M) and simvastatin (0.01 - 10 &#181;M) for 12 and 24 h. The proteins profile did not change with statins treatment. In PBMC, baseline mRNA expression of CYP3A4 is approximately 2.6 to 9.5 times higher than CYP3A5 (p< 0.05). There was a correlation in expression between CYP3A4 and CYP3A5, before (r2 = 0.22; p< 0.0001) and after treatment (r2 = 0.58; p<0.0001) with atorvastatin. Baseline mRNA expression of CYP3A4 and CYP3A5 is higher in (NL) than in (HC) (p<0.05). Atorvastatin treatment did not increase CYP3A4 and CYP3A5 mRNA in PBMC (p>0.05). CYP3A4/5 activity was higher in NL subjects than in HC (p<0.0001). Atorvastatin treatment did not affect CYP3A4/5 activity in HC (p>0.05). The studied variants CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D analyzed as a haplotype block did not affect response to treatment, mRNA expression or activity of CYP3A4 and CYP3A5. However, AGT haplotype showed lower CYP3A5 mRNA expression levels when compared to GAC and GAT haplotypes at baseline (p<0.05). Conclusion: The results of this study allow us to conclude that atorvastatin and simvastatin, but not ezetimibe, influence the expression of CYP3A4 and CYP3A5 mRNA in vitro in HepG2 cell line, but this effect was not reproduced in Caco-2 cell line or PBMC. CYP3A4 and CYP3A5 present great interindividual variability, despite the individual´s haplotype and is not influenced by atorvastatin.

A ezetimiba e a sinvastatina são fármacos hipolipidêmicos. A ezetimiba pertence à nova classe das 2 - azetidinona, inibidores e bloqueadores do colesterol intestinal. A sinvastatina pertence à classe dos inibidores competitivos da hidroxi-3-metilglutarilcoenzima A redutase (HMG-CoA), que é a última etapa regulada na síntese do colesterol. O objetivo do trabalho foi desenvolver e validar métodos por cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) e eletroforese capilar (CE), rápidos, seletivos e confiáveis para determinação dos hipolipidêmicos em formulações farmacêuticas. A separação cromatográfica foi realizada usando coluna Nano separation technologies (NST) Cianopropril (CN) (150 mmx 4,6 mm, com partícula 3,5 &#181;m), e eluição isocrático usando água purificada: acetonitrila (48:52, v/v); vazão 0,8 mL/min e volume de injeção de 20 &#181;L. A temperatura da coluna foi de 35 ºC e a detecção foi realizada com detector na região do UV em 238 nm. O método por cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) foi desenvolvido utilizando capilar de sílica fundida 30 cm (comprimento efetivo) x 50 &#181;m d.i. e eletrólito constituído de tetraborato de sódio (TBS) 20 mmol L-1: dodecil sulfato de sódio (SDS) 30 mmol L-1, pH 9,0 ajustado com 10% ácido fosfórico: acetonitrila 12% v/v. O tempo de injeção foi de 3 segundos com pressão hidrodinâmica de 20 mbar, voltagem aplicada de 30 kV e detecção no UV em 238 nm. Os métodos analíticos foram validados de acordo com os requerimentos vigentes da ANVISA, ICH e Farmacopéia Americana. Portanto, os métodos propostos demonstraram ser lineares, precisos, exatos e adequados para quantificação simultânea da ezetimiba e sinvastatina em formas farmacêuticas sólidas. / Ezetimibe and simvastatin are hipolipidemic drugs. Ezetimibe belongs to a new class of 2 - azetidione, inhibitors and blockers of intestinal chrolesterol. Simvastatin belongs a class of competitive inhibitors of 3-hydroxymethylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase, which is the last regulated step in the cholesterol synthesis. The aim of this project was to develop and validate fast, selective and reliable chromatographic and electrophoretic methods, to determine hypolipidemic drugs in pharmaceutical formulations. The chromatographic separation was carried out on a Nano separation technologies (NST) Cyanpropyl (CN) (150 mm x 4,6 mm, 3,5 &#181;m), isocratic elution using purified water: acetonitrila (48:52 v/v), the flow rate was 0,8 mL/min and the injection volume was 20 &#181;L. The column temperature was kept at 35 ºC and detection wavelength was set at 238 mn. The micellar electrokinetic chromatographic method was developed using a fused silica capillary column 30 cm (effective length) x 50 &#181;m i.d, the electrolyte was constituted of 20 mmol L-1 tetraborate buffer solution: 30 mmol L-1 sodium dodecyl sulphate (SDS), pH 9.0 adjusted with 10% phosphoric acid: 12 % v/v acetonitrile. The injection time was 3 s at 20 mbar, the applied voltage was 30 kV and detection was set at 238 nm. The both methods were developed and validated according to ANVISA, ICH and US Pharmacopeia guidelines. Therefore, the proposed methods proved to be linear, precise, accurate and suitable for simultaneous quantitation of ezetimibe and simvastatin in solid pharmaceutical formulations.