Orientador: Ciro Moraes Barros / Banca: Fabíola Freitas de Paula Lopes / Banca: Fernanda Alvarenga / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Resumo: A fim de melhor compreender as diferenças entre zebuínos e taurinos em relação à resistência ao estresse térmico (ET), objetivou-se com o presente trabalho: (1) verificar se a adição de IGF-I ao meio de cultivo, na ausência de Soro Fetal Bovino (SFB), seria capaz de manter as taxas de produção embrionária semelhantes àquelas obtidas em meio de cultivo com SFB; (2) verificar se a adição de IGF-I ao meio de cultivo é mais eficiente em diminuir os efeitos deletérios do ET em embriões da raça Holandesa preto e branco (HPB) quando comparados aos da raça Nelore; (3) verificar se o efeito deletério do ET no desenvolvimento embrionário e na taxa de apoptose é mais acentuado em embriões da raça HPB, quando comparado aos da raça Nelore. No experimento 1, oócitos de vacas aneloradas oriundas de matadouro foram maturados, fertilizados com sêmen de touros da raça Nelore e, 10 horas pós inseminação (hpi), os embriões foram distribuídos ao acaso em quatro grupos, de acordo com a composição do meio de cultivo: SFB (5% de SFB + 0 ng/mL de IGF-I; n=165); IGF (0% de SFB + 51 100 ng/mL de IGF-I; n=163); SFB+IGF (5% de SFB + 100 ng/mL de IGF; n=169) e controle (0% de SFB + 0 ng/mL de IGF-I; n=168). Foram avaliadas as taxas de clivagem, mórula, blastocisto e blastocisto eclodido. Nos experimentos 2 e 3, oócitos de vacas Nelore e HPB oriundas de matadouro foram maturados em meio TCM 199, fertilizados com sêmen de touros das raças Nelore (n=6) e HPB (n=6), respectivamente, e cultivados em meio SOF (synthetic oviduct fluid, na ausência de SFB) até o estágio de blastocisto. Dadas 10 hpi, os embriões foram distribuídos ao acaso em quatro grupos: controle (cultivados na ausência de IGF a 39 oC); ET (cultivados na ausência de IGF e expostos a 41 oC, 96 hpi, por 9 horas, retornando a seguir para 39 oC); IGF (cultivados na presença de IGF a 39 oC) e ET/IGF (IGF e ET). No ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Not available / Doutor

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437983.pdf: 3242745 bytes, checksum: 9b67fa711fdfe3bdd518bb49b3f07fc0 (MD5) Previous issue date: 2012-03-19 / This study was designed to characterize, by means of functional and molecular approaches, the relevance of kinin B1 and B2 receptors in bladder cancer. Our data clearly shows that both B1 des-Arg9-BK and B2 BK receptor agonists were able to stimulate the proliferation of the grade 3-derived bladder cancer T24 cells. Furthermore, the incubation of B1 and B2 receptor antagonists, SSR240612 and HOE140, respectively, markedly inhibited the proliferation rate of T24 cells. In contrast, only higher concentrations of BK elicited the proliferation of the grade 1 bladder cancer cell line RT4, while des-Arg9-BK incubation completely failed to induce its proliferation. Interestingly, real time PCR experiments revealed that mRNA expression of B2, and mainly B1 receptors was found superior in T24 cells, in comparison to the low malignity grade RT4 cells. Furthermore, data obtained using bladder cancer human biopsies revealed that B1 receptor expression was visibly increased in all tumoral samples or under chronic inflammation of bladder. Concerning the signaling pathways related to the mitogenic effects of kinins, we bring novel evidence showing that pharmacological inhibition of PI3Kg with AS252424 concentration-dependently reduced T24 cell proliferation induced by BK or des-Arg9-BK. Finally, the incubation of T24 cells with kinin agonists led to a marked activation of PI3K/AKT and ERK 1/2 signaling pathways, whereas p38 MAP kinase remained unaffected. Our results indicate that kinin B2, and especially B1 receptors appear to be implicated in bladder cancer progression. It is tempting to suggest that selective kinin antagonists might represent potential therapeutic alternatives for bladder cancer control. / O presente estudo teve por objetivo caracterizar, atrav?s de abordagens funcionais e moleculares, a relev?ncia dos receptores B1 e B2 para as cininas no c?ncer de bexiga. Os dados obtidos mostraram que tanto o agonista dos receptores B1, des- Arg9-BK, quanto do receptor B2, BK, foram capazes de estimular a prolifera??o das c?lulas de c?ncer de bexiga grau 3, denominadas T24. Al?m disso, a incuba??o dos antagonistas dos receptores B1 e B2, SSR240612 e HOE140, respectivamente, inibiram acentuadamente a prolifera??o das c?lulas T24. Por outro lado, apenas maiores concentra??es de BK levaram ? prolifera??o das c?lulas de c?ncer de bexiga grau 1 RT4; enquanto a incuba??o com des-Arg9-BK n?o induziu sua prolifera??o. De maneira similar, os resultados revelaram que a express?o de mRNA dos receptores B2 e, principalmente, dos receptores B1 foi superior em c?lulas T24, em compara??o com as c?lulas RT4, que apresentam baixo grau de malignidade. Al?m disso, os dados obtidos com bi?psias de c?ncer de bexiga humano revelaram que a express?o do receptor B1 foi claramente maior em todas as amostras tumorais ou, em uma bi?psia obtida de um quadro de inflama??o cr?nica de bexiga. Em rela??o ?s vias de sinaliza??o relacionadas com os efeitos mitog?nicos das cininas, os dados obtidos mostram que a inibi??o farmacol?gica da PI3Kg com AS252424 reduziu de maneira concentra??o-dependente a prolifera??o das c?lulas T24, quando est? foi induzida por BK ou des-Arg9-BK. Finalmente, a incuba??o das c?lulas T24 com agonistas dos receptores de cininas produziu uma acentuada ativa??o das vias de sinaliza??o PI3K/AKT e ERK 1/2, enquanto a via p38 MAP quinase permaneceu inalterada. Nossos resultados indicam que os receptores de cininas B2 e, especialmente, os receptores B1 parecem estar associados com a progress?o do c?ncer de bexiga. Dessa forma, ? poss?vel sugerir que antagonistas seletivos de receptores de cininas poderiam representar alternativas terap?uticas interessantes para o controle do c?ncer de bexiga.

La aterosclerosis es una enfermedad multifactorial que depende en gran parte de factores ambientales, pero con una fuerte base genética que puede predisponer a padecerla. Además de la susceptibilidad individual, en el desarrollo de esta patología tienen una gran importancia las modificaciones en la expresión génica que se producen en las células como una respuesta homeostática ante estímulos de tipo pro-aterogénico. Esta respuesta es un intento de corregir o adaptar la función celular ante el estímulo, pero puede acabar contribuyendo al desarrollo de la enfermedad. Por otra parte, muchos de los fármacos empleados en el tratamiento y prevención de la aterosclerosis y sus complicaciones actúan en gran parte modificando la expresión o actividad de algunos de los genes relacionados con esta patología. La complejidad de estos procesos y el elevado número de genes que pueden estar implicados constituyen un reto para la comunidad científica. Su conocimiento permitirá una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que conducen al desarrollo de la aterosclerosis, y por tanto, permitirá diseñar estrategias terapéuticas para prevenirla o frenarla. En este contexto, el objetivo general de la presente tesis doctoral ha sido contribuir al estudio de la regulación de la expresión génica en monocitos y macrófagos, células clave en todas las etapas de la aterogénesis, como respuesta ante diferentes condiciones pro-aterogénicas y/o fármacos. La consecución de este objetivo ha llevado a la realización de los cuatro trabajos que se presentan, cuyos objetivos específicos fueron: I. Determinar el perfil de expresión génica en monocitos de pacientes con hiperlipemia familiar combinada (HFC), antes y después de un tratamiento con atorvastatina, mediante la utilización de microarrays de cDNA. II. En un modelo in vitro (monocitos THP-1 diferenciados a macrófagos), determinar el efecto de estímulos pro-aterogénicos sobre la expresión de los genes más relevantes identificados en el anterior objetivo, explorando las vías de señalización intracelulares que resultan afectadas. III. En el mismo modelo, estudiar el efecto del inhibidor de proteasas ritonavir sobre la expresión de genes que controlan la acumulación de colesterol en el macrófago. Las principales conclusiones del trabajo experimental de la presente tesis doctoral han sido las siguientes: I. Los monocitos de pacientes con HFC presentan un perfil de expresión génica diferente de los individuos controles sanos. Los genes diferencialmente expresados corresponden a proteínas con funciones clave en los monocitos, relacionadas con el proceso aterosclerótico. El tratamiento de los pacientes con ATV durante un mes es capaz de revertir algunos de los cambios inducidos por la HFC en el patrón de expresión génica de los monocitos circulantes. II. La expresión de IL-1R2 se halla reducida en monocitos de sangre periférica de pacientes con HFC, en macrófagos THP-1 tratados con LDL acetiladas o con VLDL, y también en lesiones ateroscleróticas humanas. La represión génica de IL-1R2 observada en los tratamientos con lipoproteínas se relaciona con la acumulación intracelular de lípidos en el macrófago. Además, las lipoproteínas evitan el incremento en la expresión de receptores de IL-1 y reducen la expresión proteica de la cinasa asociada IRAK-1 en macrófagos activados por LPS. III. La expresión de TFPI-2 se encuentra incrementada en monocitos de pacientes con HFC en comparación con sujetos control. El tratamiento con trombina provoca el aumento de la expresión, tanto génica como proteica, de TFPI-2 en macrófagos THP-1 y macrófagos derivados de monocitos humanos, mediante un mecanismo en el que se encontrarían implicados NF-kB, ERK1/2 y JNK. IV. El tratamiento de macrófagos THP-1 con ritonavir induce un incremento en la expresión de genes implicados en el transporte de colesterol (CD36, ABCA1 y CYP27), por un mecanismo en el que intervendrían SREBP-1, PPARγ y LXR. / Atherosclerosis is a multifactorial disease, in which development are very important changes in gene expression that occur in cells as a homeostatic response to pro-atherogenic stimuli. Moreover, many of the drugs used in the treatment and prevention of atherosclerosis and its complications largely act by modifying the expression or activity of some genes associated with this pathology. In this context, the objective of this thesis was the study of regulation of gene expression in monocytes and macrophages, in response to different pro-atherogenic conditions and/or drugs. Achieving this goal has led to the creation of four works presented, whose specific objectives were: I. Determine the profile of gene expression in monocytes from patients with familial combined hyperlipidemia, before and after treatment with atorvastatin. II. In an in vitro model, determine the effect of pro-atherogenic stimuli on the expression of most relevant genes identified in the above objective, exploring intracellular signaling pathways that are affected. III. In the same model, study the effect of the protease inhibitor ritonavir on the expression of genes that control the accumulation of cholesterol in the macrophage. The main conclusions of the experimental work are: I. Monocytes from patients with FCH have a different gene expression profile of healthy control individuals. Treatment with ATV is able to reverse some of the HFC-induced changes in the pattern of gene expression in circulating monocytes. II. IL-1R2 expression is reduced in peripheral blood monocytes from patients with HFC, in THP-1 macrophages treated with lipoproteins, and also in human atherosclerotic lesions. Repression of IL-1R2 gene observed in treatments with lipoproteins is associated with intracellular accumulation of lipids in the macrophage. In addition, lipoproteins modify LPS-induced expression of IL-1R2 and IL-1 signalling. III. TFPI-2 expression is increased in monocytes from patients with FCH compared with control subjects. Thrombin treatment causes increased expression in THP-1 macrophages and human monocyte-derived macrophages through a mechanism that would be found involved NF-κB, ERK1/2 and JNK. IV. Treatment of THP-1 macrophages with ritonavir induces an increased expression of genes involved in cholesterol transport (CD36, ABCA1 and CYP27), by a mechanism which would involve SREBP-1, PPARγ and LXR.

O veneno de animais contém um arsenal de toxinas que desencadeia respostas fisiológicas e bioquímicas específicas. A crotamina, um peptídio catiônico (4,4 kDa, pI 9,5), é um dos componentes mais abundantes do veneno de cascavel Sul Arrericana (Crotalus durissus terrificus). No Brasil, há populações de C. d. terrificus que expressam ou não a crotamina no veneno. Em um único espécime de C. d. terrificus crotamina-positivo, foram isolados cDNAs precursores de duas isoformas de crotamina, dentre as quais a crotamina lle-19, presente somente no veneno de C.d. ruruima. Análise por Northern blot de RNA total e mensageiro de glândulas de C.d. terrificus crotamina-positivo e -negativo, indica que a expressão é defectiva em espécimes de cascavel crotamina-negativo. O gene da crotamina (Crt-pl) foi isolado e possui três exons interrompidos por dois introns de diferentes fases e tamanhos. O exon I codifica a totalidade do peptídio sinal; o exon II codifica os três resíduos carboxi-terminais do peptídio sinal, bem como a maior parte da toxina madura; o terceiro exon codifica os resíduos terminais da toxina. Tentativa de identificar o pseudogene da crotamina, que indicaria a ausência de transcritos na glânlula de veneno, permitiu isolar um gene parálogo ao da crotamina, isto é o gene crotasin (Cts-p2). Esse gene apresenta a mesma organização estrutural do gene da crotamina, contudo, o intron I é cerca de 800 pares de base mais longo e o exon II é hipermutado. Esse gene é expresso em diferentes tecidos de cascavel, majoritariamente no pâncreas, mas insignificantemente nas glândulas de veneno. Surpreendentemente, esse gene é também detectado no genoma de C. d. terrificus crotamina-positivo, sugerindo que o gene de crotamina é o produto de uma duplicação gênica, bem como da evolução acelerada que operou restritivamente ao exon II. Buscando as funções do produto desse gene nos tecidos de cascavel, por alinhamento de domínios protéicos e outras famílias de peptídios de vertebrados, duas categorias foram encontradas: peptídios catiônicos antibióticos (β-defensinas) e domínios ricos em cisteína de receptores de fator de crescimento. Testes antibióticos indicam que o crotasin, a crotamina e oligopeptídios derivados sintéticos possuem certa atividade microbicida seletiva. Por outro lado, ensaios com células-tronco embrionárias de camundongo e crotamina de veneno mostram que a crotamina é citotóxica em concentrações milimolares, mas induz a diferenciação dos corpos embrionários, em concentrações micromolares. Esses achados demonstram a multi-funcionalidade de peptídios catiônicos, com três pontes de cisteína precisamente arranjadas, é decorrente da versatilidade dos domínios protéicos anfipáticos, que permitem interação com a membrana plasmática, modulando canais iônicos e receptores celulares. / Abstract not available.

O veneno de animais contém um arsenal de toxinas que desencadeia respostas fisiológicas e bioquímicas específicas. A crotamina, um peptídio catiônico (4,4 kDa, pI 9,5), é um dos componentes mais abundantes do veneno de cascavel Sul Arrericana (Crotalus durissus terrificus). No Brasil, há populações de C. d. terrificus que expressam ou não a crotamina no veneno. Em um único espécime de C. d. terrificus crotamina-positivo, foram isolados cDNAs precursores de duas isoformas de crotamina, dentre as quais a crotamina lle-19, presente somente no veneno de C.d. ruruima. Análise por Northern blot de RNA total e mensageiro de glândulas de C.d. terrificus crotamina-positivo e -negativo, indica que a expressão é defectiva em espécimes de cascavel crotamina-negativo. O gene da crotamina (Crt-pl) foi isolado e possui três exons interrompidos por dois introns de diferentes fases e tamanhos. O exon I codifica a totalidade do peptídio sinal; o exon II codifica os três resíduos carboxi-terminais do peptídio sinal, bem como a maior parte da toxina madura; o terceiro exon codifica os resíduos terminais da toxina. Tentativa de identificar o pseudogene da crotamina, que indicaria a ausência de transcritos na glânlula de veneno, permitiu isolar um gene parálogo ao da crotamina, isto é o gene crotasin (Cts-p2). Esse gene apresenta a mesma organização estrutural do gene da crotamina, contudo, o intron I é cerca de 800 pares de base mais longo e o exon II é hipermutado. Esse gene é expresso em diferentes tecidos de cascavel, majoritariamente no pâncreas, mas insignificantemente nas glândulas de veneno. Surpreendentemente, esse gene é também detectado no genoma de C. d. terrificus crotamina-positivo, sugerindo que o gene de crotamina é o produto de uma duplicação gênica, bem como da evolução acelerada que operou restritivamente ao exon II. Buscando as funções do produto desse gene nos tecidos de cascavel, por alinhamento de domínios protéicos e outras famílias de peptídios de vertebrados, duas categorias foram encontradas: peptídios catiônicos antibióticos (β-defensinas) e domínios ricos em cisteína de receptores de fator de crescimento. Testes antibióticos indicam que o crotasin, a crotamina e oligopeptídios derivados sintéticos possuem certa atividade microbicida seletiva. Por outro lado, ensaios com células-tronco embrionárias de camundongo e crotamina de veneno mostram que a crotamina é citotóxica em concentrações milimolares, mas induz a diferenciação dos corpos embrionários, em concentrações micromolares. Esses achados demonstram a multi-funcionalidade de peptídios catiônicos, com três pontes de cisteína precisamente arranjadas, é decorrente da versatilidade dos domínios protéicos anfipáticos, que permitem interação com a membrana plasmática, modulando canais iônicos e receptores celulares. / Abstract not available.