Orientador : Yuji Takahata / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-02T09:34:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lino_AntonioCarlosSenges_D.pdf: 9837276 bytes, checksum: a0722f744b8f70f81266a3437b34a8a3 (MD5) Previous issue date: 2002 / Doutorado

Orientador: André Sampaio Pupo / Banca: Wilma de Grava Kempinas / Banca: Edson Antunes / Resumo: A ejaculação precoce é a disfunção sexual masculina com maiores taxas de incidência e prevalência. De etiologia complexa, as principais abordagens farmacológicas desta condição têm sido a utilização de anestésicos locais, inibidores seletivos da recaptura de serotonina e mais recentemente, inibidores da fosfodiesterase tipo 5. O reflexo ejaculatório é um processo altamente organizado com a interação de áreas centrais encefálicas e espinhais, centros autonômicos simpáticos e parasimpáticos além de reflexos somáticos. O sistema nervoso autônomo simpático, através da ativação de adrenoceptores 1 ( 1-ARs), particularmente o subtipo 1A, desempenha papel fundamental na fase de emissão do reflexo ejaculatório através da modulação da contratilidade de órgãos como o ducto deferente, vesícula seminal e próstata. Além disso, a participação do influxo de cálcio extracelular via canais de cálcio dependentes de voltagem tipo L (canais de cálcio tipo L) na atividade contrátil destes órgãos é bem caracterizada. Devido à importância dos 1-ARs e canais tipo L no reflexo ejaculatório, este trabalho avaliou a eficácia do antagonista de 1-ARs Tamsulosin e das diidropiridinas bloqueadoras de canais de cálcio Nifedipina e (S)-(+)-Niguldipina no retardo da ejaculação em ratos. Os resultados obtidos demonstram que a atividade contrátil do ducto deferente e vesícula seminal ao estímulo adrenérgico via ativação de 1-ARs in vitro é fortemente inibida pelo antagonista de 1-ARs Tamsulosin e pelas bloqueadoras de canais de cálcio Nifedipina e (S)-(+)-Niguldipina. Entretanto, embora a contração destes órgãos e, portanto, a fase de emissão do reflexo ejaculatório tenha sido afetada, a latência ejaculatória dos animais não foi alterada. Estes resultados indicam que o bloqueio de canais de cálcio tipo L ou o antagonismo de 1-ARs no ducto deferente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Premature ejaculation is one of the most common male sexual dysfunctions. With complex aetiology, the main pharmacological approaches involve local anesthetics, selective serotonin reuptake inhibitors and, more recently, phosphodiesterase 5 inhibitors. The sympathetic nervous system plays a crucial role in the ejaculation, controlling vasa deferentia, seminal vesicles and prostate contraction through 1- adrenoceptor ( 1-AR) activation. In addition, the contractions of these organs are dependent on influx of extracellular calcium through L-type voltage-dependent calcium channels (L-type calcium channels). Due to the involvement of 1-ARs and L-type calcium channels in the ejaculatory reflex, this dissertation evaluated the efficacy of the 1-AR antagonist Tamsulosin and of dihydropyridine calcium channel blockers Nifedipine and (S)-(+)-Niguldipine in the delay of ejaculation in rats. The results showed that the vas deferens and seminal vesicle contraction in response to 1-AR activation is potently inhibited by Tamsulosin, Nifedipine and (S)-(+)- Niguldipine. However, although vas deferens and seminal vesicles contractions have been inhibited, the ejaculatory latency in vivo was not affected. These results show that although L-type calcium channel blockade and 1-ARs antagonism in the vas deferens and seminal vesicle are effective in the inhibition of events related to the seminal emission phase of ejaculation, they are not able to delay the ejaculation. The present results indicate that modulation of contractions of organs involved in seminal emission is not a suitable strategy to retard of ejaculation / Mestre

Artículo 1. Activación de la apoptosis mitocondrial en el linfoma de células del manto (LCM): elevada sensibilidad a mitoxantrona en casos con genes de respuesta a daño a DNA funcionales.El LCM es un síndrome linfoproliferativo agresivo y altamente resistente a las terapias actuales. Al estudiar el efecto citotóxico de la fludarabina, la mitoxantrona y la ciclofosfamida sobre células primarias de LCM y sobre células de líneas celulares portadoras de la t(11;14)(q13;q32) se demuestra que la mitoxantrona, un inhibidor de la topoisomerasa II, ejerce el mayor efecto citotóxico. Además, la variante blástica es más sensible a la mitoxantrona que la variante típica posiblemente debido a los elevados niveles de expresión de la topoisomerasa-II-alfa en los casos blásticos. La citotoxicidad inducida por estos fármacos genotóxicos está mediada por la activación de la vía apotótica mitocondrial debido a un daño en el DNA, por lo que es necesario que los sensores de daño a DNA, p53 y/o ATM, sean funcionales.Artículo 2. La expresión del transportador equilibrativo de nucleósidos-2 (hENT2) correlaciona con la sensibilidad ex vivo a la fludarabina en células de leucemia linfática crónica-B (LLC-B).El efecto de la fludarabina sobre células de LLC-B viene determinado, en primera instancia, por el transporte vía hENT2, atribuyéndole importancia, por primera vez, en el efecto terapéutico de un análogo de nucleósidos. La expresión de este transportador correlaciona significativamente con el efecto citotóxico inducido por la fludarabina en células de LLC-B.Artículo 3. La expresión del transportador equilibrativo hENT1 correlaciona con el transporte de gemcitabina y la citotoxicidad in vitro del fármaco en células de linfoma de células del manto (LCM).Sin embargo, las células de LCM, que no responden in vitro a la fludarabina, expresan niveles más altos de mRNA y de proteína de hENT1 que de hENT2. Esta expresión diferencial podría explicar la diferente respuesta a la fludarabina entre células de LCM y LLC-B. La gemcitabina, fármaco transportado mayoritariamente por hENT1, induce un efecto citotóxico sobre células de LCM a dosis inferiores a las necesarias de fludarabina para ejercer el mismo efecto, lo que nos sugiere que el análisis de la expresión de transportadores de nucleósidos en las células de LLC-B y LCM resulta útil para la elección del tratamiento a seguir y posiblemente para predecir la respuesta al tratamiento.Artículo 4. La pérdida de expresión de MTAP en el linfoma de células del manto está asociada a una corta supervivencia. Implicación para una posible terapia dirigida.Los casos de LCM que presentan deleción del gen MTAP y pérdida de expresión de la proteína se asocian a una mayor agresividad de la enfermedad y peor pronóstico. Este fenómeno se debe, muy probablemente, a la estrecha relación entre el gen MTAP y el locus INK4a-ARF en este tipo de tumores, lo que sugiere que la detección inmunohistoquímica de MTAP puede ser un buen marcador de la pérdida de todo el locus. Además, el análisis de la expresión de MTAP puede ser una buena herramienta para identificar aquellos pacientes que podrían beneficiarse de una terapia dirigida mediante la inhibición de la vía de síntesis de novo de AMP. Nuestros resultados apoyan la idea del uso de la combinación de L-alanosina y EFA como tratamiento de esos casos con deleción de MTAP. / In this study we have analyzed the mechanisms of drug-induced cell death in four cell lines with the t(11;14) and in primary cells from 10 patients with MCL. Mitoxantrone, a topoisomerase II inhibitor, induced a strong cytotoxic effect in three cell lines (JVM-2, REC-1, and Granta 519), as well as in primary MCL cells. This cytotoxic effect due to apoptosis induction was observed despite the presence of either p53 or ATM abnormalities. However, no cytotoxic effect was detected after incubation with DNA damaging agents in the NCEB-1 cell line carrying p53 and ATM alterations, despite the presence of a functional mitochondrial machinery. These results support that mitoxantrone can be effective in the treatment of MCL but that this activity requires the integrity of functional DNA-damage response genes. Fludarabine is considered the treatment of choice for most patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL). We have analyzed the role of plasma membrane transporters in nucleoside-derived drug bioavailability and action in CLL cells. In this study, we have observed a significant correlation between the expression of hENT2 by Western blot and fludarabine uptake via hENT carriers and also with ex vivo sensitivity of CLL cells to fludarabine. These results suggest that the equilibrative nucleoside transporter hENT2 plays a role in fludarabine responsiveness in CLL patients.MCL cells express high levels of hENT1 protein compared to CLL cells, and a good correlation was found between protein and mRNA levels of hENT1, thus indirectly suggesting that hENT1 might be transcriptionally regulated in MCL cells. More importantly, a significant correlation between these two parameters, drug uptake and sensitivity to gemcitabine was also observed. These results further support that NTs are implicated in the therapeutic response to nucleoside analogues, and suggest a particular and novel role for hENT1 in the genotoxic response to selected nucleoside analogues, such as gemcitabine, in MCL cells. In this study we have determined the methylthioadenosine phosphorylase (MTAP) gene alterations in MCL and investigated whether the targeted inactivation of the alternative de novo AMP synthesis pathway may be an useful therapeutic strategy in tumors with inactivation of this enzyme. MTAP gene deletion and protein expression correlated with clinical behavior. L-alanosine induced cytotoxicity in MCL cells. 9-beta-D-Erythrofuranosyl adenine (EFA), an analogue of MTA, selectively rescued MTAP positive cells from Lalanosine toxicity. MTAP gene deletion and lack of protein expression are associated with poor prognosis in MCL and might identify patients who might benefit from treatment with "de novo" AMP synthesis pathway targeted therapies.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000437983-Texto+Completo-0.pdf: 3242745 bytes, checksum: 9b67fa711fdfe3bdd518bb49b3f07fc0 (MD5) Previous issue date: 2012 / This study was designed to characterize, by means of functional and molecular approaches, the relevance of kinin B1 and B2 receptors in bladder cancer. Our data clearly shows that both B1 des-Arg9-BK and B2 BK receptor agonists were able to stimulate the proliferation of the grade 3-derived bladder cancer T24 cells. Furthermore, the incubation of B1 and B2 receptor antagonists, SSR240612 and HOE140, respectively, markedly inhibited the proliferation rate of T24 cells. In contrast, only higher concentrations of BK elicited the proliferation of the grade 1 bladder cancer cell line RT4, while des-Arg9-BK incubation completely failed to induce its proliferation. Interestingly, real time PCR experiments revealed that mRNA expression of B2, and mainly B1 receptors was found superior in T24 cells, in comparison to the low malignity grade RT4 cells. Furthermore, data obtained using bladder cancer human biopsies revealed that B1 receptor expression was visibly increased in all tumoral samples or under chronic inflammation of bladder. Concerning the signaling pathways related to the mitogenic effects of kinins, we bring novel evidence showing that pharmacological inhibition of PI3Kg with AS252424 concentration-dependently reduced T24 cell proliferation induced by BK or des-Arg9-BK. Finally, the incubation of T24 cells with kinin agonists led to a marked activation of PI3K/AKT and ERK 1/2 signaling pathways, whereas p38 MAP kinase remained unaffected. Our results indicate that kinin B2, and especially B1 receptors appear to be implicated in bladder cancer progression. It is tempting to suggest that selective kinin antagonists might represent potential therapeutic alternatives for bladder cancer control. / O presente estudo teve por objetivo caracterizar, através de abordagens funcionais e moleculares, a relevância dos receptores B1 e B2 para as cininas no câncer de bexiga. Os dados obtidos mostraram que tanto o agonista dos receptores B1, des- Arg9-BK, quanto do receptor B2, BK, foram capazes de estimular a proliferação das células de câncer de bexiga grau 3, denominadas T24. Além disso, a incubação dos antagonistas dos receptores B1 e B2, SSR240612 e HOE140, respectivamente, inibiram acentuadamente a proliferação das células T24. Por outro lado, apenas maiores concentrações de BK levaram à proliferação das células de câncer de bexiga grau 1 RT4; enquanto a incubação com des-Arg9-BK não induziu sua proliferação. De maneira similar, os resultados revelaram que a expressão de mRNA dos receptores B2 e, principalmente, dos receptores B1 foi superior em células T24, em comparação com as células RT4, que apresentam baixo grau de malignidade. Além disso, os dados obtidos com biópsias de câncer de bexiga humano revelaram que a expressão do receptor B1 foi claramente maior em todas as amostras tumorais ou, em uma biópsia obtida de um quadro de inflamação crônica de bexiga. Em relação às vias de sinalização relacionadas com os efeitos mitogênicos das cininas, os dados obtidos mostram que a inibição farmacológica da PI3Kg com AS252424 reduziu de maneira concentração-dependente a proliferação das células T24, quando está foi induzida por BK ou des-Arg9-BK. Finalmente, a incubação das células T24 com agonistas dos receptores de cininas produziu uma acentuada ativação das vias de sinalização PI3K/AKT e ERK 1/2, enquanto a via p38 MAP quinase permaneceu inalterada. Nossos resultados indicam que os receptores de cininas B2 e, especialmente, os receptores B1 parecem estar associados com a progressão do câncer de bexiga. Dessa forma, é possível sugerir que antagonistas seletivos de receptores de cininas poderiam representar alternativas terapêuticas interessantes para o controle do câncer de bexiga.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000434470-Texto+Completo-0.pdf: 6587349 bytes, checksum: 405b1e4ec3fc9ec1beb9e4856acacdf7 (MD5) Previous issue date: 2011 / Approximately one-third of the world’s population is infected with Mycobacterium tuberculosis, the aetiological agent of human tuberculosis (TB). As global incidence of drug-resistance constantly increases, the urgent need for developing new anti-TB drugs and vaccines becomes more evident. Component enzymes of fundamental metabolic pathways seem to be attractive as define molecular targets. Guanosine monophosphate synthase (GMPS), a G-type amidotransferase, catalyzes the amination of xanthosine monophosphate (XMP) to guanosine monophosphate (GMP) in a reaction that occurs in two domains, the glutamine amidotransferase and the ATP pyrophosphatase, where it attacks a highly reactive adenyl-XMP intermediate, leading to GMP formation. The guaA (Rv3396c) gene, which codes for GMPS, was identified by sequence homology in the M. tuberculosis H37Rv genome. We evidenced that adenyl-XMP formation causes enzyme inhibition by increase of ATP and XMP levels. In addition, M. tuberculosis GMPS (MtGMPS) displays an allosteric behavior to XMP variation, demonstrating positive cooperativity and different kinetic aspects from that reported for human and Escherichia coli enzymes. The proposed ordered mechanism of substrates binding, which results in the release of pyrophosphate before binding ammonia showed to be the same to other GMPSs. Our results on MtGMPS might be useful to reveal its role in M. tuberculosis purine metabolism, providing knowledge for the development of new drugs and vaccines to treat and prevent TB, respectively. / Aproximadamente 1/3 da população mundial está infectada com o Mycobacterium tuberculosis, agente etiológico da tuberculose humana (TB). A incidência global e o constante aumento da resistência às drogas tornam evidente a urgente necessidade do desenvolvimento de novas drogas, para o tratamento, e vacinas, para a prevenção desta doença. As enzimas das vias metabólicas fundamentais são vistas como atrativos alvos moleculares definidos. A enzima guanosina monofosfato sintase (GMPS), uma amidotransferase do tipo G, catalisa a aminação da xantosina monofosfato (XMP) à guanosina monofosfato (GMP), em uma reação que ocorre em dois domínios, o glutamina amidotrasferase e o adenosina trifosfato (ATP) pirofosfatase, onde ocorre o ataque do intermediário altamente reativo adenil-XMP, levando a formação de GMP. O gene guaA (Rv3396c), o qual codifica a enzima GMPS, foi identificado por homologia de sequência no genoma de M. tuberculosis H37Rv. Nós evidenciamos que a formação do adenil-XMP causa uma inibição da enzima pelo aumento dos níveis de ATP e XMP. Além disso, a GMPS de M. tuberculosis (MtGMPS), apresentou um comportamento alostérico na variação dos níveis de XMP, demonstrando cooperatividade positiva e diferentes aspectos cinéticos dos já reportados para as enzimas de humanos e Escherichia coli. O mecanismo ping-pong foi proposto com base nos resultados evidenciados pela liberação de pirofosfato (PPi) depois da ligação da amônia, corroborando com os dados previamente publicados para outras GMPSs. Nossos resultados podem ser úteis por revelar o papel desta enzima no metabolismo de purinas do M. tuberculosis, fornecendo conhecimento para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas para o tratamento e prevenção, respectivamente.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000436876-Texto+Completo-0.pdf: 1707187 bytes, checksum: a5856afc9a54d87e34f88e782140d450 (MD5) Previous issue date: 2011 / Gliomas are the most common and devastating tumors of the central nervous system (CNS). Among the gliomas group, the GBM is the most prevalent, aggressive and deadly malignant. Many pieces of evidence point out the relevance of natural compounds for cancer therapy and prevention, including chalcones. Chalcones are group of natural precursors of flavonoid and display a wide variety of biological and pharmacological proprieties that include anti-proliferative and anti-cancer activities. This study aimed at evaluating the in vitro anti-proliferative activity and cell viability inhibition of nine quinoxaline derived chalcones, structurally based on the selective PI3Ky inhibitor AS605240. These synthetic compounds were tested at different time-periods of incubation (24, 48 e 72 h) and concentrations (0,1; 0,1; 1; 5 e 10 μg/mL) in glioma cell lines from human and rat origin (U-138 MG and C6, respectively).The results showed by MTT assay and cell couting revealed that four chalcones (compounds N2, N9, N10 and N12), displayed higher efficacies and potencies, being able to inhibit either cell proliferation or viability, in a time- and concentration dependent manner. These four compounds which present methoxy groups at A-ring and their efficacy was greater than that seen for the positive control compound AS605240. Flow cytometry analysis demonstrated that incubation of C6 cells with chalcone N9 led to G1 phase arrest, likely indicating an interference with apoptosis. Furthermore, chalcone N9 was able to visibly inhibit AKT activation, allied to the stimulation of ERK 1/2 MAP-kinase. The chalcones tested herein, especially those displaying a methoxy substituent at A-ring, might well represent promising molecules for the treatment of gliomas. / Os gliomas são os tumores do SNC mais comuns e devastadores. Dentre os gliomas, o GBM é o mais prevalente, agressivo, maligno e apresenta um mau prognóstico. A relevância dos compostos naturais, incluindo as chalconas, no tratamento e na prevenção do câncer está sendo muito evidenciada. As chalconas formam um grupo de compostos naturais derivados dos flavonóides que apresentam diferentes propriedades biológicas e farmacológicas, incluindo as atividades anti-proliferativas e anti-tumorais. O objetivo deste estudo foi avaliar a ação anti-proliferativa e a capacidade de inibição da viabilidade celular in vitro de nove chalconas derivadas da quinoxalina, baseadas estruturalmente no inibidor seletivo de PI3Ky, o AS605240. Estes compostos sintéticos foram testados em diferentes tempos de incubação (24, 48 e 72 h) e concentrações (0,1; 0,1; 1; 5 e 10 μg/mL) em linhagens de glioma humano e de rato (U-138 MG e C6, respectivamente). Os resultados observados nos experimentos de MTT e na contagem celular revelaram que quatros chalconas (compostos N2, N9, N10 e N12), apresentaram grande eficácia e potência, sendo capazes de inibir a proliferação e a viabilidade celular, de maneira tempo e concentração dependente. Estes quatro compostos que possuem radicais metóxi no anel A de sua estrutura demonstraram uma eficácia superior àquela do composto AS605240, usado como controle positivo. Os resultados da citometria de fluxo demonstraram que a incubação das células C6 com a chalcona N9 levaram a um bloqueio celular na fase G1, possivelmente indicando interferência com a apoptose. Além disto, a chalcona N9 foi capaz de inibir visivelmente a ativação da AKT, aliada à estimulação de ERK 1/2 MAP-quinase. As chalconas estudadas neste projeto, especialmente as que apresentam o radical metoxi no anel A, representam promissoras moléculas para o tratamento dos gliomas.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-23Bitstream added on 2014-06-13T20:53:14Z : No. of bitstreams: 1 kiguti_lra_me_botib.pdf: 1147680 bytes, checksum: 2af4ebdd84a8cedf1deef8d15145e30a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A ejaculação precoce é a disfunção sexual masculina com maiores taxas de incidência e prevalência. De etiologia complexa, as principais abordagens farmacológicas desta condição têm sido a utilização de anestésicos locais, inibidores seletivos da recaptura de serotonina e mais recentemente, inibidores da fosfodiesterase tipo 5. O reflexo ejaculatório é um processo altamente organizado com a interação de áreas centrais encefálicas e espinhais, centros autonômicos simpáticos e parasimpáticos além de reflexos somáticos. O sistema nervoso autônomo simpático, através da ativação de adrenoceptores 1 ( 1-ARs), particularmente o subtipo 1A, desempenha papel fundamental na fase de emissão do reflexo ejaculatório através da modulação da contratilidade de órgãos como o ducto deferente, vesícula seminal e próstata. Além disso, a participação do influxo de cálcio extracelular via canais de cálcio dependentes de voltagem tipo L (canais de cálcio tipo L) na atividade contrátil destes órgãos é bem caracterizada. Devido à importância dos 1-ARs e canais tipo L no reflexo ejaculatório, este trabalho avaliou a eficácia do antagonista de 1-ARs Tamsulosin e das diidropiridinas bloqueadoras de canais de cálcio Nifedipina e (S)-(+)-Niguldipina no retardo da ejaculação em ratos. Os resultados obtidos demonstram que a atividade contrátil do ducto deferente e vesícula seminal ao estímulo adrenérgico via ativação de 1-ARs in vitro é fortemente inibida pelo antagonista de 1-ARs Tamsulosin e pelas bloqueadoras de canais de cálcio Nifedipina e (S)-(+)-Niguldipina. Entretanto, embora a contração destes órgãos e, portanto, a fase de emissão do reflexo ejaculatório tenha sido afetada, a latência ejaculatória dos animais não foi alterada. Estes resultados indicam que o bloqueio de canais de cálcio tipo L ou o antagonismo de 1-ARs no ducto deferente... / Premature ejaculation is one of the most common male sexual dysfunctions. With complex aetiology, the main pharmacological approaches involve local anesthetics, selective serotonin reuptake inhibitors and, more recently, phosphodiesterase 5 inhibitors. The sympathetic nervous system plays a crucial role in the ejaculation, controlling vasa deferentia, seminal vesicles and prostate contraction through 1- adrenoceptor ( 1-AR) activation. In addition, the contractions of these organs are dependent on influx of extracellular calcium through L-type voltage-dependent calcium channels (L-type calcium channels). Due to the involvement of 1-ARs and L-type calcium channels in the ejaculatory reflex, this dissertation evaluated the efficacy of the 1-AR antagonist Tamsulosin and of dihydropyridine calcium channel blockers Nifedipine and (S)-(+)-Niguldipine in the delay of ejaculation in rats. The results showed that the vas deferens and seminal vesicle contraction in response to 1-AR activation is potently inhibited by Tamsulosin, Nifedipine and (S)-(+)- Niguldipine. However, although vas deferens and seminal vesicles contractions have been inhibited, the ejaculatory latency in vivo was not affected. These results show that although L-type calcium channel blockade and 1-ARs antagonism in the vas deferens and seminal vesicle are effective in the inhibition of events related to the seminal emission phase of ejaculation, they are not able to delay the ejaculation. The present results indicate that modulation of contractions of organs involved in seminal emission is not a suitable strategy to retard of ejaculation

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-17Bitstream added on 2014-06-13T20:23:03Z : No. of bitstreams: 1 satrapa_ra_dr_botib.pdf: 444664 bytes, checksum: ea4f185d0abddba64ab9a9ce073f5407 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A fim de melhor compreender as diferenças entre zebuínos e taurinos em relação à resistência ao estresse térmico (ET), objetivou-se com o presente trabalho: (1) verificar se a adição de IGF-I ao meio de cultivo, na ausência de Soro Fetal Bovino (SFB), seria capaz de manter as taxas de produção embrionária semelhantes àquelas obtidas em meio de cultivo com SFB; (2) verificar se a adição de IGF-I ao meio de cultivo é mais eficiente em diminuir os efeitos deletérios do ET em embriões da raça Holandesa preto e branco (HPB) quando comparados aos da raça Nelore; (3) verificar se o efeito deletério do ET no desenvolvimento embrionário e na taxa de apoptose é mais acentuado em embriões da raça HPB, quando comparado aos da raça Nelore. No experimento 1, oócitos de vacas aneloradas oriundas de matadouro foram maturados, fertilizados com sêmen de touros da raça Nelore e, 10 horas pós inseminação (hpi), os embriões foram distribuídos ao acaso em quatro grupos, de acordo com a composição do meio de cultivo: SFB (5% de SFB + 0 ng/mL de IGF-I; n=165); IGF (0% de SFB + 51 100 ng/mL de IGF-I; n=163); SFB+IGF (5% de SFB + 100 ng/mL de IGF; n=169) e controle (0% de SFB + 0 ng/mL de IGF-I; n=168). Foram avaliadas as taxas de clivagem, mórula, blastocisto e blastocisto eclodido. Nos experimentos 2 e 3, oócitos de vacas Nelore e HPB oriundas de matadouro foram maturados em meio TCM 199, fertilizados com sêmen de touros das raças Nelore (n=6) e HPB (n=6), respectivamente, e cultivados em meio SOF (synthetic oviduct fluid, na ausência de SFB) até o estágio de blastocisto. Dadas 10 hpi, os embriões foram distribuídos ao acaso em quatro grupos: controle (cultivados na ausência de IGF a 39 oC); ET (cultivados na ausência de IGF e expostos a 41 oC, 96 hpi, por 9 horas, retornando a seguir para 39 oC); IGF (cultivados na presença de IGF a 39 oC) e ET/IGF (IGF e ET). No... / Not available

Made available in DSpace on 2016-06-02T12:30:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000478920-Texto+Completo-0.pdf: 4958315 bytes, checksum: 38858f11b57077cc60813c0fa01390dd (MD5) Previous issue date: 2016 / The gastrin-releasing peptide (GRP) and its receptor (GRPR) were recently identified as specific components of pruritus, suggesting an important pharmacological potential for this system; however, the mechanisms underlying GRP/GRPR activity remain undefined. Herein, we evaluated GRPR localization and downstream signaling pathways. Our data show that GRP directly activates small-size capsaicin-sensitive DRG neurons, an effect that translates into transient calcium flux and membrane depolarization. Expression profile revealed that PI3KΎ is downstream of the GRP/GRPR axis, observed by GRP-induced Akt phosphorylation in ex vivo naive mouse spinal cords and in GRPR transiently expressing HEK293 cells. However, ex vivo mouse spinal cord stimulation by GRP failed to induce the activation of MAP-kinases, namely ERK 1/2 and p38. Intrathecal GRP administration led to intense scratching behavior, an effect significantly reduced by either GRPR antagonism or the PI3KΎ inhibition. We assessed whether the GRP/GRPR system is involved in chronic itching using the dry skin model and found that GRPR blockade or PI3KΎ inhibition reversed the scratching. We also found that p-Akt and GRPR are co-expressed in the spinal cord and in DRG neurons from dry skin mice, and that p-Akt levels are increased in these animals, an effect prevented by GRPR blockade. The intradermal injection of GRP also triggers scratching behavior, which was significantly decreased after treatment with PI3KΎ inhibitor. The itching response was also induced by the intrathecal injection of an Akt activator. Altogether, these findings are highly suggestive that GRPR is expressed by the peripheral and central terminals of DRG nociceptive afferents, which transmit itch via the PI3KΎ/Akt pathway. / O peptídeo liberador de gastrina (GRP) e seu receptor (GRPR) foram recentemente identificados como componentes específicos do prurido, com importante potencial farmacológico; no entanto, os mecanismos intracelulares que medeiam a atividade do sistema GRP/GRPR permanecem desconhecidos. O presente estudo avaliou a localização do GRPR e as vias de sinalização downstream ativadas por este receptor. Os dados obtidos mostram que o GRP ativa diretamente neurônios de pequeno diâmetro do DRG, sensíveis a capsaicina, um efeito demonstrado pelo fluxo transitório de cálcio e pela despolarização da membrana. O perfil de expressão observado sugere que a PI3KΎ é ativada downstream ao sistema GRP/GRPR, como indicado pela fosforilação de Akt (marcador de atividade de PI3KΎ) induzida por GRP, em medulas de camundongos ex vivo e, em células HEK293 transfectadas com GRPR. Contudo, a aplicação de GRP em medulas de camundongos, ex vivo, não parece depender da ativação das MAP-quinases, ERK1/2 ou p38. A injeção intratecal de GRP leva a um comportamento de coçar intenso, que é significativamente reduzido por antagonistas de GRPR ou pela inibição farmacológica de PI3KΎ.Para avaliar se o sistema GRP/GRPR estaria envolvido no prurido crônico, foi empregado o modelo de pele seca em camundongos. Neste paradigma experimental, o bloqueio de GRPR ou de PI3KΎ reverteu o comportamento de coçar. Os dados obtidos também mostram que p-Akt e GRPR estão co-localizados na medula espinhal e em neurônios do DRG de animais com pele seca e, que os níveis de p-Akt estão aumentados nesses animais, um efeito que foi prevenido pelo bloqueio de GRPR. A injeção intradérmica de GRP também induziu o comportamento de coçar, que foi significativamente reduzido após o tratamento com inibidor de PI3KΎ. Finalmente, foi demonstrado que a injeção intratecal de um ativador de Akt foi capaz de induzir coceira em camundongos. O conjunto de resultados obtidos sugere que o GRPR é expresso por terminais periféricos e centrais de neurônios nociceptivos do DRG, transmitindo o prurido através da ativação da via PI3KΎ/Akt.

Made available in DSpace on 2014-06-11T02:02:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000458593-Texto+Completo-0.pdf: 1436191 bytes, checksum: b126309dee58688d2fe23cb45be67db7 (MD5) Previous issue date: 2014 / The purinergic system can induce proliferation, differentiation and death on tumor cells. Different P2 purinergic receptors are involved in preventing the growth of these cells. Although the mechanisms are not completely known, they may represent interesting therapeutic targets to control tumors. The RT4 and T24 human tumor bladder cell lines have been used as low and high cancer malignancy phenotype models, respectively. Our research group has demonstrated that quercetin increases the ADP hydrolysis and inhibits ecto-5'-nucleotidase/ CD73, exerting an anti-proliferative effect on T24 cell lines. We also demonstrate that T24 cell lines expresses the purinergic enzymes CD39L4 and ecto-5'-nucleotidase / CD73, and have low hydrolytic activity of ATPase and ADPase in contrast to a high activity AMPase. These data suggest the involvement of the enzymes and purinergic receptors on progression the tumor of the bladder, as well as other tumor types.The objective of the present study was characterize the purinergic receptors P2X (1-7) expression profile on human bladder tumor cell lines and biopsies; and investigate the inflammatory genes that are up-regulated on high-grade human tumor bladder cells compared to low grade tumor bladder cells. Human bladder cells RT4 and T24 were obtained from the ATCC. Cells were cultured in DMEN and RPMI, respectively, supplemented with 10% of fetal bovine serum (FBS), under ideal conditions of cultivation Data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey–Kramer test. To confirm the relevance of P2X (1-7) receptors in bladder cancer, we have also assessed their expression in human biopsies. For this purpose, upon approval by the local ethics committee, specimens of bladder tumors and normal tissues were obtained from the same patients, who have been undergone surgical resection at the Hospital São Lucas/PUCRS. All samples were collected and rapidly frozen in -80ºC with RNA holder.Tissue specimens were ground and then sonicated in a TRIzol kit. The mRNA level was analyzed using RT-PCR analysis. Real-time PCR revealed that the mRNA expression of P2X purinergic receptors, particulary P2X4R was significantly up-regulated on both T24 and RT4 cell lines. Data from human bladder tumor biopsies comparing to bladder normal tissue, showed that P2X6 and P2X7 receptors appeared to be most often up-regulated on tumor tissues. Twelve inflammation related genes, CCL2, CCR2, TNF-α, MAPK3, IL-1β, IL-6, ADORA1, CD200, CD4, CHRNA4, EDNRA e ITGB2 were significantly up-regulated on the grade III bladder tumor cell line T24 when compared to grade I bladder tumor cell line RT4. Our results indicate that the inflammation genes overexpressed may play an important role in regulating urinary bladder cancer. We can conclude that P2X purinoreceptors and inflammation genes are differentially distributed among normal bladder, low and high tumor bladder, which could contribute to the different characteristics of these different types of cells. / O sistema purinérgico pode induzir a proliferação, diferenciação e morte em células tumorais. Diferentes receptores purinérgicos P2, estão envolvidos na inibição do crescimento tumoral. Embora os mecanismos não sejam completamente conhecidos, estes receptores podem representar alvos terapêuticos interessantes no tumor de bexiga. As linhagens celulares derivadas de tumor de bexiga humano RT4 e T24 têm sido usadas como modelo de baixa e alta malignidade de tumor, respectivamente. Estudos realizados pelo nosso grupo de pesquisa têm demonstrado o envolvimento do sistema purinérgico no tumor de bexiga. A quercetina aumenta a hidrólise do ADP e inibe a ecto - 5' - nucleotidase / CD73, exercendo um efeito anti - proliferativo sobre as células T24. Também demonstramos que as linhagens de células T24 expressam enzimas CD39L4 e ecto - 5' - nucleotidase / CD73, e têm baixa atividade hidrolítica de ATPase e ADPásica com uma elevada atividade AMPásica. Estes dados sugerem o envolvimento das enzimas e receptores purinérgicos na progressão do tumor de bexiga, bem como em outros tipos de tumor. O objetivo do estudo é caracterizar a expressão dos receptores purinérgicos P2X (1-7) em biópsias de câncer de bexiga e linhagens celulares de tumor de bexiga humano, relacionado com o perfil de genes inflamatórios mais expressos nestas amostras.Metodologia: As linhagens celulares de bexiga humanas RT4 e T24 foram obtidas a partir da ATCC. As células foram cultivadas em meio RPMI e DMEN, respectivamente, suplementado com 10 % de soro fetal bovino (SFB), sob condições ideais de cultivo. Para confirmar a relevância dos receptores P2X (1-7) no tumor de bexiga, avaliou-se a expressão em biópsias humanas. Para isso, após aprovação pelo comitê de ética local, amostras de tecidos normais e tumorais de bexiga foram obtidas dos mesmos pacientes, submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital São Lucas / PUCRS. O RNA total dos tecidos foi isolado utilizando kit TRIzol . O nível de mRNA foi analisado utilizando análise RT - PCR .Resultados: O PCR em tempo real revelou que a expressão de mRNA de receptores purinérgicos P2X, particularmente P2X4R foi significativamente up- regulada em ambas linhagens RT4 e T24. Dados a partir de biópsias de tumores de bexiga humanos que comparam os resultados de expressão do tecido tumoral em relação ao tecido normal de bexiga, demonstrou que os receptores de P2X6 e P2X7 estão superexpressos em tecidos tumorais. Doze genes relacionados com a inflamação, CCL2, CCR2, TNF-α, MAPK3, IL-1β, IL-6, ADORA1, CD200, CD4, CHRNA4, EDNRA e ITGB2 foram significativamente superexpressos em células T24 derivadas de tumor de grau III quando comparadas com as células RT4 derivadas de tumor de grau I. Nossos resultados indicam que os genes superexpressos de inflamação podem desempenhar um papel importante na regulação do tumor de bexiga urinária. Conclusão: Podemos concluir que purinoreceptores P2X e os genes inflamatórios são diferencialmente distribuídos entre bexiga normal e tumoral, o que pode contribuir para as diferentes características destes diferentes tipos de tumores.