This decade saw the development of new high-end light microscopy approaches. These technologies are increasingly used to expand our understanding of cellular function and the molecular mechanisms of life and disease. The precision of state-of-the-art super resolution microscopy is limited by the properties of the applied fluorescent label. Here I describe the synthesis and evaluation of new functional fluorescent probes that specifically stain gephyrin, universal marker of the neuronal inhibitory post-synapse. Selected probe precursor peptides were synthesised using solid phase peptide synthesis and conjugated with selected super resolution capable fluorescent dyes. Identity and purity were defined using chromatography and mass spectrometric methods. To probe the target specificity of the resulting probe variants in cellular context, a high-throughput assay was established. The established semi-automated and parallel workflow was used for the evaluation of three selected probes by defining their co-localization with the expressed fluorescent target protein. My work provided NN1Dc and established the probe as a visualisation tool for essentially background-free visualisation of the synaptic marker protein gephyrin in a cellular context. Furthermore, NN1DA became part of a toolbox for studying the inhibitory synapse ultrastructure and brain connectivity and turned out useful for the development of a label-free, high-throughput protein interaction quantification assay. / Neuentwickelte, hochauflösende Fluoreszenzmikroskopieverfahren sind prinzipiell geeignet, molekulare Mechanismen und zelluläre Vorgänge im niedrigen Nanometerbereich aufzulösen. Die maximal erreichbare Auflösung wird unter anderem von der eingesetzten Fluoreszenzmarkierung beeinflusst. In dieser Arbeit beschreibe ich die Synthese neuartiger, funktioneller, fluoreszierender Proben und evaluiere deren Eigenschaft Gephyrin, einen universalen Marker der neuronalen inhibitorischen Postsynapse, zu visualisieren. Hierzu wurden Peptide mittels Festphasenpeptidsyntese hergestellt und mit fluoreszierenden Farbstoffen konjugiert, die für hochauflösende Mikroskopieverfahren geeignet sind. Der Syntheseerfolg und die Reinheit der Stoffe wurde mittels massenspektrometrischer und chromatographischer Methoden bestimmt. In einem Hochdurchsatzverfahren wurden die Proben in einem zellulären Kontext untersucht, spezifisch Gephyrin zu markieren. In einem semi-automatisierten, parallelen Verfahren wurden drei ausgewählte Proben synthetisiert und deren Kolokalisation mit dem fluoreszierenden Zielprotein in transfizierten HEK-Zellen untersucht. Aus dieser Arbeit ist NN1DC hervorgegangen, eine peptidische Sonde zur Visualisierung von Gephyrin. Diese Probe weist verbesserte Färbeeigenschaften wie eine höhere Spezifität und Sensitivität, verglichen mit bisher bekannten peptidischen Gephyrinsonden, auf. Darüber hinaus kann NN1DA als hochaffiner Binder von Gephyrin zur Entwicklung neuer gephyrinbindender Moleküle in einem high-througput Verfahren genutzt werden.

This thesis includes measurements that were recorded by cooperation partners. The EPR spec‐ trosa mentioned in section 5.2 were recorded by Michael Auth from the Dyakonov Group (Ex‐ perimental Physics VI, Julius‐Maximilians‐Universität, Würzburg). The TREFISH experiments and transient absorption in section 5.4 spectra were performed by Jašinskas et al. from the V. Gulbi‐ nas group (Center for Physical Sciences and Technology, Vilnius, Lithuania). This dissertation investigated the interactions of semiconducting single‐walled carbon nanotubes (SWNTs) of (6,5) chirality with their environment. Shear‐mixing provided high‐quality SWNT sus‐ pensions, which was complemented by various film preparation techniques. These techniques were in turn used to prepare heterostructures with MoS2 and hBN, which were examined with a newly constructed photoluminescence microscope specifically for this purpose. Finally, the change of spectral properties of SWNTs upon doping was investigated in more detail, as well as the behaviour of charge carriers in the tubes themselves. To optimise the SWNT sample preparation techniques that supplied the other experiments, the sample quality of shear‐mixed preparations was compared with that of sonicated samples. It was found that the quantum efficiency of sheared suspensions exceeds that of sonicated suspensions as soon as the sonication time exceeds 30 min. The higher PLQY is due to the lower defect concentration in shear‐mixed samples. Via transient absorption, a mean lifetime of 17.3 ps and a mean distance between defects of 192.1 nm could be determined. Furthermore, it was found that the increased efficiency of horn sonication is probably not only due to higher shear forces acting on the SWNT bundles but also that the shortening of PFO‐BPy strands plays a significant role. Sonication of very long polymer strands significantly increased their effectiveness in shear mixing. While previous approaches could only achieve very low concentrations of SWNTs in suspensions, pre‐sonicated polymer yielded results which were comparable with much shorter PFO‐BPy batches. Reference experiments also showed that different aggregation processes are relevant during production and further processing. Initial reprocessing of carbon nanotube raw material requires 7 h sonication time and over 24 h shear mixing before no increase in carbon nano concentration is detectable. However, only a few minutes of sonication or shear mixing are required when reprocessing the residue produced during the separation of the slurry. This discrepancy indicates that different aggregates are present, with markedly different aggregation properties. To study low‐dimensional heterostructures, a PL microscope was set up with the ability to ob‐ serve single SWNTs as well as monolayers of other low‐dimensional systems. Furthermore, sam‐ ples were prepared which bring single SWNTs into contact with 2D materials such as h‐BN andMoS2 layers and the changes in the photoluminescence spectrum were documented. For h‐BN, it was observed whether previous methods for depositing SWNTs could be transferred for photo‐ luminescence spectroscopy. SWNTs were successfully deposited on monolayers via a modified drip coating, with the limitation that SWNTs aggregate more at the edges of the monolayers. Upon contact of SWNTs with MoS2, significant changes in the emission properties of the mono‐ layers were observed. The fluorescence, which was mainly dominated by excitons, was shifted towards trion emission. Reference experiments excluded PFO‐BPy and toluene as potential causes. Based on the change in the emission behaviour of MoS2, the most plausible explanation is a photoinduced charge transfer leading to delocalised charge carriers on MoS2. In contrast, on SWNTs, the introduction of additional charges would constitute a quenching centre, which would quench their PL emission, making them undetectable in the PL image. In the last chapter, the electronic properties of doped SWNTs and the behaviour of charge carri‐ ers inside the tubes should be investigated. First, the change in the conductivity of SWNT films with increasing doping levels was docu‐ mented. The resistance of the films drops drastically at minimum doping. After the initial in‐ troduction of charges, the resistance drops with increasing dopant concentration according to a double logarithmic curve. The initial drop could be due to a reduction of contact resistances within the SWNT network film, but this could not be further investigated within the scope of this PhD thesis. In cooperation with Andreas Sperlich and Michael Auth, the spin concentration of SWNTs at different doping levels was determined. The obtained concentrations were compared with the carrier concentrations determined from PL and absorption spectra. At low spin densities, good agreement with previous models was found. Furthermore, the presence of isolated spins strongly suggests a localised charge carrier distribution at temperatures around 10 K. When the charge density is increased, the spin density deviates significantly from the charge carrier con‐ centration. This discrepancy is attributed to the increasing delocalisation of charge carriers at high charge densities and the interactions of neighbouring spins. These results strongly indicate the existence of localised charge carriers in SWNTs at low temperatures. Next, the effect of doping on the Raman spectra of SWNT suspensions was investigated. In gen‐ eral, doping is expected to reduce the intensity of the Raman bands, i.e. a consequence of the reduced resonance gain due to bleaching of the S2 transition. However, similar to the resistivity measurements, the oscillator strength of the G+ band drops sharply in the first doping steps. It was also found that the G+ band decreases more than would be expected due to loss of reso‐ nance condition. Furthermore, the G‐ is bleached faster than the G+ band. All these anomalies suggest that resonance enhancement is not the only relevant effect. Another much faster deac‐ tivation path for the excitons may be introduced by doping. This would leave less time for the scattering process to occur and reduce the oscillator strength of the Raman bands. In cooperation with Vidmantas et al., the photoinduced charge carrier behaviour of SWNT/PCBM films was investigated. The required films were prepared by drop coating. The SWNT suspen‐ sions required for this were obtained from sheared SWNT preparations. Using transient absorp‐ tion and TREFISH, a number of charge transfer effects were identified and their dynamics in‐ vestigated: the recombination of neutral excitons (< 50 ps), the electron transfer from carbon nanotubes to PCBM molecules (< 1 ps), the decay of charge‐transfer excitons (∼200 ps), the recombination of charge carriers between charge‐transfer excitons (1 ns to 4 ns) and finally the propagation through the SWNT network (∼20 ns) / Diese Arbeit beinhaltet Messungen, die von Kooperationspartnern durchgeführt wurden. Die in Abschnitt 5.2 erwähnten EPR‐Spektren wurden von Michael Auth aufgenommen. Die TREFISH‐ Experimente und die transiente Absorption im Abschnitt 5.4‐Spektren wurden von Jašinskas et al. durchgeführt. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Wechselwirkungen von halbleitenden, einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (SWNTs) der (6,5) Chiralität mit ihrer Umgebung untersucht. Dies wurde durch Einsatz von Schermischen als Präparationsmethode, sowie einer Reihe von Filmpräpa‐ rationstechniken ermöglicht. Diese Techniken wurden wiederum eingesetzt, um Heterostruk‐ turen mit MoS2 und hBN herzustellen, welche mit einem eigens dafür aufgebauten Photolu‐ mineszenzmikroskop untersucht wurden. Schlussendlich wurde die Änderung der spektralen Eigenschaften von SWNTs bei Dotierung näher untersucht, ebenso wie das Verhalten von Ladungs‐ trägern in den Röhren selbst. Die EPR Spektren die im Abschnitt 5.2 aufgeführt sind wurden von Michael Auth aufgenommen. Die TREFISH Experimente und die dazugehörigen transienten Ab‐ sorptions Spektren wurde von Jašinskas et al. durchgeführt. Für die Herstellung der benötigten SWNT‐Proben wurde die Probenqualität von geschermis‐ chten Ansätzen mit deren von beschallten Proben verglichen. Dabei wurde festgestellt, dass die Quanteneffizienz von geschermischten die von beschallten deutlich übersteigt, sobald die Beschallungszeit 30 min überschreitet. Dies ist auf die geringere Defektkonzentration in gescher‐ mischten Proben zurückzuführen. Über transiente Absorption konnte eine mittlere Lebensdauer von 17.3 ps und ein mittlerer Abstand zwischen Defekten von 192.1 nm bestimmt werden. Ferner wurde festgestellt, dass die erhöhte Effizienz von Horn‐Beschallung wahrscheinlich nicht nur auf höhere Scherwirkung an den SWNT‐Bündeln liegt, sondern auch die Verkürzung von PFO‐ BPy Strängen eine erhebliche Rolle spielt. Die Beschallung von sehr langen Polymer‐Strängen hat deren Effektivität bei Schermischen deutlich erhöht. Während bei vorherigen Ansätzen nur sehr geringe Konzentration an SWNTs in Suspensionen erreicht werden könnten, konnte mit vor‐beschallten Polymer vergleichbare Ergebnisse wie mit wesentlich kürzeren PFO‐BPy Char‐ gen erreicht werden. Referenzexperimente zeigten außerdem, dass verschiedene Aggregation‐ sprozesse bei der Herstellung und Weiterverarbeitung relevant sind. Bei der initialen Aufar‐ beitung von Kohlenstoffnanorohr Rohmaterial sind 7 h Beschallungszeit und über 24 h Schermis‐ chen erforderlich, bevor keine Erhöhung der Kohlenstoffnano‐Konzentration mehr feststellbar ist. Bei Wiederaufarbeitung des bei der Abtrennung des Suspension entstandenen Rückstands sind allerdings nur wenige Minuten Beschallung oder Schermischen notwendig. Dies deutet darauf hin, dass grundlegend unterschiedliche Aggregate vorliegen, mit deutlich anderen Aggre‐ gationseigenschaften. Um nieder‐dimensionale Heterostrukturen zu untersuchen wurde ein PLE‐Mikroskop aufgebaut, mit der Fähigkeit einzelne SWNTs, sowie Monolagen andere nieder‐dimensionale Systeme zu un‐ tersuchen. Weiterhin wurde Proben hergestellt welche einzelne SWNTs mit 2D‐Materialien wie h‐BN und MoS2 Schichten in Kontakt bringen und der Änderungen im Photolumineszenz Spek‐ trum dokumentiert. Für h‐BN wurde beobachtet, ob bisherige Methoden zur Ablagerung von SWNTs für Photolumineszenz‐Spektroskopie übertragen werden können. Dabei wurde beobachtet, dass über eine modifizierte Tropfbeschichtung SWNTs auf Monolagen abgelagert werden kön‐ nen, mit der Einschränkung, dass an den Kanten der Monolagen SWNT verstärkt aggregieren. Bei Kontakt von SWNTs mit MoS2 wurden erhebliche Änderungen in den Emissionseigenschaften der Monolagen beobachtet. Die hauptsächlich von Exzitonen dominierte Fluoreszenz wurde hin zu Trion‐Emission verschoben. Referenzexperimente schlossen PFO‐BPy und Toluol als poten‐ zielle Ursachen aus. Basierend auf der Änderung des Emissionsverhaltens von MoS2, ist die plau‐ sibelste Erklärung ein photoinduzierter Ladungstransfer, welcher zu delokalisierten Ladungsträgern auf MoS2 führt. Hingegen auf SWNTs würde die Einführung zusätzlicher Ladungen ein Löschzen‐ trum darstellen, was deren PL Emission weitestgehend unterdrücken würde. Im letzten Kapitel sollten die elektronischen Eigenschaften von dotierten SWNTs und das Verhal‐ ten von Ladungsträgern innerhalb der Röhren untersucht werden. Zunächst wurden die Veränderung in der Leitfähigkeit von SWNT‐Filmen bei zunehmenden Dotier‐ ungsgrad dokumentiert. Dabei wurde beobachtet, dass der Widerstand der Filme bei minimaler Dotierung drastisch abfällt. Nach dem ersten Einbringen von Ladungen fällt der Widerstand mit steigender Dotiermittelkonzentration gemäß eines doppel‐logarithmischen Verlaufs. Der initiale Abfall könnte an einer Verringerung von Kontaktwiderständen innerhalb des SWNT‐Netzwerk‐ Films liegen, allerdings konnte dies nicht in Rahmen dieser Doktorarbeit geklärt werden. Im Rahmen einer Kooperation mit Andreas Sperlich und Michael Auth wurde dabei die Spinkonzen‐ tration von SWNTs bei verschiedene Dotierungsgraden untersucht. Die erhaltenen Konzentra‐ tionen wurden mit den Ladungsträger‐Konzentration, die aus PL und Absorptionsspektren bes‐ timmt wurden, verglichen. Bei niedrigen Spin‐Dichten zeigte sich eine gute Übereinstimmung mit bisherigen Modellen. Ferner, deutet die Präsenz von isolierten Spins stark auf eine lokalisierte Ladungsträger‐Verteilung bei Temperaturen um 10 K hin. Bei Erhöhung der Ladungsdichte we‐ icht die Spindichte erheblich von der Ladungsträger‐Konzentration. Diese Diskrepanz wird auf die zunehmende Delokalisierung der Ladungsträger bei hohen Ladungsdichten zurückgeführt. Delokalisierte Spins sind nicht detektierbar in EPR Methoden. Diese Resultate sind ein starkes Indiz für das Vorhandensein von lokalisierten Ladungsträgern in SWNTs bei niedrigen Tempera‐ turen. Als Nächstes wurde der Effekt von Dotierung auf die Raman Spektren von SWNT Suspensionen untersucht. Generell wird erwartet, dass Dotierung die Intensität der Raman‐Banden verringert, also Folge der verringerten Resonanzverstärkung durch Bleichen des S2 Übergangs. Allerdings wurde ähnlich wie bei den Widerstandsmessungen ein starker Abfall in der Oszillatorstärke der G + ‐Bande bei den ersten Dotierungsschritten festgestellt. Weiterhin wurde festgestellt, dass die G + Band stärker abnimmt, als durch Verlust der Resonanzbedingung zu erwarten wäre. Außer‐ dem wird die G‐ stärker gebleicht als die G+ Bande. All diese Anomalien deuten darauf hin, dass die Resonanzverstärkung nicht der einzige relevante Effekt ist. Möglicherweise spielt eine beschleunigte Deaktivierung der Exzitonen über durch Dotierung eingebrachte Defekte eine entscheidende Rolle. In Kooperation mit der Gruppe um Vidmantas et al. wurde das photoinduzierte Ladungsträger‐ Verhalten von SWNT/PCBM Filmen untersucht. Die dazu benötigten Filme wurden über Tropf‐ beschichtung hergestellt. Die dazu notwendingen SWNT‐Suspensionen stammen aus gescher‐ mischten SWNT‐Ansätzen. Über transiente Absorption und TREFISH konnten eine Reihe von Ladungstransfer‐Effekten identifiziert un deren Dynamik untersucht werden: die Rekombination von neutralen Exzitonen (50 ps, den Elektronentransfer von Kohlenstoffnanoröhren auf PCBM Moleküle (< 1 ps), den Zerfall von Ladungstransfer‐Exzitonen (∼200 ps), die Rekombination von Ladungsträgern zwischen Ladungstransfer‐Exzitonen (1 ns to 4 ns) und schließlich die Propaga‐ tion durch das SWNT‐Netzwerk (∼20 ns))

The mold Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) is known as human pathogen and can cause life-threatening infections in humans with a weakened immune system. This is a known complication in patients receiving glucocorticoids, e.g. after hematopoietic stem cell transplantation or solid organ transplantation. Although research in the field of immune cell/fungus interaction has discovered key strategies how immune cells fight against infectious fungi, our knowledge is still incomplete. In order to develop effective treatment options against fungal infections, a detailed understanding of their interactions is crucial. Thus, visualization of immune cell and fungus is an excellent approach to gain further knowledge. For a detailed view of such interaction processes, a high optical resolution on nanometer scale is required. There is a variety of super resolution microscopy techniques, enabling fluorescence imaging beyond the diffraction limit. This work combines the use of three complementary super resolution microscopy techniques, in order to study immune cell/fungus interaction from different points of view. Aim of this work is the introduction of the recently invented imaging technique named expansion microscopy (ExM) for the study of immune cell/fungus interactions. The core aspect of this method is the physical magnification of the specimen, which increases the distance between protein structures that are close to each other and which can therefore be imaged separately. The simultaneous magnification of primary human natural killer (NK) cells and A. fumigatus hyphae was established in this work using ExM. Reorganization of cytoskeletal components of interacting NK cells was demonstrated here, by expansion of the immunological synapse (IS), formed between NK cells and A. fumigatus. In addition, reorganization of the microtubule-organizing center (MTOC) towards fungal hyphae and an accumulation of actin at the IS has been observed. Furthermore, ExM has been used to visualize lytic granules of NK cells after degranulation. After magnification of the specimen, lysosome associated protein 1 (LAMP1) was shown to surround perforin. In absence of the plasma membrane-exposed degranulation marker LAMP1, a “ring-shaped” structure was often observed for fluorescently labeled perforin. Volume calculation of lytic granules demonstrated the benefit of ExM. Compared to pre-expansion images, analyses of post-expansion images showed two volume distributions for degranulated and non-degranulated NK cells. In addition, this work emphasizes the importance of determining the expansion factor for a structure in each species, as variations of expansion factors have been observed. This factor, as well as possible sample distortions should be considered, when ExM is used in order to analyze the interaction between two species. A second focus of this work is the visualization of a chimeric antigen receptor (CAR), targeting an epitope on the cell wall of A. fumigatus. Structured illumination microscopy (SIM) revealed that the CAR is part of the immunological synapse of primary human CAR T cells and CAR-NK-92 cells. At the interaction site, an accumulation of the CAR was observed, as well as the presence of perforin. CAR accumulation at fungal hyphae was further demonstrated by automated live cell imaging of interacting CAR-NK-92 cells, expressing a fluorescent fusion protein. Additionally, the use of direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) gave first insights in CAR expression levels on the basal membrane of CAR-NK-92 cells, with single molecule sensitivity. CAR cluster analyses displayed a heterogeneous CAR density on the basal membrane of transfected NK 92 cells. In summary, this work provides insights into the application of ExM for studying the interaction of primary human NK cells and A. fumigatus for the first time. Furthermore, this thesis presents first insights regarding the characterization of an A. fumigatus-targeting CAR, by applying super-resolution fluorescence microscopy, like SIM and dSTORM. / Der Schimmelpilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) ist bekannt als Humanpathogen und kann lebensbedrohliche Infektionen bei Menschen mit einem geschwächten Immunsystem verursachen. Dies ist eine bekannte Komplikation bei Patienten die Glucocorticoide erhalten, z.B. nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation oder soliden Organtransplantation. Obwohl die Forschung im Bereich der Immunzelle/Pilz Interaktion Schlüsselstrategien entdeckt hat, wie Immunzellen infektiöse Pilze bekämpfen, ist unser Wissen immer noch unvollständig. Um effektive Therapieoptionen gegen Pilzinfektionen zu entwickeln, ist ein detailliertes Verständnis ihrer Interaktionen äußerst wichtig. Die Visualisierung von Immunzelle und Pilz ist daher ein exzellenter Ansatz um weitere Erkenntnisse zu gewinnen. Für einen detaillierten Einblick in solche Interaktionsprozesse ist eine hohe optische Auflösung im Nanometerbereich erforderlich. Hierzu gibt es eine Vielzahl an hochauflösenden Mikroskopietechniken, die es ermöglichen, Fluoreszenzbildgebung jenseits der Beugungsbegrenzung zu erzielen. Diese Arbeit kombiniert die Nutzung von drei sich ergänzenden hochauflösenden Mikroskopietechniken, um die Interaktion von Immunzelle/Pilz aus verschiedenen Blickwinkeln zu studieren. Ziel dieser Arbeit ist das Einführen der kürzlich entwickelten Bildgebungsmethode, namens Expansions-Mikroskopie (engl. expansion microscopy, kurz: ExM), um Immunzelle/Pilz Interaktionen zu studieren. Kernaspekt dieser Methode ist die physische Vergrößerung der Probe, wodurch der Abstand zwischen nahe beieinanderliegenden Proteinstrukturen vergrößert wird und diese daher separiert aufgenommen werden können. Die simultane Vergrößerung von primären humanen Natürlichen Killerzellen (engl. Natural Killer, kurz: NK) und A. fumigatus Hyphen wurde in dieser Arbeit mittels ExM etabliert. Durch Expansion der Immunologischen Synapse (engl. immunological synapse, kurz: IS), ausgebildet zwischen NK Zellen und A. fumigatus, konnte hier die Reorganisation von Bestandteilen des Zytoskeletts interagierender NK Zellen gezeigt werden. Darüber hinaus konnte eine Reorganisation des Mikrotubuli-organisierenden Zentrums (engl. microtubule-organizing center, kurz: MTOC) in Richtung Pilzhyphen, sowie eine Anreicherung von Aktin an der IS beobachtet werden. Außerdem konnte ExM genutzt werden, um lytische Granula von NK Zellen nach Degranulation zu visualisieren. Für das Lysosom-assoziierte Membranprotein 1 (engl. lysosome-associated protein 1, kurz: LAMP1) konnte nach Vergrößerung der Probe gezeigt werden, dass es Perforin umgibt. Unter Abwesenheit des Plasmamembran-exponierten Degranulations-Markers LAMP1 wurde oft eine „ringförmige“ Struktur für fluoreszenzmarkiertes Perforin beobachtet. Die Volumen Berechnung von lytischen Granula demonstrierte den Nutzen der ExM. Im Vergleich zu Analysen von Bildern vor Expansion, zeigten Analysen von Bildern nach Expansion zwei Verteilungen für die Volumengröße degranulierter und nicht-degranulierter NK Zellen. Zusätzlich unterstreicht diese Arbeit die Wichtigkeit, den Expansionsfaktor für eine Struktur aus jeder Spezies zu bestimmen, da Variationen für Expansionsfaktoren beobachtet wurden. Dieser Faktor sollte ebenso wie mögliche Proben-Deformationen in Betracht gezogen werden, wenn ExM genutzt wird, um die Interaktion zwischen zwei Spezies zu analysieren. Ein zweiter Fokus dieser Arbeit ist die Visualisierung eines chimärischen Antigenrezeptors (engl. chimeric antigen receptor, kurz: CAR), der ein Epitop auf der Zellwand von A. fumigatus erkennt. Strukturierte Beleuchtungs-Mikroskopie (engl. structured illumination microscopy, kurz: SIM) zeigte, dass der CAR Teil der Immunologischen Synapse von primären CAR-T Zellen und CAR-NK-92 Zellen ist. Eine Anreicherung des CARs, an der Interaktionsseite wurde beobachtet, so wie das Vorhandensein von Perforin. Die Anreicherung vom CAR an der Pilz-Hyphe wurde ferner durch automatisierte Lebend-Zell-Bildgebung interagierender CAR-NK-92 Zellen demonstriert, die ein fluoreszierendes Fusionsprotein exprimieren. Zusätzlich lieferte das Nutzen von direkter stochastischer optischer Rekonstruktions-Mikroskopie (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy, kurz: dSTORM) erste Einblicke in CAR Expressionslevel auf der basalen Membran von CAR-NK-92 Zellen, mit Einzelmolekül Empfindlichkeit. CAR Cluster Analysen zeigten eine heterogene CAR Dichte auf der basalen Membran transfizierter NK-92 Zellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit erstmals Einblicke in die Anwendung von ExM für die Untersuchung der Interaktion von primären humanen NK Zellen und A. fumigatus liefert. Zudem präsentiert die Thesis erste Einblicke hinsichtlich der Charakterisierung eines A. fumigatus-erkennenden CARs, unter Anwendung von hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie, wie SIM oder dSTORM.

In acute graft-versus-host disease (GVHD) alloreactive donor T cells selectively damage skin, liver, and the gastrointestinal tract while other organs are rarely affected. The mechanism of this selective target tissue infiltration is not well understood. We investigated the importance of alloantigen expression for the selective organ manifestation by examining spatiotemporal changes of cellular and molecular events after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). To accomplish this we established a novel multicolor light sheet fluorescence microscopy (LSFM) approach for deciphering immune processes in large tissue specimens on a single-cell level in 3 dimensions. We combined and optimized protocols for antibody penetration, tissue clearing, and triple-color illumination to create a method for analyzing intact mouse and human tissues. This approach allowed us to successfully quantify changes in expression patterns of mucosal vascular addressin cell adhesion molecule–1 (MAdCAM-1) and T cell responses in Peyer’s patches following allo-HCT. In addition, we proofed that LSFM is suitable to map individual T cell subsets after HCT and detected rare cellular events. We employed this versatile technique to study the role of alloantigen expression for the selective organ manifestation after allo-HCT. Therefore, we used a T cell receptor (TCR) transgenic mouse model of GVHD that targets a single peptide antigen and thereby mimics a major histocompatibility complex (MHC)-matched single antigen mismatched (miHAg-mismatched) HCT. We transplanted TCR transgenic (OT-I) T cells into myeloablatively conditioned hosts that either express the peptide antigen ovalbumin ubiquitously (βa-Ova) or selectively in the pancreas (RIP-mOva), an organ that is normally not affected by acute GVHD. Of note, at day+6 after HCT we observed that OT-I T cell infiltration occurred in an alloantigen dependent manner. In βa-Ova recipients, where antigen was ubiquitously expressed, OT-I T cells infiltrated all organs and were not restricted to gastrointestinal tract, liver, and skin. In RIP-mOva recipients, where cognate antigen was only expressed in the pancreas, OT-I T cells selectively infiltrated this organ that is usually spared in acute GVHD. In conditioned RIP-mOva the transfer of 100 OT-I T cells sufficed to effectively infiltrate and destroy pancreatic islets resulting in 100% mortality. By employing intact tissue LSFM in RIP-mOva recipients, we identified very low numbers of initial islet infiltrating T cells on day+4 after HCT followed by a massive T cell migration to the pancreas within the following 24 hours. This suggested an effective mechanism of effector T cell recruitment to the tissue of alloantigen expression after initial antigen specific T cell encounter. In chimeras that either expressed the model antigen ovalbumin selectively in hematopoietic or in parenchymal cells only, transplanted OT-I T cells infiltrated target tissues irrespective of which compartment expressed the alloantigen. As IFN-γ could be detected in the serum of transplanted ovalbumin expressing recipients (βa-Ova, βa-Ova-chimeras and RIP-mOva) at day+6 after HCT, we hypothesized that this cytokine may be functionally involved in antigen specific OT-I T cell mediated pathology. In vitro activated OT-I T cells responded with the production of IFN-γ upon antigen re-encounter suggesting that IFN-γ might be relevant in the alloantigen dependent organ infiltration of antigen specific CD8+ T cell infiltration after HCT. Based on these data we propose that alloantigen expression plays an important role in organ specific T cell infiltration during acute GVHD and that initial alloreactive T cells recognizing the cognate antigen propagate a vicious cycle of enhanced T cell recruitment that subsequently culminates in the exacerbation of tissue restricted GVHD. / In der akuten Graft-Versus-Host Disease (GVHD) infiltrieren allogene Spender T Zellen Haut, Leber und den Magen-Darm-Trakt des Empfängers und attackieren das Gewebe. Andere Organe sind dagegen interessanterweise nur selten betroffen. Die Mechanismen dieser selektiven Organinfliltration sind bisher weitestgehend unbekannt. In meiner Dissertationsarbeit untersuchte ich den Einfluss der Alloantigenexpression auf die selektive Organmanifestation während der GVHD. Um komplexe Immunprozesse die nach allogener Stammzelltransplantation auftreten, besser zu verstehen, entwickelten wir eine Lichtblattmikroskopietechnik (LSFM) die zelluläre und molekulare Veränderungen im intakten Gewebe detektieren kann. Wir etablierten eine neuartigen mehrfarben LSFM-Methodik, die es ermöglicht, Immunprozesse in großen Gewebsstücken von Maus und Mensch in Einzelzellauflösung dreidimensional darzustellen. Dazu kombinierten und optimierten wir Protokolle, um eine Penetration von Antikörpern tief in das Gewebe sowie die Aufklärung und die dreifache Beleuchtung des Gewebes zu ermöglichen. Diese Methode erlaubte uns die erfolgreiche Quantifizierung der Proteinexpression des Adressins mucosal vascular addressin cell adhesion molecule–1 (MAdCAM-1) als auch die Quantifizierung der T Zell Antwort im intakten Peyer’s Plaque nach allogener hämatopoetischer Transplantation (HCT). Weiterhin konnten wir die Methode zur Untersuchung der Migration unterschiedlicher T Zell-Subpopulationen nach HCT erfolgreich einsetzen und konnten einzelne, organinfiltrierende Zellen detektierten und quantifizieren. Wir benutzten die LSFM Methode um den Einfluss der Alloantigenexpression auf die selektive Organmanifestation zu studieren. Dazu verwendeten wir ein Transplantationsmodell, in dem der Haupthistokompatibilitätskomplex übereinstimmt (MHC-matched) und eine Diskrepanz nur in einem einzelnen Peptid Antigen (miHAG-mismatch) zwischen Spender und Empfänger bestand. Wir transplantierten T Zell Rezeptor (TCR) transgene (OT-I) T Zellen in myeloablativ bestrahlte Empfänger, die das Peptidantigen Ovalbumin entweder in allen Geweben (βa-Ova) oder selektiv in der Bauchspeicheldrüse (RIP-mOva) exprimieren. Die Bauchspeicheldrüse ist ein Organ, das normalerweise nicht von der akuten GVHD betroffen ist. An Tag 6 nach allogener HCT waren alle Organe die das Alloantigen exprimieren auch von Spender T Zellen infiltriert. In myeloablativ bestrahlten RIP-mOva Empfängern reichten bereits 100 transferierte OT-I T Zellen aus, um Alloantigen-exprimierende pankreatische Inselzellen zu zerstören. Dies führte zu einer Mortalität von 100% der Empfänger und spricht für eine sehr effiziente Alloantigendetektion und Gewebsinfiltration durch die Spender T Zellen. Um die Kinetik der Organinfiltration der Spender T Zellen detailliert zu untersuchen, verwendeten wir die neue Lichtblattmikroskopietechnik, welche die Analyse intakter Organe ermöglicht. In RIP-mOva Empfängern identifizierten wir erste wenige Spender T Zellen im Pankreas an Tag 4 nach Transplantation, gefolgt von einer massiven Pankreasinfiltration durch Spender T Zellen innerhalb von 24 Stunden. Dies deutet auf eine gezielte Rekrutierung der Spender T Zellen nach erstem Antigenkontakt in das Gewebe mit Alloantigenexpression. Um zu untersuchen, ob die Alloantigenexpression vom parenchymalen Gewebe oder aber durch hämatopoetische Zellen zur spezifischen Organinfiltration führt, transplantierten wir OT-I T Zellen in chimäre Empfänger, in denen das Alloantigen entweder nur im Gewebsparenchym oder ausschließlich von hämatopoetischen Zellen exprimiert wird. An Tag 6 nach der allogenen HCT fanden wir Spender T Zellen in allen Geweben, unabhängig davon welches Empfängerzellkompartment das Alloantigen präsentierte. Wir detektierten hohe IFN-γ-Werte im Serum von Ovalbumin exprimierenden Empfänger (βa-Ova, βa- Ova-Chimären und RIP-mOva). Weiterhin fanden wir, dass nach erneutem Kontakt mit dem spezifischen Alloantigen, OT-I T Zellen die in vitro aktiviert wurden, IFN-γ produzierten. Wir schließen aus diesen Beobachtungen, dass für die antigenabhängige Gewebeinfiltration IFN-γ wichtig ist. Zusammenfassend postulieren wir, dass die Alloantigenexpression im Gewebe eine wichtige Rolle in der organspezifischen Infiltration durch Spender T Zellen spielt, und dass T Zellen die Alloantigen spezifisch erkennen, dafür verantwortlich sind, dass weitere Effektor-T Zellen in das Gewebe rekrutiert werden.

Im Fokus dieser Arbeit stand der Aufbau einer auf DNA basierenden Nanostruktur. Der universelle Vier-Buchstaben-Code der DNA ermöglicht es, Bindungen auf molekularer Ebene zu adressieren. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der DNA prädestinieren dieses Makromolekül für den Einsatz und die Verwendung als Konstruktionselement zum Aufbau von Nanostrukturen. Das Ziel dieser Arbeit war das Aufspannen eines DNA-Stranges zwischen zwei Fixpunkten. Hierfür war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, welche es ermöglicht, Funktionsmoleküle als Ankerelemente ortsaufgelöst auf eine Oberfläche zu deponieren. Das Deponieren dieser Moleküle sollte dabei im unteren Mikrometermaßstab erfolgen, um den Abmaßen der DNA und der angestrebten Nanostruktur gerecht zu werden. Das eigens für diese Aufgabe entwickelte Verfahren zum ortsaufgelösten Deponieren von Funktionsmolekülen nutzt das Bindungspaar Biotin-Neutravidin. Mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops (AFM) wurde eine zu einem „Stift“ umfunktionierte Rasterkraftmikroskopspitze so mit der zu deponierenden „Tinte“ beladen, dass das Absetzen von Neutravidin im unteren Mikrometermaßstab möglich war. Dieses Neutravidinmolekül übernahm die Funktion als Bindeglied zwischen der biotinylierten Glasoberfläche und dem eigentlichen Adressmolekül. Das somit generierte Neutravidin-Feld konnte dann mit einem biotinylierten Adressmolekül durch Inkubation funktionalisiert werden. Namensgebend für dieses Verfahren war die Möglichkeit, Neutravidin mehrmals zu deponieren und zu adressieren. Somit ließ sich sequenziell ein Mehrkomponenten-Feld aufbauen. Die Einschränkung, mit einem AFM nur eine Substanz deponieren zu können, wurde so umgangen. Ferner mußten Ankerelemente geschaffen werden, um die DNA an definierten Punkten immobilisieren zu können. Die Bearbeitung der DNA erfolgte mit molekularbiologischen Methoden und zielte darauf ab, einen DNA-Strang zu generieren, welcher an seinen beiden Enden komplementäre Adressequenzen enthält, um gezielt mit den oberflächenständigen Ankerelementen binden zu können. Entsprechend der Geometrie der mit dem AFM erzeugten Fixpunkte und den oligonukleotidvermittelten Adressen kommt es zur Ausbildung einer definierten DNA-Struktur. Mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden wurde die aufgebaute DNA-Nanostruktur nachgewiesen. Der Nachweis der nanoskaligen Interaktion von DNA-bindenden Molekülen mit der generierten DNA-Struktur wurde durch die Bindung von PNA (peptide nucleic acid) an den DNA-Doppelstrang erbracht. Diese PNA-Bindung stellt ihrerseits ein funktionales Strukturelement im Nanometermaßstab dar und wird als Nanostrukturbaustein verstanden. / The main aim of this work was the development of a DNA-based nanostructure. The universal four-letter code of DNA allows addressing bonds at the molecular level. The chemical and physical property of DNA makes this macromolecule an ideal candidate as a construction element for nanostructures. The aim of this work was to span a DNA strand between two fixed points. For this purpose it was necessary to develop a method which makes it possible to deposit functional molecules as anchoring elements with highly spatial resolution on a surface. These molecules should be immobilized on the lower micrometer scale to meet the requirements of the desired nanostructure. The method that has been developed for this task, which enables to deposit functional molecules, uses the binding pair biotin-neutravidin. Using the tip of an atomic force microscope (AFM), which can be uses like a pen, it was possible to deposit neutravidin on the lower micrometer scale. This neutravidin molecule is the linking element between the biotinylated glass surface and the actual address molecule. The thus generated neutravidin field could then be functionalized with a biotinylated molecule by incubation. The method has been published as sequential spotting method because it enables a sequential functionalization of neutravidin after it has been deposited. It was so possible to build up a multi-component array. The limitation of being able to deposit only one single substance with an AFM has been circumvented. It also was necessary to create anchor elements in order to immobilize the DNA at defined positions. The processing of the DNA was carried out using molecular biological methods and aimed at generating a DNA strand, which at both ends has a complementary sequence for binding to the surface bound anchor elements. The defined structure is a result of the geometry of the fixed points, generated by the AFM. Using fluorescence microscopy, the constructed DNA nanostructure was detected. The proof of the interaction of DNA-binding molecules with the DNA structure was carried out by the binding of PNA (peptide nucleic acid), which is capable of binding to double stranded DNA. The PNA and its DNA-interaction is a functional building block in the nanometer scale and can be regarded as a promising nanostructure.

Diese Arbeit beschreibt die Untersuchung der Diffusion in dünnen Flüssigkeitsfilmen auf festen Oberflächen mit Methoden der Einzelmoleküldetektion. Anhand von Computersimulationen wird die Spotgrößenanalyse als neue Methode zur Analyse von Diffusionsprozessen vorgestellt. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Diffusion von Farbstoffen in ultradünnen Flüssigkeitsfilmen stark verlangsamt ist. In einem ca. 3 nm dicken Film aus Tetrakis(2-ethyl-hexoxy)-silan werden Diffusionsprozesse beobachtet, die durch Sprünge zwischen Bereichen mit diskreten Werten der Diffusionskonstante gekennzeichnet sind. Die Existenz diskreter Werte der Diffusionskonstante kann durch die Ausbildung von Flüssigkeitsschichten molekularer Dicke (Liquid Layering) erklärt werden. Die Spotgrößenanalyse erweist sich als unabhängige Methode zur Bestimmung der Diffusionskonstante diffundierender Moleküle. Gegenüber der etablierten Bestimmung der Diffusionskonstante aus Trajektorien diffundierender Moleküle durch Berechnung der mittleren quadratischen Verschiebung bietet die Spotgrößenanalyse eine höhere statistische Genauigkeit und die Möglichkeit, Änderungen der Diffusionskonstante instantan zu detektieren.

Stuttgart, Univ., Diss., 2005.

Essen, Universiẗat, Diss., 2005--Duisburg.

In the heart the β\(_1\)-adrenergic receptor (AR) and the β\(_2\)-AR, two prototypical G protein-coupled receptors (GPCRs), are both activated by the same hormones, namely adrenaline and noradrenaline. Both receptors couple to stimulatory G\(_s\) proteins, mediate an increase in cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and influence the contractility and frequency of the heart upon stimulation. However, activation of the β\(_1\)-AR, not the β\(_2\)-AR, lead to other additional effects, such as changes in gene transcription resulting in cardiac hypertrophy, leading to speculations on how distinct effects can arise from receptors coupled to the same downstream signaling pathway. In this thesis the question of whether this distinct behavior may originate from a differential localization of these two receptors in adult cardiomyocytes is addressed. Therefore, fluorescence spectroscopy tools are developed and implemented in order to elucidate the presence and dynamics of these endogenous receptors at the outer plasma membrane as well as on the T-tubular network of intact adult cardiomyocytes. This allows the visualization of confined localization and diffusion of the β\(_2\)-AR to the T-tubular network at endogenous expression. In contrast, the β\(_1\)-AR is found diffusing at both the outer plasma membrane and the T-tubules. Upon overexpression of the β\(_2\)-AR in adult transgenic cardiomyocytes, the receptors experience a loss of this compartmentalization and are also found at the cell surface. These data suggest that distinct signaling and functional effects can be controlled by specific cell surface targeting of the receptor subtypes. The tools at the basis of this thesis work are a fluorescent adrenergic antagonist in combination of fluorescence fluctuation spectroscopy to monitor the localization and dynamics of the lowly expressed adrenergic receptors. Along the way to optimizing these approaches, I worked on combining widefield and confocal imaging in one setup, as well as implementing a stable autofocus mechanism using electrically tunable lenses. / Im Herzen werden der β\(_1\)-adrenerge Rezeptor (AR) und der β\(_2\)-AR, zwei prototypische GPCR, durch die Hormone Adrenalin und Noradrenalin aktiviert. Dabei interagieren beide Rezeptoren mit dem stimulatorischen G\(_s\) Protein, bewirken eine Erhöhung des cyclischen Adenosinmonophosphates (cAMP) und beeinflussen die Kontraktionskraft und Frequenz des Herzens nach einem Stimulus. Jedoch hat die Aktivierung des β\(_1\)-ARs, nicht des β\(_2\)-ARs, auch weitere Effekte, wie z.B. Veränderungen in der Transkription von Genen. Dies wiederum führt zu Spekulationen, wie solch unterschiedliche Effekte von Rezeptoren hervorgerufen werden können, die gleiche Signalwege bedienen. In dieser Arbeit wird untersucht, ob dieses unterschiedliche Verhalten durch eine ungleiche Verteilung dieser beiden Rezeptoren in adulten Kardiomyozyten hervorgerufen werden könnte. Dazu wird die Lokalisation und die Dynamik dieser endogenen Rezeptoren in der Plasmamembran sowie im T-tubulären Netzwerk von intakten adulten Kardiomyozyten, unter Entwicklung und Verwendung hochsensitiver Fluoreszenzspektroskopiemethoden, bestimmt. Dies ermöglicht die örtliche und dynamische Eingrenzung des β\(_2\)-adrenergen Rezeptors unter endogener Expression ausschließlich auf das T-tubuläre Netzwerk. Dementgegen stellt sich heraus, dass sich der β\(_1\)-adrenerge Rezeptor ubiquitär auf der äußeren Membran und den T-Tubuli befindet und diffundiert. In β\(_2\)-AR überexprimierenden transgenen Kardiomyozyten hingegen werden diese Kompartments nicht beibehalten und es findet eine Umverteilung der Rezeptoren, auch unter Einbezug der Zelloberfläche, statt. Diese Daten können stärker darauf hindeuten, dass einige Rezeptorsubtypen sich gezielt und spezifisch bestimmte Zelloberflächen aussuchen, um somit ihre verschiedenen Signale und funktionären Effekte erzeugen zu können. Zu den Techniken, die in dieser Arbeit die Bestimmung der Lokalisation und der Dynamiken der niedrig exprimierten adrenergen Rezeptoren zulassen, gehört die Anwendung von Fluoreszenzspektroskopiemethoden in Kombination mit einem fluoreszierenden β-adrenergen Antagonisten. Weitere Techniken, die im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurden und in weiterführenden Studien aufschlussreiche Erkenntnisse liefern könnten, umfassen die Entwicklung eines Setups aus einer Kombination aus Weitfeld- und Konfokalmikroskopie und die Implementierung eines stabilen Autofokus mit Hilfe einer elektrisch veränderbaren Linse.

Im Laufe der Evolution haben Bakterienarten äußerst vielfältige und ausgeklügelte extrazelluläre Strukturen entwickelt, die es ihnen ermöglichen, Substrate in ihre Umgebung abzugeben oder Wirtszellen während einer Invasion anzugreifen. Diese Sekretionssysteme sind an vielen bakteriellen Mechanismen wie Biofilmbildung, Zellmotilität, Virulenz oder Gentransfer und Verbreitung von Antibiotikaresistenzen beteiligt. Das Verständnis des Aufbaus und der Regulierung dieser Strukturen ist angesichts der zunehmenden Entwicklung multiresistenter Bakterien von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus geht der Aufbau solcher Strukturen unweigerlich auf Kosten wertvoller zellulärer Energieressourcen, was einen spannenden Parameter darstellt, um zu untersuchen, wie Bakterien den optimalen Mechanismus zum Ausgleich zwischen zellulären Mechanismen und Energieverbrauch wählen. Diese Arbeit konzentriert sich auf den Aufbau und die Regulierung bakterieller extrazellulärer Filamente, insbesondere des flagellaren Typ-III-Sekretionssystems (T3SS). Im ersten Kapitel werden Defekte in der Zellmorphologie aufgezeigt, die durch die Deletion des FlhE-Proteins während des Zusammenbaus der Flagellen verursacht werden, was die Bedeutung der Regulierung des Membranpotentials verdeutlicht. Das zweite Kapitel zeigt, dass der Assemblierungsmechanismus der Flagellen-Filamente, welcher dem Injektions-Diffusions-Modell entspricht, im Vergleich zu anderen Sekretionssystemen schneller ist und für die Energieerhaltung optimiert ist. Das dritte Kapitel untersucht die Rolle des Pilus beim Plasmid-Transfer, der mit einem Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS) assoziiert ist, und liefert zusätzliche Hinweise darauf, dass der Pilus als Kanal für den Plasmid-DNA-Transfer dienen kann. Im letzten Kapitel wird ein neuer Biosensor zur Messung des Gehalts an bis-(3'-5')-zyklischem Diguanosinmonophosphat (c-di-GMP) entwickelt, einem entscheidenden Molekül in bakteriellen Mechanismen, die Zellmotilität und Biofilmbildung miteinander verbinden. Insgesamt bietet diese Arbeit Einblicke in die Regulation des flagellaren T3SS und des T4SS-Pilus, ein neues Werkzeug zur Untersuchung von c-di-GMP und Einblicke, wie Bakterien entscheidende Überlebensparameter und die Optimierung eines energiesparenden Aufbaus abwägen. / Through evolution, bacterial species have developed highly diverse and sophisticated extracellular structures enabling them to secrete substrates in their environment or to target host cells during invasion. Those secretion systems are involved in many bacterial mechanisms such as biofilm formation, cell motility, virulence or gene transfer and antibiotic resistance dissemination. Understanding the assembly and regulation of these structures is crucial due to the increasing development of multi-drug resistant bacteria. Moreover, the assembly of such structures inevitably comes at the cost of valuable cellular energy resources, representing an exciting parameter to study how bacteria selected the optimal mechanism to balance cellular mechanisms and energy consumption. This thesis focuses on the assembly and regulation of bacterial extracellular filaments, notably the flagellar type III secretion system (T3SS) flagellum . The first chapter reveals cell morphology defects caused by the deletion of the FlhE protein during flagellum assembly, highlighting the importance of membrane potential regulation . Chapter two illustrates that the flagellar filament assembly mechanism, following the injection-diffusion model, is faster compared to other secretion systems and optimized for energy conservation. The third chapter investigates the role of the pilus in plasmid transfer, associated with a type IV secretion system (T4SS), and gives additional evidence that the pilus may also act as a channel for plasmid DNA transfer. The final chapter develops a new biosensor for measuring bis-(3’-5’)-cyclic diguanosine monophosphate (c-di-GMP) levels, a crucial molecule in bacterial mechanisms linking cell motility and biofilm formation. Overall, this thesis provides insights into the regulation of the flagellar T3SS and the T4SS pilus, a new tool to study c-di-GMP, and how bacteria balance crucial survival parameters and energy-conserving assembly optimization .