Un microenvironnement riche en IL-4 a été mis en évidence dans le lymphome folliculaire (FL). Cette IL-4 impliquée dans la croissance tumorale a été démontrée comme principalement secrétée par les lymphocytes T follicular helper (Tfh). Dans cette étude, nous étudions l’interaction bidirectionnelle entre les cellules fibroblastiques réticulaires (FRC) dont le réseau est augmenté dans le FL et les lymphocytes Tfh par analyse des profils d’expression génique, et co-culture in vitro des lymphocytes Tfh primaires avec des cellules fibroblastiques humaines de type FRC-like. Nous démontrons que les cellules FRC-like augmentent in vitro la croissance des sous-populations de Tfh. De plus, nous avons mis en évidence une augmentation spécifique de la sécrétion d’IL-4 par les précurseurs Tfh (pre-Tfh) co-cultivés avec les cellules FRC-like, augmentation d’IL-4 impliquant les voies Notch et ICAM1/LFA1. Cette observation est particulièrement intéressante dans le contexte du FL car les lymphocytes pre-Tfh de FL comparés à des lymphocytes pre-Tfh d’amygdales non tumorales sont caractérisés par un profil d’expression génique enrichi en gènes des voies Notch et des intégrines en plus d’une surexpression d’IL-4. En conclusion, notre description de l’interaction entre les cellules stromales et les sous-populations Tfh démontrent une modification du profil cytokinique des Tfh au stade précurseur qui pourrait expliquer le profil cytokinique retrouvé dans le microenvironnement du FL, et apporter de nouveaux éléments pour la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques. / The enrichment of the microenvironment with tumor-promoting interleukin 4 (IL4) has been implicated in the pathogenesis of follicular lymphoma (FL) and was found to be conferred mainly by T follicular helper (Tfh) cells. In this study, we investigated the bidirectional crosstalk of fibroblastic reticular cells that are expanded in FL and Tfh cells with the analysis of gene expression profiles of the respective, and an in-vitro co-culture model of human induced FRC-like cells. We demonstrated that FRC-like cells enhance the growth of Tfh cell subsets in vitro. Crucially, we uncovered a specific upregulation of IL-4 secretion by precursor Tfh (pre-Tfh) cells co-cultured with FRC-like cells. Additionally, we demonstrated that Notch and ICAM1/LFA1 are two pathways involved in IL-4 secretion following FRClike cell / Tfh cell crosstalk. This observation was particularly interesting in FL context, because FL pre-Tfh cells display an enriched Notch and integrin gene expression profile as well as an overexpression of IL-4, compared to their tonsil counterpart. Altogether, we described new interactions between stromal cells and Tfh subsets and uncovered a specific cytokine profile modification at pre-Tfh stage after contact with FRC-like cells that could explain the high levels of IL-4 in FL and provide a novel target for therapy.

Le lymphome folliculaire (FL) est le lymphome B indolent le plus fréquent. Outre des altérations géniques récurrentes, le micro-environnement tumoral, et notamment les cellules stromales lymphoides,joue un rôle majeur dans le développement de ce cancer. Cependant, la caractérisation in-situ des cellules stromales lymphoïdes chez l'homme tout comme les facteurs menant à la polarisation du stroma en un stroma protumoral ont été peu étudiés. Dans cette thèse, nous avons montré, que les cellules stromales présentes dans les ganglions et la moelle osseuse envahis des patients atteints de FL surexpriment fortement la chimiokine CXCL12. Nous avons ensuite tenté de comprendre les mécanismes responsables de cette induction. Alors que les cellules B tumorales induisent une surexpression de la chimiokine CCL2 dans les cellules stromales de façon dépendante de leur synthèse de TNF, elles ne contribuent pas à l'induction de CXCL12. A l'inverse, le principal compartiment TCD4 impliqué dans la croissance tumorale du FL, les cellules T follicular helper (TFH), augmentent l'expression de CXCL12 dans les cellules stromales. Le taux d'IL-4, la principale cytokine produite par les TFH de FL, est d'ailleurs corrélé à celui de CXCL12 au sein de ma niche tumorale du FL. De plus, à l’aide d'un modèle de différenciation en stroma lymphoide, nous avons démontré que l’IL4 induit l’expression de CXCL12 par les cellules stromale in vitro. Cette production est augmentée quand les cellules stromales sont déjà engagées vers la voie de différentiation lymphoide par un traitement TNF/LT qui favorise l'activation de STAT6 par l'IL-4. Nous avons validé ces résultats dans un modèle de formation d'organe lymphoide ectopique chez la souris. Enfin, CXCL12 induit la migration et l'adhésion au stroma des B de FL via l'activation de cascades de signalisations qui peuvent être abrogées par l'utilisation d'un inhibiteur de Btk utilisé en clinique, l'Ibrutinib. Ces résultats sont en faveur de l'intérêt de considérer la boucle IL-4/CXCL12 pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette pathologie constamment fatale. / Follicular lymphoma (FL) is the most frequent indolent B-cell lymphoma. Beside recurrent genetic alterations, tumor microenvironment, including lymphoid stromal cells, has been shown to play a key role in FL development. However, in situ characterization of lymphoid stromal cells is still lacking in humans and there are very few studies focusing on the factors that could lead to stroma polarization in normal and pathological context. In this thesis, we showed first that in FL, lymph node (LN) and bone marrow (BM) infiltrating stromal cells highly express the chemokine CXCL12. We next focused on the mechanisms underlying this upregulation. Interestingly, whereas malignant FL B cells induced overexpression of CCL2 in stromal cells in a TNF-dependent manner, they did not contribute to CXCL12 induction. Conversely, FL-infiltrating follicular helper T cells (FL-TFH), the key FL-supportive T-cell subset could trigger CXCL12 expression in stromal cells. IL-4 is the main FL-TFH-derived cytokine and showed a positive correlation with CXCL12 expression inside FL cell niches. Moreover, based on our in vitro lymphoid stroma differentiation model, we demonstrated that IL-4 promoted CXCL12 expression in stromal cells, together with a phenotype close to that identified in situ within FL cell niche. Such IL4 dependent CXCL12 regulation is more pronounced in stromal cells already committed towards lymphoid stromal cells by a prestimulation by TNF/LT in association with an increased STAT6 activation. These data were validated in a model of ectopic lymphoid organ formation in mice. Finally, CXCL12 induced FL B-cell migration, and adhesion to stromal cells through the activation of a signaling pathway that could be abrogated by the Btk inhibitor Ibrutinib. These data argue for considering IL-4/CXCL12 axis as a potential therapeutic target to disrupt FL protective cell niche in this still fatal malignancy.

La voie PI3K/AKT est impliquée dans la progression de divers cancers humains, et semble jouer un rôle majeur dans le développement de tumeurs lymphoïdes. Elle pourrait être impliquée dans la pathogénie du lymphome folliculaire (LF) par certains mécanismes non identifiés. Les travaux de thèse portent sur l'étude des anomalies de la voie PI3K/AKT dans le LF, dans le but d'apporter une nouvelle cible thérapeutique. 38 biopsies tissulaires de LF humain ont été étudiées pour une analyse mutationnelle du gène PIK3CA dans les exons 9 et 20 par séquençage. Les mêmes échantillons ont été analysés par western blot et immunohistochimie pour détecter l'expression des protéines AKT, AKT phosphorylée (pAKT), et PTEN. Deux cas de lymphadénite ont été utilisés comme témoins.Les résultats obtenus montrent que l'expression d'AKT était présente dans tous les cas de LF et lymphadénite, et 14/38 (37%) échantillons de LF et 2/2 cas de lymphadénite exprimaient pAKT. 9/38 (24%) échantillons de LF ont montré un niveau élevé d'expression de pAKT, alors que 5/38 (13%) cas de LF, et 2/2 échantillons de lymphadénite montraient un faible niveau d'expression de pAKT. L'expression de PTEN a été observée dans 30/38 (79%) cas de LF et 2/2 cas de lymphadénite, tandis que 8/38 (21%) cas ont montré une perte d'expression de PTEN. En outre, 3 cas qui expriment pAKT montrent une perte d'expression de PTEN. Aucune mutation du gène PIK3CA n'a été détectée dans les échantillons étudiés. Ces données suggèrent que la voie PI3K/AKT peut être activée dans certains cas de LF, soit en raison de la phosphorylation d'AKT, soit en raison d'une perte d'expression de PTEN, en absence de mutations de PIK3CA. / The phosphoinositide 3- kinase (PI3K) pathway is involved in the growth of various human cancers, including lymphoid malignancies. However its role in the pathogenesis of follicular lymphoma (FL) has not been yet described.The PhD work focuses on the study of alterations in the PI3K/AKT pathway in follicular lymphoma, in order to provide a new therapeutic target.To clarify this point, biopsy tissue samples from 38 human FL cases were investigated for PIK3CA somatic mutations in exons 9 and 20 using Sanger sequencing. The same samples were analyzed using western blotting and immunohistochemistry to detect expression of AKT, phosphorylated AKT (pAKT), and PTEN proteins. Two cases of benign lymphadenitis were used as controls. AKT expression was present in all FL and lymphadenitis cases. 14/38 (37%) FL and 2/2 lymphadenitis cases expressed pAKT. 9/38 (24%) FL samples showed high level of pAKT, whereas 5/38 (13%) FL cases and 2/2 benign lymphadenitis samples expressed pAKT at low level. PTEN expression was observed in 30/38 (79%) FL and 2/2 benign lymphadenitis cases, whereas 8/38 (21%) of FL cases showed loss of PTEN expression. In addition, 3 cases with positive pAKT did not express PTEN. PIK3CA mutations were not detected in any sample. These data suggest that the PI3K/AKT signaling pathway could be activated in a subset of FL cases, due to either AKT phosphorylation or PTEN downregulation, in the absence of PIK3CA mutations.

Des études récentes ont montré une implication de la neuropiline 1 (Nrp1)dans le contrôle de l'activation des lymphocytes T. Son invalidation s'accompagned'une aggravation de l'encéphalite auto-immune expérimentale (EAE). Lasémaphorine 3A (Sema-3A), ligand principal de la Nrp1, semble participer à uneboucle autocrine de rétro contrôle négatif de la prolifération des lymphocytes T.Cependant, peu d'études ont été réalisées chez l'homme pour déterminer dansquelle(s) situation(s) la Nrp1 est exprimée par les lymphocytes T. Notre travail aconsisté à étudier l'expression de la Nrp1 par les populations lymphocytaires Thumaines afin de comprendre à quel niveau peut avoir lieu ce rétro contrôle. Nousmontrons que les lymphocytes T régulateurs (Treg) chez l'homme n'expriment pas laNrp1, contrairement aux Treg murins. En revanche, la Nrp1 est exprimée par leslymphocytes T effecteurs après engagement avec l'antigène, soit au niveau desorganes lymphoïdes secondaires pour les lymphocytes T folliculaires helper (Tfh) eninteraction avec les lymphocytes B, soit au niveau des sites d'inflammationspériphériques pour les lymphocytes T effecteurs mémoires (TEM). Dans les deuxcas, cette expression survient en fin d'activation et pourrait servir de frein à uneactivation incontrôlée des lymphocytes T.D'autre part, nous avons abordé le rôle du récepteur alpha à l'IL-2 (CD25)dans l'homéostasie des lymphocytes T. L'étude chez la souris il2ra-/- a révélé un rôleimportant du CD25 pour la survie des Treg in vivo, mais aussi pour l'acquisition delymphocytes T mémoires. Seulement deux cas de déficience en CD25, associés àdes maladies auto-immunes, ont été décrits chez l'homme. Cependant, ces étudesn'ont pas abordé à quel niveau le CD25 intervient sur l'homéostasie des lymphocytesT. Nous complétons ces études par la présentation de trois nouveaux cas dedéficience en CD25 développant des maladies auto-immunes de type IPEX. Nousmontrons que le CD25 intervient activement dans le maintien des populations Tregnaïves et effectrices, mais aussi dans celui des populations lymphocytaireseffectrices mémoires.

L’hormone anti-Müllerienne (AMH), une glycopréotéine exclusivement produite par les cellules de la granulosa (CG) des follicules ovariens de la femme, est un marqueur unique de du statut folliculaire ovarien. Contrairement à l’inhibine B, l’estradiol et la FSH, l’AMH est produite par un large éventail de follicules allant des follicules primaires aux follicules à petit antrum. Cependant, les mécanismes précis régulant la production d’AMH par les CG restent mal connus. Nous avons montré que la sélection folliculaire précoce au cours de la phase de transition lutéo-folliculaire, un phénomène fréquemment retrouvé chez les femmes ayant un vieillissement ovarien, caractérisé par la présence d’au moins un follicule surdéveloppé au cours de la phase folliculaire précoce, n’altérait pas la puissance de la relation entre le compte folliculaire antral et les concentrations sériques d’AMH. En revanche, cette situation perturbait significativement celle entre le nombre de follicules antraux et les taux sériques de FSH, d’inhibine B et d’estradiol. Nous avons par la suite mis en évidence, en utilisant un nouvel outil, nommé Follicular Output RaTe (FORT), que le pourcentage de follicules qui répondent effectivement à la FSH exogène en atteignant la maturation pré-ovulatoire, était négativement et indépendamment lié aux taux sériques d’AMH, ce qui va dans le sens de l’hypothèse d’un effet inhibiteur de l’AMH sur la sensibilité des follicules à la FSH. Ensuite, nous avons regardé si la production d’AMH par ovaire et par follicule était altérée chez les femmes n’ayant plus qu’un seul ovaire suite à une ovariecomie unilatérale. En effet, tout indique que chez ces femmes, des réarrangements majeurs de la folliculogenèse sont mis en place pour maintenir une fonction ovarienne malgré la perte brutale d’une partie du pool folliculaire. Ainsi, par une analyse extensive et comparative de la folliculogenèse utilisant des marqueurs hormono-folliculiares, nous n’avons pu mettre aucune modification significative chez les femmes avec un ovaire unique, comparativement aux contrôles. A l’aide du modèle précédemment utilisé, nous avons constaté une augmentation de la sensibilité des follicules antraux à la FSH exogène, évaluée par le FORT, chez des femmes avec un seul ovaire, comparativement aux femmes avec 2 ovaires. Ces résultats supportent l’hypothèse d’une augmentation de la sensibilité folliculaire à la FSH, qui pourrait faire partie des possibles mécanismes compensatoires en jeu dans le maintien d’une folliculogenèse efficace chez les femmes ayant eu une ovariectomie unilatérale.Finalement, à l’aide de 2 approches complémentaires, in vitro and in vivo, nous avons montré que la FSH et l’AMPc stimulaient la transcription de l’AMH, et que la LH avait un effet additif. Nous avons montré que les gonadotrophines et l’AMPc agissaient à travers la protéine kinase A et la P38 MAP Kinase, impliquant notamment les facteurs de transcription GATA binding factor-4 et le steroidogenic factor-1. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence que l’expression d’AMH pouvait être régulée de manière différentielle par l’estradiol, en fonction du type de récepteur aux estrogènes exprimés par les CG. Ainsi, la chute d’expression de l’AMH au sein des CG des follicules matures, qui expriment essentiellement ERβ, est probablement liée à un effet de l’estradiol. En résumé, ces travaux de thèse ont permis d’apporter de nouvelles données sur la régulation de la croissance folliculaire et sur la production d’AMH chez la femme. / Anti-Müllerian hormone (AMH), a glycoprotein that is exclusively produced by the granulosa cells (GC) of ovarian follicles in the adult female, is a unique biomarker of ovarian follicular status. In contrast with inhibin B, estradiol and FSH, AMH is produced in a wide range of follicles that goes from the primary to the small antral stages of folliculogenesis. However, the precise mechanisms that drive AMH expression by GC remain poorly understood.We showed that untimely and/or accelerated antral follicle growth during the luteal–follicular transition, a phenomenon that is frequent in ovarian-aged women and that is characterized by the presence of at least one overdeveloped antral follicle during the first days of the follicular phase does not alter the strength of the relationship between antral follicle count and serum AMH levels but does affect the relationship between serum FSH, inhibin B and estradiol levels and the number of antral follicles. The heftiness of AMH in relation to advanced antral follicle growth provides a further explanation for the reported stronger association between serum AMH levels and antral follicle counts as compared with the other hormonal markers of the ovarian fertility status. We subsequently demonstrated, using an innovative tool, the Follicular Output RaTe (FORT), that the percentage of follicles that effectively respond to exogenous FSH by reaching pre-ovulatory maturation is negatively and independently related to serum AMH levels, which is in keeping with the hypothesis that AMH inhibits follicle sensitivity to FSH. Given this hypothesis, we wondered if per-ovary and per-follicle AMH production could be altered in patients having a single ovary as a result of unilateral oophorectomy. Indeed, all indicate that major rearrangements of folliculogenesis occur to preserve and maintain ovarian function despite the abrupt halving of follicular stockpile in these patients. We performed an extensive and comparative evaluation of the folliculogenesis using homono-follicular markers failing to show major changes in unilaterally oophorectomized when compared with control women. Using the same model, we demonstrated an increased antral follicle responsiveness to exogenous FSH, as assessed by FORT, in normo-ovulating unilaterally oophorectomized women undergoing controlled ovarian hyperstimulation. These results support the hypothesis that increased FSH sensitivity ranks among the possible compensating mechanisms at stake in the maintenance of successful folliculogenesis after unilateral oophorectomy.Finally, using complementary approaches, in vitro and in vivo, we showed that FSH and cAMP enhance AMH transcription, and LH has an additive effect. Gonadotropins and cAMP act through protein kinase A and p38 MAPK signaling pathways and involve the GATA binding factor-4 and steroidogenic factor-1 transcription factors, among others. The expression profile of AMH and the dynamics of serum AMH after gonadotropin stimulation have been interpreted as a down-regulating effect of FSH upon AMH production by GC. We also demonstrated that AMH expression can be differentially regulated by estradiol depending on the estradiol receptors by GC. Therefore the decrease in AMH expression by GC of mature follicles, which mainly express ERβ, is likely due to the effect of estradiol.In short, this Ph.D. work offers new insight into the regulation of the follicular growth and AMH production in woman.

Les cellules T folliculaires helper (Tfh) jouent un rôle central dans la mise en place de réponses humorales efficaces. En effet, les Tfh participent à la sélection des lymphocytes B permettant le développement de lymphocytes B mémoires et d’anticorps de haute affinité. Les Tfh représentent ainsi une cible prometteuse pour la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment pour augmenter l’efficacité de la vaccination. Ainsi, il apparaît crucial de mieux comprendre les étapes menant à leur développement, en particulier chez l’Homme. L’initiation de la polarisation Tfh se déroule dans les organes lymphoïdes secondaires et met en jeu les cellules myéloïdes mononucléaires (MMC). Les MMC présentes dans les organes lymphoïdes comprennent les macrophages résidents et trois sous populations de DC résidentes : les cDC1 (CD141+), les cDC2 (CD1c+) et les pDC. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés au rôle respectif des sous populations de MMC humaines dans l’induction de la polarisation Tfh. Ainsi, les travaux effectués au cours de ma thèse avaient pour objectifs dans un premier temps d’analyser la capacité des différentes populations de MMC à induire la polarisation Tfh, afin de mettre en évidence de potentielles spécialisations fonctionnelles. Dans un second temps, nous nous sommes concentrés sur les mécanismes moléculaires impliqués dans l’induction par les MMC de la polarisation Tfh. Nous avons montré une spécialisation fonctionnelle des cDC2 et des macrophages des amygdales pour la polarisation Tfh. Toutefois, des différences ont été observées entre les cDC2 et macrophages, puisque les macrophages induisent la sécrétion par les lymphocytes T d’une grande quantité de CXCL13 par rapport au cDC2, qui sont plus efficaces pour induire la production d’IL21. Nous avons pu également montrer que les cDC2 et macrophages sécrétaient des cytokines précédemment identifiées comme ayant un rôle dans l’induction des Tfh telles que IL12p70, ActivinA et TGFβ. Afin de confirmer le rôle de ces cytokines dans la polarisation induite par les MMC d’amygdales, nous avons utilisé des anticorps bloquants dans nos expériences de polarisation T helper. Ainsi, nous avons confirmé le rôle de l’IL12p70, de l’Activin A et du TGFβ dans l’induction des Tfh humains. Nos résultats suggèrent également un rôle de l’Activin A et de TGFβ dans l’induction de la sécrétion de CXCL13, alors que l’IL12p70 serait impliqué dans l’induction de la sécrétion d’IL21. Nos résultats suggèrent aussi l’existence de deux sous populations de Tfh caractérisées soit par l’expression d’IL21 soit par l’expression de CXCL13. Les travaux réalisés au cours de ma thèse enrichissent ainsi les connaissances sur la spécialisation fonctionnelle des sous populations de DC et des macrophages humains, et apportent de nouveaux éléments pour la compréhension de la différenciation des Tfh humains. / T follicular helper cells (Tfh) play a key role in the establishment of efficient humoral responses. Indeed, Tfh are involved in B lymphocyte selection allowing the development of high affinity memory B cells and antibodies. Tfh are promising targets for new therapeutic strategies, especially to increase the effectiveness of vaccination. Thus, it is crucial to better understand the stages leading to their development, especially in human. Initiation of Tfh polarisation occurs in secondary lymphoid organs and involves mononuclear myeloid cells (MMC). MMC from secondary lymphoid organs include resident macrophages and three subsets of resident Dendritic Cells (DC): cDC1 (CD141+), cDC2 (CD1c+) and pDC. We were particularly interested in human MMC subsets respective roles in the induction of Tfh polarisation. Thus, the work carried out during my thesis aimed first at analysing the ability of different populations of MMC to induce Tfh polarisation, in order to highlight potential functional specialisations. In a second step, we focused on the molecular mechanisms involved in Tfh polarisation by MMC. We have shown a functional specialisation of cDC2 and tonsillar macrophages for Tfh polarisation. However, differences have been observed between cDC2 and macrophages, since macrophages induce secretion by T cells of a large amount of CXCL13 compared to cDC2, which are more effective in inducing IL21 production. We have also been able to show that cDC2 and macrophages secreted cytokines previously shown to play a role in Tfh induction such as IL12p70, ActivinA and TGFβ. In order to confirm the role of these cytokines in Tfh polarisation induced by tonsil MMCs, we used blocking antibodies in our T helper polarisation experiments. Thereby, we confirmed the role of IL12p70, Activin A and TGFβ in the induction of human Tfh. Our results also suggest a role for Activin A and TGFβ in inducing secretion of CXCL13, whereas IL12p70 would be involved in the induction of IL21 secretion. Besides, our results suggest the existence of two Tfh subsets characterised by expression of either IL21 or CXCL13. The work performed during my thesis broadens the knowledge on the functional specialisation of human DC subsets and macrophages, and provides new insight into the differentiation of human Tfh.

La première ovulation induite par effet mâle chez la brebis anovulatoire en anoestrus saisonnier est souvent accompagnée d’un développement de cycles courts qui peuvent être contrecarrés par un traitement progestatif préalable. Nos travaux ont montré que la réponse au mâle est plus rapide en fin d’anoestrus en raison d’une sélection à J0 de follicules dont le stade de développement est plus avancé. En parallèle, ils apportent de nouvelles connaissances sur le mécanisme d’action par lequel la progestérone parvient à supprimer les cycles courts induits par effet mâle, en modulant certaines caractéristiques de la dynamique de croissance folliculaire et en améliorant l’activité stéroïdogénique des follicules préovulatoires. Cependant, d’autres études sont nécessaires pour étudier l’impact de ces effets sur la qualité ovocytaire et la fertilité de ces premières ovulations induites par effet mâle sur un plus grand nombre d’animaux. / The first ovulation induced by male effect in anestrous ewes during the non-breeding season usually result in the development of short cycles that can be avoided by progesterone priming. Our results show that ewes ovulate earlier in June due to selection at J0 of follicles in a more advanced stage of development. However, these observations seem to be unrelated to the luteal outcome after male effect. In parallel, we demonstrate the positive effect of progesterone on the completion of follicular growth and the improvement of the ability of these follicles to respond properly to LH surge and to synthesis ovarian steroids. However, further studies are required to understand whether these changes have functional consequences on the quality of oocytes induced by the male effect and in fertility after male effect on a large number of animals.

Les membranes basales (MB) jouent un rôle majeur au cours des processus morphogénétiques. Elles et sont principalement composées de Collagène de type IV, de Perlecan et de Laminine. Les récepteurs d'adhésions/signalisations (Intégrines/Dystroglycans) localisés au pôle basal des cellules épithéliales, interagissent directement avec les MBs. De nombreuses études montrent l'importance de la composition des MBs dans le devenir cellulaire. Cependant, le rôle mécanique de la MB au cours du développement d'un organe multicouche n'est pas connu. Comme modèle de morphogenèse épithéliale, nous avons choisi d'étudier l'épithélium du follicule ovarien chez Drosophila melanogaster. La MB entoure chaque follicule ovarien qui est composé d'une monocouche de cellules épithéliales cuboïdes entourant un groupe interne formé de 16 cellules de la lignée germinale (15 cellules nourricières en postérieur et 1 ovocyte en antérieur). Au cours du développement folliculaire, les cellules épithéliales s'aplatissent suivant une vague antéro-postérieur. Cette transition cellulaire cuboïde – aplatie dépend du remodelage des jonctions d'adhérence et du cytosquelette. Mes travaux de thèse ont porté sur l'étude du rôle mécanique et moléculaire de la MB au cours de la morphogenèse épithéliale chez la Drosophile. J'ai ainsi pu montrer (i) que la rigidité de la MB augmente au fur et à mesure du développement du follicule, (ii) que l'aplatissement dépend de la structure de la MB et de la liaison a cette MB grâce aux intégrines (iii) que la MB s'assouplie lors de la transition cuboïde-squameux et que cette assouplissement dépend de ce processus. Ces résultats démontrent un dynamisme mécanique et moléculaire de la MB au cours de l'ovogenèse et de la morphogenèse, révélant le rôle central de la MB lors de ces processus. Parallèlement j'ai développé une approche par segmentation cellulaire afin d'extraire les valeurs métriques (hauteur, anisotropie, surface basale, volume) des cellules épithéliales et de mesurer les variations de ces paramètres au cours de la morphogenèse épithéliale (MARS-ALT) / Epithelial cell morphogenesis is an essential process for animal development. Epithelia are composed of polarized cells with a basal side interacting through Integrins, with a basement membrane (BM) and a lateral side containing cadherin-based junctional complexes. Integrins and Cadherins are, both, linked to actin filaments and are thus involved in cell shape regulation. While these links are well documented, it remains unclear how the components of the BM and the 3D organisation of this tissue influence epithelial cell morphogenesis. The model we are using to study this influence is the follicular epithelium in Drosophila melanogaster. It consists of a monolayer of 800 epithelial cells surrounding the egg chamber consisted of an internal cluster of 16 germline cells (15 nurse cells and one posteriorly-localized oocyte). An extracellular matrix (ECM), composed mainly of Collagen IV and Laminins, surrounds each follicle, directly secreted by follicular cells. During follicle development, the cuboidal epithelial cells become squamous around the nurse cells and columnar around the oocyte. The cuboidal-to-squamous transition depends on both Integrins (formed by the subunits aPS2/bPS) and Cadherin-based adherens junction remodelling. Here we designed an Atomic Force Microscopy (AFM) approach to investigate the elastic modulus of the ECM in a living ovarian follicle at different stages of development and particularly during epithelial cell morphogenesis. First, we found that the stiffness changes temporally during oogenesis with an increase of stiffness during Collagen IV deposition. Second, during cell morphogenesis, we observed a gradient of ECM stiffness. Third, by measuring the stiffness in mutants delaying or promoting cell flattening, we showed that the regional differences occurs in function of the cell ability to flatten. Fourth, to assess the involvement of Collagen IV or its structure for the ECM rigidity properties, we measured the stiffness of ECM produced by follicles mutant for Collagen IV or after collagenase treatment and concluded that collagen fibrils are the source of rigidity properties.Altogether, these results demonstrate the role of the regulation of the ECM stiffness for epithelial cell morphogenesis and highlight a new mechanical aspect in the comprehension of developmental processes

La vaccination du tissu cutané présente un fort potentiel, car elle permet le ciblage de l’antigène aux populations de cellules dendritiques uniques et spécialisées de la peau, et le recrutement de cellules inflammatoires du sang.Les cellules T helper folliculaires (TFH) jouent un rôle crucial dans l’établissement de la réponse humorale. Cependant, les interactions cellulaires et moléculaires qui gouvernent leur induction dans un contexte de vaccination restent à élucider.Mon projet de thèse a eu pour but de mieux comprendre les mécanismes d’induction des réponses TFH et humorales, par l’étude des événements précoces ayant lieu aux sites d’immunisation et d’induction de l’immunité adaptative après vaccination cutanée. L’utilisation de modèles murins nous a permis d’évaluer la contribution de différentes populations de la peau, du ganglion, et du sang dans la mise en place de ces réponses après immunisation intradermique avec un antigène particulaire présentant l’antigène modèle p24 du VIH. Cette étude a révélé un rôle crucial des cellules de Langerhans et des cellules dendritiques migratoires de la peau dans l’induction de réponses TFH et humorales.Nous avons ensuite évalué la capacité de différentes formulations d’adjuvants à polariser la réponse TFH et humorale contre un antigène de l’enveloppe du VIH à fort potentiel vaccinal. L’utilisation de l’émulsion IFA favorise l’induction des cellules TFH et induit la production d’anticorps neutralisants des souches du VIH.Ces résultats soulignent l’importance de cibler les DCs de la peau par l’utilisation de voies de vaccination pertinentes et l’utilisation d’adjuvants capables de favoriser la réponse cellulaire TFH. / Skin vaccination is of great interest, as it enables targeting of the antigen to unique and specialized dendritic cell populations of the skin, as well as recruitment of inflammatory blood cells.T follicular helper (TFH) cells play a critical role in the setting of the humoral response. However, the cellular and molecular interactions that underlie their induction after vaccination remain unknown.My thesis project aimed at understanding the immune mechanisms by which skin vaccination could favor the induction of TFH and humoral immune responses by studying the early events that take place in tissue and lymph node.Using mice models, we evaluated the relative contributions of various populations from the skin, lymph node and blood in the setting of TFH cell responses after intradermal immunization with nanoparticles coated with p24 antigen from HIV. This revealed a crucial role of Langerhans cells and skin migratory dendritic cells in the induction of TFH and germinal center responses.We then evaluated the ability of different adjuvant formulations to polarize the TFH and humoral response against a promising vaccine antigen from HIV envelope protein. Emulsifying the antigen in IFA favors the induction of TFH cells and induces the production of neutralizing antibodies able to block viral infection.This work highlights the relevance of targeting skin dendritic cells by using relevant vaccination routes and adjuvant formulation able to induce TFH cell responses.

Les Wnts représentent une famille de glycoprotéines de signalisation qui sont connues pour les nombreux rôles qu'ils jouent durant le développement embryonnaire et dans la cancerogénèse. Plusieurs Wnts, leurs récepteurs (Fzd) et d'autres composants des voies de signalisation des Wnt sont exprimés dans l’ovaire postnatal, et il a été démontré que l’expression de certains de ces gènes est régulée pendant le développement et l'ovulation/luteinization folliculaires. Toutefois, leurs rôles physiologiques dans l’ovaire demeurent mal définis. Pour étudier le rôle de WNT4 dans le développement folliculaire, nous avons entrepris d’identifier ses cibles transcriptionnels dans les cellules de la granulosa. Pour ce faire, nous avons employé la souris Catnbflox(ex3)/flox(ex3), chez laquelle une activation constitutive de la voie de Wnt/β-catenin a lieu suite à l’action de la recombinare Cre. Des cellules de la granulosa de ces souris ont été mises en culture et infectées avec un adenovirus pour causer la surexpression de WNT4 ou l’expression de Cre. L’ARN a alors été extrait de ces cellules et analysé par micro-puce. Les résultats ont démontré qu’une forte proportion des gènes induits par WNT4 étaient des gènes impliqués dans la réponse cellulaire au stress. Presque tous gènes induits par WNT4 ont également été induits par Cre, indiquant que WNT4 signale via la voie Wnt/β-catenin dans ces cellules. Nos résultats suggèrent donc que WNT4 favorise la survie des follicules par l’induction de gènes de réponse au stress dans les cellules de la granulosa, augmentant ainsi la résistance cellulaire à l'apoptose. / The Wnts comprise a large family of local-acting, secreted glycoprotein signaling molecules that are known mostly for the numerous roles they play in embryonic development and cancer. Several Wnts, their cognate receptors of the Frizzled (Fzd) family and other components of the Wnt signaling pathways are expressed in the postnatal ovary, and several have been shown to exhibit specific patterns of regulation in response to gonadotropin stimulation. Nonetheless, their role(s) in ovarian physiology remain poorly defined. To study the role of WNT4 in follicle development, we endeavoured to identify its transcriptional targets in granulosa cells. To this end, we used the Catnbflox(ex3)/flox(ex3) mouse model, in which constitutive activation of the Wnt/β-catenin pathway is obtained following Cre-mediated genetic recombination. Cultured granulosa cells from these mice were infected with adenoviruses to either overexpress WNT4 or to express Cre. RNA from these cells was then extracted and subjected to microarray analysis. Results revealed that a large proportion of the genes induced by WNT4 were genes previously shown to mediate cellular stress responses. Nearly all genes that were up-regulated by WNT4 were also induced by the Cre, indicating that WNT4 signals via the Wnt/β-catenin pathway in these cells. Our findings suggest that WNT4 mediates ovarian follicle survival by inducing a stress response in granulosa cells, thereby increasing their resistance to apoptosis.