Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: Os acidentes ofídicos constituem um problema de saúde pública, afetando regiões de clima tropical e subtropical e áreas rurais e pobres de países da América Latina, África, Ásia e Oceania. No Brasil, o gênero Bothrops é responsável por cerca de 90% dos acidentes ofídicos notificados, cujo envenenamento é caracterizado por intensa mionecrose local ineficientemente neutralizada pela soroterapia. O veneno botrópico possui uma classe de proteínas miotóxicas estruturalmente semelhantes às fosfolipases A2 (PLA2), responsáveis por induzir lesões musculares por um mecanismo não-catalítico parcialmente explicado por diferentes hipóteses. Contudo, há evidências que os efeitos miotóxico e paralisante in vitro são decorrentes de sua atividade desestabilizadora de membranas e que atuam em sinergia com as PLA2 catalíticas no envenenamento. Neste estudo, foi desenvolvido um novo protocolo de purificação da miotoxina não-catalítica (PLA2 homólogas ou proteínas PLA2-like) botrópica BthTX-I, a qual foi avaliada em testes cristalográficos, calorimétricos, miográficos e morfológicos. Potenciais inibidores vegetais da classe dos cinamatos foram co-cristalizados com a BthTX-I e testados em inibir as lesões e paralisia musculares in vitro promovida pela toxina a fim de evoluir no conhecimento da relação estrutura/atividade das PLA2 homólogas miotóxicas. Dentre todos os compostos testados, os ácidos chicórico e caftárico apresentaram-se como excelentes inibidores da BthTX-I. Contudo, foi possível ap... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Snakebites are a public health problem, concerning tropical and subtropical regions, rural and poor areas of Latin America, Africa, Asia and Oceania countries. In Brazil, Bothrops genus accounts for about 90% of reported snakebites, whose envenomation is characterized by intense local myonecrosis inefficiently neutralized by antivenom. A class of myotoxic proteins found in Bothrops venoms which is structurally similar to phospholipases A2 (PLA2), is responsible for inducing muscle injuries by a non-catalytic mechanism, partially explained by different hypotheses. However, there are evidences that myotoxic and in vitro paralyzing effects are due to their destabilizing-membrane activity and they act in synergy with the catalytic PLA2 myotoxins in envenomation. In this study, it was developed a new protocol for purification of a non-catalytic botropic myotoxin (PLA2 homologues or PLA2-like proteins) BthTX-I, which was evaluated by crystallographic, calorimetric, myographic and morphologic assays. Potential plant inhibitors of cinnamates class were co-crystallized with BthTX-I and tested to inhibit in vitro paralysis and muscle injuries promoted by the toxin. Among all the compounds tested, the chicoric and caftaric acids presented excellent BthTX-I inhibition characteristiscs. However, only chicoric acid (CA) we were able to perform crystallographic experiments, which presented different structural characteristics compared to other ligands and bothropic toxins. According to the ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Resumo: Os acidentes ofídicos foram recentemente incorporados na lista de doenças tropicais negligenciadas pela Organização Mundial de Saúde (OMS). No Brasil, uma parcela significativa destes acidentes (10%) é ocasionada pela serpente Crotalus durissus terrificus (Cdt), popularmente conhecida como cascavel. Dentre os componentes do veneno, a fosfolipase A2 secretória (sPLA2) representa aproximadamente 35% da massa do veneno seco. A Cdt sPLA2 responde pela atividade mais importante e clinicamente significativa que inicia com o processo inflamatório logo após o contato com a peçonha. Quando não tratada, a peçonha pode fazer com que o indivíduo sofra com insuficiência renal aguda, a qual não é neutralizada em curto espaço de tempo, nem mesmo pelo antiveneno específico. O processo inflamatório em diversas doenças humanas, está altamente relacionado com a formação de altas quantidades de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs e ERNs), conhecido como explosão oxidativa/nitrosativa. Este processo é combatido por moléculas de baixo peso molecular como (vitaminas D e E, e glutationa), como também por enzimas antioxidantes, como a catalase (Cat), superóxido dismutase (Sod) e peroxirredoxinas (Prx). Já foi demonstrado que as sPLA2 humanas compartilham grande similaridades bioquímicas e farmacológicas com seus homólogos de serpentes e são capazes de induzir a formação de EROs e ERNs em células de mamíferos, mas nenhum estudo até o presente momento abordou de forma sistemática danos em... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Snake envenomation have recently been added to the list of tropical neglected diseases by the World Health Organization (WHO). In Brazil, a significant portion of ophidian accidents (~ 10%) is caused by the Crotalus durissus terrificus (Cdt) snake, popularly known as rattlesnake. Among the components of the venom, secretory phospholipase A2 (sPLA2) accounts for approximately 35% of the mass of the dry venom. Cdt sPLA2 accounts for the most important clinical damages and to the ingflammmatory proccess. When untreated, venomation can cause acute renal failure, which is not neutralized in a short time, not even by the specific antivenom. The inflammatory process, which is very well characterized in several human diseases, is highly related to the formation of high amounts of reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS), known as oxidative / nitrosative burst. This process is counteracted by low molecular weight molecules such as vitamins D and E and glutathione, as well as antioxidant enzymes such as peroxiredoxins (Prx). human sPLA2 share high biochemical and pharmacological similarities with their snake homologs and are able to induce the formation of ROS and RNS in mammalian cells, but no study to date has systematically addressed damage to biomolecules carried out by ROS and RNS and the expression of peroxiredoxins in response to sPLA2 administration of snakes. We have recently shown that the administration of polyphenolic extracts of Laguncularia racemosais able to in... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

SILVA, Katiane Queiroz da. Efeito da adição de plasma seminal e de sua composição bioquimica sobre os espermatozóides epididimários de caprinos. 2009. 43 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Zootecnia, Fortaleza-CE, 2009 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-08-02T14:51:18Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_kqsilva.pdf: 313426 bytes, checksum: 9fae2725277c1fe6e2b27d9bb34c0908 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-08-02T14:51:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_kqsilva.pdf: 313426 bytes, checksum: 9fae2725277c1fe6e2b27d9bb34c0908 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:51:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_kqsilva.pdf: 313426 bytes, checksum: 9fae2725277c1fe6e2b27d9bb34c0908 (MD5) Previous issue date: 2009 / The objective of this study was to verify the effect of the addition and of the composition of the seminal plasma (SP) on the characteristics of the epididymal spermatozoa (ES) of goat. Eight goat males were used for obtaining of the biological material so that, the SP it was obtained in previous collections and stored at -18 oC until that proceeded to the addition to ES and the biochemical analyses. ES were obtained of the tail of the epididymal by the method of surgical castration. Four sample of 100 μL were removed from the "pool" of ES, and in two of them 120 μL were added of SP. Two sample, one with and other without SP, were diluted in a concentration of 200 x 106 sptz /mL, in the extender citrate-yolk (CY) and in the extender tris-yolk (TY). The samples were evaluated the vigor, motility and motility degradation rate (TDM) in fresh state and for the test of slow thermoresistence, after two and 24 hours of conservation. For the determination of fructose levels and total proteins were used specific kits of In Vitro Diagnóstico S/A®. The determination of activity of the phospholipase A2 was realized by the technique of the pH-stat. For the analysis of the data was used the statistical program SAS@. The results demonstrated that the addition of SP to ES reduced seminal parameters significantly, except in the extender TY when the animals were to grouped in function of concentration of total proteins of SP. Besides, the TY, when used to conserve the ES added of SP with low fructose concentration (540 mg/dL) preserved the seminal characteristics better. It follows that the initial concentration of fructose in the seminal plasma influenced the quality of conservation of the epididymal spermatozoa; as for the total proteins just affected the conservation in the citrate-yolk and the intensity of activity of the phospholipase A2 did not interfere in the conservation at 5 ºC of the epididymal spermatozoa of goat / O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da adição e da composição do plasma seminal (PS) sobre as características dos espermatozóides epididimários (EEP) de caprinos. Utilizaram-se oito machos caprinos para obtenção do PS, que foi obtido em coletas prévias e armazenado a -18o C até que se procedessem a sua adição aos EEP e as análises bioquímicas. Os EEP foram obtidos da cauda do epidídimo pelo método de castração cirúrgica. Do “pool” de EEP foram retiradas quatro alíquotas de 100 μL, sendo que em duas delas foram adicionados 120 μL de PS e nas outras duas não. Duas alíquotas, uma com e outra sem PS, foram diluídas a uma concentração de 200 x 106 sptz/ mL, no diluidor citrato-gema (CG) e no diluidor tris-gema (TG). As amostras foram avaliadas quanto ao vigor, à motilidade e à taxa de degradação da motilidade (TDM) no seu estado fresco e pelo teste de termorresistência lento, após duas e 24 horas de conservação. Para a determinação dos níveis de frutose e de proteínas totais foram utilizados os kits específicos da In Vitro Diagnóstico S/A®. A determinação da atividade da fosfolipase A2 foi realizada pela técnica do pH-stat. Para a análise dos dados foi utilizado o programa estatístico SAS@. Os resultados demonstraram que a adição de PS aos EEP diminuiu significativamente os parâmetros seminais avaliados, exceto no diluidor TG quando os animais foram agrupados em função da concentração de proteínas totais do PS. Além disso, o TG, quando utilizado para conservar os EEP adicionados de PS de baixa concentração de frutose (540 mg/dL) preservou melhor as características seminais avaliadas. Concluiu-se que a concentração inicial de frutose no PS influenciou positivamente a qualidade de conservação dos espermatozóides epididimários; já a de proteínas totais afetou apenas a conservação no CG e a intensidade de atividade da fosfolipase A2 não interferiu na conservação a 5 ºC dos espermatozóides epididimários de caprinos

Submitted by Rolando Ié null (rolandoye@yahoo.com.br) on 2018-04-04T17:57:27Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Ie_Rolando_Final[3220].pdf: 2455707 bytes, checksum: 3f68750eb72fdc030f1392cc3293f665 (MD5) / Rejected by Disleide Silvia Valerio Gounella null (disleide@clp.unesp.br), reason: Boa tarde. Fazer as seguintes modificações: - Alterar o título do arquivo para o nome do trabalho, ou seja, o arquivo deverá ter o título da dissertação; - Incluir a folha de aprovação com data e assinada pela banca; - Acertar a formatação da ficha catalográfica; - Corrigir a palavras chave "veneno serpente" que estão separadas, para "venenos de serpentes" como consta no seu trabalho. Qualquer dúvida, entre em contato. abs. Disleide Silvia Valerio Gounella Bibliotecária CLP - São Vicente Fone: (13)3569-7154 Mailto: disleide@clp.unesp.br skype: disleidesilviavaleriogounella on 2018-04-04T19:13:48Z (GMT) / Submitted by Rolando Ié null (rolandoye@yahoo.com.br) on 2018-04-11T17:36:23Z No. of bitstreams: 1 Avaliação da ação protetora de extratos de Laguncularia racemosa na evolução da atividade farmacológica de sPLA2 Danos moleculares e resposta antioxidante durante o processo inflamatório..pdf: 3375211 bytes, checksum: 47ae3733003877ba3ff44a4417474111 (MD5) / Approved for entry into archive by Disleide Silvia Valerio Gounella null (disleide@clp.unesp.br) on 2018-04-11T18:09:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ie_r_me_svic.pdf: 2864379 bytes, checksum: 0b7eb6759926f7f64a9bfde5500083ea (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-11T18:09:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ie_r_me_svic.pdf: 2864379 bytes, checksum: 0b7eb6759926f7f64a9bfde5500083ea (MD5) Previous issue date: 2018-02-22 / Outra / Os acidentes ofídicos foram recentemente incorporados na lista de doenças tropicais negligenciadas pela Organização Mundial de Saúde (OMS). No Brasil, uma parcela significativa destes acidentes (10%) é ocasionada pela serpente Crotalus durissus terrificus (Cdt), popularmente conhecida como cascavel. Dentre os componentes do veneno, a fosfolipase A2 secretória (sPLA2) representa aproximadamente 35% da massa do veneno seco. A Cdt sPLA2 responde pela atividade mais importante e clinicamente significativa que inicia com o processo inflamatório logo após o contato com a peçonha. Quando não tratada, a peçonha pode fazer com que o indivíduo sofra com insuficiência renal aguda, a qual não é neutralizada em curto espaço de tempo, nem mesmo pelo antiveneno específico. O processo inflamatório em diversas doenças humanas, está altamente relacionado com a formação de altas quantidades de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs e ERNs), conhecido como explosão oxidativa/nitrosativa. Este processo é combatido por moléculas de baixo peso molecular como (vitaminas D e E, e glutationa), como também por enzimas antioxidantes, como a catalase (Cat), superóxido dismutase (Sod) e peroxirredoxinas (Prx). Já foi demonstrado que as sPLA2 humanas compartilham grande similaridades bioquímicas e farmacológicas com seus homólogos de serpentes e são capazes de induzir a formação de EROs e ERNs em células de mamíferos, mas nenhum estudo até o presente momento abordou de forma sistemática danos em biomoléculas efetuados por EROs e ERNse a expressão de proteínas antioxidantes em resposta a administração de sPLA2 de serpentes. Recentemente demonstramos que a administração de extratos de Laguncularia racemosa (mangue branco) capazes de inibir a ação da trombina, entretanto não foram efetuadas avaliações se a aplicação do extrato de L. racemosa frente a Cdt sPLA2. Também e importante salientar que apesar de existir inúmeros trabalhos de caracterização bioquímica, farmacológica e estrutural de sPLA2 de serpentes até o presente momento poucos trabalhos tiveram como objetivo sua produção de forma recombinante. Este ponto é importante pois a manipulação gênica destas proteínas, através de mutações sitio dirigidas, podem auxiliar a identificar resíduos envolvidos na catálise, levando a uma melhor compreensão dos mecanismos funcionais, abrindo caminho para novas abordagens terapêuticas para o tratamento do envenenamento por serpentes. Adicionalmente, a enzima sPLA2 de origem animal é utilizada em processos biotecnológicos e possui importância econômica. Este trabalho teve dois grandes objetivos: 1) investigar a existência de danos oxidativos, a expressão de proteínas antioxidantes em resposta a administração de sPLA2 de Crotalus durissus terrificus (Cdt sPLA2), bem com avaliar possíveis efeitos protetores da administração de extratos butanólico e de acetato de etila extraídos de folhas de L. racemosa após a inoculação da Cdt sPLA2 na fase tardia da edemaciação; 2) Obtenção de sPLA2 recombinante de Cdt (Cdt sPLA2r) visando fornecer subsídios para sua manipulação genética e maior entendimento de seu funcionamento. Com relação ao primeiro objetivo nossos resultados indicam que os extratos de L. racemosa não são capazes de inibir o processo de edemaciação induzido por Cdt sPLA2. A investigação de processos indicadores de estresse oxidativo como oxidação de sulfidrilas, carbonilação proteica e peroxidação lipídica não idicaram a existência de estresse oxidativo na fase tardia do processo de edemaciação ocasionado por Cdt sPLA2. Tambem avaliamos os níveis de expressão e modificação das proteínas antioxidantes Sod, Cat e Prx2 por western blot, e os resultados também revelaram que os níveis da enzima foram muito similares independente da administração de Cdt sPLA2 ou Cdt sPLA2 com extratos de L. racemosa. Em conjunto os resultados indicam fortemente que não ocorre estresse oxidativo na fase tardia do processo da edemaciação por Cdt sPLA2.No caso do segundo objetivo foi possível clonar, expressar e purificar a enzima recombinante Cdt sPLA2 (Cdt sPLA2r). Análises da atividade de fosfolipase revelaram que Cdt sPLA2r possuipadrão de atividade Michaeliana ao passo que a enzima purificada do veneno possui perfil alostérico. Adicionalmente a velocidade inicial (V0) de Cdt sPLA2r(10.8 × 10-1 µM/s) foi maior que para a enzima nativa (7.1 × 10-1 µM/s). A expressão de Cdt sPLA2r abre caminhos para investigações envolvendo mutações sítio dirigidas para melhor entendimento da enzima, a qual também possui importância biotecnológica. Em conjunto os resultados apresentados neste trabalho representam avanços na compreensão do processo de toxicológico envolvido na ação de Cdt sPLA2 e de sua expressão recombinante. / Snake envenomation have recently been added to the list of tropical neglected diseases by the World Health Organization (WHO). In Brazil, a significant portion of ophidian accidents (~ 10%) is caused by the Crotalus durissus terrificus (Cdt) snake, popularly known as rattlesnake. Among the components of the venom, secretory phospholipase A2 (sPLA2) accounts for approximately 35% of the mass of the dry venom. Cdt sPLA2 accounts for the most important clinical damages and to the ingflammmatory proccess. When untreated, venomation can cause acute renal failure, which is not neutralized in a short time, not even by the specific antivenom. The inflammatory process, which is very well characterized in several human diseases, is highly related to the formation of high amounts of reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS), known as oxidative / nitrosative burst. This process is counteracted by low molecular weight molecules such as vitamins D and E and glutathione, as well as antioxidant enzymes such as peroxiredoxins (Prx). human sPLA2 share high biochemical and pharmacological similarities with their snake homologs and are able to induce the formation of ROS and RNS in mammalian cells, but no study to date has systematically addressed damage to biomolecules carried out by ROS and RNS and the expression of peroxiredoxins in response to sPLA2 administration of snakes. We have recently shown that the administration of polyphenolic extracts of Laguncularia racemosais able to inhibit the action of thrombin, however, were not evaluated the action of L. racemosa extractsadministration combat the deleterious effects of the Cdt sPLA2. It is also important to point out that although there are numerous biochemical, pharmacological and structural characterizations of sPLA2 from snakes, at the presene, few studies have aimed at its production by recombinant techniques. This is very important since the genetic manipulation of these proteins through site-directed mutations can help identify residues involved in catalysis, leading to a better understanding of the functional mechanisms, which may in future be reflected in new therapeutic approaches. Additionally, these enzymes are used in biotechnological processes.This work had two main objectives: 1) to investigate the existence of oxidative damages, the expression of antioxidant proteins in response to sPLA2 administration of Crotalus durissus terrificus (Cdt sPLA2), and to evaluate possible protective effects of the administration of butanolic and acetate extracts of ethylene extracted from L. racemosa leaves after inoculation of the Cdt sPLA2 at the late stage of edema; 2) the production of recombinant Cdt sPLA2 (Cdt sPLA2r) to provide subsidies for its genetic manipulation aiming a better understanding of molecular aspects of the enzyme function as also its applicability in biotechnological processes. Regarding the first objective, our results indicate that extracts of L. racemosawere not able to inhibit the process of the edema induced by Cdt sPLA2. The investigation of oxidative stress markers such as sulfhydryl oxidation, protein carbonylation and lipid peroxidation did not identify the existence of oxidative stress in the late phase of the edemaprocess caused by Cdt sPLA2. We also evaluated levels of expression and modification of the antioxidant proteins Sod, Cat and Prx2 by western blot, and the results also revealed that enzyme levels were very similar regardless of the administration of Cdt sPLA2 or Cdt sPLA2 with extracts of L. racemosa. Together the results strongly indicate that oxidative stress does not occur in the late phase of the edema caused by Cdt sPLA2. In the case of the latter objectives it was possible to clone, express and purify the recombinant enzyme Cdt sPLA2 (Cdt sPLA2r). Analysis of the phospholipase activity revealed that Cdt sPLA2r has a Michaelian environment activity whereas the enzyme purified from the venom has an allosteric profile. In addition, the initial velocity (V0) of the Cdt sPLA2r (10.8 × 10-1 μM / s) was higher than for the native enzyme (7.1 × 10-1 μM / s). The expression of Cdt sPLA2r opens pathways for investigations involving site directed mutations to a better understanding of the enzyme, which also has biotechnological importance. Together the results presented in this work represent advances in the understanding of the toxicological process involved in the action of Cdt sPLA2 and its recombinant expression.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / CHAPTER II: Toxoplasmosis affects a third of world population with high incidence in tropical areas. Since this disease has great relevance in health public, the search for new therapeutic approaches has been considered. Here, we report the antiparasitic effects of BnSP-­7 toxin, a Lys49 phospholipase A2 homologue from Bothrops pauloensis snake venom, on Toxoplasma gondii. BnSP-­7 presented activity against HeLa host cells in higher doses (200 μg/mL to 50 μg/mL) by MTT assay, whereas in lower doses (25 μg/mL to 1.56 μg/mL) does not interfere with HeLa viability. Also, the toxin did not presented effects on T. gondii tachyzoite viability as carried out by trypan blue exclusion, but decreased both adhesion and parasite proliferation, when tachyzoites were treated before infection. We also performed cytokine measurements from supernatants collected from HeLa cells infected with T. gondii tachyzoites previously treated with RPMI or BnSP-­7. MIF and IL-­6 productions by HeLa cells were increased by BnSP-­7 treatment. These data suggest that the BnSP-­7 toxin is an important tool for the discovery of new parasite targets that can be exploited to develop new drugs for toxoplasmosis treatment. / CAPÍTULO II: A toxoplasmose afeta um terço da população mundial com alta incidência em áreas tropicais. Uma vez que esta doença tem grande relevância na saúde pública, a busca por novas abordagens terapêuticas são constantemente exigidas. Neste trabalho nós relatamos os efeitos antiparasitários da toxina BnSP-­7, uma fosfolipase A2 Lys49 homóloga da peçonha de Bothrops pauloensis, em Toxoplasma gondii. BnSP-­7 apresentou citotoxicidade contra células HeLa em doses mais elevadas (200 μg/mL a 50 ug/ ml), enquanto que em doses mais baixas (25 ug/ml a 1,56 ug/ml), a toxina não interferiu na viabilidade da HeLa. A toxina não alterou a viabilidade de formas taquizotas de T. gondii, realizado pelo ensaio de exclusão de azul de tripan, mas diminuiu tanto a adesão quanto à proliferação desses parasitas, quando foram tratados antes da infecção. Também foi realizado a dosagem de citocinas a partir de sobrenadantes recolhidos a partir de células HeLa infectadas com formas taquizoítas de T. gondii previamente tratados com meio RPMI ou BnSP-­7. A produção de MIF e IL-­6 foram aumentadas pelas células HeLa após o tratamento com BnSP-­7. Estes dados sugerem que a toxina BnSP-­7 é uma ferramenta importante para a descoberta de novos alvos de parasitas que podem ser explorados para desenvolver novos fármacos para o tratamento da toxoplasmose. / Mestre em Genética e Bioquímica

A bothropstoxina I (BthTX-I) é uma miotoxina isolada do veneno da serpente brasileira Bothrops jararacussu, a qual é um membro da família das fosfolipases A2, mas não apresentam atividade catalítica devido á substituição D49K. A proteína for fornecida pelo Prof. Dr. J. R. Giglio e Profa. Dra. A. C. O. Cintra do Departamento de Bioquímica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e usada em experimentos de cristalização, os quais foram realizados usando a técnica de difusão de vapor \"hanging drop\" a 18°C. A BthTX-I cristalizou em tampão HEPES 0.1 M, pH variando entre 7.0 e 7.6. O agente precipitante foi o (NH4)SO4 em concentrações que variaram de 57% a 62% de saturação. A coleta de dados foi inicialmente feita utilizando o difratômetro automático R-AXIS IIC da Rigaku Co. do Laboratório de Cristalografia de proteínas do IFSC-USP. Subseqüentemente foi realizado uma segunda coleta de dados no SERC Daresbury Laboratory na Inglaterra, usando radiação síncrotron. A BthTX-I cristalizou no grupo espacial P3121 com os seguintes parâmetros de rede: a=b=57.58 ANGSTROM, c= 131.27 ANGSTROM, ALPHA=BETA=90° e GAMA=120°. O processamento de dados foi realizado com o programa MOSFLM, conduzindo a um Rmerge=6.3% e completeza de 99.6% a uma resolução de 2.1 ANGSTROM. A estrutura foi resolvida por Substituição Molecular, utilizando o programa AMoRe, onde foi utilizada como modelo inicial a estrutura da miotoxina da serpente Agkistrodon piscivorus piscivorus e refinada usando o programa XPLOR que conduziu a um fator Rfinal= 18.7% e Rfree=27.4%. A unidade assimétrica contém dois monômeros, os quais podem ser escolhidos de forma a apresentar interações similares aquelas descritas para a miotoxina II da Bothrops asper. A superfície de interface é entretanto, surpreendentemente pequena quando comparada com outras estruturas diméricas e a complementaridade é menor do que o valor esperado. Um modelo teórico para a ligação do fosfolipídeo na BthTX-I sugere que nenhuma interação direta entre a ligação ester sn-2 e a K49 deve ser esperada de forma a explicar a falta de atividade catalítica. Foi visto também, que é possível se reproduzir um dendrograma baseado na seqüência de aminoácidos, pelo uso de estruturas tridimensionais para os membros da família das PLA2 / Bothropstoxin- I (BthTX-I) is a myotoxin isolated from the Brazilian snake Bothrops jararacussu which is a member of the phospholipase A2 but presents no catalytic activity due to a D49K substitution. Protein was provided from the Departamento de Medecina de Ribeirão Preto by Prof. Dr. J. R. Giglio and Profa. Dra. A. C. O. Cintra and used in crystallization experiments which were performed using the vapor diffusion technique in hanging drops at 18°C. The BthTX-I crystallized in 0.1 M HEPES, pH ranging from 7.0 to 7.6. The precipitant was (NH4)SO4 in concentrations ranging from 57% to 62%. The data collection was initially performed using the automatic difractometer R-AXIS IIC from the Rigaku Co. at the Laboratório de Cristalografia of IFSC-USP. Subsequently a second data set was collected at SERC Daresbury Laboratory in England using synchrotron radiation. BthTX-I crystallizes in space group P3121 with a=b=57.58 ANGSTROM, c= 131.27 ANGSTROM, ALPHA=BETA=90° e GAMA=120°. Processing of the data was performed with the MOSFLM program yielding an Rmerge= 6.3% and completeness of 99.6% at 2.1 ANGSTROM. resolution. The structure was solved by Molecular Replacement using the package AMoRe with the Agkistrodon piscivorus piscivorus enzyme as search model and refined using the refinement program X-PLOR to a Rfinal= 18.7% and Rfree=27.4%. The asymmetric unit contains two BthTX-I monomers, which can be chosen such that they present similar interactions to those described for the homologous myotoxin II from Bothrops asper. The interface is, however, surprisingly small when compared to other dimeric structures and is less complementary than expected. A theorical model for phospholipid building to BthTX-I suggests that no direct interactions between the sn-2 ester bond and K49 would be expected, thus explaining the lack of catalytic activity. It is shown that it is possible to reproduce a dendrogram based on amino acid sequences and by the use of three dimensional structures for members of the PLA2 family

Os mastócitos participam do sistema imunológico liberando mediadores farmacologicamente ativos. A principal via de ativação dos mastócitos é através do receptor de alta afinidade para a imunoglobulina E (FcRI). A ativação dos mastócitos via FcRI culmina com a liberação de mediadores. A enzima PLD atua sobre fosfolipídios hidrolisando a fosfatidilcolina em ácido fosfatídico e colina. A PLD é ativada após o estímulo via FcRI e possui um papel importante na transdução do sinal em mastócitos. Existem duas isoformas da enzima PLD, a PLD1 e a PLD2 que são expressas, diferentemente, de acordo com o tipo celular. Ambas as isoformas podem estar expressas numa mesma célula, apenas uma ou nenhuma. Neste estudo foram utilizadas células RBL-2H3 transfectadas para a super expressão PLD2 nas formas catalítica ativa (CA) e inativa (CI). O papel da PLD2 foi examinado nestas células com o objetivo de elucidar sua atuação no processo de secreção incluindo o aparelho de Golgi e os grânulos secretores. As células CA e CI possuem maior atividavidade de -hexosaminidase total, porém quando estimuladas mostram uma deficiência na liberação desta enzima, quando comparadas com as células selvagens. A PLD2 nas células CA, CI, VET e RBL-2H3 está localizada no citosol, sendo abundante na região justanuclear, principalmente nas células CI, sugerindo uma associação com o aparelho de Golgi. A dupla marcação com o mAb AA4, que imunomarca gangliosídeos derivados do GD1b da membrana plasmática e com anti-PLD2, mostrou que esta enzima não se localiza na membrana plasmática. A dupla marcação com anti-PLD2 e anti-GM130 mostrou que as áreas de maior concentração da PLD2 se co-localizam com o aparelho de Golgi, especialmente nas células CI. A marcação com anti-GM130 e os experimentos com microscopia eletrônica de transmissão mostraram que o aparelho de Golgi está organizado nas células CA e desorganizado nas células CI, onde se encontra disperso no citoplasma. Ainda, as células CI expressam menos GM130 em comparação com as demais linhagens celulares. Quando a produção de PA pela PLD está inibida pelo 1-Butanol, as células CA apresentam as mesmas características fenotípicas das células CI. A incubação das CI com PA resulta na reestruturação do aparelho de Golgi. A manutenção estrutural do aparelho de Golgi, também está relacionada com os microtúbulos. Nas células CI o centro organizador de microtúbulos é dificilmente identificado. Os microtúbulos nas células CI são desordenados em comparação com as demais linhagens celulares. Estes resultados mostram que a produção de PA pela PLD2 é importante na organização de microtúbulos e na manutenção da estrutura do aparelho de Golgi. As alterações celulares relacionadas com os microtúbulos e o aparelho de Golgi afetam o processo secretor nestas células e, provavelmente, em outros tipos de células secretoras. Estes achados poderão levar a novas estratégias terapêuticas para controlar a liberação de mediadores durante processos alérgicos e inflamatórios. / Mast cells are components of the immune system that liberate a wide variety of pharmacologically active mediators. The principle method of activating mast cells is through the high affinity receptor for IgE (FcRI). This activation then culminates with the release of mediators. Phospholipase D (PLD) acts on phospholipids, hydrolyzing phosphatidylcholine to phosphatidic acid (PA) and choline. PLD is activated following stimulation via FcRI and plays an important role in signal transduction in mast cells. PLD has two isoforms, PLD1 and PLD2, which are differentially expressed depending on the cell type where none, one or both may be expressed. RBL-2H3 cells, a mast cell line, transfected to super express catalytically active (CA) and inactive (CI) forms of PLD2 were used in the present study. The role of PLD2 was examined in these cells in order to clarify the action of PLD2 in the secretory process. Although the CA and CI cells posses a greater total -hexosaminidase activity, when stimulated these cells release less -hexosaminidase than cells transfected with empty vector or wild type RBL-2H3 cells. In all cell lines, PLD2 was dispersed throughout the cytoplasm with a concentration in the juxtanuclear region suggesting an association of PLD2 with the Golgi apparatus. Double labeling with anti-PLD2 and mAb AA4, which recognizes gangliosides derived from GD1b on the plasma membrane, showed that PLD2 was not associated with the plasma membrane. When the cells were double labeled with anti-PLD2 and anti-GM130, which labels the cis-Golgi saccules, PLD2 does colocalize with the Golgi apparatus, especially in CI cells. Labeling with anti-GM130 alone as well as experiments employing transmission electron microscopy revealed that the Golgi apparatus is well organized in the CA cells, but is disorganized and dispersed in the cytoplasm in the CI cells. By Western Blotting, the CI cells also expressed less GM130 than the other cell lines. When the production of PA by PLD2 was inhibited by 1-Butanol, the Golgi apparatus of the CA cells presented the same phenotypic characteristics as that of the CI cells. Conversely, incubation of the CI cells with PA resulted in the reorganization of the Golgi apparatus. The structural maintenance of the Golgi apparatus is also related to microtubules. In the CI cells, the microtubule organizing center was difficult to identify and the microtubules were disorganized in the cytoplasm as compared to the other cell lines. These results show that the production of PA by PLD2 is important in the arrangement of the microtubules and in maintaining the structure of the Golgi apparatus. Alterations in the distribution of the microtubules and the structure of the Golgi apparatus in the CI cells affect the secretory process in these cells, and such alterations may affect the secretory process in other cell types as well. The findings presented here may lead to new therapeutic strategies to control the production and release of mediators during allergic and inflammatory processes.

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T09:30:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cotrim_CamilaAparecida_M.pdf: 24882799 bytes, checksum: f5ac35590f5619d941a17e8aa3f11bb4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Nas últimas décadas, o uso de compostos naturais como flavonóides e sapogeninas tem sido largamente difundidos na indústria farmacêutica devido suas atividades antiinflamatórias, prevenção de câncer e de doenças cardiovasculares. Neste trabalho, foi avaliado o efeito da quercetina (flavonóide) e hecogenina (sapogenina), sobre as atividades catalítica e farmacológicas de uma isoforma de fosfolipase A2 secretória (sPLA2) de Crotalus durissus terrificus em duas situações: pré-incubado e co-incubado. Na préincubação, a sPLA2 pura foi incubada com os compostos e os resultados indicam modificações estruturais na estrutura secundária como evidenciada pelas análise de dicroísmo circular. Os dois compostos foram capazes de diminuir a atividade enzimática, porém, somente a quercetina foi capaz de diminuir a mionecrose. Nenhum dos compostos apresentou efeito sobre a formação de edema. Na co-incubação, três concentrações diferentes dos compostos foram misturados com sPLA2 e imediatamente testados. A coincubação mostrou uma menor ação sobre atividade catalítica quando comparado com a préincubação, sugerindo a importância da incubação dos compostos com a proteína. Entretanto, a co-incubação mostrou melhor efeito sobre as atividades farmacológicas (edema e miotoxidade). Os resultados obtidos sugerem a existência de dois sítios farmacológicos distintos, um relacionado com sítio enzimático e outro distinto dessa atividade. Além disso, estudos de docking realizados entre a sPLA2 e a quercetina mostraram a existência de ligações de hidrogênio, interações polares e hidrofóbicas, sugerindo que outros flavonóides com estruturas similares podem se ligar à sPLA2. Além de avaliar o efeito da quercetina sobre a sPLA2 de Crotalus durissus terrificus foi avaliado o efeito sobre uma sPLA2 cataliticamente inativa (Lys49-sPLA2) de Bothrops pirajai. O resultado de dicroísmo circular não apresentou modificações em nível de estrutura secundária, entretanto, estudo de estabilidade mostrou que a quercetina leva a uma maior estabilidade térmica da estrutura proteica frente a altas temperaturas, tornando o processo de desnaturação reversível. Apesar da ausência de atividade catalítica, Lys49-sPLA2 apresentou formação de edema, miotoxidade e uma baixa agregação plaquetária. Entretanto, nenhuma das atividades farmacológicas foi inibida significativamente pela quercetina. Os resultados apresentados mostram que o uso de compostos fenólicos são uma boa iniciativa para estudar e melhor entender as ações de sPLA2 purificadas do veneno de serpente. / Abstract: In the last decades, the use of natural compounds, such as flavonoids and sapogenins has been applied to various pharmaceutical industries due their anti-inflammatory, câncer preventive and cardiovascular protective activities. In this study was evaluated the effect of quercetin (flavonoid) and hecogenin (sapogenin) on the catalytic and pharmacological activity of a secretoy phospholipase A2 from Crotalus durissus terrificus in two different situations: pre-incubated and co-incubated. In the pre-incubation situation, native sPLA2 was incubated with the compounds and the results have shown structural modifications in secondary structure as evidenced through circular dicroism. Both compounds were able to decrease catalytic activity, however, just quercetin was able to decrease myonecrosis. None of the compounds have shown effects on the oedema formation. In the co-incubation, three different concentrations of both compounds were mixed with sPLA2 and immediately tested. Co-incubation has shown lesser effect on catalytic activity than pre-incubation, suggesting an important role of incubation process. Nevertheless, co-incubation presented better effects in pharmacological activities (oedema and myotoxic). These results suggest the existence of two pharmacological sites in the protein, one that is correlated with the enzymatic site and another that is distinct from it. In addition, molecular docking studies between sPLA2 and quercetin showed the existence of hydrogen-bonded, polar interactions and hydrophobic interactions, suggesting that other flavonoids with similar structures could bind to sPLA2. Besides to evaluate the effect of quercetin on a Crotalus durissus terrificus sPLA2, was also evaluated the effect of this compound on a sPLA2 inactive catalytically (Lys49-sPLA2) from Bothrops pirajai. Dicroism circular results did not show modifications in secondary structure, however, thermal stability study have shown that quercetin is able to increase the stability of sPLA2 in high temperatures, in addition to become the denaturation a reversive process. Despite of the lack of catalytic activity, Lys49-sPLA2 has shown oedema formation, myotoxic and a low platelet aggregation. Although none of pharmacological activities was significantly abolish by quercetin. The results have shown that the use of phenolics compounds are a good point to study and better understand the actions of sPLA2 purified from venom snake. / Mestrado / Bioquimica / Mestre Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Marcos Hikari Toyama, Kléber Luiz de Araújo e Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T12:34:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moure_MarianaCristinaRodriguez_M.pdf: 1080274 bytes, checksum: a6e3e078955c429c6eb371ccab0b187e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A anémona do mar Bunodosoma caissarum possui mais de 40 proteínas diferentes, como mostrado através da eletroforese 2-D, o que pode levar a uma variedade de efeitos biológicos. Foram investigados também alguns parâmetros farmacológicos, onde se pode verificar a capacidade desta toxina em interagir com modelos de homeostase sanguínea, no caso em particular das agregações plaquetárias, assim como sua capacidade de indução à inflamação, através do edema de pata de rato, onde se observou um aumento de até 400% de modo proporcional a quantidade de material utilizada, sendo o máximo de 12ug/ml. Nos ensaios antibacterianos foi possível observar que o extrato de B caissarum apresentou diminuição de aproximadamente 97% da bactéria Xanihomonas axonopodis. O efeito toxicológico da Bunodosoma caissarum foi estudado através da utilização duas linhagens celulares pancreáticas tumorais RINm5F e RINm5F-Cat (esta última superexpressando a enzima catalase), onde após o período de exposição ao veneno (até 72 h) foi observado um aumento da morte na células RINm5F de modo dose-tempo depentende de até 60%, enquanto que as células RINm5F- Cat não apresentaram diminuição de sua viabilidade celular em nenhuma dose e tempo utilizada, mostrando que a B caissarum poderia causar a morte celular através do aumento do stress oxidativo. A determinação de espécies reativas de oxigênio no meio intracelular foi medido através da fluorescência do DCFH-DA, formados através da incubação com o extrato de B caissarum, mostrando um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio de mais de 100% quando comparadas com as células controle. A análise das principais enzimas antioxidantes mostrou que o extrato de B caissarum causou um aumento da atividade da enzima Cu/ZnSOD, tanto para as células RINm5F controle como para as com superexpressão da enzima catalase (RINm5F. Cat), enquanto que, a atividade da enzima glutationa peroxidase não sofreu nenhuma diferença nas células RINm5F controle ou nas RINm5F.Cat. e a enzima catalase não aumentou na células RINm5F e se manteve alta nas células RINm5F.Cat. Sendo assim, Bc provocou um aumento das espécies reativas de oxigenio, sendo principalmente de oxigênio superóxido. Resumindo, este trabalho visa contribuir de forma modesta ao entendimento da ação de toxinas de anémonas do mar mostrando que a Bunodosoma caissarum possui características antibacteriana, cítotóxica, inflamatório e trombolíticos que podem ser de grande xi interesse biológico e farmacológico, e o possível mecanismo de citotoxicidade B. caissarum em células de mamíferos, que inclui aumento do estresse oxidativo com excessiva produção de peróxido de hidrogênio, pelo menos no caso das células produtoras de insulina / Abstract: Acording to our studies, we could notice that the sea anemone, Bunodosoma caissarum have more than 40 different protein, as showed through the electrophoresis 2-D, what may lead to a variety of biological effects. Also was investigated, some pharmacological parameters where we could confirm the ability of this toxin on interacting with models of blood homeostasis. In particular case of the platelet aggregation, as well as its ability to induce inflammation, trough the edema in rat paw, where we could observe an increased response proportional to the amount of used material. In the antibacterian tests it was possible to observe that the Be extracts presents a decrease in the numbers of severals bacterias in a dose dependent way. The toxicological effect of the Bunodosoma caissarum was studied through the use of two pancreatic tumor cell lines RINm5F and RINm5F-Cat (the last one overexpressing the enzyme catalase), where after the period of exposure to the poison (till 72h), was observed an increase in RINmSF cell death, much greater than when compared with cells RINm5F-Cat, in every doses and administrated time, showing that the Be could cause cell death through the oxidative stress increase. The DCFH-DA test measured the production of reactive oxygen species intracellularly formed by incubation with the Be extract, showing an increase in the production of reactive oxygen species of more than 100% when compared with control cells. The analysis of the main antioxidant enzymes showed that the Be extract caused an increase in enzyme Cu/ZnSOD activities, both cells Rinm5F control and for the overexpression of catalase (RINm5F. Cat), while the glutathione peroxidase did not suffered any difference in RINm5F cell control or in the RINm5F.Cat. and the catalase enzyme did not increase in the RINm5F cells and remained high in cells RINm5F.Cat. So, we could believe that Be caused an increase in the reactive oxygen species, being mainly the oxygen superoxide. Abstracting, this paper aims to contribute modestly to the understanding in molecular level of the sea anemone toxin action, showing that the Bunodosoma caissarum have antibacterial, cytotoxic, inflammatory and thrombolytic characteristics that can be of great biological and pharmacological interest, and the possible mechanism of cytotoxicity of the Bunodosoma caissarum in mammals cell, certainly includes increased oxidative stress with excessive production of hydrogen peroxide, at least in the case of insulin-producing cells / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da adiÃÃo e da composiÃÃo do plasma seminal (PS) sobre as caracterÃsticas dos espermatozÃides epididimÃrios (EEP) de caprinos. Utilizaram-se oito machos caprinos para obtenÃÃo do PS, que foi obtido em coletas prÃvias e armazenado a -18o C atà que se procedessem a sua adiÃÃo aos EEP e as anÃlises bioquÃmicas. Os EEP foram obtidos da cauda do epidÃdimo pelo mÃtodo de castraÃÃo cirÃrgica. Do âpoolâ de EEP foram retiradas quatro alÃquotas de 100 μL, sendo que em duas delas foram adicionados 120 μL de PS e nas outras duas nÃo. Duas alÃquotas, uma com e outra sem PS, foram diluÃdas a uma concentraÃÃo de 200 x 106 sptz/ mL, no diluidor citrato-gema (CG) e no diluidor tris-gema (TG). As amostras foram avaliadas quanto ao vigor, à motilidade e à taxa de degradaÃÃo da motilidade (TDM) no seu estado fresco e pelo teste de termorresistÃncia lento, apÃs duas e 24 horas de conservaÃÃo. Para a determinaÃÃo dos nÃveis de frutose e de proteÃnas totais foram utilizados os kits especÃficos da In Vitro DiagnÃstico S/AÂ. A determinaÃÃo da atividade da fosfolipase A2 foi realizada pela tÃcnica do pH-stat. Para a anÃlise dos dados foi utilizado o programa estatÃstico SAS@. Os resultados demonstraram que a adiÃÃo de PS aos EEP diminuiu significativamente os parÃmetros seminais avaliados, exceto no diluidor TG quando os animais foram agrupados em funÃÃo da concentraÃÃo de proteÃnas totais do PS. AlÃm disso, o TG, quando utilizado para conservar os EEP adicionados de PS de baixa concentraÃÃo de frutose (540 mg/dL) preservou melhor as caracterÃsticas seminais avaliadas. Concluiu-se que a concentraÃÃo inicial de frutose no PS influenciou positivamente a qualidade de conservaÃÃo dos espermatozÃides epididimÃrios; jà a de proteÃnas totais afetou apenas a conservaÃÃo no CG e a intensidade de atividade da fosfolipase A2 nÃo interferiu na conservaÃÃo a 5 ÂC dos espermatozÃides epididimÃrios de caprinos / The objective of this study was to verify the effect of the addition and of the composition of the seminal plasma (SP) on the characteristics of the epididymal spermatozoa (ES) of goat. Eight goat males were used for obtaining of the biological material so that, the SP it was obtained in previous collections and stored at -18 oC until that proceeded to the addition to ES and the biochemical analyses. ES were obtained of the tail of the epididymal by the method of surgical castration. Four sample of 100 μL were removed from the "pool" of ES, and in two of them 120 μL were added of SP. Two sample, one with and other without SP, were diluted in a concentration of 200 x 106 sptz /mL, in the extender citrate-yolk (CY) and in the extender tris-yolk (TY). The samples were evaluated the vigor, motility and motility degradation rate (TDM) in fresh state and for the test of slow thermoresistence, after two and 24 hours of conservation. For the determination of fructose levels and total proteins were used specific kits of In Vitro DiagnÃstico S/AÂ. The determination of activity of the phospholipase A2 was realized by the technique of the pH-stat. For the analysis of the data was used the statistical program SAS@. The results demonstrated that the addition of SP to ES reduced seminal parameters significantly, except in the extender TY when the animals were to grouped in function of concentration of total proteins of SP. Besides, the TY, when used to conserve the ES added of SP with low fructose concentration (540 mg/dL) preserved the seminal characteristics better. It follows that the initial concentration of fructose in the seminal plasma influenced the quality of conservation of the epididymal spermatozoa; as for the total proteins just affected the conservation in the citrate-yolk and the intensity of activity of the phospholipase A2 did not interfere in the conservation at 5 ÂC of the epididymal spermatozoa of goat