Made available in DSpace on 2014-07-29T16:11:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Fabiula.pdf: 1283219 bytes, checksum: 9daa5fd6fda20c31ea6e9dd5731a9e99 (MD5) Previous issue date: 2009-09-18 / Inflammation is a local reaction of tissue involving neurological, vascular, humoral and cellular reactions to eliminate the causal agents and reduce the cellular damages. Prostaglandins, thromboxanes and leukotrienes are examples of chemical inflammation mediators, resulting for the action of the enzyme phospholipase A2 (PLA2). The PLA is a enzyme that hydrolyses membrane phospholipids in the sn-2 position resulting in lisophospholipids and arachidonic acid (AA), taking a key role in the production of lipidic inflammatory mediators. The research and development of new chemical entities security, effective and that presents less side effects to the particular therapeutic target, constituted the principal objective of technological innovation in pharmaceuticals industry. Due the side effects of selective inhibitors of the production of eicosanoids currently presents in the market, control of production of AA by inhibiting PLA2 is a useful treatment for pathological conditions that are caused by mediators of the AA. In this work synthetic routes were studied to obtain new candidates prototypes of anti-inflammatory drugs obtained by rational planning of new piperazines derivatives originally designed from nerolidylcatechol (25) and arilsulfonilpiperazines (26) to presents the inhibitory profile of secreted PLA2 enzyme. The final synthesized compound, N-(benzo[d][1,3]dioxol-5-aryl) acetamide (18), E-N-(3,7-dimetylocta-2,6-dienyl) benzo[d] [1,3]dioxol-5-amine (19), (E)-N-(6-dienil,3,7-dimetilocta-2)aminobenzeno (20), (E)-4-(6-dienil,3,7-dimetilocta-2)(aminometil)fenol (21) e (E)-(N)-(6-dienil,3,7-dimetilocta-2)-N-(4-idroxifenil)metanosulfanoamida (22) were submitte to in vitro pharmacological assays to evaluated the enzymatic inhibition of sPLA2 and characterization by hydrogen nuclear magnetic resonance (RMN 1H) and the 13 carbon nuclear magnetic resonance (RMN 13C). Based on the obtained results by pharmacological assays can be concluded that the final synthesized compounds (18, 19, 21, 22) presents good anti-inflammatory profiles. As the synthetic methods employed to obtain the final molecules (18-22) the results showed be viable in its execution enable an obtainment of compounds with appropriate yields and efficiency in the profile of purification / A inflamação é uma reação local dos tecidos envolvendo reações neurológicas, vasculares, humorais e celulares, objetivando eliminar o agente causal e diminuir o dano celular. As prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos, são exemplos de mediadores químicos da inflamação, originados a partir da ação da enzima fosfolipase A2 (PLA2). A PLA2 é uma enzima que hidrolisa fosfolipídios presentes na membrana celular na posição sn-2 produzindo lisofosfolipídios e ácido araquidônico, tendo um papel chave na produção de mediadores lipídicos inflamatórios. A pesquisa e desenvolvimento de novas entidades químicas seguras, eficazes e que apresentem menos efeitos colaterais para um determinado alvo terapêutico, constituí o principal objeto de inovação tecnológica das indústrias farmacêuticas. Devido aos efeitos colaterais dos inibidores seletivos da produção de eicosanóides presentes atualmente no mercado, o controle da produção de ácido araquidônico (AA) pela inibição da PLA2 surge como um vantajoso tratamento para as condições patológicas que são causadas pelos mediadores do AA. Neste trabalho foram estudadas rotas sintéticas para obtenção de novos candidatos a protótipos de fármacos anti-inflamatórios obtidos por meio do planejamento racional de novos derivados piperazínicos originalmente desenhados a partir do nerolidilcatecol (16) e do arilsulfonilpiperazina (17) para apresentarem perfil inibitório da enzima PLA2 secretada. Os compostos finais sintetizados, N-(benzo[d][1,3]dioxol-5-aril) acetamida (18), E-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil) benzo[d] [1,3]dioxol-5-amina (19), (E)-N-(6-dienil,3,7-dimetilocta-2)aminobenzeno (20), (E)-4-(6-dienil,3,7-dimetilocta-2)(aminometil)fenol (21) e (E)-(N)-(6-dienil,3,7-dimetilocta-2)-N-(4-idroxifenil)metanosulfanoamida (22) foram submetidos a ensaios farmacológicos in vitro para avaliação da inibição enzimática da sPLA2 e caracterização por meio de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e de Carbono (RMN 13C). Baseados nos resultados obtidos por meio dos ensaios farmacológicos concluimos que os compostos sintetizados (18, 19, 21, 22) apresentaram perfil anti-inflamatório esperado. Quanto às metodologias sintéticas empregadas para obtenção dos compostos finais (18-22) os resultados obtidos demonstraram serem esta viáveis nas suas execuções permitindo a obtenção de compostos com rendimentos adequados e com eficiência no perfil de purificação

As peçonhas de serpente do gênero Bothrops se caracterizam por induzir miotoxicidade, edema, coagulação e hemorragia. Por essa razão, alguns pesquisadores estão buscando por tratamentos alternativos contra os envenenamentos ofídicos com inibidores naturais e artificiais. O presente estudo tem como objetivo estudar as interações entre as PLA2s (Asp49 e Lys49) de veneno de serpente Bothrops jararacussu, denominadas BthTX-I e BthTX-II, respectivamente, e o inibidor vegetal isolado da espécie Cordia verbenacea. C. verbenacea apresenta diversas atividades farmacológicas já demonstradas, sendo utilizada também pela população como antiofídica. O extrato hidroalcoólico das folhas preparado à seco, foi submetido a técnicas cromatográficas como Sephadex LH-20 e CLAE, obtendo-se a purificação do princípio ativo antiofídico da planta, denominado ácido rosmarínico. A peçonha de B. jararacussu foi submetida à cromatografia de filtração em gel Sephadex G-75 e, à cromatografia de troca iônica. O ácido rosmarínico (AR) foi isolado do extrato metanólico de C. verbenacea e apresentou inibição da hemorragia provocada pela peçonha bruta de B. jararacussu. Em comparação, o ácido rosmarínico® também inibiu o efeito hemorrágico causado pela peçonha bruta de B. jararacussu. A atividade edematogênica provocada pelas toxinas BthTX-I e II foi avaliada e testada com os inibidores. Ambos AR e AR® não inibiram significativamente a induçào de edema. Resultados semelhantes foram obtidos com as atividades anticoagulante, e fosfolipásica. O ácido rosmarínico, AR e AR®, demonstrou alto efeito inibitório sobre a citotoxicidade e miotoxicidade induzida pela peçonha bruta e pela toxina BthTX-I. Ambos inibidores apresentou um menor efeito sobre a atividade miotóxica induzida pela toxina BthTX-II. Simulações de docking realizadas com três PLA2s e AR mostraram perfis de interações similares, reforçando as principais interações enzima-inibidor obtidas experimentalmente, relatadas na literatura. Os cálculos de derivação de farmacóforo baseados em diferentes inibidores relatados na literatura, assim como estudos de campos de interação molecular foram realizados, nos quais os resultados indicaram as principais modificações na estrutura do inibidor ácido rosmarínico necessárias para otimização. Nas simulações de screening virtual, novos potenciais inibidores de BthTX-I foram selecionados a partir de base de dados de compostos drug-like, direcionando os próximos passos aos testes biológicos, os quais serão realizados com esta fosfolipase e os novos candidatos a inibidores modelados. / Snake venoms from Bothrops genus are characterized by inducing myotoxicity, edema, thrombosis and hemorrhage. Thus, some researchers are searching for alternative treatments against ophidian poisoning with natural and artificial inhibitors. This work aimed study the interactions between PLA2s (Asp49 e Lys49) from Bothrops jararacussu snake venom, named BthTX-I and BthTX-II, respectively, and the inhibitor isolated from Cordia verbenacea plant. C. verbenacea presents several pharmacological activities already demonstrated, and it is also used by the population by its antiophidic activity. The hydroalcoholic extract prepared from the dried leaves, was submitted to chromatographic techniques as Sephadex LH-20 and HPLC, resulting in the purification of the antiophidian compound active from the plant, named rosmarinic acid. B. jararacussu snake venom was submitted to gel filtration chromatography on Sephadex G-75 and ion exchange chromatography. Rosmarinic acid (RA) was isolated from the C. verbenacea methanolic extract and it presented hemorrhage inhibition caused by crude venom from B. jararacussu. In comparison with this, Rosmaric acid® also inhibited the hemorrhagic effect caused by crude venom from B. jararacussu. Edematogenic activity caused by BthTX-I and II was evaluated and tested with the inhibitors. Both, RA e RA® did not inhibit the edema indution significantly. Similar results were obtained with the anticoagulant and phospholipasic activity. The rosmarinic acid, RA e RA®, presented high inhibitory effect for myotoxicity and cytotoxicity induced by crude venom and the toxin BthTX-I. Both inhibitors presented minor effect on myotoxicity activity induced by BthTX-II toxin. Docking simulations performed with three PLA2 and RA have shown similar interactions profiles, corroborating the main enzyme-inhibitor interactions experimentally obtained, reported in literature. Pharmacophore perception calculations based on different inhibitors reported in literature as well as molecular interaction fields studies were here carried out, whose results indicate the main changes in the structure of the rosmarinic acid inhibitor necessary to optimization. In the virtual screening simulations, novel potential BthTX-I inhibitors were selected from drug-like compounds databases, thus guiding next steps towards biological tests, which will must be performed with this phospholipase and the new inhibitor candidates modeled.

Os venenos de serpentes são misturas complexas com composição variada, possuindo constituintes orgânicos e inorgânicos. Dentre os compostos orgânicos, destacam-se as proteínas, tóxicas e/ou com altas atividades enzimáticas. Desta forma, os venenos desenvolvem importante papel na captura de presas e auxílio à digestão. Venenos de serpentes da família Viperidae apresentam ampla e variada gama de ações biológicas, como proteólise, coagulação, hemorragia, neurotoxicidade e miotoxidade. Populações de serpentes habitantes endemicamente em ilhas são bons modelos para estudos de evolução, especialmente quando comparadas a espécies de mesmo gênero que habitam o continente. Espécies ancestrais de serpentes do gênero Bothrops sofreram isolamento geográfico cerca de 9 mil anos atrás, quando no Período Pleistoceno porções de terra na região Sudeste do Brasil foram isoladas do continente, levando a formação de ilhas costeiras, devido a elevação do nível do mar. Tal isolamento deu origem a novas espécies insulares pertencentes ao gênero Bothrops. Estudos relacionados aos venenos destas espécies, suas especificidades e diferenças com relação a serpentes continentais são escassos. O Arquipélago de Alcatrazes localiza-se no litoral de São Paulo, distando aproximadamente 35 Km da costa. Não há relatos da existência de mamíferos na ilha, com exceção de morcegos. Serpentes adultas da espécie Bothrops alcatraz, endêmica da Ilha de Alcatrazes, apresentam características encontradas em serpentes juvenis do grupo das jararacas, como a dieta baseada exclusivamente em animais ectotérmicos e a composição diferenciada do veneno. O presente trabalho tem como objetivo caracterizar as principais ações do veneno da serpente B. alcatraz, espécie endêmica e ilhoa, isolando cromatograficamente suas frações. Resultados indicam no veneno de B. alcatraz apresenta as atividades coagulante sobre plasma humano, fosfolipásica, miotóxica e edematogênica mais ativas quando comparadas com as ações do veneno de B. jararaca do continente. As ações proteolítica, hemorrágica e toxicidade para camundongos são mais potentes no veneno de B. jararaca. A presença de ação neurotóxica específica para artrópodes no veneno de B. alcatraz sugere a ação de uma fosfolipase A2, a qual foi isolada cromatograficamente. As propriedades e composição do veneno de B. alcatraz indicam uma provável evolução de toxinas adaptadas a seu tipo de presa/alimento. / Snakes venoms are complex mixtures with varied composition constituted by organic and inorganic molecules. The main organic components are proteins, which can be toxic and show high enzymatic activities, thus playing important role in prey capture and digestion in snakes. Viperidae snakes family show wide range of biological actions, as proteolytic, coagulant, hemorrhagic, neurotoxic and myotoxic activities. Snake populations inhabiting endemically islands are useful models for evolution studies, specially when compared to their congeneric continental species. Bothrops species ancestors from Southeastern Brazil underwent geographic isolation about 9 thousand years ago, during the Pleistocene Period, when land portions were separated from the continent by the sea. The isolation originated new (island endemic) Bothrops species. Studies related to those snake venoms, its specialties and differences among continental species of the genera Bothrops are scarce. The Alcatrazes Archipelago is located in São Paulo coast, 35 kilometer far from the continent. There are no register of mammals in those islands, except for bats. Bothrops alcatraz is endemic from the Alcatrazes Island. Adults show some similarities to young specimens from the continental jararaca group. They feed exclusively on ectothermic animals and their venom shows a different composition. The aim of this study was to analyze the endemic island snake, B. alcatraz, venom, isolating by chromatography the venom fractions. Results indicated that B. alcatraz venom presents coagulant, phospholipase, myotoxic and edema forming activities higher than continental B. jararaca venom. The proteolytic, haemorrhagic and mice toxicity are higher on B. jararaca venom. The specific neurotoxic action in arthropods of B. alcatraz venom suggests a phospholipase A2 action, which was isolated bt cromatography. The properties and composition of B. alcatraz venom indicates a possible evolution of toxins adapted to the prey kinds.

Os venenos de serpentes contêm concentrações elevadas de fosfolipases A2 secretadas (sFLA2), que apresentam homologia com as FLA2s de mamíferos, cujos níveis estão aumentados em doenças inflamatórias. Neste estudo, investigou-se a ativação e a expressão de fatores envolvidos na formação de corpúsculos lipídicos (CLs) em células fagociticas e o papel desses fatores na resposta imune inata, induzida pela MT-III, uma sFLA2s de veneno. A MT-III induziu aumento dos níveis de triacilglicerol, colesterol e lisofosfolipideos e a ativação e expressão dos fatores PPAR-g, PPAR-d/b, SREBP2 e do CD36. Sob estimulo da MT-III, o receptor PPAR-b/d, as enzimas DGAT, ACAT e FAS foram relevantes para a formação de CLs e para a expressão da PLIN2. O CD36 participa da expressão da COX-2, sem modificar a liberação de PGE2. O TLR2 e a MyD88 foram essenciais para a formação de CLs e síntese da IL-1b e IL-10. Ainda, o TLR2 foi relevante para a liberação de PGE2, PGD2 e LTB4, enquanto MyD88 foi fundamental somente para a liberação de PGE2 e expressão da PLIN2, induzidas pela MT-III. / Snake venoms contain high concentrations of secreted phospholipase A2 (sPLA2) with homology to mammalian PLA2s, whose levels are elevated in inflammatory diseases. In this study, we investigated activation and expression of factors involved in lipid droplets formation (LDs) and participation that factors in the innate immune response induced by MT-III, sPLA2s from snake venom, in phagocytic cells. MT-III induced increase of triacylglycerol, cholesterol and lysophospholipids levels and activation and expression of factors PPAR-g, PPAR-d/b, SREBP2 and CD36. PPAR-b/d receptor, DGAT, ACAT and FAS enzymes were relevant to LDs formation and critical to PLIN2 expression induced by MT-III. CD36 participates in COX-2 expression without modifying PGE2 release stimulated by MT-III. TLR2 and MyD88 were essential to LDs formation and IL-1b and IL-10 synthesis stimulated by MT-III. Moreover, TLR2 was relevant to PGE2, PGD2 and LTB4 biosynthesis, while MyD88 is essential only for PGE2 release and PLIN2 expression induced by MT-III.

Orientadores: Sergio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T20:51:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RomeroVargas_FreyFrancisco_D.pdf: 4482249 bytes, checksum: 951ba98ea20426e2308c178f17a7680d (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Uma nova miotoxina fosfolipase A2 (BtTX-II) foi purificada a partir do veneno total de Bothriopsis taeniata através de dois passos cromatográficos, envolvendo inicialmente cromatografia de exclusão molecular, seguida de HPLC de fase reversa. BtTX-II foi caracterizada bioquimicamente através de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) mostrando uma única banda eletroforética com massa relativa (Mr) de 14000 Da, em condições não reduzidas e reduzidas (DTT 1M). A pureza e massa molecular foram confirmadas por espectrometria de massa (MALDI-Tof MS), a qual determinou uma massa molecular de 13889,98 Da. BtTX-II apresentou atividade catalítica de 12,075 ± 0,138 nmoles/mg/min em presença do substrato cromogênico específico ácido 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoico. Análise de composição de aminoácidos da PLA2 (BtTX-II) corroborou seu caráter básico. A análise dos peptídeos trípticos foi determinada por ESI-QTof-MS/MS espectrometria de massa e as regiões contendo peptídeos internos mostraram semelhança com outras PLA2s miotóxicas botrópicas cataliticamente ativas. BtTX-II, pertencente à classe PLA2 D49, exibiu atividade ótima a pH 8,0 e temperatura de 37 ºC. Na ausência de Ca2+ e na presença de alguns íons divalentes, tais como Mg2+, Mn2+, Zn2+ e Cd2+ (10mM), a atividade fosfolipásica foi significativamente diminuída. Também foi demonstrado o efeito inibitório de crotapotinas crotálicas sobre a atividade PLA2 da BtTX-II. O efeito neurotóxico da BtTX-II foi analisado através de estudos miográficos em preparações neuromusculares "ex vivo", mostrando que BtTX-II induz um leve bloqueio na junção neuromuscular em preparações Biventer cervicis de pintainho. Tais preparações foram utilizadas para o estudo morfológico quantitativo da BtTX-II, o que mostrou uma leve atividade miotóxica "in vitro" com a concentração de 50?g de BtTX-II. O efeito miotóxico também foi avaliado através de ensaios de liberação de creatina kinase plasmática e análise histopatológica do músculo gastrocnêmio de camundongo "in vivo", com estes últimos testes foram observandos maiores mudanças morfológicas quando comparadas aos estudos "in vitro", mostrando estar diretamente relacionada com a liberação de CK. BtTX-II induz miotoxicidade local após injeção intramuscular, mas não produz miotoxicidade sistêmica após injeções intravenosa. O efeito edematogênico foi estudado através do modelo coxim plantar de camundongo e mostrou ser elevado nas primeiras horas após injeções subcutâneas, em todas as concentrações aplicadas (1- 20 ?g). O efeito citotóxico "in vitro" foi caracterizado utilizando uma cultura celular da linhagem de mioblastos/miotubos de músculo esquelético de camundongo. BtTX-II não induz citotoxicidade em mioblastos; mas BtTX-II evidenciou atividade citotóxica em miotubos, em uma concentração padrão de 20 ?g. Nossos resultados sugerem que BtTX-II atua no processo de regeneração muscular em baixas concentrações (10 ?g) durante o período de 28 dias após as injeções intramusculares no gastrocnêmio de camundongo, demonstrando ser apropriado para a análise na regeneração muscular, pois induz necrose e não acarreta lesão do tecido vascular nem nervoso, o que é de suma importância para o processo de regeneração muscular. Isto foi possível pela presença de células satélite envolvidas neste processo junto com o infiltrado inflamatório notório em todos os períodos da regeneração / Abstract: A new miotoxin phospholipase A2 (BtTX-II) was purified from Bothriopsis taeniata crude venom through two steps cromatográficos, involving molecular exclusion chromatography, as first step, and followed by RP-HPLC. BtTX-II, was characterized biochemically through electrophoresis in polyacrylamide gel (SDS-PAGE) showing a single eletrophoretic band, in reduced and not reduced conditions, with relative mass (Mr) of 14000 Da. The purity and molecular mass was confirmed by mass spectrometry mass (Maldi-Tof SM), showed a molecular mass of 13889.98 Da. BtTX-II showed catalytic activity of 12.075 ± 0.138 nmoles/mg/min upon of the specific chromogenic substrate acid 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic. Analysis of aminoacid composition of PLA2 (BtTX-II) corroborated its basic character. Tryptic peptide analyse were determined for ESI-QTof-MS/MS mass spectrometry and the regions containing internal peptides showed similarity with other miotoxic botropics PLA2s. BtTX-II belonging to the class PLA2 D49 exhibited an optimal activity in pH 8.0 and at 37 ºC. In the absence of Ca2+ and in presence of some divalent íons such Mg2+, Mn2+, Zn2+ and Cd2+ (10mM), the phospholipasic activity was significantly decreased. Also, it was demonstrated the inhibitory effect of crotalics crotapotins upon activity PLA2 of the BtTX-II. The neurotoxic effect of the BtTX-II was analized through myographic studies in neuromuscular preparations "ex vivo", showing that BtTX-II induce a light blockade at the neuromuscular junction on chicken Biventer cervicis preparations. Such preparations were used for quantitatives morphologic studies, were shown a light myotoxic activity "in vitro" at higher concentration. On the other hand, the myotoxic effect was evaluated through release of plasmatic creatine kinase "in vivo" and was carry out histophatologic analyzes mouse gastrocnemius muscle, with these last tests were observed larger morphologic changes when compared to studies "in vitro", showing directly related with the CK liberation. BtTX-II induces local miotoxicity after intramuscular injection, but it did not produce systemic miotoxicity after intravenous injections. The edematogenic effect was studied through the model mouse paw edema and showed to be high in the first hours after subcutaneous injections, in all applied concentrations (1-20 ?g). The cytotoxic effect "in vitro" was characterized using a cell culture of the rodent lineage of myoblasts/myotubes cells. BtTX-II did not induce citotoxicity in skeletal muscle myoblasts; however, BtTX-II showed cytotoxic activity in myotubes, both with a standard concentration of 20 ?g. Our results suggest that BtTX-II act in the process of muscular regeneration in low concentrations (10 ?g) during a period of 28 days after intramuscular injections in the mouse gastrocnemius muscle, This effect was to be appropriate for muscular regeneration analyzes because it induces necroses and it did not carry out lesion of the vascular nor nervous tissue, thus, it is of supreme importance for the process of muscular regeneration. Those results were possible by the presence of satellite cells involved in these processes together with notorious inflammatory infiltrate in every periods of the regeneration / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2016-05-17T20:16:41Z No. of bitstreams: 1 Adriano Silvio dos Santos.pdf: 1418434 bytes, checksum: 4ac5ef78eb225e6693c107993f6ee978 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T20:16:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adriano Silvio dos Santos.pdf: 1418434 bytes, checksum: 4ac5ef78eb225e6693c107993f6ee978 (MD5) Previous issue date: 2015-02-24 / Snakes venom of the Bothrops species induces a local inflammatory reaction, characterized by pain, edema, leukocyte migration and can be accompanied by tissue necrosis. The use of antivenom performs the function of neutralizing the greatest possible amount of circulating venom, thus minimizing its systemic effects, but its action does not extend to local manifestations, and thus require the use of another therapeutic option to control this reaction. The low level laser therapy (LLLT) is used as an alternative treatment in cases of muscle injury due to its biological effects, such as analgesics, anitinflamatory and healing. In a previous study of our lab it was found that LBP can enhance the viability of C2C12 muscle cells after the addition of B. jararacussu venom in the medium and that this effect of LBP is related to protection of the cell membrane. In the present study we analyzed the effect of LBP in the cell monolayer integrity, viability of muscle cells, exposed to injury by myotoxins BthTX - I - and BthTX - II isolated from Bothrops jararacussu venom. Cells received BthTX – I (75 μg / mL) and were immediately irradiated with LLLT Aluminum Indium Gallium Phosphate and Aluminium Gallium Arsenide, the wavelengths (λ) 685nm and 830 nm, power density 4 J/cm2, 100mW of power, total energy 1,3 J, application time of 13 and 35 seconds per point and the cells were incubated for 15, 30 and 60 minutes. The results demonstrated that BthTX – I affect cell viability in a dose dependent manner, but did not change cell integrity. The concentration of 75 μg/mL was chosen for the experiments with LBP. LLLT caused an significant increase in cell viability in all the analyzed period of time and in the λ 685 nm and 830 nm against Bothrops I toxin, however in the LBP λ 685 nm against Bothrops toxin II was effective only at 15 min, while the LBP at λ 830 was effective at 15 and 60 min. The LLLT was not able to change the LDH release at all times and wavelength used. Thus, LBP was able to protect C2C12 muscle cells against the miotoxic effect of isolated myotoxins isolated from B. jararacussu venom. Therefore, the results suggest that LLLT can be considered an effective therapeutic tool in patients bitten by snakes. / O veneno das serpentes do gênero Bothrops induz uma reação inflamatória local intensa, caracterizada por dor, formação de edema, migração leucocitária, podendo ser acompanhada por necrose tecidual. A utilização do soro antibotrópico desempenha a função de neutralizar a maior quantidade possível do veneno circulante, minimizando assim seus efeitos sistêmicos, porém sua ação não se estende às manifestações locais, sendo assim necessário o uso de outro recurso terapêutico para o controle dessa manifestação. A laserterapia de baixa potência (LBP) é uma alternativa de tratamento em situações de lesão muscular, devido a seus efeitos biológicos, tais como analgésicos, antinflamatórios e cicatrizantes. Em trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório, verificou-se que o LBP foi capaz de aumentar a viabilidade de células musculares C2C12, após a adição do veneno de B. jararacussu e que esse efeito do LBP é relacionado a uma proteção da membrana celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do LBP em células musculares C2C12 submetidas à lesão por miotoxinas (BthTX - I e BthTX - II) isoladas do veneno da serpente Bothrops jararacussu quanto a: viabilidade, descolamento celular e liberação da enzima LDH. As células receberam a BthTX – I e BthTX – II na dose 75 μg/mL e foram imediatamente irradiadas com LBP Índio Gálio Alumínio Fósforo e Arseneto de Gálio Alumínio, nos comprimentos de onda (λ) 685 nm vermelho e 830 nm infra-vermelho, de forma pontual, tempo de aplicação de 13 s e 35 s respectivamente e as células foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. Os resultados demonstraram que a BthTX - I e BthTX - II afetou a viabilidade celular de forma dose-dependente, sendo escolhida a dose 75 μg/mL para a realização dos experimentos com o LBP, porém não foi capaz de causar alterações na integridade. O LBP causou aumento significativo na viabilidade celular, em todos os tempos analisados no λ 685 nm e 830 nm frente à BthTX - I, entretanto o LBP no λ 685 nm e λ 830 frente a BthTX - II foi efetivo somente no tempo de 15 e 60. O LBP não foi capaz de diminuir a liberação de LDH em todos os tempos analisados e com os dois λ utilizados. Desta forma, verificou-se que o LBP foi capaz de proteger as células musculares C2C12 contra o efeito miotóxico das miotoxinas isoladas do veneno B. jararacussu e que esta proteção está relacionada ao efeito protetor a nível mitocondrial. Ainda, os resultados obtidos sugerem que o LBP pode ser considerado uma ferramenta terapêutica eficaz em pacientes picados por serpentes.

O tratamento atual indicado para casos de envenenamentos por peçonhas é a administração intravenosa de antivenenos, produzidos através da hiperimunização de animais. Entretanto, os antivenenos disponíveis podem, algumas vezes, não proteger os pacientes e causar reações de hipersensibilidade. Fosfolipases A2 (PLA2), L-aminoácido oxidases (LAAO), metalo e serinoproteases são os principais componentes de peçonhas ofídicas e contribuem para a neurotoxicidade, hemorragia, hemólise, miotoxicidade, cardiotoxicidade e formação de edemas. Foram empregados ensaios para avaliar as atividades das enzimas presentes na peçonha de serpentes da espécie Lachesis muta rhombeata e aquele para atividade de protease foi otimizado. A tecnologia de Phage display foi empregada para a seleção de fagos-anticorpos capazes de reconhecer a peçonha bruta. Os fagos foram amplificados em Escherichia coli TG1 e usados para infectar E. coli HB2151, a qual produz fragmentos de anticorpos humanos solúveis. Estes foram purificados e utilizados em testes de inibição de alguns dos componentes tóxicos da peçonha. Os testes de atividade para PLA2, protease e Laminoácido oxidase foram padronizados com sucesso e as 3 proteínas mostraram elevada atividade enzimática. Após otimização, a quantidade de peçonha necessária para o ensaio de protease foi reduzida em 25 vezes. A massa molecular de PLA2 foi estimada em 17 kDa e as massas moleculares de proteases foram estimadas em 40, 35 e 24 kDa, através de zimogramas. O método de bio panning foi eficiente para a seleção de fagos-anticorpos contra a peçonha bruta. Diversos fragmentos de anticorpos foram purificados e incubados com a peçonha bruta para testar suas capacidades de neutralização sobre cada enzima. Cinco clones demonstraram-se hábeis em inibir a PLA2 através da inibição da hemólise. O clone 4E inibiu 100% da hemólise durante as duas horas de ensaio quando pré-incubado na proporção 2:1 (scFv:peçonha). Os clones 2C e 4E inibiram 100% durante uma hora quando pré-incubados na proporção 1:1 e os clones 2F e 9F inibiram a hemólise parcialmente. Outros testes serão conduzidos para a seleção de clones capazes de neutralizar as demais enzimas, os quais, juntamente com os clones já selecionados, serão analisados através de ensaios in vivo. Espera-se que eles possam contribuir para a construção de um novo antiveneno capaz de superar algumas das dificuldades associadas às técnicas de imunoterapia convencionais / The current treatment for animal envenoming is the intravenous administration of antivenoms, produced by animal hyperimmunization. Unfortunately, available antivenoms sometimes do not protect patients and may cause hypersensitivity reactions. Phospholipases A2 (PLA2), L-amino acid oxidases, metallo and serine proteases are considered the most important snake venom components and contribute to neurotoxicity, hemorrhage, hemolysis, myotoxicity, edematogeny and cardiotoxicity. Assays for evaluating the enzymes present in Lachesis muta rhombeata venom were developed and the protease one was optimized. Phage display technology was used to select phage antibodies able to recognize the crude venom. Phages were amplified in Escherichia coli TG1 and used to infect E. coli HB2151, which produces human antibody fragments. Inhibition tests aiming the neutralization of some toxic components of the venom were performed using purified antibody fragments. Activity assays for evaluating PLA2, protease and L-aminoacid oxidase were successfully performed and all enzymes showed high activity levels. The molecular mass of PLA2 was estimated in 17 kDa and the molecular mass of proteases were estimated in 40, 35 and 24 kDa, by zymography. After optimizing the conditions for proteolytic assay, it was possible to use 25 times less venom than it was necessary at first. The bio panning method was efficient for selecting specific phage antibodies against the crude venom. Several clones were selected to infect HB2151 and to produce soluble antibody fragments, which were purified and incubated with the venom to test their inhibition capacity over each enzyme. Five clones demonstrated ability to neutralize PLA2 by inhibiting hemolysis. The clone 4E could inhibit 100% of hemolysis for over 2 hours when preincubated at the ratio 2:1 (scFv:venom). Clones 2C and 4E could inhibit 100% for 1 hour when preincubated at the ratio 1:1 and clones 2F e 9F could inhibit partially. Other tests will be performed to select clones able to neutralize other enzymes and, together with the clones already selected, will be evaluated by in vivo experiments. It is expected that they may contribute to the construction of a potential new antivenom able to overcome some of the problems associated with conventional immunotherapy

A Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva que causa comprometimento cognitivo e demência. O diagnóstico é baseado em parâmetros clínicos, mas sua confirmação é post-mortem, após avaliação patológica durante a autópsia. Os tratamentos disponíveis para a DA são os inibidores da colinesterase (IChEs) e os antagonistas de receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA), sendo que os IChEs compõe o principal grupo. Diversos estudos tem mostrado um efeito neuroprotetor dos IChEs, levando a alterações na patogênese da DA. Avaliar e mensurar essas alterações são papeis atribuídos aos biomarcadores. Neste sentido podemos destacar a fosfolipase A2 (PLA2), a principal responsável pelo metabolismo de fosfolípides de membrana, e que tem sido achada diminuída na DA, assim como a glicogênio sintase-quinase (GSK), responsável pela fosforilação da proteína Tau, que é um dos processos alterados na DA. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tratamento com IChE sobre a atividade da PLA2 e expressão da GSK3B em plaquetas de 30 pacientes com DA após 3 e 6 meses de tratamento. Como grupo controle foram investigados 42 individuos idosos sem doença neurodegenerativa. Encontramos nos pacientes com DA antes do tratamento uma diminuição da atividade da iPLA2 quando comparada ao grupo controle. Após três e seis meses de tratamento a PLA2 aumentou, voltando ao nível dos controles. Os pacientes que apresentaram um aumento maior da iPLA2 apos 3 meses de tratamento apresentaram melhora cognitiva mais marcante após seis meses de tratamento, avaliado pelo CAMCOG. Apos 6 meses de tratamento encontramos um inativação da GSK3B, medida por um aumento em sua forma fosforilada. Nossos resultados sugerem que o donepezil apresenta propriedades modificadoras na doença de Alzheimer, e ainda que a medida da atividade da iPLA2 poderia ser usada como marcador de resposta terapêutica ao donepezil e, possivelmente, a outros IChEs, na doença de Alzheimer / Alzheimer\'s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder that causes dementia and cognitive impairment. The Diagnosis is based on clinical parameters, but confirmation is post-mortem after pathologic evaluation during autopsy. The treatments available for AD are cholinesterase inhibitors (IChEs) and N-methyl-D-aspartate (NMDA) antagonists. The main group comprises the IChEs. Several studies have shown a neuroprotective effect of IChEs, leading to alterations in the pathogenesis of AD. Evaluate and measure these changes are assigned to biomarkers. In this regard we can highlight the phospholipase A2 (PLA2) the main enzyme in membrane phospholipids metabolism and that has been found decreased in AD as well as Glycogen Synthase kinase (GSK), a major responsible for tau phosphorylation which is one processes altered in AD. The objective of this study was to evaluate the effect of treatment with IChE on PLA2 activity and GSK3B expression in platelet of 30 AD patients after 3 and 6 months of treatment. The control group comprised 42 elderly individuals without neurodegenerative disease The results obtained were a decreased iPLA2 activity in patients with AD before treatment as compared to controls. After 3 and 6 months of treatment, we observed a significant increase in iPLA2 activity, restoring enzymatic activity similar to that observed among control. The patients who showed higher iPLA2 activity in the first three months were those showing cognitive improvement after six months of treatment, measured by CAMCOG. After 6 months of treatment a GSK3B inactivation were found, measured by an increase in its phosphorylated form. Our results suggest that donepezil present modifying properties in Alzheimer disease and that iPLA2 activity measurement could be used as a marker of therapeutic response to donepezil and possibly other IChEs in Alzheimer\'s disease

A Infecção pelo dengue afeta todas as regiões tropicais e subtropicais do globo, registra aproximadamente 390 milhões de casos por ano, e se destaca como um problema emergente de proporções crescentes, especialmente no Brasil, que atualmente responde por 60% dos casos no continente americano. Assim, ações para criar, adaptar e atender as condições para promover avanços na compreensão do processo de infecção pelo vírus em nível molecular pode ser de grande valor, tanto para enfrentar os desafios impostos pela conjuntura atual do dengue, quanto pela possibilidade de ampliar o conhecimento de mecanismos moleculares para outros vírus relacionados. Aqui, focando na proteína E do envelope do vírus do dengue, abordamos o problema da infecção viral sob os aspectos estruturais da proteína do envelope (E) quando enfrenta as condições ambientais distintas ao longo do caminho desde o trato digestivo do vetor exotérmico até a maquinaria celular do hospedeiro homeotérmico. Para este efeito, empregamos simulações de Dinâmica Molecular, avaliando e quantificando os processos de rearranjo conformacional do o domínio III isolado da proteína E dos quatro sorotipos de dengue, os quais são induzidos por alterações nos parâmetros termodinâmicos intensivos (pH 3, 5 e 7, T = 298K e 310K). Além disso, a configuração quaternária pentarradial de cinco domínios III é estudada, correlacionando flexibilidades específicas das regiões de loops a ajuste induzido a eventuais ligantes. Nós também verificamos a estabilidade estrutural do complexo DIII com o fragmento da região ligante de antígeno de um anticorpo monoclonal (Fab 1A1D-2), bem como as forças de interação entre a interface de ligação, identificando resíduos-chave. Além disso, os eventos relacionados com a interação da proteína E (tanto na forma monomérica quanto na dimérica) com o envelope lipídico viral são minuciosamente estudados, abrindo o caminho para um possível estudo centrado na formação de trímeros da proteína E, levando à fusão de membranas e subsequente inoculação do RNA viral no citoplasma. Finalmente, alternativas são propostas para a compreensão do mecanismo de ação da fosfolipase do veneno de Crotalus durissus terrificus - a cascavel sul-americana, que tem se mostrado eficaz na inibição in vitro da infecção pelo vírus do dengue. / Dengue infection burdens all tropical and subtropical regions of the globe, registers approximately 390 million cases annually, and stands out as an emerging problem of increasing proportions, especially in Brazil, which currently accounts for 60% of cases in the American continent. Thus, actions to create, adapt and meet conditions to promote advances in understanding the process of virus infection at the molecular level can be of great value both to meet the challenges posed by current conjuncture of dengue, and for the possibility to extend the knowledge of the molecular mechanisms to related viruses. Here, focusing on the E protein of the dengue virus envelope, we address the problem of viral infection under stereochemical aspects of the envelope (E) protein when it undergoes the distinct environmental conditions along the pathway from the exothermic vector\'s digestive tract to the homeothermic host\'s cell machinery. To this end, we employ molecular dynamics to assess and quantify the processes of conformational rearrangement of isolated domain III of the E protein of the four serotypes of dengue, as induced by changes on intensive thermodynamic parameters (pH 3, 5 and 7; T = 298K and 310K). Further, the 5-fold quaternary configuration of five domains III is studied, correlating specific loop regions flexibilities with induced fit with eventual ligands. We also check the structural stability and interaction forces between the interface of the complex DIII and the antigen binding fragment of a monoclonal antibody (Fab 1A1D-2), identifying key residues. Additionally events related to the interaction of the E protein (both as a monomer and as a dimer) with the viral membrane are thoroughly studied, paving the way for a possible study focused on the formation of trimers of E protein, leading to membrane fusion and subsequent inoculation of viral RNA in the cytoplasm. Finally, alternatives are proposed for understanding the mechanism of action of the phospholipase from the venom of Crotalus durissus terrificus - the South American rattlesnake, which has proven effective in vitro inhibition of Dengue virus infection.

As fosfolipases A2 (PLA2s, E.C. 3.1.1.4) pertencem a uma superfamília de enzimas que realizam a clivagem de fosfolipídios da membrana celular em ácidos graxos e lisofosfolipídios, numa reação dependente de cálcio. As PLA2s apresentam um importante papel em várias funções celulares, incluindo manutenção dos fosfolipídios celulares, geração de prostaglandinas e leucotrienos, tradução de sinais, proliferação celular e contração muscular. O presente trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural e funcional de uma fosfolipase A2 ácida tóxica(BmooTX-I) isolada da peçonha da serpente Bothrops moojeni. A BmooTX-I foi purificada por uma combinação de cromatografias em resinas de troca iônica (DEAE-Sephacel), exclusão molecular (Sephadex G-75) e interação hidrofóbica (Phenyl-Sepharose CL-4B). A confirmação do grau de pureza foi realizada através de análise por espectrometria de massa MALDI TOF da BmooTX-I reduzida (monômero, 13.802,66 Da) e não reduzida (dímero, 27.506,38 Da), da focalização isoelétrica (pI 4,2) e de SDS-PAGE. A região N-terminal da enzima apresentou alta homologia com outras PLA2s Asp49 de peçonhas de serpentes. A BmooTX-I apresentou também elevada atividade fosfolipásica e induziu edema moderado in vivo. Além disso, foi capaz de inibir a agregação plaquetária e a coagulação do plasma, induzir a liberação de PGI2 por HUVECs e apresentar efeito citotóxico sobre células tumorais, bactérias e fungos. O tratamento da enzima com o reagente brometo de p-bromofenacila (BPB) neutralizou a atividade enzimática e de inibição da agregação plaquetária. A determinação da miotoxicidade foi realizada através da dosagem dos níveis de CK no plasma de camundongos previamente injetados com a toxina. A análise histopatológica das fibras musculares demonstrou a presença de infiltrado inflamatório e líquido intercelular, ambos confirmados pela análise ultra-estrutural. O presente trabalho deverá contribuir para a elucidação e determinação da composição bioquímica dos venenos animais, já que as fosfolipases A2 ácidas tóxicas possuem mecanismos de ação ainda não totalmente esclarecidos. / Phospholipases A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) belong to a superfamily of enzymes that perform the cleavage of phospholipids of cell membranes in fatty acids and lysophospholipids in a calcium dependent reaction. PLA2s have an important role in several cellular functions, including maintenance of cellular phospholipids, the generation of prostaglandins and leukotrienes, translation signals, cell proliferation and muscle contraction. This study aimed at the structural and functional characterization of an acidic and toxic phospholipase A¬2 (BmooTX-I) isolated from Bothrops moojeni snake venom. BmooTX-I was purified by a combination of chromatographic steps on resins of ion exchange (DEAE Sephacel), molecular exclusion (Sephadex G-75) and hydrophobic interaction (Phenyl Sepharose CL-4B). The confirmation of the purity degree was analyzed by MALDI TOF mass spectrometry of reduced BmooTX-I (monomer, 13,802.66 Da) and not reduced (dimer, 27,506.38 Da), by isoelectric focusing (pI 4.2) and by SDS-PAGE. The N-terminal region of the enzyme showed high homology with other Asp49 PLA2s of snake venoms. BmooTX-I also presented high phospholipase activity and induced moderate edema in vivo. Furthermore, this enzyme was capable of inhibiting platelet aggregation and plasma coagulation, inducing the release of PGI2 by HUVECs, also showing cytotoxic effects on tumor cells, bacteria and fungi. Treatment of the enzyme with the p-bromophenacyl bromide (BPB) neutralized the enzymatic activity and the inhibition of platelet aggregation. The determination of myotoxicity was accomplished through the determination of the CK levels in plasma of mice previously injected with the toxin. The histopathological analysis of muscle fibers showed the presence of inflammatory infiltration and intercellular fluid, both confirmed by ultrastructural analysis. This work contributes to the elucidation and determination of the biochemical composition of animal venoms, since the mechanisms of action of toxic acidic phospholipases A2 are not yet fully understood.