A Fotoquimioterapia (FQT) vem sendo usada no tratamento de várias doenças, inclusive câncer, com a vantagem de ser menos agressiva, possuindo efeitos colaterais negativos desprezíveis. Esta técnica envolve a combinação de uma fonte de luz visível e de um fotossensibilizador (FS), que é reativo apenas sob a irradiação com luz adequada, e que se acumula preferencialmente no tecido doente. Uma ideia para deixar essa técnica mais eficiente é potencializar esta última característica do FS com uso de um carreador que tenha afinidade com tecidos doentes. Pensamos na hipótese de usar a albumina do soro como carreador uma vez que ela é uma proteína intrínseca do organismo, tem alta afinidade com os tecidos tumorais e possui sítios para ligar vários compostos extrínsecos. Como modelo usamos a albumina de soro bovino (ASB). Como FS utilizamos acridina laranja, nitrofurantoína, corantes ciânicos com dois cromóforos e protoporfirina IX (PpIX) sintética e extraída de glândulas Harderianas de ratos da linhagem Wistar (PpIX endógena). Foram analisadas as características de ligação entre os FS e a ASB e seus efeitos nas características fotofísicas dos FS em função da sua estrutura, utilizando espectroscopias de absorção ótica, fluorescência estática e resolvida no tempo e a técnica de microscopia de imagens por tempo de vida da fluorescência (FLIM). Foi mostrado que a ligação com ASB induz ao deslocamento batocrômico dos espectros de absorção e da fluorescência, aumentando a intensidade e o tempo de vida de fluorescência dos FS. Características como carga positiva, estrutura linear e tamanho pequeno da molécula do FS favorecem sua ligação com a ASB. Uma comparação entre PpIX sintética e endógena mostrou que a formação de um complexo da PpIX com estruturas anfifílicas também aumenta a probabilidade da sua ligação com a ASB. Os resultados obtidos mostraram que a ASB se liga efetivamente aos FS de diferentes estruturas e pode ser usada como carreador dos mesmos para tecidos tumorais. / Photochemotherapy (PCT) is used for the treatment of various diseases, including cancer, with the advantage of being less aggressive with reduced adverse effects. This technique includes the use of a visible light source and a photosensitizer (PS), which is reactive only under light exposure and localizes preferably in abnormal tissues. To make this technique more efficient it is necessary to increase the PS content in these tissues using a carrier which possesses affinity with these tissues and is able to bind PS. A good opportunity is to use serum albumin as a carrier since it is an intrinsic protein, has high affinity to tumor tissues and possesses sites for binding of various extrinsic compounds. In this work the bovine serum albumin (BSA) was used as a carrier model. Acridine orange, nitrofurantoin, cyanine dyes with two chromophores and protoporphyrin IX synthetic and extracted from Harderian glands of Wistar line rats (endogenous) were used as PS. The characteristics of the PS binding with BSA and the effect of this interaction on PS photophysical properties were studied using optical absorption, steady-state and time resolved fluorescence spectroscopies, and fluorescence lifetime image microscopy (FLIM). It was demonstrated that PS binding with BSA produces a bathochromic shift in the PS absorption and fluorescence spectra and increases its fluorescence intensity and lifetime. The positive charge, linear structure and small size of the PS molecule favors its binding with BSA. A comparison between synthetic and endogenous PpIX demonstrates that complexation of PpIX molecule with an amphiphilic structure increases the probability of its binding with BSA. The obtained results demonstrate that BSA binds effectively PS with different molecular structures and it is promising for their transport to tumor tissue.

Orientador: Anderson Orzari Ribeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2013

A imobilização de fotossensibilizadores (FS) em materiais nanométricos tem se mostrado uma excelente alternativa ao seu emprego na forma molecular para terapia fotodinâmica (PDT). O presente trabalho descreve uma série de estratégias sintéticas desenvolvidas para a imobilização de FS em nanoesferas de sílica contendo núcleos magnéticos, bem como o estudo das propriedades foto-químicas, foto-físicas e morfológicas dos nanomateriais obtidos. Os FS utilizados foram o azul de metileno, tionina, azure A, protoporfirina IX, hematoporfirina IX e clorofilina. As metodologias de imobilização empregadas envolveram a adição do FS durante o crescimento da camada de sílica ou a ligação do FS na superfície do nanomaterial já formado. Em alguns casos foi necessário modificar previamente o FS com organossilanos. Os núcleos magnéticos foram preparados por co-precipitação de sais de ferro(II) e ferro(III) em meio básico e o revestimento com sílica foi realizado utilizando-se tetraetilortossilicato em uma microemulsão. Os núcleos magnéticos revestidos com uma camada de sílica mantiveram o comportamento superparamagnético. Para a tionina e o azul de metileno não foi detectada geração de oxigênio singlete após a imobilização. Para o azure A, protoporfirina IX e clorofilina imobilizados, a geração de oxigênio singlete foi detectada e caracterizada por métodos químicos e físicos. O material contendo clorofilina mostrou-se bastante promissor e foi empregado em estudos preliminares com células HeLa, levando à morte celular após irradiação, o que comprova o potencial para PDT. O comportamento do fotossensibilizador imobilizado e a possível proteção extra fornecida pela camada de sílica foram estudados pela supressão de fluorescência com íons brometo e supressão da geração de oxigênio singlete com albumina de soro bovino. Hematoporfirina IX é mais afetada na forma livre do que imobilizada em nanoesferas de sílica, o que indica que o FS imobilizado é capaz de gerar oxigênio singlete e está mais protegido de interferentes. / The immobilization of photosensitizers (PS) in nanometric materials is an excellent alternative to their use in molecular forms for photodynamic therapy (PDT). The present work describes a series of synthetic strategies for the immobilization of PS on silica nanospheres containing magnetic nucleous, as well as the studies of the photochemical, photophysical and morphological properties of the obtained materials. The studied PS were methylene blue, thionin, azure A, protoporphyrin IX, hematoporphyrin IX and chlorophyllin. The immobilization methodologies involve the addition of PS during the growth of the silica shell or the attachment of PS to the material surface. Often, a previous modification of the PS with organosilanes was necessary. The magnetic cores were prepared by co-precipitation of iron(II) and iron(III) salts in basic media and the coating with silica was performed by a microemulsion using TEOS. After coating with silica, the magnetic nanomaterial maintained the superparamagnetic behavior. The generation of singlet oxygen by thionin and methylene blue was not detect after immobilization. The generation of singlet oxygen by immobilized azure A, protoporphyrin IX and chlorophyllin was detected and characterized by chemical and physical methods. The material containing chlorophyllin is promising for PDT and was applied in preliminary studies with HeLa cells, causing cell death after irradiation. The behavior of the immobilized PS and the possible extra protection given by the silica shell were investigated by fluorescence quenching with bromide ions and by suppression of singlet oxygen generation with bovine serum albumin. Hematoporphyrin IX was more affected in the free form than immobilized in silica nanospheres, which indicates that the immobilized FS still generates singlet oxygen and is more protected against interfering species

A Terapia Fotodinâmica (TFD) caracteriza-se por um conjunto de processos físicos, químicos e biológicos que ocorre após a administração de compostos fotossensibilizantes, que ficam retidos preferencialmente nos tecidos alterados, ao que se segue a irradiação com luz visível, ativando esses fotossensibilizadores (FS) por meio da absorção da luz. Nesta modalidade terapêutica, ocorrem mecanismos de transferência de energia entre o FS e o oxigênio molecular presente nos tecidos, gerando espécies reativas de oxigênio capazes de levar as células à morte. A TFD tem uma de suas principais aplicações no tratamento do câncer de pele, e este trabalho tem por objetivo otimizar tal aplicação utilizando a luz intensa pulsada (LIP) como sistema de irradiação. Na literatura, estudos demonstram a eficiência da aplicação de LIP na área dermatológica e estética na remoção de pelos, tratamento de lesões vasculares, acnes e no fotorejuvenescimento da pele, através de efeitos fotoquímicos e térmicos, mas não há relatos sobre aplicações terapêuticas para o câncer de pele. A aplicação da LIP em TFD leva a diferentes tipos de vantagens destacando-se a possibilidade de diminuição do tempo de tratamento, com consequente redução da dor durante o procedimento. Além disso a possibilidade de aplicação de misturas de FSs que absorvam em diferentes comprimentos de onda, promovendo a ativação simultânea de diferentes bandas de absorção que pode levar a potencialização do efeito da TFD. A ideia da irradiação com LIP é permitir a possibilidade de excitar diferentes bandas do FS simultaneamente, bem como reduzir os níveis de saturação do oxigênio dos tecidos devido a longos períodos de irradiação, minimizando também possíveis efeitos térmicos ocasionados pela irradiação prolongada. Neste trabalho, estudou-se a TFD com um equipamento comercial de LIP (Intense Pulse Light, HKS801) utilizando dois precursores do FS endógeno Protoporfirina (PpIX), 5-ácido aminolevulínico (ALA) e aminolevulinato de metila (M-ALA) e os FSs Photodithazine (PDZ) e Indocianina verde (ICV), em modelo de pele normal de suínos. As diferenças relativas à aplicação tópica de ALA e M-ALA por meio de creme e através da aplicação em sistema de injeção de alta pressão sem agulhas (SAFE INJECT) foram avaliadas. O sistema de injeção também foi utilizado para disponibilização dos FSs na pele. O estudo in vitro mostrou que a LIP interagiu com todos os FSs e levou à multiativação de suas bandas. Com relação aos estudos in vivo observou-se diferentes aspectos do uso da LIP para TFD. A avaliação de fluorescência mostrou que a distribuição por injeção foi mais homogênea, sugerindo a possibilidade de protocolos de TFD menos demorados. A análise termográfica mostrou que não ocorre aquecimento relevante do tecido nas aplicações de LIP em aplicações de TFD no protocolo utilizado. A avaliação histológicas das condições entre 24 e 48 horas permitiu observar as diferentes fases do processo cicatricial em função do tempo decorrido. O estudo possibilitou maior entendimento sobre os efeitos da LIP em tecido biológico, especialmente em associação à TFD. Também foi estabelecido, pela primeira vez, um modelo de protocolo para investigação do uso da LIP em modelo animal para TFD em pele, que pode ser extrapolado em futuros estudos para tratamentos oncológicos e dermatológicos. Consideradas as possibilidades oferecidas e a pronta disponibilidade do dispositivo para irradiação, a TFD com LIP torna-se viável técnica e comercialmente para uso clínico. / Photodynamic Therapy (PDT) is mainly composed of physical, chemical, and biological processes that occur after administration of photosensitizing compounds, which are selectively held in abnormal tissues. After visible light irradiation, those photosensitizers (PS) are activated by light absorption. During treatment, energy transfer mechanisms take place between PS and molecular oxygen that is available in tissues, promoting the generation of reactive oxygen species that bring cells to death. One of this technique´s main applications is skin cancer treatment, and this study aims to optimize such a PDT application by using intense pulsed light (IPL) as irradiation system. Literature shows IPL efficacy on dermatological aesthetic procedures, such as hair removal, treatment of vascular lesion, acne and skin photorejuvenation, promoted by photochemical and thermal effects. However, skin cancer treatment was never reported. Using IPL for PDT may bring advantages such as reducing the treatment sessions, which reduces pain during procedures, and the ability to use PS blends that will absorb in different regions of wavelengths, resulting in simultaneous activation of different absorption bands and improving PDT effect. Shorter irradiation may reduce oxygen depletion due to long irradiation periods, and major thermal effects. In this study, PDT was performed using an IPL commercial device (Intense Pulse Light, HKS801) with the application of two PpIX precursors (ALA and MAL) and the exogenous PS Photodithazine (PDZ) and Indocyanine Green (ICG) on porcine health skin model. Administration of the PS or PpIX precursors were investigated both by vehiculation via cream and by high pressure, needle-free injection (SAFE INJECT). The results obtained in this study showed that the damage induced by PDT using the needle-free injection is more expressive than for cream vehiculation. The in vitro study showed that IPL interacted with all PS and promoted absorption bands multi-activation. The in vivo studies showed different aspects of using IPL for PDT. Fluorescence investigation showed that the distribution by the needle-free injection was more homogeneous, suggesting that shorter PDT protocols are possible. Thermography imaging showed that no relevant heating was observed for IPL applications of PDT during the protocols of choice. Histological analysis of conditions between 24 and 48 hours allowed observing the different stages of the healing process as a function of time. This study provided deeper understanding of IPL effects in biological tissues, and particularly when associated to PDT. In addition, for the first time, an investigation protocol for the use of IPL-PDT in porcine healthy skin was designed, which can be extrapolated for future studies on cancer and skin lesions. Given the possibilities and the prompt availability of the irradiation device, IPL-PDT is readily available technically and commercially for clinical use.

A Fotoquimioterapia (FQT) vem sendo usada no tratamento de várias doenças, inclusive câncer, com a vantagem de ser menos agressiva, possuindo efeitos colaterais negativos desprezíveis. Esta técnica envolve a combinação de uma fonte de luz visível e de um fotossensibilizador (FS), que é reativo apenas sob a irradiação com luz adequada, e que se acumula preferencialmente no tecido doente. Uma ideia para deixar essa técnica mais eficiente é potencializar esta última característica do FS com uso de um carreador que tenha afinidade com tecidos doentes. Pensamos na hipótese de usar a albumina do soro como carreador uma vez que ela é uma proteína intrínseca do organismo, tem alta afinidade com os tecidos tumorais e possui sítios para ligar vários compostos extrínsecos. Como modelo usamos a albumina de soro bovino (ASB). Como FS utilizamos acridina laranja, nitrofurantoína, corantes ciânicos com dois cromóforos e protoporfirina IX (PpIX) sintética e extraída de glândulas Harderianas de ratos da linhagem Wistar (PpIX endógena). Foram analisadas as características de ligação entre os FS e a ASB e seus efeitos nas características fotofísicas dos FS em função da sua estrutura, utilizando espectroscopias de absorção ótica, fluorescência estática e resolvida no tempo e a técnica de microscopia de imagens por tempo de vida da fluorescência (FLIM). Foi mostrado que a ligação com ASB induz ao deslocamento batocrômico dos espectros de absorção e da fluorescência, aumentando a intensidade e o tempo de vida de fluorescência dos FS. Características como carga positiva, estrutura linear e tamanho pequeno da molécula do FS favorecem sua ligação com a ASB. Uma comparação entre PpIX sintética e endógena mostrou que a formação de um complexo da PpIX com estruturas anfifílicas também aumenta a probabilidade da sua ligação com a ASB. Os resultados obtidos mostraram que a ASB se liga efetivamente aos FS de diferentes estruturas e pode ser usada como carreador dos mesmos para tecidos tumorais. / Photochemotherapy (PCT) is used for the treatment of various diseases, including cancer, with the advantage of being less aggressive with reduced adverse effects. This technique includes the use of a visible light source and a photosensitizer (PS), which is reactive only under light exposure and localizes preferably in abnormal tissues. To make this technique more efficient it is necessary to increase the PS content in these tissues using a carrier which possesses affinity with these tissues and is able to bind PS. A good opportunity is to use serum albumin as a carrier since it is an intrinsic protein, has high affinity to tumor tissues and possesses sites for binding of various extrinsic compounds. In this work the bovine serum albumin (BSA) was used as a carrier model. Acridine orange, nitrofurantoin, cyanine dyes with two chromophores and protoporphyrin IX synthetic and extracted from Harderian glands of Wistar line rats (endogenous) were used as PS. The characteristics of the PS binding with BSA and the effect of this interaction on PS photophysical properties were studied using optical absorption, steady-state and time resolved fluorescence spectroscopies, and fluorescence lifetime image microscopy (FLIM). It was demonstrated that PS binding with BSA produces a bathochromic shift in the PS absorption and fluorescence spectra and increases its fluorescence intensity and lifetime. The positive charge, linear structure and small size of the PS molecule favors its binding with BSA. A comparison between synthetic and endogenous PpIX demonstrates that complexation of PpIX molecule with an amphiphilic structure increases the probability of its binding with BSA. The obtained results demonstrate that BSA binds effectively PS with different molecular structures and it is promising for their transport to tumor tissue.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2016-06-16T12:02:55Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Amanda Vargas Teles - 2016.pdf: 2056252 bytes, checksum: 368e99b26e688ce89da00fe5b604b179 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-06-28T13:14:00Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Amanda Vargas Teles - 2016.pdf: 2056252 bytes, checksum: 368e99b26e688ce89da00fe5b604b179 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T13:14:00Z (GMT). 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Aiming at new alternatives for the treatment and disposal of these cattle pathogen, the photoinactivation becomes a viable alternative because this treatment has shown to be effective against animal and human microorganisms. The technique is based on the synergistic combination of a photosensitizer (PS), oxygen, and light. When irradiated by a light source, the photosensitizer undergoes a series of photophysical processes, which culminate in the generation of reactive oxygen species (ROS), which in large amounts are toxic to pathogens. Aiming at a better efficiency of photoinactivation is necessary to know the characteristics of each photosensitizer, analyzing the molecular structure, quantum yield, lifetime, toxicity, stability, and absorption at specific wavelengths. The irradiation time has shown to be very important because each PS reacts differently at a given time. To evaluate the effect of the electrical charges present on PS, zinc insert ring in the central ring of the molecule and the irradiation time in the photodynamic inactivation, BoHV-1 aliquots were used with initial viral titer from 105.75 incubated for one hour with four different photosensitizers: TPPS4, ZnTPPS4, TMPyP, and ZnTMPYP. Subsequently, they we irradiated for two hours and sampled every 15 minutes. As control, we used virus without any treatment, virus irradiated in the absence of PS, and virus with PS without radiating. After irradiation, the sample was added to cultures of cells permissive to the virus, which was analyzed for the presence of cytopathic effect (CPE), and the results were expressed as viral titers. Although all treatments had significant differences, all PSs used in the study were effective in the treatment of BoHV-1. The ZnTMPYP was the most efficient, fully inactivating the virus with 30 minutes of irradiation, and the TPPS4 showed the worst result unable to inactivate the virus after the period of irradiation, but considerably reduced the viral load of BoHV -1. We also analyzed the photodegradation of a plasmid DNA using the same photosensitizers. Again, ZnTMPYP showed better results. / O herpesvírus bovino 1 (BoHV - 1) é um vírus da família Herpesviridae e da subfamília Alphaherpesvirinae, conhecido por causar diversas doenças em bovinos no mundo todo, incluindo a rinotraqueíte, vaginite, balanopostite, aborto, conjuntivite e enterite. O BoHV - 1 é responsável por grande perda econômica, tanto para produtores de leite quanto de carne, devido a uma diminuição na produção de leite, diminuição na taxa de ganho de peso animal, uma maior susceptibilidade às infecções secundárias e as ocorrências de abortos. Visando novas alternativas para o tratamento e eliminação deste patógeno do rebanho, a fotoinativação se torna uma alternativa viável devido ao fato deste tratamento ter se mostrado eficiente contra vários microrganismos de interesse animal e humano. A inativação fotodinâmica (PDI) é baseada na combinação de três componentes: fotossensibilizador (PS), oxigênio e luz. Ao ser irradiado por uma fonte de luz no comprimento de onda específico, o fotossensibilizador sofre uma série de processos fotofísicos que culminarão na geração de espécies reativas do oxigênio (ROS) que em grandes quantidades são tóxicos a patógenos. Visando uma melhor eficiência da fotoinativação, é necessário conhecer as características de cada fotossensibilizador, analisando a estrutura molecular, rendimento quântico, tempo de vida, toxicidade, estabilidade e absorção em comprimentos de onda específicos. O tempo de irradiação tem se mostrado muito importante, porque cada PS reage de uma maneira diferente em determinado período. Para avaliar a interferência das cargas elétricas presentes nos PS, a inserção de zinco no anel no anel central da molécula e o tempo de irradiação na inativação fotodinâmica, foram utilizadas alíquotas do BoHV-1 com título viral inicial de 105,75, incubadas durante uma hora com quatro diferentes porfirinas como fotossensibilizadores: TPPS4, ZnTPPS4, TMPYP e ZnTMPYP. Posteriormente, foram irradiadas durante duas horas, sendo retiradas amostras a cada 15 minutos. Como controle foram utilizados vírus sem qualquer tipo de tratamento, vírus irradiado sem a presença de PS e vírus com PS sem irradiar. Após a irradiação a amostra foi adicionada em culturas de células permissíveis ao vírus, onde foi analisada a presença de efeito citopático (CPE) e os resultados foram expressos em títulos virais. Apesar de todos os tratamentos possuírem diferenças significativas, todos os PSs utilizados no estudo se mostraram eficazes no tratamento do BoHV-1. A ZnTMPYP foi a mais eficiente, inativando totalmente o vírus com 30 minutos de irradiação, e a TPPS4 apresentou o pior resultado não conseguindo inativar o vírus após o período de irradiação, porém reduziu consideravelmente a carga viral do BoHV-1. Analisamos também a fotodegradação de um DNA plasmidial utilizando os mesmos fotossensibilizadores. Novamente, a ZnTMPYP apresentou melhores resultados.

A leishmaniose pertence à classe de doenças infecciosas e é causada por parasitas do gênero Leishmania. Essa enfermidade se manifesta nas formas visceral ou cutânea e o tratamento de ambas consiste em quimioterapia utilizando fármacos à base de antimônio. A aplicação desses medicamentos, no entanto, apresenta diversas desvantagens, como o surgimento de efeitos colaterais severos e a disseminação de parasitas resistentes aos fármacos convencionais. Dessa forma, há uma grande necessidade de se desenvolver novos medicamentos, bem como, novas técnicas de tratamento e diagnostico. Neste trabalho foram sintetizados novos fotossensibilizadores derivados da riboflavina (vitamina B2) com potencial aplicação no tratamento de leishmaniose cutânea (através de terapia fotodinâmica) e foram sintetizados novos complexos de Ru (II) com potencial uso como sensores luminescentes de antimônio. Os derivados da riboflavina foram obtidos utilizando a vitamina B2 como material de partida e as transformações químicas estudadas fizeram uso de reações de acilação das hidroxilas da cadeia ribitil e de alquilações do nitrogênio 3 do sistema de anéis isoaloxazina. Essas modificações estruturais permitiram a construção de uma biblioteca de fotossensibilizadores que contém partes hidrofílicas, hidrofóbicas, anfifílicas e iônicas, que possibilitaram estudos da relação estrutura atividade. Com a otimização dessas rotas sintéticas foram obtidos dois derivados flavínicos-catiônicos inéditos na literatura com rendimentos de até 68%. Foi mostrado que as transformações químicas estudadas não afetaram significantemente as propriedades fotofísicas dos derivados flavínicos, sendo todos eles fluorescentes e capazes de fotossensibilizar a produção de oxigênio singlete com rendimento quântico semelhante ao da riboflavina (Φ&#916. ≈ 0,5). Por outro lado, as modificações estruturais na riboflavina alteraram as propriedades físico-químicas em termos de solubilidade e coeficiente de partição. Os derivados sintetizados foram testados contra promastigotas de Leishmania major utilizando LED azul (470 nm). Os fotossensibilizadores apresentaram baixa toxicicidade no escuro (CE50 (concentração efetiva 50%)> 100 µM para todos os compostos) e todos os derivados testados apresentaram maior fototoxicidade (CE50 de até 5 µM) que a riboflavina (CE50 de 50 µM). Foi observado que a fototoxicidade dos derivados da riboflavina está fortemente associada à lipofilicidade do fotossensibilizador. Um complexo de Ru (II) que responde à presença de antimônio foi preparado a partir do bis-complexo Ru(bpz)2Cl2 e do ligante derivado da fenantrolina contendo o grupo bitiofeno (bitiofeno-imidazo-fen). Esse complexo apresenta potencial na construção de sensores luminescentes de antimônio. Foi mostrado que o novo complexo sintetizado [Ru(bpz)2(bitiofeno-imidazo-fen)2+] apresenta baixa luminescência na região do vermelho devido à auto-supressão causada pelo grupo bitiofeno. No entanto, estudos preliminares mostraram que a adição de SbCl3 ou tartarato de antimônio ao meio intensifica significativamente a emissão nessa região do espectro. Devido à formação do complexo Sb-bitiofeno, ocorre o aumento percentual da espécie eletronicamente excitada e a mesma é auto-suprimida com menos eficiência. / The leishmaniases belong to a group of infectious diseases caused by a parasite of the genus Leishmania. This disease manifests as the visceral or the cutaneous forms and the treatment of both types is based on chemotherapies with antimony drugs. The application of these drugs, however, presents drawbacks like several side effects and dissemination of parasites resistant to this conventional treatment. Thus, there is a growing need to develop new drugs, as well as new modalities of treatment and diagnosis. In this work, novel photosensitizers derived from riboflavin (vitamin B2) with potential application in the treatment of cutaneous leishmaniasis (by photodynamic therapy) were synthesized. Also, novel Ru (II) complexes with potential usage as luminescent sensors of antimony were synthesized. The riboflavin derivatives were obtained by using vitamin B2 as the starting material, and the chemical transformations were based on acylation of the hydroxyl groups from the ribityl side chain and alkylation of nitrogen 3 of the isoalloxazine ring system.These structural modifications yielded a library of photosensitizers containing hydrophilic, hydrophobic, amphiphilic or ionic moieties, which provide molecules for a study of the structure-activity relationship. By optimizing these synthetic routes, two novel cationic riboflavin derivatives were obtained in good yield (up to 68%). It has been shown that the chemical modifications performed have not significantly affected the photophysical properties of the riboflavin derivatives. All compounds are fluorescent and able to photosensitize singlet oxygen in yields similar to riboflavin itself (Φ&#916 ≈ 0,5). On the other hand, these structural modifications varied the physic-chemical properties related to solubility and partition coefficient of the derivatives. The obtained derivatives were tested against promastigotes of Leishmania major using blue LED (470 nm). The photosensitizers displayed low dark toxicity (EC50 (Effective Concentration 50%) > 100 µM for all the studied compounds) and all derivatives showed greater phototoxicity (EC50 up to 5µM) when compared to riboflavin (EC50 = 50µM). It was observed that the phototoxicity of the riboflavin derivatives is strongly associated with the lipophilicity of photosensitizer. A Ru (II) complex that responds in the presence of antimony was prepared from Ru(bpz)2Cl2 and a phenanthroline ligand containing a bithiophene group (bithiophen-imidazo-phen). This complex can be potentially applied in the construction of luminescent sensors of antimony. It has been demonstrated that the novel complex [Ru(bpz)2(bitiofeno-imidazo-fen)2+] displays low red luminescence due to the self-quenching promoted by the bithiophen moiety. However, preliminary studies have evidenced that, upon addition of SbCl3 or antimony tartrate to the media, the emission intensifies in the red region of the spectrum. Due to the formation of the chelate Sb-bithiophene, the elf-quenching of the electronic excited species occurs less efficiently.

Mitocôndrias desempenham um papel central na homeostase celular. Estas organelas se diferem das demais não só por suas múltiplas funções, mas por terem seu próprio genoma, distinto do genoma nuclear. Estas organelas também participam de mecanismos de morte celular de forma central nos três mecanismos mais conhecidos: apoptose, necrose e autofagia. O mtDNA está localizado na face interna da membrana mitocondrial, onde são geradas grandes quantidades de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs). Em consequência, o mtDNA acumula modificações oxidativas, mesmo em condições normais de metabolismo. Entretanto as respostas celulares ao acúmulo de lesões no mtDNA ainda não são claras. Para investigarmos se lesões oxidativas no mtDNA causam morte celular, propomos um modelo no qual oxigênio singlete é gerado especificamente na mitocôndria, pela ação de fotossensibilizadores com diferentes localizações celulares (azul de metileno, AM, e cristal violeta, CV, citosólicos; Ro 19-8022, Ro, citosólico e nuclear). Mostramos, por microscopia confocal, que os corantes tem a localização esperada em células HeLa. Além disso, observamos que o AM gera oxigênio singlete proporcionalmente a concentração do corante e dose de fotoativação. Mostramos que células tratadas com os corantes diminuem a velocidade de duplicação 24 h após o tratamento, que resulta em morte celular. Para AM e Ro, estes efeitos foram proporcionais à concentração de corante e da dose de fotoativação. Por outro lado, CV apresentou uma alta toxicidade mesmo no escuro. Mostramos que as células tratadas com AM não apresentam fragmentação internucleossômica de DNA, típica de apoptose após 24 h e não apresentam quebras de fita e formação de sítios abásicos logo após o tratamento. Finalmente mostramos que células com depleção do número de cópias de mtDNA são menos sensíveis ao tratamento com AM e igualmente sensíveis ao tratamento com Ro que células HeLa normais, indicando que lesões oxidativas ao mtDNA determinam a sensibilidade celular ao AM. / Mitochondria play a central role in cell homeostasis. They differ from other subcellular structures not only due to their many functions but also because they have their own genome. Moreover, mitochondria also play a central role in cell death, in apoptosis, necrosis as well as autophagy. The mitochondrial DNA sits at the inner side of the inner mitochondrial membrane, where most of reactive oxygen species are generated, and in fact, mtDNA accumulates oxidative damage under normal physiological conditions. However, cellular responses to mtDNA damage are not clearly understood. In order to ascertain whether mtDNA damage induces cell death, we established a cellular model in which oxidative stress is induced exclusively in mitochondria, by using two photosensitizers that localize in the cytosol (methylene blue, MB and crystal violet, CV) and comparing to another one with diffuse distribution (Ro 19-8022, Ro). These molecules generate singlet oxygen locally upon photoactivation. Using confocal fluorescence microscopy we confirmed the cellular localization of the dyes, and found that. MB generates singlet oxygen in cells in a dose- and light-dependent fashion. Treatment with the dyes induced dose-dependent cell proliferation inhibition and cell death. The cytotoxic effects of MB and Ro were completely dependent on light-activation whereas CV induced cell death in the dark. We found that under these conditions, MB treatment did not induce internucleosomal DNA fragmentation or non-nucleosomic fragmentation, as we did not observe comet formation. These results indicate absence of nuclear DNA damage. On the other hand, cells depleted of mtDNA showed decreased sensitivity to MB but not to RO, indicating that mtDNA damage plays a key role in inducing cell death under these experimental conditions.

O gênero Neoscytalidium está crescentemente sendo associado às infecções superficiais e profundas causadas em pacientes imunocomprometidos e imunocompetentes. O fungo filamentoso Neoscytalidium dimidiatum é um microrganismo saprofítico e fitopatogênico, encontrado no solo e vegetação de regiões de clima tropical e subtropical. N. dimidiatum var. hyalinum e N. dimidiatum estão envolvidos em infecções superficiais de pele e unha sendo que a espécie produtora de melanina, N. dimidiatum, está associado preferencialmente a infecções profundas sugerindo que a espécie variante não produtora de melanina, N. dimidiatum var. hyalinum, pode ser menos virulenta que a pigmentada. Pouco é descrito na literatura sobre as variedades em questão tanto em relação à sensibilidade a drogas antifúngicas e ao tratamento fotodinâmico antimicrobiano (TFDA), bem como a características fisiológicas referentes à tolerância a variações de temperatura e pH. Assim, o presente trabalho teve como objetivo o estudo de isolados clínicos de N. dimidiatum e N. dimidiatum var. hyalinum obtidos de infecções de pele e unha. Neste estudo foram realizadas a identificação molecular, a filogenia multilocus, a verificação in vitro do desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs e a caracterização in vitro do perfil de susceptibilidade a antifúngicos e TFDA com fotossensibilizadores (FSs) fenotiazínicos, bem como os efeitos do TFDA nas biomoléculas dos artroconídios das variedades estudadas. A filogenia multilocus foi realizada pelo sequenciamento de sete diferentes loci onde foi evidenciado polimorfismo na região Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 e nos genes ?-Tubulina (TUB), Fator de Alongamento de cadeia 1? (EF1) e Histona H3 (HH3). O agrupamento dos isolados clínicos deste estudo em genótipos distintos permitiu a separação em 6 tipos de sequência (TSs), sendo que o TS5 foi composto apenas pela espécie variante N. dimidiatum var. hyalinum. A análise de desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs demonstrou um tamanho de colônia reduzido para todos os isolados de N. dimidiatum var. hyalinum. Anfotericina B, voriconazol e terbinafina foram os antifúngicos mais eficientes para ambas variedades. Os valores das concentrações inibitórias mínimas (CIMs) encontrados para os derivados azólicos foram baixos para todos os isolados clínicos de N. dimidiatum var. hyalinum. Os isolados clínicos de N. dimidiatum mostraram ser menos sensível ao TFDA com os FSs azul de metileno (MB), novo azul de metileno N (NMBN), azul de toluidina O (TBO) e novo derivado sintético (S137) quando comparado à variedade hialina. NMBN e S137 mostraram maior eficiência para inativação de Neoscytalidium spp. Adicionalmente, no TFDA todos os FSs apresentaram efeito de permeabilidade de membrana plasmática, embora somente NMBN e S137 apresentaram a produção de Malondialdeido (MDA), isto é, causaram a peroxidação lipídica nos artroconídios de N. dimidiatum e da variedade hialina / Neoscytalidium sp. is increasingly being associated with superficial and deep infections in immunocompromised and immunocompetent patients. The filamentous fungus Neoscytalidium dimidiatum is a saprophytic and plant pathogenic microorganism that is found in soil and vegetation of tropical and subtropical regions. N. dimidiatum var. hyalinum and N. dimidiatum are involved in superficial skin and nail infections. The melanin producer N. dimidiatum is preferably associated with deep infections suggesting that the clinical isolate without melanin, N. dimidiatum var. hyalinum, may be less virulent than the pigmented variety. Little is described in the literature regarding the varieties N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum about the sensitivity to antifungal drugs and photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT), and the physiological characteristics related to the growth at different temperature and pH. Therefore, the present study aimed to investigate clinical isolates of N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum obtained from skin and nail infections. Here in this study were performed the molecular identification, multilocus phylogeny, the in vitro characterization of development at different temperatures and pHs, and the characterization of in vitro susceptibility to antifungal agents and PACT with phenotiazinium photosensitizers (PSs), as well the PACT effects on the biomolecules of the Neoscytalidium spp. arthroconidia. The multilocus phylogeny was performed by sequencing seven different loci where polymorphism were identified in the Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 region of rDNA and in the genes ?-tubulin (TUB), elongation factor 1? (EF1) and Histone H3 (HH3). The grouping of the clinical isolates from this study in different genotypes allowed the clustering in 6 sequence types (ST), in which the ST5 was composed exclusively by all N dimidiatum var. hyalinum isolates from this study. The analysis of development at different temperatures and pHs showed a reduced colony size for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. Amphotericin B, voriconazole and terbinafine were the most effective antifungal for both varieties. The minimal inhibitory concentrations (MICs) values found for the azoles derivatives were low for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. N. dimidiatum clinical isolates have shown to be less sensitive to PACT with the PS methylene blue (MB), new methylene blue (NMBN), toluidine blue O (TBO) and new synthetic derivative (S137) when compared to hyaline variety. NMBN and S137 have shown more effectiveness for the inactivation of Neoscytalidium spp. Additionally, all PS in PACT have caused plasma membrane permeability, although only NMBN and S137 showed the production of malondialdehyde (MDA), i.e., caused lipid peroxidation in both N. dimidiatum and hyaline variety

A oxidação de membranas lipídicas pode ser benéfica (p.ex. sinalização celular) ou prejudicial, sendo a permeabilização de membranas uma de suas consequências citotóxicas. A permeabilização fotoinduzida de membranas é parte essencial do mecanismo da terapia fotodinâmica (PDT), uma modalidade clínica em que fotossensibilizadores, luz e oxigênio são combinados para oxidar biomoléculas e consequentemente danificar células indesejadas. Neste trabalho, buscamos entender molecularmente quais fatores levam à permeabilização fotoinduzida de membranas. Enfatizamos os papéis do oxigênio, do status da membrana e de reações específicas do fotossensibilizador em contato com a membrana. Simulações de dinâmica molecular foram usadas para obter a distribuição de oxigênio em membranas em função da temperatura nas fases fluida ou gel. Procedimentos específicos de análise de cinéticas de luminescência de oxigênio singlete foram desenvolvidos para calcular tempos de vida de estado excitado triplete compatíveis com as variações da distribuição de oxigênio em membranas. Caracterizamos um derivado fluorogênico do α-tocoferol como uma sonda para oxigênio singlete em experimentos com lipossomos, possibilitando comparar qualitativamente os níveis de oxigênio singlete atingindo a membrana quando produzido por fotossensibilizadores hidrossolúveis ou lipossolúveis. Experimentos em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) nos permitiram comparar a ativação da sonda com o aumento de área superficial da membrana, e estimar a constante de velocidade da reação do oxigênio singlete com lipídeos insaturados como 6 x 104 M-1 s-1. Estreitando nosso foco para a permeabilização fotoinduzida de membranas, inicialmente caracterizamos quatro fotossensibilizadores fenotiazínicos em relação a suas interações com membranas e suas capacidades de promover o vazamento de uma sonda fluorescente. Fotossensibilizadores que se particionaram mais em membranas (e não os geradores de oxigênio singlete mais eficientes) danificaram a membrana de lipossomos mais eficientemente. A ligação à membrana também afetou as vias de decaimento dos estados excitados triplete. Com esse estudo, selecionamos o fotossensibilizador hidrofílico azul de metileno (MB) e o fotossensibilizador mais hidrofóbico DO15 para as investigações subsequentes. Os efeitos de ambos os fotossensibilizadores em GUVs foram caracterizados e observamos que as cinéticas de permeabilização indicaram diferentes taxas de produção de lipídeos formadores de poros para MB e DO15, o que deve depender de interações específicas com a membrana. Para melhor compreender o papel de interações fotossensibilizador/membrana, caracterizamos a oxidação de lipídeos por ambos os fotossensibilizadores, em uma condição em que DO15 permeabilizava membranas 70 vezes mais eficientemente que MB. Observamos principalmente a formação de hidroperóxidos lipídicos para MB, enquanto que para DO15, além desses mesmos produtos, observamos a formação de álcoois, cetonas e aldeídos fosfolipídicos de cadeia truncada, esses últimos tendo sido relacionados a condições em que se observou a permeabilização de membranas. Embora já fosse sabido que aldeídos fosfolipídicos aumentam a permeabilidade da membrana, esse fenômeno nunca havia sido demonstrado para a formação de aldeídos in situ. A fotooxidação lipídica foi acompanhada por aumento do fotobranqueamento de DO15 e pela formação de radicais lipídicos oxigenados, indicando a ocorrência de reações diretas entre lipídeos e fotossensibilizadores. O mapeamento dos fatores que levam à permeabilização fotoinduzida em membranas, focando em reações e interações moleculares, é o maior produto desse trabalho / Oxidation of lipid membranes can be beneficial (e.g., cell signaling) or detrimental, with membrane permeabilization representing one of its cytotoxic outcomes. Photoinduced membrane permeabilization is key to the mechanism of photodynamic therapy (PDT), a clinical modality in which photosensitizers, light and oxygen are combined to oxidize biomolecules and consequently damage diseased cells. In this work, we aimed to understand at the molecular level which factors lead to photoinduced membrane permeabilization. We emphasized the roles of oxygen, membrane status and specific reactions of the photosensitizer in contact with the membrane. Molecular dynamics simulations were used to assess oxygen distribution in membranes as a function of temperature within membranes in gel or liquid phases. Special fitting procedures of singlet oxygen luminescence kinetics were devised to allow the calculation of triplet excited state lifetimes compatible with variable oxygen distributions in membranes. We characterized a fluorogenic α-tocopherol probe as a singlet oxygen trapping molecule in experiments with liposomes, and were able to qualitatively compare the amount of singlet oxygen molecules reaching the membrane after being generated by water soluble or membrane bound photosensitizers. Experiments performed in giant unilamellar vesicles (GUVs) allowed us to compare the activation of the probe with the observed membrane surface area increase and estimate the reaction rate of singlet oxygen with unsaturated lipids to be 6 x 104 M-1 s-1. We then narrowed our focus to photoinduced membrane permeabilization, initially characterizing four phenothiazinium photosensitizers with respect to their interactions with membranes and their capability to promote leakage of a fluorescent probe. Photosensitizers that bound to membranes to a larger extent (and not the most efficient singlet oxygen generators) were the most efficient ones to damage liposomal membranes. Membrane binding also affected triplet excited state deactivation pathways. From this study, we selected the hydrophilic photosensitizer methylene blue (MB) and the more hydrophobic photosensitizer DO15 for subsequent investigations. We characterized the effects of both photosensitizers in GUVs and observed that the kinetics of membrane permeabilization implied different rates of generation of pore-forming lipids for MB and DO15, which should depend on specific interactions with membranes. To further understand the role of photosensitizer/membrane interactions, we characterized the oxidized lipids formed by both photosensitizers in a condition in which the membrane permeabilization efficiency of DO15 was 70 times higher than that of MB. We observed mainly formation of lipid hydroperoxides by MB, while DO15 not only led to these same products, but also to alcohols, ketones and phospholipid truncated aldehydes, the latter being related to conditions in which membrane permeabilization was observed. Although aldehydes were already known to increase membrane permeability, this phenomenon had never before been demonstrated for aldehyde formation in situ. Lipid photooxidation was accompanied by increased photobleaching of DO15 and by formation of lipid oxygenated radicals, indicating the occurrence of direct reactions between lipids and photosensitizers. A roadmap of the factors leading to photoinduced membrane permeabilization focusing on molecular interactions and reactions is the major achievement of this work.