Le mélanome métastatique reste à l’heure actuelle une pathologie dramatique avec une survie moyenne de 13 mois après diagnostic, démontrant l’échec des chimiothérapies. Ces travaux de thèse ont pour but de développer une stratégie alternative utilisant les siRNA (petits ARN interférents) encapsulés au sein de nanocapsules lipidiques (LNC) pour une injection intraveineuse. Les premiers travaux ont porté sur le développement et l’amélioration du procédé de formulation des LNC chargées en siRNA. Les résultats ont permis une encapsulation à hauteur de 35%, une stabilité prolongée supérieure à 3 mois et une efficacité d’extinction du gène cible dans les cellules de mélanome. La deuxième partie de la thèse s’est orientée sur les stratégies de ciblage du mélanome après administration systémique. Différentes modifications de surface des LNC à l’aide de polyéthylène glycol (PEG) et d’Affitins (peptide d’affinité) ont été mises au point. La biodistribution sur des animaux « sains » ou des animaux greffés en sous-cutanés (mélanome humain) a révélé des comportements distincts en fonction des recouvrements utilisés. Les formes pegylées ont montré une accumulation préférentielle au site tumoral en comparaison avec les formes non modifiées ou modifiées avec les Affitins. Dans une troisième partie, des études d’efficacité anti-tumorale ont été réalisées avec un siRNA ciblant la protéine Bcl-2 ou la sous unité alpha 1 de la pompe Na/K ATPase. Une réduction du volume tumoral de 25% est observée avec les LNC siRNA Bcl-2. Par ailleurs, l’association de nouvelles chimiothérapies, les ferrocifènes, et des siRNA Bcl-2, montrent grâce à leur co-encapsulation au sein des LNC, des effets prometteurs. Ces travaux démontrent ainsi la capacité des LNC à délivrer des siRNA par voie intraveineuse dans de nouvelles stratégies de ciblage du mélanome. / Metastatic melanoma represents the most aggressive form of skin cancer with a median survival around 13 months. The low efficacy of actual chemotherapy is explained by important resistance phenomenon. The objective of this work consists in developing a new alternative strategy based on siRNA (small interfering RNA) encapsulated into lipid nanocapsules (LNCs) for intravenous injection. Firstly, the experiments were focused on development and optimization of formulation process for the encapsulation of siRNA into LNCs. The result demonstrated an encapsulation efficiency evaluated at 35% by spectrophotometer analysis, an important stability at 4°C (for at less 3 month) and an efficient gene inhibition in melanoma cells. The second part of this work studied the melanoma targeting potential of surface modified LNCs after systemic injection. In this way, pegylation with different polymers and Affitin grafting (affinity peptide) was performed on siRNA LNCs. The biodistribution on healthy animals and subcutaneous melanoma tumor bearing mice revealed the distinct behavior of various modified LNCs. All pegylated LNCs showed a preferential accumulation in tumor site in comparison with non-modified or Affitins LNCs. In a third part, the anti-cancer efficacy was tested with siRNA targeting Bcl-2, an anti-apoptotic member, or Alpha 1 subunit of Na/K ATPase. A reduction of tumoral volume evaluated at 25% was observed for Bcl-2 siRNA LNC. Moreover, the association with new promising anticancerous drug, ferrocifens, and Bcl-2 siRNA co-encapsulated into LNCs evidenced promising effects. This work demonstrated the capacity of LNC to deliver siRNA into melanoma cells and tumor after systemic administration thank to new targeting strategies in melanoma

Les cancers de l’ovaire constituent la cinquième cause de cancer chez la femme et la principale cause de décès pour cancer gynécologique. Ce mauvais pronostique est lié à un diagnostic tardif de la maladie et à l’acquisition de la résistance au sel de platine. L’individualisation thérapeutique est nécessaire compte tenu de l’évolution très clinique hétérogène malgré une histologie et un stade similaire. Les facteurs pronostiques classiques comme l’âge, le stade FIGO, le type histologique, le grade et le résultat chirurgical, ne sont pas suffisants pour prédire la réponse thérapeutique et le pronostique. Cette hétérogénéité clinique est probablement expliqué par l’existence des formes biologiques différentes. La réponse clinique initiale à la chimiothérapie chez la plupart des patientes suivi d’une récidive dans plus de la moitié des cas suggère l’existence d’une subpopulation des cellules qui développe des mécanismes de résistance et survivent. Le TGCA a retrouvé des mutations au niveau de TP53 dans plus de 95% des patientes avec un cancer séreux de l’ovaire à haut grade. Ils ont trouvé une prévalence élevé de mutations somatiques mais peu récurrentes, avec un nombre important des variations du nombre de copies. La recombinaison homologue est défectueuse dans la moitié des tumeurs analysées et les voies de signalisation NOTCH et FOXM1 sont également impliqués. La mutation TP53 et les défets de réparation d’ADN provoquent une instabilité génétique et favorisent une diversité génétique. Il y a des données dans la littérature sur l’hétérogénéité existante entre différentes localisations des cancers de l’ovaire en fonction du moment de la maladie chez la même patiente et chez des patientes différentes avec la même histologie. Nous avons centré notre étude sur la caractérisation de l´expression génique des métastases péritonéales sur une série de patientes avec un cancer sereux de haut grade de l’ovaire en carcinose péritonéale. Nous avons montré des profils géniques différents entre les localisations péritonéales et la tumeur primitive. Nous avons mis en évidence que les gènes présentant des variations d’expression génique les plus marquées au niveau du péritoine codaient pour des protéines impliquées dans les voies de signalisation des principales cytokines intervenant dans l’oncogenèse dont la voie JAK/STAT. Ces voies de signalisation sont probablement impliquées dans la réponse des tumeurs à leur microenvironnement au niveau du péritoine (J Translational medicine 2012). Nous avons réalisé une deuxième étude pour combiner le séquençage génomique et transcriptomique au niveau des prelevements multi-site des patientes avec un cancer de haut grade de l´ovaire afin d’évaluer s’il existe des différences d’expression allélique. 43 gènes montrent des variants alléliques communs à tous les patients. La majorité des gènes presentent une expresión preferentielle par site mais les voies de sigalisation sont similaires pour les localisations peritoneales et pour les tumeurs primitives. Ces produits codent des protéines impliquées dans les voies de signalisation impliquées dans l’adhésion, la migration cellulaire, la réparation de l’ADN ou la croissance cellulaire et peuvent être des cibles thérapeutiques éventuelles (PLOS Genetics under final review). / Ovarian cancer is the fifth most common cause of cancer in women and the leading cause of death in gynaecological cancer. This low survival rate is due to the frequent diagnosis of epithelial ovarian cancer at an advanced stage, and to intrinsic and acquired resistance to platinum-based chemotherapy. Individualisation of treatment is necessary since EOC is a heterogeneous disease. Patients with morphologically similar, advanced-stage tumours display a broad range of clinical outcomes. Prognostic features, including patient’s age, performance status, FIGO stage, histological tumour grade and subtype, and initial surgery results, are insufficient to capture the important individual variations in response to chemotherapy and survival. This heterogeneous outcome suggests the existence of biologically different forms. The Cancer Genome Atlas (TCGA) found that TP53 mutations are present in more than 95% of HGSOC. They found a high prevalence of somatic mutations, but there is a low prevalence of recur¬rent mutations; and there are large-scale copy number aberrations. Initial analyses also suggest that homologous recombination is defective in about half of the tumours analysed, and that NOTCH and FOXM1 signalling are involved in ovarian cancer pathogenesis. However, TP53 mutation and frequent germline and somatic DNA repair defects lead to genetic instability with the potential to generate genetic diversity. Indeed, genetic heterogeneity by different mutational profiles throughout time among different tumor localisations within the same patient, and between patients have been reported.We have focused our research on the charecterisation of peritoneal gene expression profiles compared to primary ovarian lesions. High-density gene expression arrays demonstrate significant different gene expression profiles compared to theirs matched ovarian primary tumors. Differentially expressed genes are enriched in specific pathways, including cell adhésion, cytokine signaling and specifically JAK-STAT pathway. Underlying copy number variation significantly affect gene expression, and patients with copy number alterations displayed greater gene expression différences between their peritoneal and matched primary ovarian lesions (J Translational medicine 2012). In a second study, we performed a combined genome and transcriptome analysis form multi-site samples form ovarian cancer patients to identify preferentially expressed alleles. 43 genes shared across all patients presented significant allele variants. Patients clustered together but every sample and site clustered independently at the variant level. Most genes seemed site-specific but there were similar pathways in the primary and metastatic sites. Preferentially expressed alleles could act as cancer drivers and therefore they can constitute a new therapeutic target (PLOS Genetics under final review).

La récente découverte de nouvelles classes de petits ARN a ouvert la voie permettant l’exploration de nouvelles régulations des évènements physiopathologiques. Nous avons récemment démontré que les petits ARN dérivés des RNY (s-RNY) forment une classe indépendante de biomarqueurs permettant la détection de lésions coronariennes et sont associés au fardeau athérosclérotique. Ici, nous étudions le rôle des s-RNY dans les monocytes/macrophages humains et murins et avons démontré que dans les monocytes/macrophages chargées en graisse l’expression des s-RNY est corrélée dans le temps avec l’activation de la mort cellulaire dirigée par les caspases et de l’inflammation via la voie NF-κB. Des expériences de gain ou de perte de fonction ont démontré que l’expression même des s-RNY active la caspase 3 et l’activation de NF-κB. Etant donné que, dans les maladies cardiovasculaires, les s-RNY sont associés à Ro60 et circulent dans le sang de patients, nous avons étudié la fonction extracellulaire du complexe Ro60/s-RNY. Nos données démontrent que ce complexe induit la mort cellulaire ainsi que l’inflammation, lorsqu’il est ajouté au milieu de culture de monocytes/macrophages. Enfin, nous démontrons aussi que la fonction des s-RNY se fait par l’intermédiaire du récepteur de type Toll, TLR7. En utilisant un inhibiteur spécifique des TLR7, nous avons bloqué les effets intracellulaires aussi bien que les effets extracellulaires des s-RNY. Ces résultats positionnent les s-RNY en tant que molécules significatives qui vont impacter la physiopathologie des macrophages, indiquant leur rôle potentiel en tant que médiateur des maladies inflammatoires comme l’athérosclérose / The recent discovery of new classes of small RNAs has opened unknown territories to explore new regulations of physiopathological events. We have recently demonstrated that RNY-derived small RNAs (referred to as s-RNYs) are an independent class of clinical biomarkers to detect coronary artery lesions and are associated to atherosclerosis burden. Here, we have studied the role of s-RNYs in human and mouse monocytes/macrophages and have shown that in lipid-laden monocytes/macrophages s-RNY expression is timely correlated to the activation of both NF-κB and caspase 3-dependent cell death pathways. Loss- or gain-of- function experiments demonstrated that s-RNYs activate caspase 3 and NF-κB signaling pathways ultimately promoting cell death and inflammatory responses. Since, in atherosclerosis, Ro60-associated s-RNYs generated by apoptotic macrophages are released in the blood of patients, we have investigated the extracellular function of the s-RNY/Ro60 complex. Our data demonstrated that s-RNY/Ro60 complex induces caspase 3-dependent cell death and NF-κB-dependent inflammation, when added to the medium of cultured monocytes/macrophages. Finally, we have shown that s-RNY function is mediated by Toll-like receptor 7 (TLR7). Indeed using chloroquine, which disrupts signaling of endosome-localized Toll-like receptors (TLRs) or a more specific TLR7 antagonist, we blocked the effect of either intracellular or extracellular s-RNYs. These results position s-RNYs as relevant novel functional molecules that impacts on macrophage physiopathology, indicating their potential role as mediators of inflammatory diseases, such as atherosclerosis

La transition florale résulte d’un jeu complexe d’interactions entre des signaux endogènes et environnementaux. Les feuilles jouent un rôle crucial dans ce processus en percevant les changements associés à la lumière et en produisant les photosynthétats qui participant à la signalisation de la floraison. Toutefois, notre connaissance des changements se produisant dans les feuilles lors de la transition florale reste limitée. Nous avons caractérisé les événements morphologiques, moléculaires et transcriptionnels en relation avec la floraison florale dans les feuilles matures chez Arabidopsis, en exploitant un système de transfert de conditions en jours courts vers des jours longs, transfert qui permet d’induire et synchroniser la floraison. Nous avons identifié la fenêtre temporelle de la transition florale, mesuré la croissance foliaire, et observé un accroissement de la ploïdie au cours du processus. Par une approche de RNA-seq, nous avons étudié la dynamique transcriptionnelle des réseaux de gènes dans la feuille, et comparé avec des données dans la racine et le méristème pour avoir une vue plus intégrée de la floraison dans la plante. De plus, nous avons analysé le mode d’action de LHP1 (LIKE HETEROPROTEIN 1), une sous unité du complexe PRC1, en exploitant des lignées transgéniques avec des modifications conditionnelles du dosage de LHP1 et en analysant les effets sur la chromatine et la transcription des gènes impliqués dans la floraison. Une modulation courte du dosage en LHP1 modifie le dépôt des marques H3K27me3 et H3K4me3, démontrant une interaction fonctionnelle entre LHP1 et le complexe PRC2, et suggérant aussi un nouveau rôle dans la formation de régions chromatiniennes de type bivalent. Enfin, étant donné le rôle clé de l’organisation nucléaire dans la régulation génique, nous avons recherché et identifié des déterminants de l’architecture nucléaire en utilisant de nouveaux outils de statistiques spatiales. / The transition to flowering results from a complex interplay between endogenous and environmental cues. The leaves play a key role in this process, by perceiving the light changes and producing photosynthates, which participate to the floral signalling. However, our knowledge on the changes occurring in leaves during floral transition is still limited. We characterised the morphological, molecular and transcriptional events related to floral transition in mature leaves in Arabidopsis, using a short-day to long-day shift to induce a synchronized flowering. We identified the temporal window of the floral transition, monitored the leaf growth and observed an increase in their ploidy level during the process. By RNA-seq we studied the transcriptional dynamics of the leaf gene network, and compared with events occurring in roots and meristems to get an integrated view of floral transition in the whole plant. Furthermore, we investigated the mode of action of LIKE HETEROPROTEIN 1 (LHP1), a PRC1 subunit, by exploiting transgenic lines with conditional alterations of LHP1 dosage and analysing the effects on chromatin and transcription of flowering genes. A short-term modulation of LHP1 dosage altered the deposition of H3K27me3 and H3K4me3, showing a functional interaction between LHP1 and PRC2, and also suggesting a new role in the formation of bivalent chromatin regions. Finally, since nuclear organisation plays a key role in gene regulation, we searched and identified determinants of the nuclear architecture by using innovative spatial statistical tools.

L'intérêt de l’utilisation des vecteurs viraux comme le Adeno-Associated Virus recombinant (rAAV) dans la recherche pour le traitement des maladies génétiques a conduit à une évolution rapide des méthodes de production d'AAV au cours des deux dernières décennies (Ayuso et al., 2010). Leur large biodisponibilité in vivo et leur efficacité à long terme dans les tissus postmitotiques en font de bons candidats pour de nombreuses applications de transfert de gènes. En plus, la spécificité du traitement peut être augmentée lorsque le sérotype correct est choisi pour cibler un tissu spécifique. Parmi les méthodes de production actuellement utilisées, la tri-transfection de cellules embryonnaires humaines rénales 293 (HEK293) reste la plus populaire pour l'échelle de recherche; Et la production de rAAV médiée par des baculovirus pour des échelles plus importantes. L'importance croissante des vecteurs viraux dans l'application pratique de la thérapie génique exige l'amélioration des processus de production, en particulier en ce qui concerne les rendements et la pureté du produit final. Mon travail au cours de ces quatre années a été axé sur deux points principaux: (1) améliorer les processus biotechnologiques employés dans la production de rAAV pour la recherche et les échelles d'étude préclinique et (2) tester in vitro et in vivo les applications pour le rAAV dans le l’édition de genome. L'édition de gènes médiée par des nucléases spécialement conçues offre de nouveaux espoirs pour le traitement de plusieurs maladies héréditaires monogéniques. Récemment découvert, le système CRISPR Cas9 (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) fournit des outils importants nécessaires pour corriger les mutations par homologie. Notre modèle canonique est la souris mdx, un modèle animal naturel de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Les mutations DMD, qui conduisent à l'absence de protéine dystrophine, entraînent une myopathie progressive et fatale. Plusieurs stratégies, allant des stratégies pharmacologiques aux stratégies de saut-d’éxon, ont tenté de renverser le phénotype et ralentisser la progression de la maladie, mais les résultats ne sont pas encore satisfaisants. Ce nouvel et puissant outil d'édition de génome peut être vectorisé par rAAV. Les résultats de la première partie ont été publiés en 2015 et 2016 et seront présentés sous la forme d'articles et pour la deuxième partie, je présenterai les résultats préliminaires et les perspectives du travail qui se poursuivra dans le laboratoire. / The interest of recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV) vectors for research and clinical purposes in the treatment of genetic diseases have led to the rapid evolution of methods for AAV production in the last two decades (Ayuso et al., 2010). Their broad in vivo biodistribution and long-term efficacy in postmitotic tissues make them good candidates for numerous gene transfer applications. In addition, the specificity of the treatment can be increased when the right serotype is chosen to target a specific tissue. Among the production methods currently in use, tri-transfection of human embryonic kidney 293 (HEK293) cells remains the most popular for research scale; and rAAV production mediated by baculoviruses for larger scales. The increasing importance of viral vectors in the practical application of gene therapy demands the improvement of production processes, especially when it concerns the yields and purity of the final product. My work during these four years was focused in two main points: (1) improve biotechnological processes employed in rAAV production for research and pre-clinical study scales and (2) test in vitro and in vivo the applications for rAAV in the field of genome editing. Gene-editing mediated by engineered nucleases offers new hopes for the treatment of several monogenic inherited diseases. Recently discovered, the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Cas9 system provides important tools needed to correct by homology-directed repair mutations. Our canonical model is the mdx mouse, a naturally occurring animal model of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). DMD mutations, which lead to the absence of the protein dystrophin, results in a progressive and fatal myopathy. Several strategies, from pharmacological to exon-skipping strategies, have attempt to revert the phenotype and slow down the disease progress, however results are not yet satisfactory. This new and powerful genome editing tool can be vectorized by rAAV. Results for the first part were published in 2015 and 2016 and will be presented in the form of articles and for the second part I will present preliminary results and perspectives for the work that will be continued in the lab.

La sélénoprotéine T (SelT) est une protéine thiorédoxine-like abondamment exprimée au cours du développement embryonnaire chez le rat, mais son expression tend à disparaître après la naissance, notamment dans le coeur, suggérant un rôle limité de la SelT à l’âge adulte. Néanmoins, nous avons pu montrer que la SelT est réexprimée au niveau cardiaque suite à une ligature de l’artère coronaire (LC), suggérant le rôle potentiellement protecteur de cette protéine au cours des pathologies cardiovasculaires. Le but de notre projet fut donc d’évaluer les effets cardiaques d’une thérapie par la SelT au cours de l’insuffisance cardiaque, moyennant soit une thérapie protéique, soit une thérapie génique visant à surexprimer la SelT au niveau cardiaque ou au niveau systémique. La supplémentation en SelT (15μg/kg/jour, minipompes ip) a permis d’améliorer significativement le débit cardiaque et la fraction de raccourcissement du VG, mais également d’améliorer les pressions télé-systoliques et télé-diastoliques du ventricule gauche ainsi que la perfusion coronaire. Ces changements sont associés à une diminution du stress oxydant cardiaque ainsi qu’à une répression des mécanismes inflammatoires cardiaques. L’ensemble de ces améliorations a été observé sans modification de la taille d’infarctus. En parallèle, nous avons pu montrer qu’une injection intraveineuse d’un rAAV9-SelT (1.1011vg) une semaine après la LC permettait de diminuer significativement la dilatation ventriculaire gauche 3 mois après la LC. De manière concomitante, la thérapie génique par la SelT améliore le débit cardiaque ainsi que la perfusion cardiaque. Ces changements sont associés à une amélioration de la compliance et de l’élastance cardiaque. Par ailleurs, l’injection intramusculaire d’un rAAV8-SelT suivant le même protocole que précédemment. Nous avons pu montrer que le traitement par cet AAV permettait de diminuer significativement la dilatation du VG et d’améliorer la fraction de raccourcissement. De plus, la thérapie génique a permis d’améliorer la perfusion cardiaque ainsi que la relaxation coronaire endothélium-dépendante. Nous avons également pu montrer que l’ensemble des effets de la SelT sont médiés par le résidu Sec, dès lors que la modification de ce résidu par une alanine, annihile totalement l’ensemble des effets positifs observés au cours de notre étude. Ainsi, nos résultats ont permis de montrer clairement que le rôle bénéfique d’un traitement par la SelT au cours de l’ICC, et ce, grâce à un mécanisme sélénocystéine-dépendant. La SelT semble donc être une cible thérapeutique prometteuse pour le traitement de cette pathologie. / Selenoprotein T (SelT) is a thioredoxin-like protein, which is abundantly but transiently expressed in the heart during the embryonic development, suggesting that SelT plays a limited role during adulthood. However, data from our laboratory show that cardiac SelT expression increases after myocardial infarction. This suggests that SelT may play a yet unrevealed role in cardiovascular diseases but SelT’s potential protective role is unknown. Thus, we sought to investigate the cardiac effects of a SelT-mediated therapy in chronic heart failure (CHF) using either a protein or gene therapy through either a protein supplementation, or rAAV encoding for different forms of SelT. SelT supplementation (15μg/kg/day, IP, administered for 1 month starting 7 days after MI) resulted in a restoration of cardiac output and LV fractional shortening (sham: 178,1±14,8; MI: 161,1±7,7; MI+SelT; 177,6 ±8,0 and sham: 44,5±5,1; MI: 17,1±0,8; MI+SelT: 25,6±2,4, respectively), in association with an improvement of LV end-diastolic and end-systolic pressures as well as LV tissue perfusion. These changes were associated with a lower oxidative status and with a decrease in inflammation pathways (-32,7% vs MI for oxidative stress and - 27,2% and - 31,4% for inflammation, measured by electron paramagnetic resonance and western blotting analyses of IL1ß and IL6 expressions, respectively). All these effects were observed at identical infarct sizes. In parallel, a single intravenous injection of rAAV9-SelT (1.1011 virus - genome copies) one week after MI resulted in an increased cardiac SelT expression 3 weeks after injection (+150%, p<0.05). This SelT - overexpression reduced HF-induced increase in left ventricular diameters in both systole and diastole (at 1 and 3 months post-MI). Simultaneously, SelT improved stroke volume and cardiac output, without change in heart rate or body weight. Moreover, cardiac perfusion was improved by rAAV9-SelT in both interventricular septum and in the border zone of the infarct. These changes were associated with an improvement in cardiac compliance and elastance parameters assessed by invasive pressure/volume curves (compliance: sham: 18.2 ±1.5; HF: 11.0±1.0; HF+rAAV9-SelT: 15.3±0.5 and elastance: sham: 1.3±0.2; HF: 2.8±0.2; HF+rAAV9-SelT: 1.4±0.2, respectively; p<0.05 vs. HF). The third part of this project consisted in a single intramuscular injection of rAAV8-SelT (1.1011 virus-genome copies, 7 days after CAL) of either the normal form (rAAV8-SelTSec), either the modified form in which the Sec residue is replaced by an Ala (rAAV8-SelTAla). rAAV8-SelTSec administration resulted in a significant increase in cardiac SelT levels as soon as 3 weeks post-administration. After 3 months, SelTSec reduced LV dilation and restored cardiac output. Simultaneously SelT improved both LV elastance and compliance. In contrast, administration of the rAAV8-SelTAla did not modify the CHF-related cardiac dysfunction, suggesting that the selenocysteine residue is essential to the normal protein function. Our results clearly show that increasing SelT to supra-normal levels reduces CHF-induced cardiac dysfunction through a selenium-dependent pathway. These results suggest that SelT might be a promising therapeutic option in the treatment of CHF.

Les complexes d'espèces rassemblant des formes sauvages et cultivées offrent une opportunité unique de disséquer les déterminants de l'adaptation à une échelle de temps courte (depuis la domestication) et à une échelle de temps plus longue (sélection naturelle dans les populations sauvages). Nous avons étudié ici le complexe formé par le maïs cultivé, Zea mays ssp. mays, et les formes sauvages apparentées, les téosintes des sous-espèces Zea mays ssp. mexicana et ssp. parviglumis. Le maïs a été domestiqué à partir de cette dernière au Mexique, il y a environ 9 000 ans. Nous avons tout d’abord étudié l'histoire démographique du maïs en utilisant des données de re-séquençage (24-53x) de 31 variétés locales de maïs couvrant sa distribution précolombienne. Nous avons confirmé l’existence d’un goulot d'étranglement pendant la domestication, entraînant une réduction importante de la taille effective de la population, ainsi que des effets de goulots en série au cours de sa dissémination post-domestication. Les effets indésirables de ces événements démographiques se traduisent par une augmentation des allèles délétères chez le maïs en comparaison des formes sauvages, particulièrement marquée chez les maïs andins. De façon intéressante, nous avons détecté des introgressions de la sous-espèce mexicana vers les maïs cultivés des régions montagneuses du Mexique, du Guatemala et du sud-ouest des États-Unis, qui réduisent la prévalence des allèles délétères. Nous avons ensuite étudié les changements plastiques dans l'expression des gènes en comparant les transcriptomes de maïs et de téosintes dans les conditions climatiques actuelles et des conditions proches de celles trouvées au moment de la domestication – basse température et faible teneur en CO₂. Nous avons identifié plus de 2000 locus qui présentent une expression différentielle entre conditions chez les téosintes, mais dont l’expression ne varie pas chez les maïs. Ces résultats suggèrent une plus grande plasticité de réponse chez les téosintes, appuyée par l’observation de changements plus substantiels dans les réseaux de co-expression chez les téosintes comparativement au maïs. Nous avons ensuite recherché les signatures génomiques de l'adaptation locale dans six populations naturelles de la sous-espèce parviglumis (20-25x). Nous avons identifié grâce à scans génomiques, des locus présentant des traces de balayages sélectifs forts et doux. Le chevauchement faible de ces locus entre les populations, indique une forte adaptation locale. Ainsi, l’adaptation génétique à une échelle géographique réduite, les introgressions répétées entre formes sauvages et domestiques et l'assimilation génétique qui « cimente » les phénotypes domestiqués initialement induits par des réponses plastiques à l'environnement, sont autant de mécanismes qui ont contribué à l’émergence et la diffusion du maïs cultivé. / Species complexes combining wild and cultivated forms provide a unique opportunity to dissect the determinants of adaptation at a short time scale (since domestication) and at a longer time scale (natural selection in wild populations). Here, we studied the complex formed by the cultivated maize, Zea mays ssp. mays, and related wild forms, teosintes subspecies Zea mays ssp. mexicana and ssp. parviglumis. Maize was domesticated from the later in Mexico about 9,000 years ago. We first studied the demographic history of maize using re-sequencing data (24-53x depth) of 31 local maize varieties covering its pre-Colombian distribution. We confirmed a bottleneck during domestication, resulting in a significant reduction in effective population size, as well as bottleneck effects during its post-domestication release. The adverse effects of these demographic events result in an increase in deleterious alleles in maize compared to its wild forms, especially in Andean maize. Interestingly, we detected introgression of mexicana subspecies into corn grown in the highlands of Mexico, Guatemala, and the southwestern United States, which reduced the prevalence of deleterious alleles. We then studied the plastic changes in gene expression by comparing maize and teosinte transcriptomes under current climatic conditions and conditions similar to those found at the time of domestication - low temperature and low CO₂ content. We have identified more than 2000 locus that show a differential expression of conditions in teosintes, but whose expression does not vary in corn. These results suggest a greater plastic response in teosintes, supported by observations of more substantial changes in co-expression networks in teosintes compared to maize. We then searched for genomic signatures of local adaptation in six natural populations of the subspecies parviglumis (20-25x sequencing depth). Genomic scans have identified loci with hard and soft selective sweeps. The low overlap of these loci between populations indicates a strong local adaptation. Thus, genetic adaptation to a small geographical scale, repeated introgression between wild and domestic forms and genetic assimilation that "cements" domesticated phenotypes initially induced by plastic responses to the environment, are all mechanisms that contributed the emergence and spread of cultivated maize.

La maladie de Huntington (MH) est une maladie autosomale dominante causée par une expansion de la répétition CAG codant pour une expansion de la polyglutamine dans le premier exon du gène Huntingtine (HTT). Ce gène code pour une protéine ubiquitaire dont la mutation entraine de graves symptômes moteurs, psychiatriques et cognitifs, dus à la dégénérescence spécifique des neurones GABAergique épineux moyens du striatum. Nous proposons d'utiliser le trans-épissage pour développer un vecteur de thérapie génique qui réduira significativement voir éliminera l'expression de la protéine mutée tout en restaurant un niveau physiologique de HTT normale dans les cellules affectées par la mutation du gène Huntingtine. Cette technologie est basée sur le remplacement de l'exon muté par un exon sans mutation pendant l'étape de maturation de l'ARNm. Du fait du caractère dominant de la mutation,l'efficacité thérapeutique nécessitera une réaction de trans-épissage très efficace capable de convertir une portion significative de pre-ARNm HTT mutés en en ARNm HTT normaux. Nous avons donc développé un système rapporteur fluorescent permettant la détection des évènements de trans-épissage afin d’identifier les séquences les plus performantes parmi une centaine de molécules candidates. Nous avons validé notre stratégie de criblage basée sur la fluorescence et réalisé le criblage sur plusieurs introns HTT (3, 9 et 20) qui ont démontré des zones favorables au trans-épissage. Une méthode de quantification directe et absolue du taux de trans-épissage a également été validée pour déterminer très précisément le taux de correction. L’ensemble de ce travail a permis de contribuer à la mise en évidence de la faisabilité du trans-épissage dans le contexte de la MH. / Huntington’s disease (HD) is an autosomal dominant genetic disorder caused by the expansion of a CAG repeat encoding a polyglutamine tract in the first exon of the Huntingtin gene (HTT). This gene encode a ubiquitous protein in which mutation lead to severe motor, psychiatric and cognitive deficits and causes degeneration of specific neuronal populations, in particular the GABAergic medium spiny neurons of the striatum. We propose to use trans-splicing to develop a gene therapy vector that will significantly reduce or eliminate the expression of the mutant protein while restoring a physiological level of normal HTT in cells affected by the HD mutation. This technology is based on replacement of the mutated exon by a normal version during the mRNA maturation process. HTT mutation being dominant, therapeutic benefits necessitates a highly efficient trans-splicing reaction that would convert a significant proportion of mutant-HTT pre-mRNA into normal HTT mRNA. For this purpose, we developed a fluorescent reporter system enabling the detection of trans-splicing events in high content screening in order to identify the most potent trans-splicing sequences among hundreds of molecules. We validated our fluorescent screening strategy and implement trans-splicing screening on 3 HTT introns (3, 9 and 20), in which we demonstrated the presence of hotspot promoting trans-splicing reactions. A direct and absolute quantification method was also validated to accurately assess the correction rate. Overall, this work generated additional evidences of trans-splicing feasibility in HD.

Une stimulation β-adrénergique (β-AR) aigue, par exemple au cours d’un exercice physique, accroît le second messager AMPc dans les cardiomyocytes aboutissant à une cascade d’évènements permettant d’augmenter la fonction cardiaque. Une élévation chronique des taux de catécholamines est délétère puisqu’elle participe au remodelage pathologique du cœur et à la progression vers l’insuffisance cardiaque (IC). L'IC correspond à l'incapacité du cœur à répondre aux besoins hémodynamiques de l'organisme. Si la majorité des patients meurt de défaillance cardiaque, une part importante décède d'arythmies.Les phosphodiestérases (PDEs) sont des enzymes essentielles puisqu’elles permettent non seulement la terminaison des signaux AMPc en dégradant ce nucléotide cyclique en 5’AMP inactif mais aussi l’organisation spatiale de ces signaux dans des compartiments subcellulaires spécifiques. L'IC s'accompagne de profonds remaniements de la voie β-AR et l'expression des PDEs est modifiée en conditions pathologiques, perturbant ainsi la compartimentation intracellulaire de l’AMPc. Il a été notamment démontré que l’expression d’une isoforme de PDE particulière, la PDE4B, diminue dans l'hypertrophie cardiaque et que l’invalidation du gène codant pour celle-ci favorise les arythmies ventriculaires chez la souris lors d’une stimulation β-AR. À l’inverse, l'expression d'une autre enzyme, la PDE2A, est augmentée dans l’IC, chez l’homme et différents modèles animaux. Ceci constituerait un mécanisme de défense lors d'un stress cardiaque puisqu’il a été montré que sa surexpression atténue l’hypertrophie induite par la noradrénaline ou la phényléphrine et limite les arythmies chez la souris.L’objectif de mon travail était de tester l’hypothèse qu’une augmentation de l’activité des PDEs pourrait constituer une alternative aux traitements classiques de l’IC, pour limiter le remodelage hypertrophique, la progression vers l’IC et les arythmies associées. Pour cela, j’ai réalisé une thérapie génique dans des modèles murins d'IC grâce à des virus adéno-associé de type 9 (AAV9) codant pour la PDE4B ou la PDE2A. Mes résultats suggèrent que cette approche pourrait constituer une nouvelle stratégie thérapeutique prometteuse de l'IC en limitant le dysfonctionnement cardiaque, l’hypertrophie du ventricule gauche, et la survenue des arythmies ventriculaires mais seulement lorsque la PDE2A est surexprimée. / Acute stimulation of β-adrenergic receptors (β-ARs), for example during physical activity, leads to the synthesis of the second messenger cAMP in cardiomyocytes, which triggers a cascade of events leading to the increase of cardiac function. While acute β-AR stimulation is beneficial to the heart, chronic β-AR activation is detrimental because it promotes cardiac remodeling and ultimately leads to heart failure (HF). HF is defined by the heart's inability to overcome hemodynamic needs of the body. While the majority of patients die of worsening heart function, a significant proportion dies suddenly of cardiac arrhythmias.Phosphodiesterases (PDEs) are crucial enzymes since they allow not only to terminate cAMP signals by degrading this second messenger into inactive 5’AMP but permit their spatial organization in subcellular compartments. HF is accompanied by profound rearrangements of the β-AR pathway and the expression of PDEs is modified under pathological conditions, thus disrupting cAMP intracellular compartmentation. The expression of one of these enzymes, PDE4B, is decreased in cardiac hypertrophy and the invalidation of the gene encoding PDE4B promotes ventricular arrhythmias under β-AR stimulation in mice. Conversely, the expression of another enzyme, PDE2A, is up-regulated in human and animal models of HF which may constitute an important defense mechanism during cardiac stress since its overexpression attenuates hypertrophy induced by norepinephrine or phenylephrine and limits cardiac arrhythmias.The purpose of my work was to test the hypothesis that an increase of PDE activity could constitute an alternative to conventional HF treatments to limit cardiac remodeling, HF progression and associated arrhythmias. To do so, I performed a cardiac gene therapy in mouse models of HF using serotype 9 adeno-associated viruses (AAV9) encoding for PDE4B or PDE2A. My results suggest that this approach may be a promising new therapeutic strategy during HF by limiting cardiac dysfunction, left ventricular hypertrophy, and could protect ventricular arrhythmias only when PDE2A is overexpressed.

La thérapie génique est probablement une des approches la plus ambitieuse de l'histoire de l'humanité pour éliminer des maladies résistantes à tout autre traitement. Cependant, c'est une approche qui doit encore être développée afin d'obtenir un meilleur contrôle du processus de délivrance des médicaments et aussi de réduire les coûts. À cette fin, ce projet de thèse est axé sur l’optimisation et le contrôle de la délivrance d’oligonucléotides basée sur l'utilisation de nanobâtonnets d'or (Gold NanoRods, GNRs). De telles nanoparticules (40 nm de long et 10 nm de diamètre) sont internalisées par les cellules et grâce à leurs propriétés physiques extraordinaires permettent de délivrer les médicaments dans le cytoplasme de manière contrôlée. En effet, leur absorption très élevée dans le proche infrarouge du spectre électromagnétique permet de convertir l’énergie lumineuse en chaleur à l’intérieur et autour des nanobâtonnets, sans affecter la cellule. L’avantage d’une absorption dans l’infrarouge est qu’à cette longueur d’onde la lumière pénètre profondément dans les tissus humains (3 cm). Le contrôle de la température autour des nanoparticules permet la libération d'oligonucléotides par simple dénaturation du duplex à un instant donné.L’obtention de nanoparticules pouvant être considérées comme un « cargo » implique de remplir les conditions suivantes : stabilité de la forme colloïdale en milieu complexe, conservation des propriétés physiques et chimiques une fois administrées et possibilité d’immobiliser et de libérer le médicament de manière contrôlée.La première étape de mon projet a consisté à établir un protocole de synthèse de nanobâtonnets d’or afin d’obtenir une solution colloïdale mono-disperse et dont la bande d’absorption de plasmon longitudinal soit dans le proche infrarouge. L'étape suivante était d’optimiser un protocole de fonctionnalisation de la surface des GNRs. Le défi ici est associé à l'agrégation des GNRs lorsque le surfactant (CTAB) nécessaire au maintien des GNRs en solution est remplacé par des biomolécules (oligonucléotides). Cependant, après une étude systématique et détaillée, la déstabilisation de la couche protectrice de surfactant sur la surface métallique et l’ajout d’oligonucléotides ayant une fonction thiol à une des deux extrémités dans un rapport approprié ont permis une bio-fonctionnalisation efficace des nanobâtonnets. En conséquence, les nanoparticules fonctionnalisées, après redispersion dans la solution, ont les propriétés physico-chimiques nécessaires. En outre, l’immobilisation des oligonucléotides sur la surface des nanoparticules est spécifique (via la liaison thiol-Au) et permet leur transfert dans des solutions tamponnées ou dans des milieux complexes sans affecter leur stabilité. Après hybridation entre le simple brin immobilisé sur la surface des nanobâtonnets et le brin complémentaire, j’ai démontré que les oligonucléotides étaient stables et que le nombre de doubles brins qui se forment par hybridation peut être contrôlé. L’analyse des propriétés des nanomatériaux a constitué la seconde étape clé de mon travail, car elle revêt une importance cruciale pour la délivrance contrôlée de médicaments. J'ai décidé d'appliquer des méthodes uniquement optiques couvrant l'absorption des nanobâtonnets et l'analyse de la fluorescence des oligonucléotides marqués et des images TEM.Au cours du projet, il a donc été possible d’établir une nouvelle approche de fonctionnalisation et de créer un protocole de caractérisation efficace, axé sur les oligonucléotides. / Gene therapy is probably one of the most ambitious approaches in human history that aims to eliminate diseases, often those completely resistant to other treatments. However, this approach requires further development in order to obtain better control over the process of drug delivery and reduce costs. For this purpose, this project has focused on delivery of oligonucleotides using gold nanorods (GNRs). Such nanoparticles, (40 mm in length and 10 nm in diameter) can be internalized by cells and their extraordinary physical properties allow the delivery of drugs to the cytoplasm of cells in a controlled manner. Indeed, their strong absorption in the near-infrared part of the electromagnetic spectrum allows conversion of the energy of light into heat around the nanorods without affecting the cells. The advantage of absorption in the infrared is that at this wavelength the light can penetrate human tissues (3 cm). Control of the temperature around the nanoparticles allows the release of oligonucleotides by simple denaturation of the duplex at a given time.Obtaining nanoparticles that can be considered as a "cargo ship" implies fulfilling the following conditions: stability of the colloidal form in a complex medium, preservation of the physical and chemical properties once administered and the ability to immobilize and release the drug in a controlled manner.The first step of my project was to establish a nanorods synthesis protocol in order to obtain a monodisperse colloidal solution whose longitudinal absorption band is in the near infrared. The next step was to optimize the functionalisation protocol of the surface of the GNRs. The challenge here is associated with the aggregation of GNRs when the surfactant (CTAB) needed to maintain the GNRs in solution is replaced by biomolecules (oligonucleotides). However, after a systematic and detailed study, the destabilisation of the surfactant protective layer on the metal surface and the addition of oligonucleotides having a thiol function at one of the two extremities in a suitable ratio allowed an efficient bio-functionalisation of the nanoparticles. As a consequence, the functionalised nanoparticles, after redispersion in solution, possess the necessary physicochemical properties. In addition, the immobilisation of oligonucleotides on the surface of the nanoparticles is specific (via the thiol-Au bond) and allows their transfer into buffered solutions or in complex media without affecting their stability. After hybridisation between the single strand immobilized on the surface of the nanorods and the complementary strand, I demonstrated that the oligonucleotides were stable and that the number of double strands that are formed by hybridization can be controlled. The analysis of the properties of nanomaterials was the next important part of the work, as it is of crucial importance for the controlled delivery of drugs. I decided to apply only optical methods covering nanorods absorption and fluorescence analysis of labeled oligonucleotides and TEM images.In summary, during the project it was possible to establish a new functionalization approach and create a protocol for efficient characterization, focused on oligonucleotides. We expect that these observations will aid further research in the field of gene delivery based on gold nanoparticles.