A galectina-3 (gal-3) pertence a uma família de proteínas com domínios de ligação a beta-galactosídeos e está relacionada com diversos aspectos tumorais, como proliferação e adesão celular, angiogênese e proteção contra morte celular. Estudos mostram sua relação com o fenômeno da hipóxia, característica de diversos tumores sólidos que apresentam altas taxas de proliferação celular. A adaptação à hipóxia é mediada principalmente pelo Fator Induzido por Hipóxia (HIF-1), a qual atua na indução de diversos genes de sobrevivência em ambientes com baixas concentrações de oxigênio. Além de HIF, outros fatores são importantes nesse processo, como NF-kB, por exemplo, sendo um fator de transcrição responsivo a diversos estresses celulares, entre eles, a hipóxia. Alguns modelos tumorais apresentam-se ideais para o estudo dos efeitos da hipóxia no microambiente tumoral, como os glioblastomas. Estes são tumores do sistema nervoso central com altas taxas de letalidade, são refratários aos principais métodos de tratamento por sua plasticidade, crescimento infiltrativo e heterogeneidade. Histologicamente, estes tumores apresentam atipia nuclear, altas taxas de mitose e áreas de pseudopaliçada. Postula-se que estas áreas sejam compostas por células migrantes de ambientes necróticos, os quais são também hipóxicos devido a sua distância de vasos sanguíneos e é demonstrado que estas células expressam tanto HIF-1alfa quanto gal-3. Ensaios in vitro realizados por nosso grupo demonstraram que a gal-3 é positivamente regulada pela hipóxia em uma linhagem de glioma híbrido, NG97ht, além de demonstrar que esta proteína é um fator chave na proteção destas células contra a morte celular induzida pela privação de oxigênio e nutrientes, mimetizando condições necróticas de pseudopaliçada in vivo, destacando-se as habilidades antiapoptóticas desta proteína. Embora uma de suas possíveis funções tenha sido elucidada, os mecanismos de atuação e de indução da gal-3 ainda são obscuros. Deste modo, este projeto visa explorar os papéis pró-tumorais da gal-3, podendo torná-la um possível alvo em terapias anti-neoplásicas, entendendo melhor seus mecanismos de proteção contra a morte celular e controle de expressão em ambientes hipóxicos, além de estudar suas possíveis funções in vivo no desenvolvimento de tumores, e também estendendo seus estudos para outras linhagens de glioblastoma. Nossos resultados demonstraram que a gal-3 está co-localizada com mitocôndrias nestas linhagens de glioma, podendo sofrer alterações pós-traducionais em hipóxia, como a fosforilação e que houve acúmulo de HIF-1alfa nuclear nestas células em hipóxia. Vimos também que a gal-3 na linhagem NG97ht apresentou-se proveniente de dois alelos diferentes e que fatores intermediários deveriam ser expressos previamente pela célula antes da indução de gal-3 em hipóxia. Também demonstramos que houve dependência de NF-kB na indução transcricional de gal-3 nestas condições. Estes experimentos também demonstraram que a exposição de células à hipóxia e privação de nutrientes é capaz de induzir tanto espécies reativas de oxigênio como o aumento da autofagia nestas células, fatores importantes na indução da morte celular, além de demonstrar que na linhagem NG97ht a indução da morte nestas condições ocorreu por necrose, sem apresentar apoptose celular. Expandimos esta teoria da participação da gal-3 como molécula protetora contra a morte em hipóxia e privação de nutrientes para outra linhagem de glioma humano, a T98G. E finalmente, demonstramos que a diminuição da expressão de gal-3 em células tumorais da linhagem U87MG levou a diminuição das taxas de estabelecimento e crescimento tumoral in vivo / Galectin-3 (gal-3) belongs to a family of proteins with beta-galactoside binding domains and is related to various tumoral aspects, such as cell proliferation and adhesion, angiogenesis and protection against cell death. Studies show its relationship with the hypoxia phenomenon, a characteristic of many solid tumors that have high cell proliferation rates. The adaptation to hypoxia is mainly mediated by Hypoxia Induced Factor (HIF-1), which acts in the induction of several survival genes in environments with low oxygen concentrations. In addition to HIF, other factors are important in this process, such as NF-kB, for example, which is a transcription factor responsive to various cellular stresses, including hypoxia. Some tumor models are ideal for studying the effects of hypoxia in the tumor microenvironment, e.g. glioblastomas. These central nervous system tumors with high mortality rates are refractory to the main treatment methods due to their plasticity, heterogeneity and infiltrative growth. Histologically, these tumors exhibit nuclear atypia, high mitotic rates and pseudopalisading areas. It is postulated that these areas are composed of migrating cells out of necrotic microenvironments, which are also hypoxic due to their distance from the blood vessels and it is shown that these cells express both HIF-1alfa and gal-3. In vitro assays performed by our group demonstrated that gal-3 is positively regulated by hypoxia in a hybrid glioma cell line, NG97ht, and demonstrated that this protein is a key factor in protecting these cells against cell death induced by oxygen and nutrient deprivation conditions mimicking necrotic pseudopalisading areas in vivo, highlighting the pro-survival abilities of this protein. Although one of its possible functions has been elucidated, gal-3 mechanisms of action and induction are still unclear. Thus, this project aims to explore the gal-3 pro-tumoral effects, which may make it a possible target for anti-neoplastic therapies, better understanding the mechanisms of protection against cell death and expression in hypoxic environments, and also study its possible functions in vivo, extending these studies to other glioma cell lines. Our results demonstrated that gal-3 is located within the mitochondria in these glioma cell lines and may undergo posttranslational modifications in hypoxia, such as phosphorylation and that there is accumulation of nuclear HIF-1alfa in these cells under hypoxia. We have also seen that gal-3 in the NG97ht cell line presents two different alleles and that intermediate factors must be expressed previously by the cell before gal-3 induction in hypoxia. We also demonstrated that there is dependence on the NF-kB transcriptional factor for the gal-3 induction under these conditions. These experiments also demonstrated that exposure of cells to hypoxia and nutrient deprivation is capable of inducing reactive oxygen species and increased autophagy in these cells, which are important factors in the induction of cell death. In addition, we demonstrated that the induction of the NG97ht cell death in these conditions is due to necrosis. We expanded this theory of the participation of gal-3 as a protective molecule against cell death in hypoxia and nutrient deprivation to another human glioma cell line, T98G. And finally, we demonstrated that decreased expression of gal-3 in the U87MG glioma cell line leads to lower tumor establishment rates and decreased growth in vivo

Galectina-1 (Gal-1) pertence à família de lectinas que reconhecem -galactosídeos e pode ser expressa em vários tipos celulares, incluindo as células endoteliais e músculo liso. Esta lectina endógena possui propriedades imunomodulatórias e antiinflamatórias, dependentes de processos celulares, essenciais incluindo ativação, diferenciação, sobrevivência, fagocitose e adesão celular. Os eventos iniciais da lesão vascular são pouco conhecidos e, na literatura, são escassos os dados sobre a participação da Gal-1 nesses eventos. Portanto, neste trabalho, pretendeu-se avaliar a participação dessa lectina nos eventos iniciais da lesão vascular por hiperhomocisteinemia moderada induzida em camundongos. A dose padrão de 0,4g/Kg/dia de homocisteína-tiolactona foi administrada oralmente a camundongos selvagens (Gal-1+/+) e destituídos do gene da Gal-1 (Gal-1-/-), por diferentes tempos, causando uma elevação da concentração plasmática de homocisteína total, Este fato provocou alterações na reatividade vascular de contração na artéria aorta e de rolamento e adesão de leucócitos em vênulas mesentéricas. Foi detectada a presença da Gal-1 nas aortas de animais Gal-1+/+ em todos tempos de tratamento e no controle, observando, porém, um aumento dela no grupo tratados por 15 dias e, mais expressa em 24 horas (expressão protéica por Western blot e imunofluorescência e, gênica por Real Time PCR). Neste tempo, houve maiores alterações metabólicas significativas como triglicérides, LDL, colesterol total, glicose e de homocisteína. A análise da expressão das óxido nítrico sintases revelou não haver alterações para NOS induzida (iNOS) entre os grupos de animais Gal-1+/+ controle e tratados, nem mesmo em relação aos animais controles Gal-1-/-. Entretanto, o tratamento modulou a expressão da NOS endotelial (eNOS) nos animais Gal-1+/+, havendo uma redução da proteína para os tempos de 48 horas e 7dias (expressão protéica por imunohistoquímica - peroxidade e, gênica por RT-PCR). O tratamento não alterou a concentração plasmática de óxido nítrico (NO) em camundongos Gal-1+/+, mas foi detectada redução dos valores basais para animais Gal-1-/- e, uma redução com o tratamento por 15 dias. Portanto, foi verificado que a expressão de Gal-1 foi aumentada com o tratamento de Hcy-Taq nos tempos de 24 horas e 15 dias, onde se observam significativas e maiores alterações biológicas dos parâmetros de lesão vascular induzida pela hiperhomocisteinemia moderada analisadas: reatividade vascular, rolamento e adesão de leucócitos em vênulas mesentéricas, concentração de homocisteína plasmática, perfil lipídico e expressão da óxido nítrico sintase endotelial. / Galectin-1 (Gal-1) belongs to the lectin family of -galactosides-binding proteins and can be expressed by several cell types, including endothelial cells and vascular smooth cells. This endogenous lectin has immunological and anti-inflammatory properties dependent of essential cellular processes, including activation, differentiation, survival, phagocytosis and cell adhesion. There are few and inconclusive studies about the engagement of Gal-1 in vascular injury initial processes. Thus, this work was conducted to evaluate the engagement of Gal-1 in hyperhomocysteinemia-induced vascular injury. Wild type (Gal-1+/+) and Gal-1-knockout (Gal-1-/-) mice were fed with 0,4g/Kg/day with thiolactone-homocysteine (D,L Hcy-T) for different times, provoking increased plasmatic total homocysteine levels. That has indicated alterations in aortic vasomotor responses and mesenteric venial leukocyte rolling and adhesion. Gal-1 was detected in aortic frozen section of Gal-1+/+ mice for all times of treatment with D,L Hcy-T, but more detected for aorta of 15 days treated animal group and, more expressed, for 24 hours ones (protein expression by Western blot and immunofluorescence and, genetic by Real Time PCR). Besides, at 24 hours of treatment, many metabolic alterations were observed: increased LDL, triglycerides, cholesterol, glucose and homocysteine levels. Expressions for nitric oxide sintases (NOS) showed no alteration for inducible NOS (iNOS) for Gal-1+/+ mice (treated or not), even for Gal-1-/- untreat mice. However, the treatment was able to modulate endothelial NOS (eNOS) decreasing the expression at 48 hours and 7 days treated animals group (protein expression by imunoperoxidase and, genetic by RT-PCR). Gal-1-/- mice have less circulating constitutive nitric oxide (NO) than Gal-1+/+ ones, and, the treatment has reduced these levels only for Gal-1-/- 15 days treated mice but not for Gal-1+/+ ones . This work, therefore, has shown that Gal-1 is always expressed by aortas. However, increased expression of Gal-1 at 24 hours and 15 days of treatment has been often correlated to biological alterations in the in hyperhomocysteinemia-induced vascular injury: aortic vasomotor responses, leukocyte rolling and adhesion in mesenteric venues, plasmatic homocysteine, lipid metabolites and NOS expression.

A proteína de ligação a maltose (MBP) é amplamente conhecida na literatura como um marcador para métodos de purificação de afinidade e é freqüentemente fusionada a proteínas relevantes para melhorar seu rendimento, facilitando sua purificação e aumentando sua estabilidade e solubilidade. Por outro lado, foi relatado que o nitrogênio piridínico não quaternizado do filme eletropolimerizado com N-(3-pirrol-1-ilpropil)-4,4\'-bipiridínio (PPB) desempenhou um papel importante na imobilização da proteína de ligação da maltose (MBP). Neste trabalho relatamos a modificação do eletrodo de carbono vítreo (CV) pela redução eletroquímica do derivado de arildiazônio piridínico gerado in situ e seu uso na imobilização da proteína MBP fusionada à galectina-1 (MBP-Gal-1). Resultados de voltametria cíclica mostraram formação de monocamadas com carga positiva sobre CV e que o nitrogênio não quaternizado da piridina estava disponível após a modificação. Os resultados da Espectroscopia de Capacitância Eletroquímica (ECC) indicaram que o domínio do MBP foi importante para a interação do eletrodo modificado. O tempo de imobilização e a concentração de proteína fusionada também foram relevantes para a cinética e os resultados sugeriram uma saturação em 40 minutos de interação, utilizando 5 mol L-1 de MBP-Gal-1. Experimentos de detecção de lactose indicaram que a atividade da galectina-1 foi preservada após a imobilização. A reação click realizada para promover a inclusão da maltose na superfície desse eletrodo modificado gerou resultados significativamente melhores quando comparados aos do eletrodo sem a maltose ligada em sua superfície: a proteína fusionada MBP-Gal-1 demonstrou um aumento de 62% na imobilização. Também foram observados aumentos na sensibilidade para detecção de lactose (72%) e na especificidade de interação com este mesmo carboidrato (77%) / Maltose Binding Protein (MBP) is widely known in the literature as a tag for affinity purification methods and it is often fused to relevant proteins to improve its yield, facilitating its purification and enhance its stability and solubility. On the other hand, it was reported that the nonquaternized pyridine nitrogen from N-(3-pyrrol-1-ylpropyl)-4,4-bipyridinium electropolymerized film (PPB) played an important role for the immobilization of maltose binding protein (MBP). In this work we reported the glassy carbon electrode (GCE) modification by electrochemical reduction of pyridinium diazonium salt derivative generated in situ and its use on MBP fused to Galectin-1 protein (MBP-Gal-1) immobilization. Cyclic voltammetry results showed a positively charged monolayer formation onto GCE and that nonquaternized pyridine nitrogen was available after modification. Electrochemical Capacitance Spectroscopy (ECS) results indicated that the MBP domain was important for the modified electrode interaction. Immobilization time and the fused protein concentration were also relevant to the kinetics and the results suggested a monolayer saturation in 40 minutes of interaction, using 5 mol L-1 MBP-Gal-1. The click reaction performed to promote the inclusion of maltose on the surface of this modified electrode generated better results when compared to those of the electrode without maltose bounded to its surface: the MBP-Gal-1 fused protein demonstrated a 62% increase in immobilization. Increases in sensitivity for lactose detection (72%) and specificity of interaction with this same carbohydrate (77%) were also observed

A patogênese e o estadiamento do melanoma são clinicamente bem caracterizados, entretanto, muitas variações são observadas no que diz respeito à progressão e respostas terapêuticas. Mecanismos intrínsecos das células de melanoma contribuem para esse fenômeno, como a plasticidade fenotípica e a expressão de determinadas moléculas, como a galectina-3. Galectina-3 tem papel fundamental para o crescimento do tumor, metástase e montagem de uma rede vascular funcional. Dessa forma, o melanoma possui mecanismos alternativos de vascularização, onde células endoteliais e células tumorais formam a superfície luminal dos vasos e são expostas às forças fluídicas do sangue, o shear stress. Nós hipotetizamos que o shear promove a adaptação celular e células de melanoma se comunicam com (1) outras células tumorais para sustentar a progressão do tumor, ou (2) com células endoteliais para garantir a manutenção vascular. Para isso, comparamos dois modelos de geração do shear denominados pela agitação de placas concêntricas e rotação de um cone sobre placa, que é o modelo padrão dos estudos em células endoteliais. O modelo de placas concêntricas gerou resultados mais robustos, pois garantiu a viabilidade e a adesão celular em até 24h. Também investigamos o potencial angiogênico das células de melanoma após monitorar a ativação de células endoteliais em contato com o meio condicionado (MC) do shear. O shear aumentou significativamente a secreção de Angiopoietina-2, IL-8 e PLGF num contexto independente de galectina-3. Além disso, o shear diminuiu a taxa de crescimento das células que expressam galectina-3, o que não foi observado no tratamento com o MC. Já a capacidade de sobreviver em longo prazo foi maior quando as células tumorais são expostas ao MC derivado do shear, sem influência da expressão de galectina-3. Em relação ao efeito do MC liberado após shear para o remodelamento vascular, nós não observamos alteração na proliferação das células endoteliais. Entretanto, o MC do shear parece acelerar a formação de túbulos e favorecer a desorganização das fibras de actina, além de diminuir a fosforilação de ERK nas células endoteliais. Juntos, esses resultados mostram que o shear induz a secreção de moléculas pró-angiogênicas e pró-inflamatórias que promovem a sobrevivência e proliferação a longo prazo das células tumorais naive. Nas células endoteliais, o MC derivado do shear altera a sinalização de ERK e o rearranjo do citoesqueleto / Melanoma pathogenesis and staging are clinically well characterized, although a large variation is observed in progression and therapeutic responses. Intrinsic mechanisms of melanoma cells contribute to this phenomenon, such as phenotypic plasticity and the expression of certain molecules as galectin-3. Galectin-3 plays a prominent role in tumor growth, metastasis, and to build a functional vascular network. In this way, melanoma has alternative mechanisms of vascularization, in which both endothelial cells and tumor cells form the luminal surface of vessels and are in contact with flowing blood. Here, we postulated that shear stress promotes cell adaptation and melanoma cells communicate with (1) other tumor cells in order to support tumor progression; or (2) with endothelial cells to ensure vascular maintenance. We compared two methods for generating shear stress, namely revolution of concentric plates and stirring of a suspended cone on a plate, which is the gold standard method for studies on endothelial cells. The concentric plates model yielded more reliable results, since it ensured the greater viability and adhesion of cells up to 24h, as compared to the cone and plate system. We then investigated the angiogenic potential of melanoma cells by monitoring the activation of endothelial cells upon exposure to the conditioned medium (CM) from cells exposed to shear stress. Shear stress significantly increased the secretion of Angiopoietin-2, IL-8 and PLGF, in a galectin-3 independent manner. Also, shear stress decreased the growth rate of galectin-3 positive melanoma cells, but not when galectin-3 was down regulated. No such effect was observed with the shear-derived CM. Instead, we did observed long-term melanoma survival under low density upon treatment with the shear-derived CM. In this scenario, the expression of galectin-3 did not change the results. Regarding the effect of shear-derived CM to vascular remodeling, endothelial cells did not show any change in cell proliferation. However, the CM of melanoma cells upon shear accelerated the endothelial cell tube formation and disorganized the actin stress fibers. CM also decreased the phosphorylation of ERK. Taken together, these data indicate that the production of proangiogenic and proinflammatory molecules by melanoma cells under shear enables long-term survival and proliferation of naïve melanoma cells. To endothelial cells, shear-derived CM led to changes in ERK signaling and cytoskeletal rearrangement

Para que ocorra a transição do epitélio normal de laringe para carcinoma escamoso é necessário um processo de múltiplas etapas tal como exposição prolongada ao fumo e álcool e uma possível associação à infecção pelo HPV. Vários tipos de marcadores moleculares vêm sendo estudados na carcinogênese da laringe, entre eles proteínas associadas a apoptose (bcl-2 e PARP-1) assim como proteínas envolvidas em múltiplos processos biológicos como a Galectina-3. Neste estudo foram realizadas análise imunoistoquímica quantitativa e qualitativa para bcl-2, PARP-1 e galectina-3 em 65 pacientes diagnosticados com câncer de laringe subdivididos em: carcinoma de laringe in situ (CLIS), carcinoma de laringe com metástase (CLM), sem metástase (CLS) e linfonodos cervicais (LC). A detecção e tipificação do HPV foram realizadas pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e os tipos de HPV avaliados foram HPV 6, 11, 16, 18, 31 e 33. Na avaliação quantitativa de galectina-3 observou-se um significativo aumento de expressão no carcinoma invasivo de laringe (CLS e CLM) quando comparado com carcinoma in situ (CLIS), podendo concluir que essa proteína seria um bom marcador pra progressão de câncer de laringe. Para as proteínas PARP-1 e bcl-2 não houve diferença nos níveis de expressão nos grupos analisados. Na análise qualitativa PARP-1 apresentou uma homogeneidade de marcação tanto alta como baixa entre os grupos. Em relação à Galectina-3 observou-se um predomínio de casos com alta expressão, diferentemente da proteína bcl-2 onde o predomínio foi de baixa expressão em todos os casos de carcinoma de laringe e seus respectivos linfonodos metastáticos. Dos 65 pacientes, 55 (84,6%), foram positivos para beta-globina e 7 (12.7%) dos 55 pacientes foram positivos para HPV. Não foi possível verificar quaisquer correlações entre as proteínas Galectina-3, bcl-2 e PARP-1 e o HPV devido ao baixo índice de casos positivos. / To occur the transition from normal epithelium to squamous cell carcinoma is a necessary a for multiple stages process, such as smoking and alcohol abuse and a possible association with HPV infection. Several types of molecular markers have been studied in cancer of larynx, including proteins associated with apoptosis (bcl-2 and PARP-1) and proteins involved in many biological process such as galectin-3. In this study, analyses of qualitative and quantitative immunohistochemistry was performed for bcl-2, PARP-1 and galectin-3 in 65 patients diagnosed with laryngeal squamous cell carcinoma divided into in situ laryngeal carcinomas(LSCCS), laryngeal squamols cells carcinomas without metastases (LSCCWT) and with metastasis (LSCCW) and cervical lymph nodes (CL). HPV detection and typing was performed by PCR and the HPV types evaluated were HPV 6, 11, 16, 18, 31 and 33. In quantitative of galectin-3 there was observed a significant increase of expression in invasive laryngeal squamous cell carcinoma (LSCCWT and LSCCW) compared with in situ laryngeal carcinomas (LSCCS), may indicating that this protein could be a good marker for progression of laryngeal carcinoma. For PARP-1 and bcl-2 protein there was no difference in the levels of expression in all groups studied. In qualitative analysis PARP-1 showed a homogenous immunolabeling in both high and low among the groups. In relation to Galectin-3, it was observed a predominance of cases with high expression, unlike the protein bcl-2 where the expression prevalence was low in all cases of laryngeal carcinoma and their metastatic lymph nodes. Of the 65 patients, 55 (84.6%) were positive for beta-globin and 7 (12.7%) of 55 patients were positive for HPV. Because of a low incidence of HPV in the cases studied, it was not possible correlate the proteins bcl-2, PARP-1 and Galectin-3 with the presence of HPV.

Neoplasias malignas das glândulas salivares são lesões raras e o mecanismo pelo qual esses tumores progridem ainda não está completamente esclarecido na literatura. A galectina-3 é uma proteína multifuncional expressa em uma grande quantidade de tecidos normais, mas que também tem sido associada à progressão tumoral de neoplasias malignas da tireóide, próstata e neoplasias gástricas. Estudos prévios demonstraram que a galectina-3 está também expressa em algumas neoplasias malignas das glândulas salivares como carcinoma adenóide cístico e adenocarcinoma polimorfo de baixo grau de malignidade. Recentemente foi sugerido que a superexpressão da galectina-3 controla alterações nos níveis de expressão de alguns reguladores do ciclo celular, dentre eles a ciclina D1. Além disso, outros estudos revelaram que a ciclina D1 é ativada pela -catenina de uma maneira dependente da galectina-3. O objetivo desse trabalho foi comparar a marcação imunoistoquímica nuclear e / ou citoplasmática da galectina-3 no carcinoma adenóide cístico e adenocarcinoma polimorfo de baixo grau tentando relacioná-la à marcação da -catenina e ciclina D1. Foram realizadas reações de imunoistoquímica para as três proteínas em 15 casos de carcinoma adenóide cístico e em 15 casos de adenocarcinoma polimorfo de baixo grau utilizando-se material parafinado. Para a galectina-3 os carcinomas adenóides císticos apresentaram marcação imunoistoquímica apenas nas células luminais, predominantemente no núcleo. Todos os casos de adenocarcinoma polimorfo de baixo grau revelaram uma marcação predominantemente citoplasmática para essa proteína. Ambos os tumores exibiram intensa marcação citoplasmática e/ou nuclear para a -catenina na maioria dos casos. Não houve imunorreatividade para a ciclina D1 em 14/15 casos de adenocarcinoma polimorfo de baixo grau. Em contraste, os carcinomas adenóides císticos revelaram marcação nuclear específica para a ciclina D1 em 10 de 15 casos estudados em mais de 5% das células neoplásicas e essa marcação estava associada à marcação citoplasmática e nuclear da galectina-3 (p<0,05). Esses resultados sugerem que nos carcinomas adenóides císticos a expressão da galectina-3 pode exercer uma função de proliferação celular e parece estar relacionada à diferenciação celular no adenocarcinoma polimorfo de baixo grau. Além disso, a perda de expressão da galectina-3 no carcinoma adenóide cístico pode estar associada a um comportamento clínico mais agressivo dessa lesão. Embora a -catenina pareça exercer algum papel no mecanismo de carcinogênese dessas duas lesões, ela não parece se ligar à galectina-3 para ativar a ciclina D1. / Salivary gland tumors are uncommon and the mechanism by which malignant tumors progresses is still undefined. In a previous study it was shown that galectin-3 is expressed in malignant salivary gland neoplasms as adenoid cystic carcinoma and polymorphous low-grade adenocarcinoma. Galectin-3 is a multifunctional protein of a group of galactoside-binding lectins expressed in a variety of normal cells, but also has been implicated in tumor progression of some malignancies as thyroid, prostate and gastric cancers. Recently, it has been suggested that galectin-3 may be an important mediator of the -catenin/Wnt pathway. Moreover, nuclear galectin-3 expression has been implicated in cell proliferation, promoting cyclin D1 activation. Thus, in the present study we aimed to correlate galectin-3 expression, either nuclear or cytoplasmic, with the expression of -catenin (nuclear/cytoplasmic) and cyclin D1 (nuclear) in 15 cases of adenoid cystic carcinoma and in 15 cases of polymorphous low-grade adenocarcinoma. For galectin-3, adenoid cystic carcinomas showed specific staining only in luminal cells, mainly in the nuclei. In the cases of polymorphous low-grade adenocarcinoma, all tumor cells revealed a positive, mostly cytoplasmic, reaction to galectin-3. Both tumors showed intense cytoplasmic/nuclear staining for -catenin in the majority of cases. Cyclin D1 immunoreactivity was not detected in 14 of the 15 polymorphous low-grade adenocarcinomas studied. In contrast, adenoid cystic carcinomas showed specific nuclear staining for cyclin D1 in 10 of 15 cases studied in more than 5% of the neoplastic cells. Cyclin D1 expression was correlated with cytoplasmic and nuclear galectin-3 expression in adenoid cystic carcinomas (p<0,05). These results suggest that in adenoid cystic carcinoma galectin-3 may play a role in cellular proliferation through cyclin D1 activation. In polymorphous low-grade adenocarcinoma gal-3 expression seems to be associated with cellular differentiation. In addition, loss of cytoplasmic expression of galectin-3 in adenoid cystic carcinomas may be related to a more aggressive behavior of these lesions. Although -catenin seems to play a role in carcinogenesis, in both lesions, it seems that it does not bind to galectin-3 for cyclin D1 stimulation.

O glioma de grau IV (geralmente chamado de Glioblastoma Multiforme - GBM) é o tumor mais agressivo e maligno do sistema nervoso central. A elevada mortalidade e baixa expectativa de vida proporcionado por esta doença, tem direcionado os esforços de muitos pesquisadores no desenvolvimento de novas formas de diagnóstico precoce, assim como a busca por terapias inovadoras. A galectina-3, uma proteína ligante de glicanas, é expressa diferencialmente em tecido normal vs. neoplásico e possui um papel importante na adesão, diferenciação, imunomodulação, apoptose, ciclo celular, assim como processos de transformação e progressão neoplásica. Diversos estudos têm demonstrado que a interferência nas funções exercidas pela galectina-3 pode representar uma estratégia promissora no tratamento de vários tipos de tumores, incluindo o glioblastoma. De fato, tem se verificado que a administração da forma truncada de galectina-3 em modelos experimentais murinos, possui um efeito antitumoral significativo quando administrada em conjunto com quimioterápicos. No entanto, ainda não se encontra esclarecido se a interferência com as funções da galectina-3 endógena são exercidas diretamente no microambiente tumoral ou de maneira sistêmica. Dessa forma, neste trabalho buscou-se um entendimento mais profundo e completo sobre o papel anti-tumoral de galectina-3 nativa e truncada em associação com o quimioterápico temozolamida num modelo de glioblastoma humano. Adicionalmente, as ferramentas de PET-SPECT, assim como imagem molecular ótica por fluorescência ou bioluminescênca foram utilizadas para se avaliar a biodistribuição da galectinas-3 em camundongos Balb/c nude inoculados com tumor. Inicialmente demonstrou-se que, nas células U87 de glioblastoma humano, a galectina-3 nativa e não a galectina-3 truncada apresenta efeito antitumoral in vitro quando associada com temozolamida com valores de IC50 de 0.008 mM e 1.893 mM respectivamente. Os testes in vivo foram dessa forma prosseguidos com a galectina-3 nativa. Através da técnica de imagem ótica por bioluminescência, observou-se que o tratamento simultâneo de galectina-3 com temozolamida levou a uma redução do crescimento do tumor gerado pelas células U87-Luc2 (U87 transfectadas com o gene reporter da luciferase) em camundongos Balb/c nude. Esta redução foi observada mesmo após a parada do tratamento (período de acompanhamento). Curiosamente, no tratamento com apenas galectina-3 observou-se uma redução do crescimento tumoral das células U87-luc2 cujo efeito foi anulado após a suspensão do tratamento. Através de análises por PET-SPECT avaliou-se a biodistribuição da galectina-3 marcada com 99mTc (99mTc-HYNIC/Gal-3) em camundongos Balb/c nude previamente inoculados com a linhagem U87. Demonstrou-se que esta proteína migra principalmente para os rins e, em menores quantidades para o baço, não ligando todavia no tumor. Devido à meia-vida do 99mTc-HYNIC/Gal-3 não permitir estudos prolongados, a galectina-3 conjugada com VivoTag 680XL foi utilizada para se avaliar a biodistribuição por 48h, 96h e 14 dias em camundongos Balb/c nude inoculados com a linhagem de glioblastoma U87. Além de se confirmar o padrão de distribuição acima descrito, observou-se que a galectina-3 não liga no tumor independentemente do modelo tumoral utilizado. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que galectina-3 possui um efeito antiproliferativo quando administrada em conjunto com temozolamida num modelo de glioblastoma humano (células U87). Surpreendentemente, foi possivel observar pela primeira vez que o efeito antiproliferativo de galectina-3 não se deve à sua atuação direta no tumor. Nossos dados sugerem que, quando administrada in vivo, a galectina-3 atua em locais distintos do microambiente tumoral como os rins e baço, afetando portanto de maneira indireta o crescimento tumoral / Grade IV glioma or glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive and malignant tumor of the central nervous system. The high mortality and low life expectancy provided by this disease have directed the efforts of many researchers to develop innovative therapeutic strategies and early diagnosis tools. Galectin-3 is a glycan-binding protein differentially expressed in normal and neoplastic tissue and has an important role in adhesion, differentiation, immune modulation, apoptosis, cell cycle, tumor transformation and neoplastic progression. Several studies have shown that interference with the functions performed by galectin-3 could represent a promising strategy in the treatment of several kinds of tumors, including glioblastoma. Indeed, it has been found that galectin-3 truncated form has a significant antitumor effect when associated with chemotherapy in murine experimental models. However, it\'s not clear yet whether the interference with galectin-3 endogenous functions is performed directly in the tumor microenvironment or systemically. Thus, this study aimed to understand the anti-tumor effect of truncated and native galectin-3 in combination with temozolomide chemotherapy in a human glioblastoma model. Additionally, PET, SPECT and bioluminescence tools were used to evaluate the biodistribution of galectin-3 in Balb / c nude mice inoculated with the U87 glioblastoma cell line. Here it was shown that in U87 cells, native galectin-3 and not the truncated form has anti-tumor effect in vitro when associated with temozolomide with IC50 values of 0.008 mM and 1.893 mM, respectively. Therefore the in vivo studies were pursued with native galectin-3. Using the optical bioluminescence technique, it was observed that the simultaneous treatment of galectin-3 with temozolomide led to a reduction of tumor growth generated by U87- Luc2 cells (U87 cells transfected with the luciferase reporter gene) in Balb / c nude. This reduction was observed even after stopping treatment (follow-up period). Interestingly, treatment of U87-Luc2 derived-tumor with only galectin-3 led to a reduction of tumor growth whose effect was abolished after discontinuation of treatment. The biodistribution of 99mTc labeled-galectin-3 (99mTc-HYNIC / Gal-3) was performed by molecular image tools (PET-SPECT scan) in mice BALB/c nude previously inoculated with the U87 line. It was shown that this protein migrates primarily to the kidneys and, in a smaller amount to the spleen, but doesn\'t bind the tumor. Because the half-life of 99m Tc-HYNIC / 3-Gal doesn\'t allow prolonged studies, galectin-3 conjugated with VivoTag 680XL was used to assess in vivo biodistribution at 48h, 96h and 14 days in Balb / c nude mice inoculated with the human glioblastoma cell line U87. Besides confirming the distribution pattern described above, it was found that galectin-3 doesn\'t bind to the tumor, regardless the tumor model. This study shows that galectin-3 has an antiproliferative effect when associated with temozolomide in the human glioblastoma model U87. Surprisingly, it was observed, that the in vivo antiproliferative effect of galectin-3 is not due to its direct binding to tumor cells. Our data suggest that when administered in vivo, galectin-3 acts in distinct locations of the tumor microenvironment such as the kidneys and spleen, thus indirectly affecting tumor growth

Pancreatic cancer is nowadays one of the neoplasms with worst prognosis, so research towards the discovery of new molecular targets for therapy and diagnosis is more than urgent. In this direction, we have deeply evaluated the role of Galectin-1 (Gal-1) - a protein that is highly overexpressed in the tumor stroma- in pancreatic tumor progression. Interestingly, we have found that Gal-1 interacts with tissue plasminogen activator (tPA) and that this interplay seems to be involved both in pancreatic tumor epithelial cells and fibroblasts migration, Erk1/2 activation and invasion, suggesting its importance in the tumor/stroma crosstalk in vitro. We have also focused on the biochemical identification of tPA/Gal-1 interaction domains. Furthermore, we have studied Gal-1 role in pancreatic tumor progression in vivo, using murine (xenografts and transgenics) and zebrafish models. We have found that Gal-1 participates in proliferation, angiogenesis, stroma formation and necrosis in Ela-1-myc pancreatic tumors, as well as in the acinar to ductal metaplasia. Importantly, these effects result in an overall significant increase in the survival of Ela-1-myc mice with reduced Gal-1 levels. We have also analyzed Gal-1 role in mouse embryonic pancreatic development, finding interesting parallelisms with tumors. Finally, the molecular mechanisms involved in Gal-1 driving tumor pancreatic progression have been addressed through a transcriptome analysis. All together, our data support Gal-1 as a new molecular target to fight against pancreatic cancer. / Avui en dia, el càncer de pàncrees representa un dels tumors amb més elevats índex de mortalitat, per la qual cosa la recerca dirigida a la identificació de molècules per teràpia i diagnosi són més que necessàries. Amb aquest objectiu, hem avaluat el paper que juga Galectina-1 (Gal-1) - una proteïna altament sobreexpressada en l’estroma tumoral- en la progressió tumoral pancreàtica. Hem trobat que Gal-1 interactua amb l’activador tissular del plasminògen (tPA), participant en la migració, l’activació de Erk1/2 i la invasió, tant en cèl4lules tumorals pancreàtiques com en fibroblasts in vitro, suggerint una importància caudal d’aquesta interacció en la comunicació entre el tumor i l’estroma. Així mateix, ens hem centrat en la identificació bioquímica dels dominis d’interacció entre Gal-1 i tPA. A més, el paper de Gal-1 en la progressió tumoral pancreàtica ha estat adreçat in vivo, utilitzant models murins (xenografts i transgènics) i el peix zebra. Així doncs hem trobat que Gal-1 participa en la proliferació, angiogènesi, formació de l’estroma i la necrosi dels tumors pancreàtics dels ratolins Ela- 1-myc, així com en la metaplasia acinar-ductal. De forma significativa, aquests efectes es tradueixen en un increment important en la supervivència dels ratolins Ela-1-myc amb nivells reduïts de Gal-1. Hem també analitzat el paper que juga Gal-1 en el desenvolupament pancreàtic embrionari murí, trobant paral4lelismes interessants amb els tumors. Finalment, hem volgut ocupar-nos dels mecanismes moleculars involucrats en els efectes produïts per Gal-1 durant la progressió tumoral pancreàtica mitjançant microarrays. Les nostres dades presenten Gal-1 com una nova diana terapèutica per lluitar contra el càncer de pàncrees.

Galectina-1 (Gal-1) pertence à família de lectinas que reconhecem -galactosídeos e pode ser expressa em vários tipos celulares, incluindo as células endoteliais e músculo liso. Esta lectina endógena possui propriedades imunomodulatórias e antiinflamatórias, dependentes de processos celulares, essenciais incluindo ativação, diferenciação, sobrevivência, fagocitose e adesão celular. Os eventos iniciais da lesão vascular são pouco conhecidos e, na literatura, são escassos os dados sobre a participação da Gal-1 nesses eventos. Portanto, neste trabalho, pretendeu-se avaliar a participação dessa lectina nos eventos iniciais da lesão vascular por hiperhomocisteinemia moderada induzida em camundongos. A dose padrão de 0,4g/Kg/dia de homocisteína-tiolactona foi administrada oralmente a camundongos selvagens (Gal-1+/+) e destituídos do gene da Gal-1 (Gal-1-/-), por diferentes tempos, causando uma elevação da concentração plasmática de homocisteína total, Este fato provocou alterações na reatividade vascular de contração na artéria aorta e de rolamento e adesão de leucócitos em vênulas mesentéricas. Foi detectada a presença da Gal-1 nas aortas de animais Gal-1+/+ em todos tempos de tratamento e no controle, observando, porém, um aumento dela no grupo tratados por 15 dias e, mais expressa em 24 horas (expressão protéica por Western blot e imunofluorescência e, gênica por Real Time PCR). Neste tempo, houve maiores alterações metabólicas significativas como triglicérides, LDL, colesterol total, glicose e de homocisteína. A análise da expressão das óxido nítrico sintases revelou não haver alterações para NOS induzida (iNOS) entre os grupos de animais Gal-1+/+ controle e tratados, nem mesmo em relação aos animais controles Gal-1-/-. Entretanto, o tratamento modulou a expressão da NOS endotelial (eNOS) nos animais Gal-1+/+, havendo uma redução da proteína para os tempos de 48 horas e 7dias (expressão protéica por imunohistoquímica - peroxidade e, gênica por RT-PCR). O tratamento não alterou a concentração plasmática de óxido nítrico (NO) em camundongos Gal-1+/+, mas foi detectada redução dos valores basais para animais Gal-1-/- e, uma redução com o tratamento por 15 dias. Portanto, foi verificado que a expressão de Gal-1 foi aumentada com o tratamento de Hcy-Taq nos tempos de 24 horas e 15 dias, onde se observam significativas e maiores alterações biológicas dos parâmetros de lesão vascular induzida pela hiperhomocisteinemia moderada analisadas: reatividade vascular, rolamento e adesão de leucócitos em vênulas mesentéricas, concentração de homocisteína plasmática, perfil lipídico e expressão da óxido nítrico sintase endotelial. / Galectin-1 (Gal-1) belongs to the lectin family of -galactosides-binding proteins and can be expressed by several cell types, including endothelial cells and vascular smooth cells. This endogenous lectin has immunological and anti-inflammatory properties dependent of essential cellular processes, including activation, differentiation, survival, phagocytosis and cell adhesion. There are few and inconclusive studies about the engagement of Gal-1 in vascular injury initial processes. Thus, this work was conducted to evaluate the engagement of Gal-1 in hyperhomocysteinemia-induced vascular injury. Wild type (Gal-1+/+) and Gal-1-knockout (Gal-1-/-) mice were fed with 0,4g/Kg/day with thiolactone-homocysteine (D,L Hcy-T) for different times, provoking increased plasmatic total homocysteine levels. That has indicated alterations in aortic vasomotor responses and mesenteric venial leukocyte rolling and adhesion. Gal-1 was detected in aortic frozen section of Gal-1+/+ mice for all times of treatment with D,L Hcy-T, but more detected for aorta of 15 days treated animal group and, more expressed, for 24 hours ones (protein expression by Western blot and immunofluorescence and, genetic by Real Time PCR). Besides, at 24 hours of treatment, many metabolic alterations were observed: increased LDL, triglycerides, cholesterol, glucose and homocysteine levels. Expressions for nitric oxide sintases (NOS) showed no alteration for inducible NOS (iNOS) for Gal-1+/+ mice (treated or not), even for Gal-1-/- untreat mice. However, the treatment was able to modulate endothelial NOS (eNOS) decreasing the expression at 48 hours and 7 days treated animals group (protein expression by imunoperoxidase and, genetic by RT-PCR). Gal-1-/- mice have less circulating constitutive nitric oxide (NO) than Gal-1+/+ ones, and, the treatment has reduced these levels only for Gal-1-/- 15 days treated mice but not for Gal-1+/+ ones . This work, therefore, has shown that Gal-1 is always expressed by aortas. However, increased expression of Gal-1 at 24 hours and 15 days of treatment has been often correlated to biological alterations in the in hyperhomocysteinemia-induced vascular injury: aortic vasomotor responses, leukocyte rolling and adhesion in mesenteric venues, plasmatic homocysteine, lipid metabolites and NOS expression.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete, principalmente, pacientes de Unidades Hematológicas, como aqueles com neutropenia profunda e prolongada. Após a filamentação este fungo angioinvasivo é capaz de ativar e causar danos em células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) que passam a expressar um fenótipo pró-trombótico. A ativação destas células, dependente de contato célulacélula, é mediada por TNF-&#945; e caracterizada pela expressão de moléculas próinflamatórias, como citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão. Recentemente, nosso grupo comparou a ativação endotelial de HUVECs desafiadas com cepas selvagens e uma cepa mutante para o gene UGM1. Nestes experimentos a cepa mutante &#916;ugm1, que apresenta um fenótipo de maior produção de galactosaminogalactana (GAG) na parede celular, mostrou um fenótipo hiperadesivo e uma capacidade maior de ativar células endoteliais. Entretanto, os receptores e as vias de sinalização envolvidos nesta ativação permanecem desconhecidos. Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar as proteínas envolvidas nestes processos através do estudo das proteínas diferencialmente expressas nas HUVECs após a interação com A. fumigatus, usando a técnica proteômica 2D-DIGE. Brevemente, as HUVECs foram infectadas com tubos germinativos da cepa selvagem (AF293) e da cepa &#916;ugm1 de A. fumigatus. Em seguida, as proteínas foram marcadas com diferentes fluorocromos e separadas por eletroforese bidimensional. A análise quantitativa foi realizada utilizando o software DeCyder. Foram identificadas por MS/MS cinco proteínas diferencialmente expressas, incluindo a galectina-1 e a anexina A2, ambas mais expressas após a interação, sendo a primeira ~25% mais expressa após a interação com a mutante &#916;ugm1. Este trabalho propõe que a galectina-1 poderia ser o receptor endotelial para polímeros de galactose presentes na parede celular do A. fumigatus, e que a Anexina A2 poderia estar envolvida na sinalização intracelular em resposta a este patógeno. No entanto, experimentos complementares, em curso, são necessários para comprovar esta hipótese. / Aspergillus fumigatus is the main etiological agent of invasive aspergillosis, the main opportunistic fungal infection of Hematologial Unitys patients, especially those with long-term neutropenia. Upon filamentation, this angioinvasive fungus can activate and damage the human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), which in response switch to a pro-thrombotic phenotype. HUVEC activation is mediated by TNF-&#945; once cell-cell contact occurs. This activation is characterized by the expression of pro-inflammatory molecules such cytokines, chemokines and adhesion molecules. Recently, our group performed the comparison of HUVEC activation upon interaction with a wild type and the UGM1 mutant strains of A. fumigatus. The &#916;ugm1 strain, which presents an increased production of the cell wall galactosaminogalactan, showed a hyper adherent phenotype and an increased capability to cause endothelial cell stimulation and activation, when compared with the wild type strain. The receptors involved in the pathogen-host interaction or the signaling pathways after endothelial activation by A. fumigatus remain unknown. Thus, the aim of this study was to investigate the differentially expressed proteins in HUVECs upon interaction with A. fumigatus, using the 2D-DIGE proteomic approach. Briefly, HUVECs were challenged with germlings of A. fumigatus wild type Af293 and &#916;ugm1 strains and then submitted to protein extraction. The total HUVEC protein extracts were labeled with different CyDyes and fractionated by 2D electrophoresis. Quantitative analysis to determine the differences in protein abundance amongst interacted cells vs. control endothelial cells was performed using the software DeCyder. Five differentially expressed proteins were identified by MS/MS including galectin-1 and annexin A2, both overexpressed after the interaction. These two proteins are described elsewhere to be associated with host-pathogen interaction. Besides, galectin-1 showed an ~25% increase after interaction with the &#916;ugm1 strain and it is plausible that this particular protein could be a putative receptor for galactose-containing polymers of the A. fumigatus cell wall and annexin A2 could be involved in signalizing pathways upon interaction. However, other experimental evidences, under development, are necessary to confirm this hypothesis.