Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseEMC.pdf: 2324718 bytes, checksum: 03bf0e57dab75b9f8e1c149ff3e678cd (MD5) Previous issue date: 2004-01-27 / Down syndrome is the most frequent cause of mental retardation affecting millions of people worldwide and results from full or partial trisomy of chromosome 21 (HC21). Rare cases of partial trisomy allowed the identification of a small region in HC21 common to all carriers called Down Syndrome Critical Region. The genes DCRA and DSCR8, mapped to this region, encode two proteins of unknown function. With the aim of contributing to a better characterization of these proteins, DSCR8 was subcloned and expressed in fusion with thiorredoxin in Escherichia coli Rosetta (DE3). Recombinant Trx-DSCR8, observed in the soluble fraction, was subjected to the initial purification assays by affinity chromatography in a Ni-NTA column. The gene DCRA was cloned and expressed in fusion with the proteins thiorredoxin and GFP allowing the partial purification of the protein and the achievement of crystallization and immunological assays. The amino acid sequence of DCRA showed 57% and 49% of identity to a protein of unknown function from Anopheles gambiae and Drosophila melanogaster respectively. Also, in silico analyses revealed that DCRA contains a putative Vps26 domain. Subcellular localization of DCRA in fusion with GFP was observed preferentially in the cytoplasm of the cell lines tested. These results contribute to a better characterization of DCRA and DSCR8 and open up possibilities towards the understanding of the cellular role of these proteins and their relationship with the Down syndrome. / A síndrome de Down é a causa mais freqüente de retardo mental que afeta milhões de pessoas em todo o mundo e resulta de uma trissomia completa ou parcial do cromossomo 21 (HC21). Casos raros de trissomia parcial permitiram identificar uma pequena região do HC21 comum a todos os portadores denominada de Região Crítica da Síndrome de Down. Os genes DCRA e DSCR8 foram mapeados nesta região e codificam proteínas de função desconhecida. Com o objetivo de contribuir para a caracterização destas proteínas DSCR8 foi expresso em fusão com seqüência codificadora da tiorredoxina na linhagem de Escherichia coli Rosetta (DE3) o que possibilitou a obtenção de Trx- DSCR8 na fração solúvel em quantidade suficiente para os ensaios iniciais de purificação em cromatografia de afinidade Ni-NTA. O DCRA foi clonado em fase com seqüências codificadores da tiorredoxina e GFP o que permitiu que a solução protéica fosse parcialmente purificada e que ensaios de cristalização e imunização pudessem ser realizados. A seqüência de aminoácidos da proteína DCRA possui 57% e 49 % de identidade respectivamente com proteínas de Anopheles gambiae e de Drosophila melanogaster, ambas de função desconhecida. Análises in silico da seqüência de aminoácidos demonstram que DCRA possui um provável domínio de Vps26. A localização subcelular da DCRA em fusão com a GFP foi observada preferencialmente no compartimento citoplasmático em todas as linhagens celulares analisadas. Esses resultados contribuem para melhor conhecimento da DCRA e da DSCR8 e estimulam futuras análises para o entendimento da função celular destas proteínas, bem como suas implicações na síndrome de Down.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseDMNJ.pdf: 1396596 bytes, checksum: c40f8c60cc5a4bb8964cfe0ce5adc332 (MD5) Previous issue date: 2004-12-07 / Universidade Federal de Minas Gerais / Down syndrome (DS) is the most common congenital disease occurring in approximately 1 out of 700 live births. In addition to the full HC21 trisomy, rare individuals with clinically recognized DS have only a partial trisomy, carrying a region common to all patients dubbed as Down Syndrome Critical Region (DSCR). Several genes contained in this portion of the HC21 are probably related to the DS phenotypes. In an attempt to characterize some of the DSCR genes, heterologous expression and subcellular localization analyses were performed for the genes DCRB (DSCR4), c21orf45, c21orf59, c21orf83-2, c21orf 95 and c21orf101. Analyses of the recombinant proteins produced in Escherichia coli showed that most of them remained in the insoluble fraction. DCRB was expressed as a soluble protein in E. coli Rosetta (DE3), purified and subjected to assays for secondary structure analyses. Also, deletion and site directed mutagenesis as well as the production of polyclonal antisera against DCRB were performed. Subcellular localization analyses revealed that the proteins DCRB, c21orf45, c21orf59 and c21orf83-2 were distributed in the cytoplasm of mammalian cells and that c21orf95 and c21orf101 resided in the nucleus. Considering the lack of information concerning these proteins encoded in the DSCR our results allowed a insight into some of the proteins provably involved in Down syndrome. / A Síndrome de Down (SD) é o distúrbio genético mais freqüente em humanos, sendo detectado em média um caso a cada 700 nascimentos. Esta anomalia é decorrente principalmente da trissomia total do cromossomo 21 porém, em alguns casos, ocorre a trissomia parcial deste cromossomo o que possibilitou a definição de uma região comum a todos os portadores denominada Região Crítica da Síndrome de Down (DSCR). Nesta região encontram-se vários genes que possivelmente estão relacionados às características fenotípicas apresentadas pelos indivíduos portadores. Entre eles estão os genes estudados neste trabalho: DCRB ou DSCR4 e as ORFS c21orf45, c21orf59, c21orf83-2, c21orf 95 e c21orf101. Com o objetivo de contribuir para os estudos realizados com genes localizados na DSCR foram realizadas a expressão heteróloga em E. coli e a localização subcelular das proteínas codificadas pelos genes descritos acima. Assim, os experimentos de expressão heteróloga em E. coli demonstraram que as proteínas expressas encontram-se na forma insolúvel para a maioria das condições testadas, entretanto foi possível a expressão de uma pequena fração solúvel da c21orf45, c21orf59 e da DCRB quando utilizou-se células da linhagem Rosetta (DE3) o que permitiu que a última proteína fosse purificada em condições nativas e que ensaios iniciais de estrutura secundária fossem realizados. Experimentos de deleção e mutação sítio dirigida também foram realizados com esta proteína assim como a produção de anticorpos policlonais. Estudos da localização subcelular revelaram que quatro das proteínas analisadas (DCRB, c21orf45, c21orf59 e c21orf83-2) são citoplasmáticas enquanto que duas (c21orf95 e c21orf101) são nucleares. Considerando a escassez de informações a respeito dos genes localizados na DSCR, esses resultados vem contribuir para o conhecimento das proteínas possivelmente envolvidas com a Síndrome de Down.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissMMS.pdf: 957649 bytes, checksum: 26153578cc56d59b9fd242494f3cd28d (MD5) Previous issue date: 2007-03-09 / Financiadora de Estudos e Projetos / Due to the great economic importance of sugarcane crop in Brazil, the occurrence of infections by phytopathogens leading to decreased productivity and quality remains a serious problem. As the plants have natural mechanisms of defense against the attack of fungi and insects, amongst which the inhibitors of proteases are distinguished, the use of these substances in the development of resistant plants or in pesticide production may be an interesting alternative. One of the major classes of protease inhibitors acting against the attack of pathogens is the cystatins, proteins that inhibit cysteine proteases specifically. Canecystatin was the first cysteine protease inhibitor characterized from sugarcane. This gene codes for a ~ 14 kDa protein that contains conserved regions common to the cystatin family. Although the protein has previously been produced in a bacterial system of expression, in this work we use this sugarcane cystatin as a model for the implementation of a heterologous protein expression system in insect cells. This system has some advantages relatively to the prokaryotic system such as the possibility of posttranslational modifications. The recombinant protein was expressed in this system in a soluble form and purified using affinity chromatography in a nickel column, rendering approximately 23 mg/L of pure protein. The activity of the protein was assayed against papain, being capable of inhibiting the activity of this cysteine protease efficiently. Furthermore, the stability of the protein was analyzed in different conditions of pH and temperature. We conclude that the canecystatin is a good model for the implementation of the Baculovirus Expression System at the Molecular Biology Laboratory of the UFSCar / Devido à grande importância da cultura da cana-de-açúcar no Brasil, a ocorrência de infecções por fitopatógenos constitui um grave problema que acarreta queda na produtividade e na qualidade da lavoura canavieira. Uma vez que as plantas têm mecanismos naturais de defesa contra o ataque de fungos e insetos, dentre os quais se destacam os inibidores de proteases, a utilização dessas substâncias no desenvolvimento de plantas resistentes ou na produção de pesticidas seria uma alternativa interessante. Um tipo de inibidor de protease que atua na proteção contra o ataque de patógenos e como proteínas de reservas em algumas sementes são as cistatinas, proteínas que inibem especificamente cisteínoproteases. A Canacistatina foi o primeiro inibidor de cisteíno-protease caracterizado originado da cana-de-açúcar. Apesar de já ter sido anteriormente produzida em sistema bacteriano de expressão, a Canacistatina foi utilizada, nesse trabalho, como modelo de estudo para implementação do sistema de expressão de proteínas heterólogas em células de inseto. Esse sistema apresenta algumas vantagens sobre o sistema procariótico como a possibilidade de realizarem modificações pós-traducionais. A proteína recombinante foi expressa nesse sistema na forma solúvel e purificada em cromatografia de afinidade em coluna de níquel, resultando em um rendimento de 23 gramas por litro de cultura. A proteína purificada foi submetida a testes de inibição enzimática contra a papaína, sendo capaz de inibir satisfatoriamente a atividade dessa cisteíno-protease. Também foram realizados testes de estabilidade desse inibidor em diferentes condições de pH e temperatura, mostrando-se estável. A Canacistatina foi um modelo de estudo adequado para a implementação do sistema de expressão de proteínas no Laboratório de Biologia Molecular da UFSCar

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissCWR.pdf: 2377767 bytes, checksum: 22e5ef2553191133e9dfe9a15fc8707a (MD5) Previous issue date: 2007-03-19 / Universidade Federal de Sao Carlos / Sugarcane is a plant of great economical importance, mainly in Brazil, which is currently the largest producer of this crop in the world. However, sugarcane farming has suffered attacks from pests and pathogens, leading to considerable economical losses. Therefore, a number of studies have focused on the development of more resistant sugarcane varieties. Our laboratory has been working on a sugarcane protein (CaneCPI- 1), which is a cystein-protease inhibitor protein. Based on studies that indicate that insects belonging to the order Coleoptera possess cystein-proteases in their mid-gut and with the knowledge that some species of Coleoptera are sugarcane pests, a transgenic sugarcane plant overexpressing the CaneCPI-1 gene was developed under the control of maize ubiquitin promoter. CaneCPI-1 was fused to a His-tag to facilitate further purification through affinity chromatography. The calli transformation was performed through biobalistics. The transformed plants were then selected by polymerase chain reaction. Positive plants were further selected by Semi-quantitative PCR and Western blotting. A transformed plant expressing a His-tagged CaneCPI-1 was selected for purification of the recombinant protein in a nickel column, enabling purification of HISCaneCPI-1 from plant leaves in a single step. The yield was about 6mg of pure protein per kilogram of sugarcane leaves. The HISCaneCPI-1 purified from the transformed sugarcane demonstrated inhibitory activity on the human cysteine protease cathepsin L. These studies demonstrate that the sugarcane can be a safe and viable expression system for recombinant protein production, and are the first step in the establishment of a sugarcane plant that is more resistant to pathogens. / A cana-de-açúcar é uma planta de grande importância econômica, principalmente no Brasil, que hoje é o maior produtor mundial desta cultura. Porém, as lavouras de canade- açúcar estão cada vez mais sendo atacadas e destruídas por pragas e patógenos, causando grandes perdas econômicas para os produtores. Assim, vários estudos estão focados no desenvolvimento de variedades de cana-de-açúcar mais resistentes. Nosso laboratório tem trabalhado com a proteína CaneCPI-1, uma proteína inibidora de cisteíno-protease. Baseado em estudos que indicam que insetos pertencentes à ordem Coleoptera possuem enzimas proteolíticas do tipo cisteíno-proteases em seu trato digestivo e, sabendo que algumas espécies de Coleoptera são pragas de cana-de-açúcar e que causam sérios danos aos canaviais, foi desenvolvida uma cana-de-açúcar transgênica superexpressando o gene da CaneCPI-1 sobre controle do promotor da ubiquitina do milho. A CaneCPI-1 foi também fusionada a uma his-tag para facilitar a posterior purificação por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. Para a transformação genética dos calos foi utilizado o método de biobalística e, após isto, foi feita uma seleção das plantas transformadas através de uma reação de PCR. As plantas que apresentaram resultado positivo foram selecionadas por PCR Semi-quantitativo e ensaios de Western blotting. Uma planta transformada expressando a proteína CaneCPI- 1 com his-tag foi selecionada para a purificação da proteína recombinante em coluna de afinidade ao níquel, possibilitando a purificação da HISCaneCPI-1 em um único passo. O rendimento foi de 6mg de proteína pura por kilograma de folhas de cana-de-açúcar. A HISCaneCPI-1 purificada demonstrou atividade inibitória contra a enzima catepsina L, uma cisteíno-protease humana. Estes resultados mostram que a cana-de-açúcar pode ser usada como um sistema de expressão seguro e viável para a produção de proteínas recombinantes e é o primeiro passo para o estabelecimento de uma cana-de-açúcar resistente à pragas.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015.pdf: 1441432 bytes, checksum: a83fe75ef6bcdf6aded59803a162d33a (MD5) Previous issue date: 2008-08-20 / As cisteíno proteases são enzimas proteolíticas que possuem os resíduos de cisteína e histidina em seu sítio catalítico. Essa classe de enzimas está presente na grande maioria dos organismos, desde bactérias, fungos, protozoários, plantas e animais. As propriedades físico-químicas destas proteases têm sido amplamente caracterizadas, entretanto suas funções biológicas ainda não foram completamente elucidadas. Trabalhos com cisteíno proteases de plantas têm sugerido diversas funções biológicas para estas enzimas. O presente estudo tem como objetivo a produção recombinante e a caracterização de uma cisteíno protease (tipo catepsina B) de cana-de-açúcar. A produção recombinante da enzima foi realizada em E. coli nas formas solúvel e insolúvel, sendo que esta última foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. A caracterização da enzima foi realizada pela análise da hidrólise de substratos fluorescentes. Testes de inibição contra a cisteíno protease foram feitos utilizando-se inibidores recombinantes endógenos produzidos em nosso laboratório (CaneCPI-1 e CaneCPI-4), como também o inibidor específico para cisteíno proteases (E64) e o inibidor específico para catepsinas B (CA074). A inibição foi realizada com sucesso com os inibidores endógenos, como também com os inibidores sintéticos específicos. A atividade inibitória do CA074 demonstrada contra a cisteíno protease da cana-de-açúcar sugere que esta enzima seja uma cisteíno protease tipo catepsina B.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016.pdf: 1206354 bytes, checksum: fc07f54941a23475ae348908f318c08a (MD5) Previous issue date: 2008-08-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / As serpinas são conhecidos inibidores de serino proteases, enzimas notáveis por participarem de inúmeros processos fisiológicos importantes. A proteólise não regulada pode levar ao surgimento de doenças e problemas funcionais e, portanto, a função dos inibidores é fundamental para o bom funcionamento do organismo. No genoma da cana-de-açúcar foi identificada uma ORF (Open Reading Frame) que codifica uma serpina. Visto que essa planta é de grande importância para a economia brasileira e muitos trabalhos vêm sendo desenvolvidos visando à melhora da produção e estratégias de defesa contra parasitas e, dado que na literatura não se tem descrita nenhuma serpina de cana-de-açúcar, o objetivo desse trabalho foi caracterizar uma serpina presente nessa planta, denominada cana-serpina. Para isso, a ORF contida no clone SCJLRT1015H07.g foi isolada e subclonada para posterior expressão recombinante e purificação da proteína. A canaserpina recombinante pura foi capaz de inibir a atividade enzimática da quimiotripsina e tripsina, com um valor de IC50 de 0,46 e 0,50 μM, respectivamente. Além disso, a formação do complexo covalente SDS-estável foi visualizado no ensaio com tripsina, embora fracamente e no ensaio com a quimiotripsina foi possível visualizar apenas um possível complexo clivado. Portanto, esse trabalho procura contribuir para a identificação e caracterização da primeira serpina descrita para a cana-de-açúcar e trabalhos posteriores poderão identificar a especificidade em relação a outras enzimas, buscando relacioná-las a possíveis alvos endógenos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissHCSS.pdf: 1174664 bytes, checksum: 6d1af63d33e89cf1251e02e9083170e2 (MD5) Previous issue date: 2003-01-24 / The genes DCRA and DSCR1 are located in the Down Syndrome Critical Region , a specific portion of human chromosome 21 responsible for the main traits of the disease. In the present work we have used the two-hybrid system as an approach to find proteins that interact with DCRA and DSCR1. This method is based on the properties of the yeast GAL4 protein, which consists of separable domains responsible for DNA-binding and transcriptional activation. The open reading frames of DCRA and DSCR1 were cloned in frame with the GAL4 DNA-binding domain. These constructions were used to analyse protein interactions using a human foetal brain cDNA library, cloned in frame with the GAL4 transcriptional activation domain. No DCRA protein partners were found in any of the screenings performed; nevertheless, the analysis allowed the detection of several false positive clones. In the analysis of DSCR1 we identified two proteins, UXT (ubiquitously expressed transcript) and APLP1 (amyloid precursor-like protein 1). These results may help elucidate a new function for DSCR1 in the nucleus, probably related gene expresion. / Os genes DCRA e DSCR1 estão localizados no cromossomo 21 mais especificamente na Região Crítica da Síndrome de Down que, em triplicata é responsável por alguns fenótipos da Síndrome. Neste projeto, visando encontrar proteínas que interagem com as proteínas DCRA e DSCR1, foi empregado o método do Duplo- Híbrido que utiliza as propriedades da proteína GAL 4 de levedura Saccharomyces Cerevisiae. Com esta finalidade fez-se a sub-clonagem das ORFs DCRA e DSCR1 em plasmídeos que contém um domínio de ligação ao DNA da proteína GAL 4. Estas construções foram utilizadas para analisar possíveis interações proteícas utilizando uma biblioteca de cérebro fetal construída em um plasmídeo em fase com o domínio de ativação da transcrição da proteína GAL 4. Nas análises com a proteína DCRA não foi possível confirmar nenhuma interação, porém possibilitou o estabelecimento de vários falso positivos dentro da técnica. Por outro lado, identificação de novos ligantes a proteína DSCR1, que são as proteínas UXT e APLP1, revela um novo papel da DSCR1 dentro da célula, provavelmente relacionado à regulação gênica.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissPVC.pdf: 931304 bytes, checksum: 56aee4360d52be36ef0d88b8beb6b9b2 (MD5) Previous issue date: 2004-01-01 / Proteins from the inner core of HIV-1 are involved in crucial processes during the virus life cycle. p24 is the major capsid protein of HIV and is initially expressed as part of the gag polyprotein. The association of gag proteins to the cell inner-membrane surface initiates virus assembly and induces budding from the host cell membrane. Thus, p24 plays an active structural role both as part of the Gag protein and in its mature form. In this sense, we have chosen a region from C-terminal of p24, TLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNA, (p24-3) which is part of the major region responsible for protein dimerization. The linear peptide, rp24-3, and its cyclic variant, rp24-3m, were produced by recombinant strategy in Escherichia coli. The gene fragments were obtained by the synthetic gene approach and inserted into pET 32a to produce fusion proteins in the soluble form. The expression products were purified by Ni-affinity chromatography followed by an enzymatic cleavage. The peptides where purified by reverse phase chromatography and their primary sequence and molecular masses where inferred by amino acid sequence analysis and mass spectrometry, respectively. The rp24-3 secondary structure was investigated by circular dichroism and steady state fluorescence, been structured differently in water and in buffer. Besides, its tryptophan is in a partially buried environment and the addition of methanol above 70% caused a highly increase in helical content. In conclusion, this work shows a suitable system for rp24-3 production, providing satisfactory amount for structural studies. / As proteínas do centro do HIV-1 estão envolvidas em processos cruciais durante o ciclo de vida viral. A p24 é a principal proteína do capsídeo do HIV e é inicialmente expressa como parte da poliproteína Gag. A associação das proteínas Gag na superfície da membrana interna da célula hospedeira dá início à montagem viral e desencadeia o processo de brotamento da membrana da célula hospedeira. Dessa forma, a p24 possui um importante papel estrutural tanto no contexto da Gag, como na sua forma madura. Nesse sentido, foi escolhido um peptídeo da região C-terminal da p24, TLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNA, (p24-3) que compõe a região principal responsável pela dimerização da proteína p24. O peptídeo linear, rp24-3, e sua variante cíclica, rp24-3m, foram produzidos em Escherichia coli via estratégia recombinante. Os fragmentos gênicos foram obtidos por meio da montagem de genes sintéticos e foram inseridos no vetor pET 32a para a produção como proteínas de fusão na forma solúvel. Os produtos expressos foram purificados por cromatografia de afinidade em Ni e submetidos a uma clivagem enzimática. Os peptídeos foram então purificados por cromatografia em fase reversa e suas sequências primárias e massas moleculares foram inferidas por meio do sequenciamento de aminoácidos e análises por espectrometria de massa, respectivamente. A estrutura secundária do rp24-3 foi investigada por dicroísmo circular e fluorescência estática, mostrando-se estruturado diferentemente em água e em PBS. Além disso, o triptofano está em um ambiente parcialmente escondido. A adição de metanol acima de 70% causou um grande aumento no conteúdo de hélices. Concluíndo, este trabalho mostra um sistema viável para a produção do rp24-3, proporcionando quantidades necessárias para a realização de estudos estruturais.

Infecções por Neisseria meningitidis são uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo devido à habilidade do patógeno em provocar epidemias e até pandemias. Por ser capaz de se recombinar geneticamente existe uma grande variabilidade de tipos circulantes que podem diferir de acordo com a população atingida e localização geográfica. Por isso os objetivos deste estudo foram: avaliar a epidemiologia da doença meningocócica (DM) em pacientes do Rio Grande do Sul (RS), caracterizar fenotípica e genotipicamente isolados de N. meningitidis utilizando métodos convencionais e propor um novo método de tipagem para o estudo de surtos, bem como avaliar sua susceptibilidade à penicilina. Para isso foi realizado um estudo retrospectivo de coorte em 2.215 casos de DM notificados entre 1995 a 2003 no RS. Foi observada uma redução de quase 50% dos casos durante o período e a taxa de letalidade foi de 22%. Ainda assim, uma incidência marcante continua sendo observada mesmo depois do final do período epidêmico, em 1999, onde as faixas etárias de crianças entre 1 e 4 anos e menores de 1 ano representam juntas quase 55% dos casos notificados, com uma média de incidência de 11,3/100.000 hab e 31.3/100.000 hab, respectivamente. A maioria dos casos foi atribuída ao sorogrupo B (69,8%), que aumentou significativamente. Também foi observada uma diminuição significativa dos casos pelo sorogrupo C. Os fenótipos B:4,7:P1.19,15, B:15:P1.7,16 e B:NT:P1.3 representam quase 50% de todos os isolados sorotipados. Cinqüenta e seis isolados obtidos de pacientes do RS, durante o primeiro ano não-epidêmico, somados a 20 isolados dos estados de Santa Catarina e Paraná, Dinamarca e França foram genotipados por Multilocus Sequence Typing (MLST). Foram identificados 20 Sequence Types (STs) distintos, dos quais 8 foram caracterizados como tipos novos, encontrados somente no RS. ST-33 (27%) e ST-259 (18%) foram os tipos mais freqüentes, ambos pertencentes ao complexo clonal ST-32/ET-5. Os casos ST-259 do RS demonstraram uma maior tendência de desfecho de casos fatais. Não foram encontrados isolados ST-259 entre os controles geográficos ou em outros estudos previamente realizados no Brasil. Nossos resultados sugerem que estes dois clones observados durante todo o período de estudo, somados à emergência do ST-103 contribuem para a manutenção da alta incidência da DM no RS. Quase 18% dos isolados apresentaram suscetibilidade reduzida à penicilina. A presença de suscetibilidade reduzida ou plena à penicilina associada ao clone ST-461 foi estatisticamente significativa (P=0,017) quando comparada à resistência nos demais clones. Nenhum isolado demonstrou atividade para a ß-lactamase. Também foi padronizado um novo método de genotipagem, chamado de Variable Site Specific-PCR (VSS-PCR) que apresentou um excelente poder discriminatório, de baixo custo operacional e de fácil execução e interpretação, que poderá ser utilizado em estudos de surtos da DM, assim que seja validado. / Neisseria meningitidis infections are an important cause of morbidity and mortality worldwide because of the pathogen ability to cause epidemics and pandemics. The recombination ability results in a large variability of circulating types that can differ depending on the infected population and geographic localization. Considering these aspects, the aims of this study were: to evaluate meningococcal disease epidemiology affecting patients from the state of Rio Grande do Sul (RS), phenotypic and genotypic characterization of N. meningitidis isolates, using conventional methods and standardizing a new method for outbreak study; and evaluation of penicillin susceptibility. A retrospective cohort study was carried out among 2,215 meningococcal disease (MD) cases reported from 1995 to 2003 in RS, Brazil. A reduction of almost 50% in the overall incidence was observed, and the case-fatality rate during this period was 22%. Even so, high incidence of MD continued to be observed after the epidemic period which ended in 1999. The age group of 1-4 years old and infants under 1 year of age represent together almost 55% of the reported cases with a mean incidence of 11.3/100,000 pop and 31.3/100,000 pop, respectively. The majority of cases were caused by N. meningitidis serogroup B (69.8%), which increased significantly. There was a significant decrease in serogroup C cases. The phenotypes B:4,7:P1.19,15, B:15:P1.7,16 and B:NT:P1.3 represented almost 50% of all serotyped cases. Fifty-six isolates obtained from RS patients during the first non-epidemic year 2000 plus 20 isolates from other southern Brazilian states (Santa Catarina and Paraná), Denmark and France were typed by Multilocus Sequence Typing (MLST). Twenty different Sequence Types (STs) were identified, 8 of them found only in RS. ST-33 (27%) and ST-259 (18%) were the most frequent, both belonging to the ST-32/ET-5 complex. The ST-259 cases showed a trend towards higher risk of fatal outcome. ST-259 isolates were not detected among geographic controls or in other studies carried out in Brazil. Our data suggest that these two clones wich occurred over the entire study period and the emergence of the ST-103 isolates contributed to the continued high incidence of MD in RS. Almost 18% of isolates presented moderate resistance to penicillin. The decreased susceptibility or complete resistance to penicillin associated to ST-461 clone was statistically significant (P=0,017) when compared to the other clones. None of the isolates have showed ß-lactamase activity. We standardized a new genotyping method, called Variable Site Specific-PCR (VSS-PCR) that shows high discriminatory power, lower costs, easy performance and interpretation, which may be used in MD outbreaks, after its validation.

A RS 486 - Rota do Sol vem sendo motivo de polêmica desde o início da implantação da obra, em 1990. O fato de a estrada afetar um dos ecossistemas mais ameaçados no Brasil, a Mata Atlântica, somado a alguns problemas na condução das obras, que terminaram por levar ao embargo das mesmas, configuram a situação a ser enfrentada no presente trabalho. Ao longo do trajeto a estrada percorre vales e encostas da Reserva da Biosfera, na Serra Geral, apresentando grande variação altitudinal e secionando diversas comunidades vegetais de Mata Atlântica distintas estrutural e fisionomicamente. O levantamento da fauna de roedores silvestres foi realizado na área de influência da rodovia RST-453/RS-486, Rota-do-Sol, entre junho de 1997 e setembro de 2003, perfazendo um total de 14 expedições de amostragem. As coletas foram realizadas em três pontos dentro de um gradiente altitudinal, entre os municípios de Terra de Areia e Tainhas no estado do Rio Grande do Sul, onde foram reconhecidos três ambientes estrutural e fisionomicamente distintos. Estas localidades diferem em altitude e em formação vegetal estando assim distribuídas: Mata Paludosa, altitude 30 metros ─ S 29.30.392, W 050 06.422, Floresta Ombrófila Densa, altitude 350 metros ─ S 29 22.506, W 050 11.318 e Floresta Ombrófila Mista, altitude 780 metros ─ S 29 19.261, W 050 12.282 A estrutura genética de duas espécies de roedores silvestres (Oligoryzomys nigripes e Oryzomys russatus) foi analisada através de seqüências da região hipervariável do mtDNA por estimativa do fluxo gênico e da diferenciação genética entre as populações a partir do índice de diferenciação Gst. As espécies analisadas pertencem ao mesmo local, porém subdivididas em populações separadas pela fragmentação dos habitats. Estas espécies foram escolhidas devido à diferença na história de vida e utilização do habitat, características que influenciam suas respectivas estruturas populacionais e genéticas. Os resultados obtidos corroboram o padrão descrito para comunidades abertas onde poucas espécies são abundantes, espécies dominantes, e muitas são raras. A Mata Paludosa com 113 ha. apresenta diversos microambientes tendo apresentado a maior diversidade e abundância de roedores. Foi verificado um padrão de sazonalidade discreto para duas espécies: Akodon montensis — inverno nos três pontos de amostragem e Oligoryzomys nigripes — inverno na Floresta Ombrófila Densa. Os ciclos populacionais das espécies mais representativas em cada ponto foram de aproximadamente quatro anos. Os ciclos populacionais de Oligoryzomys nigripes acompanham os ciclos de Akodon montensis, via de regra com valores de captura inferiores. Delomys dorsalis, na Floresta Ombrófila Mista apresentou ciclo populacional mais longo com flutuação e Oryzomys russatus e Oligoryzomys flavescens apresentaram ciclos populacionais com períodos de inatividade maiores. As capturas de Delomys dorsalis e Euryzygomatomys spinosus na Mata Paludosa e Brucepatersonius iheringi na Floresta Ombrófila Mista caracterizam ampliação do registro de ocorrência. A Floresta Ombrófila Densa e a Floresta Ombrófila Mista apresentam maior correlação, tanto através de análise de Grupamento Hierárquico (capturas) como através de Análise de Correspondência Simples (freqüência). A freqüência de captura de Akodon montensis foi regular em todo gradiente, Delomys dorsalis, Oligoryzomys nigripes e Oryzomys russatus, aparentemente, selecionam de forma positiva um determinado tipo de formação vegetal. D. dorsalis e O. russatus, padrão de distribuição em gradiente. A utilização do marcador de uma região hipervariável do mtDNA indica que não há estruturação geográfica das populações nem um mecanismo de isolamento por distância, levantando a hipótese de que o gradiente altitudinal não tem influência na estruturação genética das populações de Oligoryzomys nigripes e Oryzomys russatus. Os resultados obtidos para Oligoryzomys nigripes e Oryzomys russatus — mtDNA — indicam uma distribuição que, se em gradiente, não apresenta relação com a altitude ou formação vegetal. Os padrões de abundância para as diferentes espécies, em cada local de captura, devem estar associados a fatores ecológicos independentes do isolamento por distância, formação vegetal e variação altitudinal.