A agenesia dentária é a falha do desenvolvimento do germe dentário causando a ausência definitiva do dente. Constitui–se na anomalia dentária mais comum, afetando até um quarto da população em geral. A principal causa está relacionada com a função anormal de genes específicos que desempenham um papel chave durante a odontogênese, especialmente o MSX1 e o PAX9. Apesar da alta frequência dessa anomalia, apenas algumas mutações no MSX1 e no PAX9 foram associadas com a agenesia não–sindrômica até o momento. Uma vez que um número maior de indivíduos afetados é esperado nos próximos anos, uma análise mais profunda dos defeitos genéticos que levam à agenesia torna–se fundamental. O objetivo desta pesquisa foi estudar seis famílias segregando oligodontia/hipodontia não–sindrômica, além de investigar a presença de mutações nos genes MSX1 e PAX9 com a finalidade de associar fenótipo e genótipo. As famílias, que apresentam mais de um integrante com agenesia, foram selecionadas a partir de uma clínica particular. Amostras de células epiteliais bucais foram coletadas de todos os indivíduos por meio de escovas citológicas. O DNA foi isolado, amplificado e sequenciado. Todas as sequências foram comparadas com as existentes no GenBank. A homologia das sequências mutantes também foi comparada utilizando–se o software online BLAST. Os genes MSX1 e PAX9 de dez indivíduos controle não afetados e sem grau de parentesco também foram sequenciados. Foi identificada uma nova mutação missense no exon 2 próximo ao final do domínio pareado do PAX9 em três famílias. A mutação heterozigótica C503G resulta em uma troca de aminoácido de alanina para glicina no resíduo 168 (Ala168Gly), o qual é invariavelmente conservado entre várias espécies. A mudança alanina–glicina pode determinar uma alteração da estrutura proteica devido às propriedades únicas de flexibilidade da glicina, levando à agenesia dentária. Tal mutação não encontra–se registrada em nenhum banco de dados conhecido ou na literatura sendo, portanto, inédita. As mutações intrônicas IVS2–109G>C, IVS2–54A>G e IVS2–41A>G também foram identificadas no PAX9. Essas variantes polimórficas podem estar envolvidas no fenótipo uma vez que um probando, o qual apresentou todas as três mutações intrônicas em homozigose, foi afetado com a mais severa forma de oligodontia dentro da amostra. A transição * 6C>T foi identificada no exon 2 do MSX1, em apenas uma família. Devido ao fato de estar localizada seis bases após o stop codon, essa mutação homozigótica pode dificultar/alterar o término da tradução contribuindo, assim, para o fenótipo. Novos estudos acerca da expressão gênica em um número maior de famílias afetadas irá aumentar o conhecimento sobre agenesia dentária. Tal entendimento permitirá alcançar melhores opções de tratamento e, talvez, uma ferramenta de diagnóstico precoce que, possivelmente, envolverá o exame de DNA baseado em variantes polimórficas. Todos esses dados podem auxiliar a clínica odontológica em um futuro próximo. / Universidade de Caxias do Sul / Tooth agenesis, the failure of development of tooth bud causing definitive absence of the tooth, is the most common dental anomaly affecting up to one quarter of the general population. The main cause is related to abnormal function of specific genes which play key roles during odontogenesis, particularly MSX1 and PAX9. Despite the high frequency of this anomaly, there are only a restricted number of mutations in MSX1 and PAX9 that have been associated with non–syndromic tooth agenesis so far. Since a greater number of affected subjects is expected over the coming years, a deeper analysis of the gene networks underlying tooth agenesis is critical. The aim of this research was to investigate six families segregating non–syndromic oligodontia/hypodontia as well as to screen for mutations in their MSX1 and PAX9 genes, attempting to associate phenotype and genotype. Families were selected from a private office. They should present more than one relative affected with agenesis. All subjects had a sample of buccal epithelial cells collected with cytology brushes. DNA was isolated, amplificated and sequenced. All sequences were compared to those in GenBank. Homology of the mutant sequences was also compared using BLAST online software. MSX1 and PAX9 genes from ten unrelated unaffected control subjects were also sequenced. A novel missense mutation lying in the exon 2 close to the end of the paired domain of PAX9 was identified in three families. Heterozygous mutation C503G is expected to result in an alanine–to–glycine amino acid change in residue 168 (Ala168Gly), which is invariably conserved among several species. The alanine–glycine change might lead to protein structural alteration due to the unique flexibility properties of glycine, leading to tooth agenesis. This is a novel mutation since it is not registered neither in any known database nor in literature. Intronic mutations IVS2–109G>C, IVS2–54A>G and IVS2–41A>G were also identified in PAX9. These polymorphic variants may be involved in the phenotype as one proband, showing all three intronic mutations in homozygosis, was affected with the most severe oligodontia within the sample. Transition *6C>T lying in the exon 2 six base pairs after the stop codon was detected in MSX1 gene in one family. Due to its proximity to the stop codon, this homozygous mutation can hinder a regular translation termination thus contributing to the phenotype. Further studies with gene expression in larger affected families will increase knowledge of tooth agenesis. Such understanding will allow to achieve better treatment options and, perhaps, an early diagnosis tool which would possibly lie on the DNA examination based on polymorphic variants. All this data may assist dental practice in a near future.

Orientador: Vera Lúcia Gil da Silva Lopes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T15:18:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_TaniaKawasakide_M.pdf: 2044257 bytes, checksum: 88ecc1c41da8ad27c2eef91360a2d656 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A patogênese das fendas orais envolve tanto fatores genéticos como ambientais. Mutações que causam fenda labiopalatal (FL±P) em camundongos apontam diretamente para genes candidatos em humanos. Por exemplo, as FL±P foram descritas em modelos animais deficientes ou com mutações nos genes TFAP2A e BMP4, sendo que mutações neste último foram detectadas em casos de FL±P não sindrômica na população chinesa. Os dois genes citados também estão associados, em modelos animais, a alterações da morfogênese de outros órgãos. Objetivou-se investigar o envolvimento dos genes BMP4 e TFAP2A na etiologia da FL±P em uma amostra de pacientes brasileiros por meio de reação em cadeia da polimerase (PCR), digestão com enzima HphI (PCR-RFLP) e sequenciamento direto. A casuística foi composta por 45 indivíduos, classificada, clinicamente, de acordo com a International Clearinghouse for Birth Defects and Surveillance and Ressearch (ICBDSR 2007). Com a finalidade de comparar com a literatura, utilizou-se a divisão em dois grupos: FL±P sindrômica (20 casos), FL±P não sindrômica (25 casos). A análise estatística foi feita com o teste do qui-quadrado. A substituição 538T®C (rs17563) no gene BMP4, anteriormente descrita como associada à FLP na população chinesa e em alguns indivíduos com microforma de FLP, foi encontrada em 34 (75,5%) indivíduos. Utilizou-se grupo controle de 169 indivíduos normais, sem casos de fendas orofaciais em três gerações e sem ascendência oriental. Não houve diferença significativa na freqüência dos genótipos e alelos do polimorfismo rs17563 no gene BMP4 entre os casos com FL±P e o grupo controle (p=0,3347, OR=0,718255, 95%CI, 0,4-1,27). Entretanto, para que a análise estatística seja conclusiva, é necessário aumento do número amostral. Alterações de sequência no gene TFAP2A, descritas como polimorfismos em base de dados genômicos, foram identificadas em cinco casos. Deste modo, não existem evidências de que os genes TFAP2A e BMP4 estejam envolvidos na gênese de FL±P nesta amostra. / Abstract: Information regarding research throughout the years shows that the pathogenesis of cleft lip and palate (CL±P) involves genetic and environmental factors. Mutations that cause CL±P in mice point directly to candidate genes in humans, as TFAP2A and BMP4 gene. The phenotype of animal models with mutations in these genes included clefts. Mutations in BMP4 have also been detected in cases of nonsyndromic CL±P in the Chinese population. Considering this, the aim of our study is to investigate the involvement of BMP4 and TFAP2A genes in the etiology of CL±P in the Brazilian population. Mutation screening by direct sequence and enzyme digestion with HphI (PCR-RFLP) were applied. Casuistry was composed by 45 patients, clinically classified by International Clearinghouse for Birth Defects and Surveillance and Ressearch (ICBDSR 2007). To compare with the literature, they were divided in syndromic CL±P (20 cases) and nonsyndromic CL±P (25 cases). Statistical analysis was performed using the chi square. The sample included 45 individuals, separated into two groups: The substitution 538T ® C (rs17563) in the BMP4 gene, previously described as associated with CL±P in the Chinese population and in some individuals with microforms of CLP was found in 34 (75.5%) subjects. A control group of 169 normal subjects, which had no cases of orofacial clefts in three generations and no Oriental ascendancy, was used. There was no significant difference in frequency of genotypes and alleles of rs17563 polymorphism in the gene BMP4 between cases with CL ± P and the control group (p = 0.3347, OR = 0.718255, 95% CI, 0.4 to 1.27). However, further studies with larger samples are necessary to elucidate this aspect. At TFAP2A gene was detected two single nucleotide polymorphisms. Thus, there is no evidence of involvement of TFAP2A and BMP4 genes in the CL±P in this sample. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Anete Pereira de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T10:48:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Benchimol-Reis_LucianaLasry_M.pdf: 5539731 bytes, checksum: c88bbc5da0a46f44533e4f3e227b95c9 (MD5) Previous issue date: 1996 / Mestrado / Genetica Vegetal / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Adilson Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T18:57:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_FelipeRodriguesda_M.pdf: 5917305 bytes, checksum: f5a2ce6dd1986e5219fe86f31267cb3c (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: As prolaminas, proteínas de reserva das sementes de cereais, são codificadas por uma série de genes regulados coordenativamente de forma específica ao nível de tecido e estágio de desenvolvimento. Estas proteínas são agrupadas em classes em função das similaridades na estrutura primária e conseqüente solubilidade. A expressão dos genes que as codificam é regulada principalmente ao nível da transcrição. As prolaminas de Coix são chamadas coixinas e representam mais de 70% do conteúdo protéico do endosperma. De acordo com sua solubilidade diferencial, as coixinas são classificadas em a e y-coixinas. Os dados moleculares obtidos até o momento indicam um alto grau de similaridade entre os genes que codificam as prolaminas de milho, Coix e sorgo. A expressão coordenada das prolaminas se dá através de mecanismos comuns a todas as classes. Entretanto, estudos recentes sobre a mutação opaco-2 mostram claramente que as a- e y prolaminas são reguladas também por um mecanismo exclusivo para estas classes. Tal fato sugere o envolvimento vários mecanismos regulando a transcrição dos genes de prolaminas. Devido principalmente à mutação opaco-2, os mecanismos envolvidos na regulação gênica das a-prolaminas são bem estudados. Pouco é conhecido sobre estes mecanismos nas y-prolaminas. Entretanto, enquanto as y-prolaminas são codificadas por, no máximo, dois genes, as «-prolaminas são codificadas por uma família muJtigênica. Tal fato torna as y-prolaminas modelos interessantes no melhoramento molecular de cereais. Nesta tese o gene da y-coixina (AGCX23.1) foi isolado de uma biblioteca genômica construída no fagemídeo Â-dash, utilizando-se um clone de cDNA de y-coixina como sonda. A seqüência da região promotora do gene foi alinhada com as seqüências dos promotores das y-prolaminas de milho e sorgo, revelando uma série de elementos conservados. Alguns destes e_mentos são semelhantes a elementos cis já descritos, como o prolamín box e os sítios de ligação dos fatores GCN4 de leveduras e C/EBP de animais. Experimentos de expressão transitória comprovaram que o promotor do gene da y-coixina é capaz de dirigir a expressão do gene da _-glicoronidase em endosperma imaturo de milho. A análise de deleção do promotor sugere que diversos elementos podem estar envolvidos na regulação de sua expressão. Experimentos de retardamento em gel provaram que três segmentos distintos do promotor da y-coixina ligam-se a fatores nucleares de maneira específica / Abstract: Prolamins, the major cereal storage proteins, are encoded by genes coordinately regulated in a tissue- and developmental stage-specific manner during seed development. There are several prolamin genes encoding proteins of discrete molecular sizes, which are divided in classes according to similarities in their primary structures and solubility. The expression of these genes is regulated primarily at the transcriptional level. The Coix prolamins, known as coixins, represent more than 70% of the total endosperm protein. Coixins can be separated in two fractions based on their differential solubility: (X- and y-coixins. The overall molecular data shows a high degree of similarity among the genes encoding the prolamins of maize, Coix and Sorghum. The coordinated expression of the prolamin genes is accomplished by a common regulatory mechanism. Still, recent studies on the opaque-2 mutation clearly demonstrated a distinct transcriptional regulation at the class level for the a- and p-prolamins. Therefore, multiple complex regulatory mechanisms are conceivably involved in the regulation of prolamin genes. Although the mechanisms of gene regulation for the a-prolamins are well studied, mostly because of the opaque-2 mutant of maize, little is known about the mechanisms controlling the y-prolamin genes. Also, while the a-prolamins are encoded by multigene families, the y-prolamíns are encoded by one or two genes, which heightens the importance of the y-prolamíns in molecular improving of cereais. In this work the y-coixin gene (I"GCX23.1) was isolated from a Coix genomic À-dash library. The library was screened using a y-coixin cDNA clone as probe. In order to elucidate the transcriptional regulation of the y-prolamin genes, the y-coixin promoter sequence was aligned with the promoter. sequences of the maize and sorghum y-prolamins genes. Several conserved motifs were found in the upstream region of these genes. Some of these motifs resembles cis-acting elements. such as the cereal prolamin box and the binding sites for yeast GCN4 and animal C/EBP transcriptional factors. Transient expression assays demonstrated the ability of the y-coixin promoter to drive the expression of the ß-glucuronidase reporter gene in immature maize endosperm. Deletion analysis of the promoter sequence suggested that several elements might be involved in its regulation. At least three distinct segments of the y-coixin promoter bind specifically to nuclear factors, as demonstrated by means of gel retardation assay / Mestrado / Genetica de Plantas / Mestre em Ciências

Orientador: Sergio Roberto Peres Line / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-13T02:01:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_CarolinaVieirade_M.pdf: 673929 bytes, checksum: de7a7d8f324324fae24215bb7eb7ed66 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O gene PAX9 pertence a uma família de fatores de transcrição denominada família Pax. Esse gene é expresso em tecidos embrionários como somitos, bolsa endodérmica da faringe, brotos distais dos membros e mesênquima derivado da crista neural. Alguns polimorfismos na região promotora desse gene em humanos vêm sendo associados a formas de agenesias não-sindrômicas autossômicas dominantes. No presente trabalho, nós verificamos a expressão gênica e a influência de duas seqüências da região promotora na transcrição do gene PAX9 em ensaios in vitro com células de tecido embrionário de ratos de 13.5 dias obtidas a partir de seus membros, face e regiões do mesencéfalo e romboencéfalo. Os fragmentos da região promotora foram clonados em plasmídios repórteres e transfectados nos três diferentes tecidos embrionários. Nossos resultados das análises de RT-PCR demonstraram que em culturas in vitro, as células dos membros e do SNC expressam o gene PAX9, porém, aquelas obtidas a partir da face não o expressaram. Além disso, os resultados dos ensaios de luciferase mostraram que a atividade dessa nos vetores construídos são mais fracas do que do vetor pGL3-Basic sozinho, sugerindo que essas regiões não são suficientes para guiar a transcrição gênica. / Abstract: PAX9 belongs to a transcriptional factor genes family named Pax. This gene is expressed in embryonic tissues like somites, pharyngeal pouch endoderm, distal limb buds and neural crest-derived mesenchyme. Some polymorphisms in the upstream promoter region of the human PAX9 have been associated with human non-syndromic forms of autossomal dominant agenesis. In the present study we verified the in vitro expression of this gene and the influence of two promoter sequences in the transcription of PAX9 gene, in embryo tissues obtained from digits, face and midbrain and hindbrain regions. These fragments were cloned on reporter plasmid and were transfected into the different cells cultures. Our RT-PCR results showed that in vitro E13.5 limb bud and CNS cells express PAX9, but not in derived facial region cells. Moreover, the luciferase activity of the Pax9 promoter vectors were weaker than pGL3-Basic alone, suggesting that the PAX9 sequences of promoter region are not sufficient to drive PAX9 gene transcription. / Mestrado / Histologia e Embriologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Anderson Ferreira da Cunha / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T01:17:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Missawa_SilviaKazue_D.pdf: 3036073 bytes, checksum: d9aad0052b5f34581b2bf95098a6d911 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A crescente necessidade da substituição de fontes de energia derivadas do petróleo por fontes renováveis de energia impulsionou pesquisas em todo o mundo. O etanol se enquadra fortemente como candidato para substituir combustíveis como, por exemplo, a gasolina. A produção de etanol brasileiro ocorre pela fermentação de açucares proveniente do caldo de cana, realizada por leveduras, fundamentalmente da espécie Saccharomyces cerevisiae. No processo fermentativo para a produção de etanol combustível no Brasil, a separação das leveduras após o esgotamento do açúcar é realizado por centrífugas de alta capacidade, o que torna o sistema complexo e dispendioso. Neste trabalho, linhagens de leveduras de laboratório e industriais foram transformadas por engenharia genética de modo que as leveduras reconhecessem o esgotamento da glicose do meio separando-se naturalmente e rapidamente. Para isso, plasmídeos e posteriormente, cassetes integrativos, foram construídos utilizando-se promotores, sensíveis a presença de glicose no meio, regulando a expressão de genes da floculação. Estes promovem a formação de agregados celulares que se separam do meio por decantação. Além disso, está relatado na literatura que mutantes respiratórios produzem uma maior quantidade de etanol. Então foi feita a deleção, em leveduras industriais, do gene PET191, cujo produto participa na montagem do citocromo c, que por sua vez é essencial para o funcionamento da cadeia respiratória nestes microorganismos. As leveduras deletadas apresentaram um aumento no rendimento da produção de etanol; na linhagem industrial JAY292, esse aumento foi de 4%. Isto pode refletir ao final de um ano, um aumento de 980 milhões de litros. Os resultados obtidos contribuem para o desenvolvimento tecnológico e industrial desta área estratégica para o país / Abstract: The increased need for replacing energy sources from fossil oil to renewable sources has prompted research initiatives throughout the world. Bioethanol is a highly competitive candidate to replace fuels such as gasoline. The production of Brazilian ethanol occurs by the fermentation of sugars from sugar cane juice by the yeast Saccharomyces cerevisiae. The industrial fermentation process used to produce ethanol fuel in Brazil includes a separation step by high-capacity centrifugation of the yeast cells after the exhaustion of the sugar, which makes the system complex and costly. In this work, laboratory and industrial yeast strains were transformed by genetic engineering techniques so that they are able to recognize the depletion of glucose from the medium and quickly separate by sedimentation, without the need of centrifugation. In order to reach this goal, plasmids and integrative cassettes were constructed using promoters sensitive to the presence of glucose in the environment regulating the expression of the genes that control flocculation. This genetic device promotes the formation of cellular aggregates that are separated from the medium by sedimentation only when glucose is depleted. Furthermore, it is reported in the literature that respiratory mutants produce a higher quantity of ethanol. Consequently, the PET191 gene was deleted in an industrial yeast strain; the gene product pet191 participates in the assembly of cytochome c, which is an essential component of the respiratory chain in these microorganisms. The deleted industrial strain JAY292 showed an increased production of ethanol by 4%. This percentage can be translated in an increase of more than 980 million liters of ethanol produced per year. These results are of great technological and industrial importance, and may contribute to the development of this strategic area for the country / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A cachaça é uma bebida típica brasileira produzida a partir da destilação do caldo de canade- açúcar fermentado principalmente por Saccharomyces cerevisiae. Grande parte da produção nacional é artesanal, e não há uma preocupação por parte dos produtores quanto ao controle microbiológico da fermentação. Este trabalho objetivou caracterizar a comunidade bacteriana contaminante do fermento utilizado na produção de cachaça. Foram coletadas quatro amostras em um alambique artesanal. A primeira (NA) foi coletada um ano anterior às outras três e utilizada como controle. As restantes foram coletadas ao final do primeiro dia de fermentação (NP), após quinze (NS) e trinta dias (NT) utilizando o mesmo fermento. Um total de 587 seqüências de 16S rDNA foram analisadas, sendo 81 da amostra NA, 177 da amostra NP, 159 da amostra NS e 170 da amostra NT. As análises das seqüências revelaram a presença de 17 gêneros e 27 espécies, além de 27 bactérias não conhecidas. Cento e setenta unidades taxonômicas operacionais (UTOs) foram identificadas utilizando o software DOTUR com uma distância evolucionária de 0.03. Quarenta e três UTOs foram identificadas na amostra controle (NA), 38 na NP, 57 na amostra NS e 38 na terceira amostra (NT). Das 170 UTOs identificadas, apenas dezessete foram identificadas duas vezes em diferentes amostras e somente uma, identificada como Lactobacillus hilgardii, foi identificada três vezes, evidenciando uma grande dinâmica populacional bacteriana durante o processo fermentativo. Análises estatísticas utilizando o software S-LIBSHUFF indicaram diferenças significativas na composição bacteriana entre amostras. Foram encontradas espécies/gêneros ainda não descritas na literatura em fermentos de cachaça, como Weissella cibaria, Leuconostoc citreum e algumas espécies de Lactobacillus. Além destas, várias bactérias não conhecidas também foram identificadas. Os resultados revelaram que a comunidade de bactérias contaminantes do processo fermentativo é muito mais complexa do que se conhecia, com características heterofermentativas e produção de congêneres que provavelmente refletem na qualidade da bebida. Este é o primeiro relato da utilização do método de seqüenciamento do gene 16S rDNA para determinar contaminantes bacterianos em fermentados de cana-de-açúcar para produção de cachaça. / Cachaça is a typical Brazilian spirit made from sugar cane fermented mainly by Saccharomyces cerevisiae. The production is mostly artisanal, and there is no microbiological control during the fermentation process. The objective of this study was to assess the bacterial community associated with the ferment used in the production of cachaça. Four ferment samples were collected from an artisanal still. The first one (NA), was collected one year previously to the other three and constituted a control reference. The remaining three samples were collected at the end of the first day of fermentation (NP), and fifteen (NS) and thirty days (NT) after using this same ferment. A total of 587 16S rDNA sequences were analyzed, being 81 sequences from the NA sample, 177 from NP, 159 from NS, and 170 from the NT sample. Sequence analyses revealed the presence of 17 genus and 27 species plus 27 unknown species. One hundred and seventy operational taxonomic units (OTUs) were identified using the DOTUR software using a cut-off evolutionary distance of 0.03. Forty three were identified in the control (NA) sample, 38 in the NP, 57 in NS, and 38 in the third (NT) sample. Of the 170 OTUs, only seventeen were detected twice in different samples and only one, identified as Lactobacillus hilgardii, was identified thrice, indicating a dynamic nature of the bacterial community during the fermentation process. Statistical analysis using the software S-LIBSHUFF indicated significant differences in the bacterial composition among samples. Our analyses also allowed to identify several bacteria not yet described as contaminants of the cachaça ferment, such as Weissella cibaria, Leuconostoc citreum and some Lactobacillus species. In addition, several unknown bacteria were also detected. The results revealed a much larger bacterial contaminant community present in the fermentative process of cachaça than previously reported with heterofermentative ability to produce secondary compounds which probably influence the quality of the final beverage. This is the first report on the utilization of the 16S rDNA sequencing method to assess the bacterial diversity of sugar cane fermentation for the production of cachaça.

A pesquisa de linhagens com duplicação cromossômica, como a linhagem A de Aspergillus nidulans, teve oseu início no final da década de 1970. Durante este período foram isolados da linhagem A, diversos variantes deteriorados, que foram caracterizados genética e citologicamente. Neste trabalho de pesquisa, as analises genéticas demonstraram que os determinantes de deterioração ou segmentos de inserção de V5, V101, V102, V103 e V104 estão localizados nos grupos de ligação VIII, III, IV, VII e I respectivamente. As análises citogenéticas revelaram diversas alterações no ciclo celular e migração nucleares nas fases iniciais de desenvolvimento. A duplicação cromossômica da linhagem A e os variantes deteriorados foram investigados a nível molecular, por técnica de PCR. Os resultados mostraram que o segmento de inserção consiste de um provável Elemento de Transposição, denominado de MATE, o qual é característico do fungo Aspergillus nidulans. Os segmentos de inserção analisados apresentam características típicas de MATE, como o motivo “Spe” que é encontrado por toda seqüência dos Elementos MATE. / The research with chromosome duplication strains, as strain A of Aspergillus nidulans, began during the 70's, with isolation of several deteriorates variants of strain A and characterization by genetic and cytological analysis. In this work the genetic analysis has demonstrated that the deterioration determinant or insertion sequence in V5, V101, V102, V103 and V104 deteriorates variants are located in the linkages groups VIII, III, IV, VII and I, respectively. The cytological analyses have demonstrated changes in cellular cycle and nuclear migration in initial phases of development. The chromosome duplication of strain A and the deteriorated variants were investigated by PCR with designed primers to mobile elements, what have resulted in the identification of the transposable element MATE, mainly by great similarity with "Spe" motif sequence that is described as essential in activity of these elements.

Wolbachia pipientis é uma alfa-protobactéria intracelular obrigatória, endossimbionte de artrópodes e nematódeos que é herdada por via materna ao longo das gerações. A presença desta bactéria nos tecidos germinativos pode provocar nos hospedeiros alterações fenotípicas reprodutivas, como partenogênese, feminização genética de machos, morte de machos, incompatibilidade citoplasmática (IC) e alterações de fitness. Alguns mecanismos moleculares dessas alterações baseiam-se na modulação da expressão gênica do hospedeiro, ou seja, a bactéria pode suprimir ou estimular genes de forma a produzir ambiência favorável à manutenção da endossimbiose. Devido a esse potencial manipulador, Wolbachia tem sido testada como \"ferramenta\" para controle populacional de insetos vetores de patógenos. O mosquito Culex quinquefasciatus, naturalmente infectado por Wolbachia na região Neotropical, é um importante vetor de diversos patógenos que atingem humanos e animais. A presença da bactéria causa IC e altera o fitness no mosquito, mediante alterações temporais na ovogênese, fecundidade e fertilidade reprodutivas. Sabe-se que a presença da Wolbachia altera a expressão do gene grauzone e há fortes indícios de que esta expressão diferencial induza à IC em Cx. quinquefasciatus. Sabe-se também que este gene possui duas cópias parálogas em Cx. quinquefasciatus, porém estudos observaram a relevância de apenas um parálogo como importante regulador dos ciclos celulares da ovogênese e espermatogênese. No entanto, as bases genéticas dos fenótipos IC e \"fitness alterado\" do modelo Wolbachia-Cx. quinquefasciatus Neotropical ainda permanecem desconhecidas. Objetivamos inicialmente neste modelo quantificar e silenciar a expressão do gene grauzone (ambos parálogos) para suportar a hipótese pré-existente de que a superexpressão deste gene em mosquitos infectados por Wolbachia causa as alterações fenotípicas reprodutivas. Durante o desenvolvimento do projeto houve intercorrências que alteraram o rumo do trabalho: a necessidade de substituição da colônia experimental de mosquitos devido a baixas demográficas e à alta variabilidade intraespecífica do gene grauzone. Frente às intercorrências, formulamos como neo-objetivo a comparação filogenética entre as variantes do gene grauzone. Detectamos também variabilidade em um dos parálogos e concluímos que as cópias parálogas do gene encerram proteínas estruturalmente distintas e talvez funcionalmente distintas no tocante à alteração reprodutiva (IC) causada pela presença da Wolbachia. Foi possível observar que fêmeas infectadas apresentam amplificações de grauzone mais intensas quando comparadas com fêmeas não-infectadas no 4° dia de emergência, corroborando dados da literatura. Em conjunto, esses achados indicam que é promissora a continuidade do estudo do papel de grauzone na IC, mas demonstra também que este gene é mais complexo do que se imaginava, o que demandará maior esforço investigativo. A expectativa de uso futuro de Wolbachia como controlador biológico de mosquitos-vetores poderá se beneficiar de estudos como aqui proposto. / Wolbachia pipientis is an obligate intracellular alpha-protobacterium, endosymbiont of arthropods and nematodes, which is inherited through maternal route over generations. The presence of this bacterium in germinative tissues can cause reproductive phenotypic alterations in the hosts, such as parthenogenesis, genetic feminization of males, death of males, cytoplasmic incompatibility (CI) and fitness changes. Some molecular mechanisms of these alterations are based on the modulation of gene expression of the host, that is, the bacterium can suppress or stimulate genes in order to produce favorable environment for the maintenance of the endosymbiosis. Due to this potential manipulator, Wolbachia has been tested as a \"tool\" for population control of pathogen vector insects. The mosquito Culex quinquefasciatus, naturally infected by Wolbachia in the Neotropical region, is an important vector of several pathogens that affect humans and animals. The presence of the bacteria causes CI and changes the fitness in the mosquito, through temporal changes in ovogenesis, reproductive fertility and fertility. The presence of Wolbachia is known to alter the expression of the grauzone gene and there are strong indications that this differential expression induces the CI in Cx. quinquefasciatus. It is known that this gene occurs with two paralogs copies in Cx. quinquefasciatus, but studies have observed the relevance of only one paralog as important regulator of oogenesis and spermatogenesis cell cycles. However, the genetic basis of the phenotypes \"changed fitness\" and CI of Wolbachia-Cx quinquefasciatus Neotropical model remain unknown. We initially aimed at quantifying and knockdown of grauzone gene (both paralogs) to support the preexisting hypothesis that overexpression of this gene in Wolbachia-infected mosquitoes causes reproductive phenotypic changes. During the development of the project there were intercurrences that altered the course of work: the need to replace mosquito populations due to demographic lows and the high intraspecific variability of grauzone gene. In view of the intercurrences we formulated the neo-objective phylogenetic comparison between the variants of the grauzone gene. We also detected variability in one of the paralogs and concluded that the paralogs copies of the gene contain structurally distinct and perhaps functionally distinct proteins with respect to the reproductive alteration (CI) caused by the presence of Wolbachia. It was possible to observe that infected females show more intense grauzone amplifications when compared to uninfected females on the 4th day of emergence, corroborating data from the literature. Taken together, these findings indicate that the continuity of the study of the role of grauzone in CI is promising, but also demonstrates that this gene is more complex than previously thought, which will require more investigative effort. The expectation of future use of Wolbachia as a biological control of mosquito-vectors may benefit from studies as proposed here.

Orientadores: Maria de Fatima Sonati, Munir Salomão Skaf / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T12:16:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jorge_SusanElisabethDominguesCosta_M.pdf: 12500595 bytes, checksum: 271d153e901aa04d248746dbcf6d90c6 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A hemoglobina (Hb), pigmento respiratório de todos os organismos vertebrados, encontra-se em elevadas concentrações nas hemácias e é responsável pelo transporte de O2 dos pulmões para os tecidos. A Hemoglobina humana constitui-se de dois pares de cadeias polipeptídicas (globinas), cada qual envolvendo um grupo prostético heme, que se liga reversivelmente ao O2. Mais de 1000 variantes estruturais da Hb humana já foram descritas, parte delas relacionada a manifestações clinicas importantes. Algumas variantes apresentam alteração funcional, que se traduz em afinidade modificada pelo O2. Quando elevada, há uma produção compensatoriamente maior de hemácias, levando a policitemia; quando diminuída, resulta em cianose. O Laboratório de Hemoglobinopatias do Departamento de Patologia Clinica da FCM/UNICAMP e um dos laboratórios de referencia no pais, tendo identificado, ate o momento, 12 hemoglobinas novas e 51 variantes raras. Destas, as variantes novas Hb Hb Boa Esperanca (?16 Lys?Thr), Hb Itapira (?30 Glu?Val), Hb Bom Jesus da Lapa (?30 Glu?Ala), Hb Olinda [ß22 (b4) -25 (b7)], Hb Caruaru (ß 122 Phe?Ser) e Hb S-Sao Paulo (ß6 Glu?Val ; ß65 Lys?Glu) foram aqui caracterizadas funcionalmente, assim como as variantes raras Hb Iwata (a87 His??Arg), Hb Sunshine Seth (?94 Asp?His), Hb Deer Lodge (ß2 His?Arg), Hb Deer Lodge (ß2 His??Arg) + Hb S (ß6 Glu??Val), Hb G-Siriraj (ß7 Glu??Lys), Hb G-Siriraj (ß7 Glu??Lys) e Hb C (ß6 Glu??Lys) em associacao, Hb M-Saskatoon (ß63 His??Tyr), Hb Redondo (ß92 His? Asn), Hb Koln (ß98 Val??Met), Hb Coimbra (ß99 Asp??Glu) e Hb Dhonburi (ß126 Val?Gli)+ Btal. O metodo analitico empregado foi descrito por Rossi-Fanelli & Antonini (1958), e analisa espectrofotometricamente o comportamento da Hb frente a conhecidas pressões parciais de oxigênio (pO2), possibilitando a medida de afinidade (p50), da constante de Hill (n), que verifica o fenômeno de cooperatividade entre as cadeias globinicas para ligação do O2, o efeito Bohr (que indica facilidade na ligação Hb-O2 conforme e elevado o pH do meio), bem como a interação com o Inositol Hexafosfato (IHP), um fosfato polianion que dificulta a ligação entre a Hb e o O2. A exceção das Hbs Itapira e Bom Jesus da Lapa, em concentrações reduzidas nos hemolisados, todas as demais apresentam afinidade alterada pelo oxigênio. Como complementação ao estudo funcional, as Hbs Caruaru e São Paulo também foram submetidas a analise por dinâmica molecular, através dos programas VMD (Visual Molecular Dynamics), com dados inseridos nos softwares CHARMM (Chemistry at Harvard Molecular Mechanics) e NAMD (Nanoscale Molecular Dynamics). As demais variantes tiveram sua analise estrutural individualizada feita através da visualização de estruturas nativas depositadas no Protein Data Bank, para melhor compreensão da relação entre o aminoácido substituído e a função protéica alterada. Deste modo, foi possível estabelecer correlações entre a estrutura e a função e inferir sobre as manifestações clinicas resultantes da presença destas heme proteínas anômalas, ilustrando-se assim a importância desses estudos para a completa caracterização das variantes. / Abstract: The human hemoglobin (Hb) is the respiratory pigment of human organisms, found in high concentrations in the erythrocytes and is responsible for transporting O2 from the lungs to the peripheral tissues. This molecule is composed by two pairs of polypeptide chains (globin), each one involving a prosthetic group heme, which bind reversibly to the O2. More than 1000 structural variants had been described already; part of them related to important clinical manifestations. Some variants present functional alteration, with modified affinity for the O2. When it is increased, it has a higher compensatory production of the erythrocytes, causing policitemia; when decreased, it results on cyanosis. The Laboratory of Hemoglobinopaties of the Department of Clinical Pathology of the FCM/UNICAMP is one of the references laboratories in the country, and identified, until this moment, 12 new hemoglobins and 51 rare variants. The new variants Hb Hb Boa Esperanca (?16 Lys?Thr), Hb Itapira (?30 Glu?Val), Hb Bom Jesus da Lapa (?30 Glu?Ala), Hb Olinda [ß22 (b4) -25 (b7)], Hb Caruaru (ß 122 Phe?Ser) e Hb S-Sao Paulo (ß6 Glu?Val ; ß65 Lys?Glu) were, in the present study, functionally characterized, as well as the rare variants Hb Iwata (a87 His??Arg), Hb Sunshine Seth (?94 Asp?His), Hb Deer Lodge (ß2 His?Arg), Hb Deer Lodge (ß2 His??Arg) + Hb S (ß6 Glu??Val), Hb G-Siriraj (ß7 Glu??Lys), Hb G-Siriraj (ß7 Glu??Lys) e Hb C (ß6 Glu??Lys) em associacao, Hb M-Saskatoon (ß63 His??Tyr), Hb Redondo (ß92 His? Asn), Hb Koln (ß98 Val??Met), Hb Coimbra (ß99 Asp??Glu) e Hb Dhonburi (ß126 Val?Gli)+ Btal. The analytical method used was described for Rossi-Fanelli & Antonini (1958), which analyses, by spectrophotometer, the behavior of the Hb against known partial pressures of oxygen (pO2), making possible the measure of affinity (p50), the constant of Hill (n), that verifies the cooperativity, the Bohr effect (that it indicates the relation between Hb-O2 binding according to the pH), as well as the interaction with Inositol Hexaphosphoric acid (IHP), that difficult linkage between the Hb and the O2. Except from Hb Itapira and Hb Bom Jesus of the Lapa, in reduced concentrations at the total hemolysate, all the others presented modified affinity to the oxygen. As a complement of the functional study, the Hb Caruaru and Hb S-Sao Paulo were also submitted to previous molecular dynamics simulation. All the other variants were structurally analyzed by the study of the native structure deposited at the Protein Data Bank, to understand better the relation between the substituted residue and the modified one at the protein function. Therefore, it was possible to establish correlations between the structure and the function and to infer on the clinical manifestations because of the presence of these anomalous proteins, illustrating the importance of these studies for the complete characterization of the variants. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas