Orientador: Claudia Regina Bonini Domingos / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Nicola Amanda Conran Zorzetto / Resumo: A anemia falciforme (AF) é uma anemia hemolítica hereditária que acarreta ao portador manifestações clínicas complexas e diversificadas. Na AF o estresse oxidativo é um dos fatores que interferem no fenótipo do portador, uma vez que influencia nos processos de vaso-oclusão aumentando as propriedades adesivas dos eritrócitos, leucócitos e plaquetas ao endotélio. Durante a transformação do eritrócito discóide com hemoglobina (Hb) S em eritrócito afoiçado, dentre os eventos bioquímicos e polimerizantes da célula, ocorre a degradação oxidativa dessa Hb, com a liberação agentes pró-oxidantes. Estes promovem a oxidação de lipídeos e também de proteínas e DNA, modificando mecanismos celulares que levam a célula a apoptose e, consequentemente, causam danos aos tecidos. Neste contexto, os principais meios de defesa no organismo são divididos em dois grupos, enzimáticos e não enzimáticos. Entre as enzimas detoxificantes de fase II mais estudadas estão as GSTs, que pertencem a uma família multifuncional de enzimas que catalisam a conjugação da molécula de GSH e possuem papel fundamental em mecanismos de defesa contra compostos endo e xenobióticos. Considerando a grande incidência da AF em nosso país e as manifestações clínicas diferenciadas nos portadores, o presente trabalho pretendeu investigar os polimorfismos das GSTs (GSTM1, GSTT1 e GSTP1) e verificar sua influência sob parâmetros oxidativos - peroxidação lipídica por TBARS, e lesão de DNA pela avaliação de Corpos de Howell-Jolly e Ensaio Cometa em portadores da AF. Foram avaliadas amostras de 91 indivíduos com AF com e sem o uso de HU e 99 amostas de um grupo controle. Para o desenvolvimento do trabalho, as amostras foram separadas em três grupos: indivíduos portadores de anemia falciforme em uso de hidroxiureia (AF + HU: 46 indivíduos), indivíduos portadores de anemia falciforme sem uso de hidroxiureia (AF - HU: 45 indivíduos) e o grupo ... / Abstract: Sickle cell anemia (SCA) is an inherited hemolytic disease that leads complex and diverse clinical manifestations. In SCA, oxidative stress is one of the factors that affect the phenotype of the carrier, in response of its influences on vaso-occlusion processes that increases the adhesive properties of erythrocytes, leukocytes and platelets to the endothelium. During the transformation of discoid erythrocytes with hemoglobin (Hb) S into sickle cells, among the biochemical and polymerizing events, the oxidative degradation of this Hb occurs, releasing pro-oxidants agents. They promote oxidation of lipids and proteins and modify cellular mechanisms that lead to cell apoptosis and cause tissue damage. In this context, the main means of body defense are divided in two groups: enzymatic and non-enzymatic. Among the phase II detoxifying enzymes, the most studied are Glutathione S-transferases (GSTs), which belong to a family of multifunctional enzymes that catalyze the combination of the glutathione (GSH) molecule and have a central role in mechanisms of defense against xenobiotic compounds. Considering the high incidence of SCA in our country and the different clinical manifestations in patients, this study aimed to investigate polymorphisms of GSTs (GSTM1 , GSTT1 and GSTP1 ) and determine its influence on oxidative parameters - lipid peroxidation by TBARS and DNA damage by evaluation of Howell -Jolly bodies (HJB) and comet assay in patients with SCA. Samples of 91 patients with SCA with and without hydroxyurea (HU) use and 99 samples of a control group were evaluated. For the work development, the samples were separated into three groups: individuals with sickle cell anemia using hydroxyurea (SCA + HU: 46 individuals), individuals with sickle cell disease without use of hydroxyurea (SCA - HU: 45 individuals) and control group (CG: 99 individuals) to verify the influence of medication on the evaluated parameters. Only the genotypic profile ... / Mestre

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-05T17:54:52Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1102782 bytes, checksum: d5cebd4b1752bf958d0a60bb4034c1e3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T17:54:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1102782 bytes, checksum: d5cebd4b1752bf958d0a60bb4034c1e3 (MD5) Previous issue date: 2005-09-08 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A espécie Capsicum chinense Jacq. apresenta considerável importância na agricultura brasileira por empregar mão-de-obra familiar em pequenas propriedades. Seus frutos são muito utilizados como condimento, além de apresentarem propriedades farmacêuticas, como anestésicos e antiinflamatórios. O sucesso dos programas de melhoramento de plantas depende da variabilidade genética disponível, requisito básico que possibilita seleção de genótipos com características comerciais de interesse. O Banco de Germoplasma de Hortaliças da Universidade Federal de Viçosa possui cerca de cem acessos de C. chinense com grande potencial de utilização em programas de melhoramento. Entretanto, a falta de informações sobre as características agronômicas desses acessos impossibilita sua utilização em tais programas. Os objetivos deste trabalho foram caracterizar e estimar a diversidade genética em acessos de Capsicum chinense do Banco de Germoplasma de Hortaliças da Universidade Federal de Viçosa por meio da análise das características morfo-agronômicas e de DNA, utilizando marcadores moleculares RAPD. Foram avaliados quarenta e nove acessos de C. chinense quanto a características ligadas à qualidade dos frutos, características morfológicas da planta e padrão molecular. A diversidade genética foi mensurada através dos métodos de agrupamento de otimização de Tocher, bem como pelo método hierárquico UPGMA. Foi verificada a existência de variabilidade entre os acessos, cuja magnitude variou conforme a característica analisada. A concentração de capsaicina total foi responsável por 88,32% da variação total dos caracteres avaliados conforme o método de Sing, sendo, portanto, a característica que mais contribui para a discriminação da diversidade genética entre os acessos. Tendo como base a distância generalizada de Mahalanobis, os dados quantitativos formaram dez grupos, sendo os acessos BGH 1694-05 e BGH 1723-22 os menos divergentes. Os agrupamentos baseado nos dados de característica morfológica de planta formaram nove grupos, sendo os acessos BGH6371-93 e BGH 6371-94 os mais similares. O índice de dissimilaridade de Nei & Li agrupou os dados moleculares em 8 grupos, sendo os acessos BGH1714-09 e BGH 6387-100 os mais divergentes. Quando analisados os dados em conjunto, os acessos BGH 8344-86 e BGH6371-94 foram os que apresentaram maior divergência entre si. Os acessos foram mais bem discriminados pelos caracteres relacionados à qualidade dos frutos. Portanto, os acessos BGH 4733-56 e BGH 6771-93 foram os que possuíam melhores características para consumo seco e in natura, respectivamente. / The species Capsicum chinense Jacp. Presents large importance in Brazilian agriculture, because uses the family working labor in small farms. The fruits are used as condiments, for pharmaceutical purposes as anesthetic and anti-inflammatory. The success of a breeding program depends on genetic variability, which allows the selection of genotypes with commercial characteristics. The germoplasm bank of vegetable (BGH) from the Universidade Federal de Viçosa has close to 100 accesses of C. chinense with potential for utilization in breeding programs. However, the lack of information about the agronomic characteristics of the accesses diminishes the effectiveness of any breeding program. The goal of this was to characterize and evaluate the genetic diversity in the accesses of the BGH using agronomic traits and DNA analysis with RAPD markers. It was studied 49 accesses evaluating the fruit quality, morphological characteristics of the plants and molecular pattern. The genetic diversity was measured by the Tocher optimizing group and by UPGMA inheritance method. It was observed the existence of variability among the accesses, and magnitude varied with the analyzed characteristic. The concentration of capsaicin was responsible for 88.32% of the total variability among the characters evaluated by the Sing method, being the trait that most contributed for the genetic discrimination among the accesses. The Mahalanobis distance method established ten groups for the accesses, being the accesses BGH 1694-05 and BGH 1723-22 the less divergent. The grouping based in morphological characteristics established nine groups, being the accesses BGH 6371-93 and BGH 6371-94 the most similar. The index of dissimilarity by Ney & Li grouped the molecular data in eight groups, being the accesses BGH 1714-09 and BGH 6387-100 the most ixdivergent. When analyzed together, the accesses BGH 8344-86 and BGH 6371-94 were the most divergent between them. The accesses were more discriminated based on the fruits characteristics. Thus, the accesses BGH 4733-56 and BGH 6771-93 had the best characteristics for dry product and in natura consumption, respectively,

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-10-18T15:38:40Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 16418727 bytes, checksum: 1e4d06e6842f6d8fd2819d47448b314d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-18T15:38:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 16418727 bytes, checksum: 1e4d06e6842f6d8fd2819d47448b314d (MD5) Previous issue date: 1999-10-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Durante a construção de um mapa de RFLP de soja, na DuPont (EUA), as sondas analisadas foram, em sua maioria, monomórflcas, porém algumas se mostraram altamente polimórticas (A1-10, A2-08, A45-10, ASS-09 e A75-10). A fim de melhor caracterizar esse padrão hipervariável, essas sondas foram seqúenciadas. Duas delas (Al-10 e A2-08) não apresentaram similaridade relevante com nenhuma sequência do “GenBank”; entretanto, uma característica marcante dessas sondas foi a sua riqueza em sequências A:T. As outras três sondas continham sequências homólogas a genes que codificam proteínas de resistência a doenças. Devido ao padrão de hibridização extremamente polimorflco revelado pela sonda A45-10, foram desenhados “primers” flanqueando essa sonda para amplincar regiões homólogas em diversos genótipos de soja, para que esse perfil de amplificação pudesse ser utilizado como “tingerprint”. Os produtos de amplificação obtidos, na faixa de 1,5 a 2,0 kb, foram capazes de identificar os diferentes genótipos analisados. A partir de uma biblioteca genômica da variedade de soja FT-Cristalina, foram isolados quatro clones, usando-se a sonda ASB-09. Um deles, o clone CR44, continha um inserto de aproximadamente 16 kb. Dois fragmentos de EcoRl e Pstl do clone CR44, que hibridizaram com a sonda A53-09, foram subclonados e seqúenciados. Esses dois fragmentos formaram um contíguo, denominado GR, de 4.198 pb. A comparação da sequência de aminoácidos predita com outras existentes no “GenBank” indicou uma homologia entre GR e a proteína “Cf-2.1-Iike” de Arabidopsis tha/iana, proteína de resistência a doenças homóloga à Cf-2/Cf-5 de Hordeum vulgare e outras proteínas de resistência de Lycopersicon. Além disso, foi identificada uma ORF de 789 nucleotídios, que codiôca uma proteína de 262 aminoácidos com domínios LRRs, uma das características estruturais da maioria das proteínas de resistência. Um RT-PCR foi feito para detectar transcritos homólogos a A53-09, A75-1O e A45-10, usando-se “primers” que flanqueavam a região de maior similaridade com genes de resistência. Em amostras de RNA extraídas de folhas, raízes e haste foi detectada a presença de transcritos, usando-se os “primers” derivados de ASB-09, o que indicou que A53-09 não é expresso de modo órgão-específico. Os produtos de amplificação presentes nos três órgãos foram seqúenciados e alinhados perfeitamente com a ORF de 789 nucleotídios. Para A75-10, foi detectada a presença de várias bandas, nos três órgãos examinados, indicando que, possivelmente, os “primers” estariam pareando com mais de um transcrito. Para A45-10, não foi detectada a presença de nenhum transcrito nos três órgãos analisados. / During the construction of one soybean RFLP map at DuPont (USA), the majority of the probes analyzed were monomorphic, however, a few of them were highly polymorphic (A1-10, A2-08, A45-10, ASB-09, and A75-10). To better understand the hypervariable pattern revealed by these probes, they were sequenced. Two of them (A1-1O and A2-08) did not present any similarities with sequences deposited in the GenBank. Their main feature was that they were highly A:T rich. The other three probes contained sequences homologous to known disease resistance genes in plants. Due to the hypervariable pattern revealed by probe A45-10, primers flanking this probe were designed and used to amplify the corresponding region in several soybean genotypes. The amplification products, in the range of 1.5 to 2 kb, allowed the identification of each of the different genotypes analyzed. Probe ASB-09 was used to screen a genomic library prepared with DNA from cultivar FT-Cristalina. Four clones were isolated. One of them, clone CR44 of approximately 16 kb, was further analyzed. Restriction of this clone with EcoRl and Pstl revealed two bands hybrizing with probe A53-09. These were subcloned and sequenced. The two fragments partially overlapped and formed a config of 4,198 bp designated GR. Blast analyses of GR with sequences deposited in the GenBank showed that it potentially encode a protein homologous to “Cf-2.1-Iike” protein of Arabidopsis tha/iana, to disease resistance protein homologous to Cf-2le-5 of Hordeum vulgare and to disease resistance proteins of Lycopersicon. An open-reading frame of 789 nucleotídes was identified in GR. It potentially encode a sequence of 262 amino acid residues with LRR motifs, a structural characteristic of most disease resistance proteins described so far. RT-PCR was performed with primers flanking the regions homologous to disease resistance genes present in probes ASB-09, A75-10, and A45-10. RNA samples extracted from leaves, roots, and stems contained transcripts which were amplitied with primers derived from probe ASB-09, indicating that expression of ASB-09 is not organ-specific. The amplification products from the three organs were sequenced and presented perfect homology with part of the 789 bp ORF present in A53-09. The primers derived from A75-10 amplifled several bands with different sizes in the three organs analyzed indicating that more than one transcript homologous to A75-10 was present in the different organs. The primers derived from A45-1O did not detect any transcripts in the organs analyzed. / CPF do autor não encontrado

Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-12-01T14:42:08Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3030242 bytes, checksum: d145bff94d511f6d8353fbb00470328b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-01T14:42:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3030242 bytes, checksum: d145bff94d511f6d8353fbb00470328b (MD5) Previous issue date: 2015-05-08 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O silenciamento de RNA pode ser induzido em plantas como resultado da infecção por vírus, um processo denominado “silenciamento gênico induzido por vírus” (virus induced gene silencing) – VIGS. Vetores VIGS permitem de uma forma rápida e eficiente a análise funcional de genes de soja por genética reversa. A construção de um vetor de silenciamento viral para inativação de genes de soja foi baseado na modificação do genoma do DNA-A de SoCSV (Soybean chlorotic spot virus) de forma a deletar o gene da proteína do capsídeo, e incorporar sítios de enzimas de clonagem chaves que permitam a inserção de sequências para silenciamento específico de genes alvos. O vetor de silenciamento derivado do genoma de SoCSV poderá ser usado para permitir o entendimento entre as possíveis comunicações cruzadas entre a via UPR e a via de morte celular mediada por NRPs (DCD/NRP), já que a falta de conhecimento com relação aos transdutores de sinais da referida via UPR em soja tem limitado seu estudo. A via UPR (Unfolded Protein Response) é desencadeada pelo acúmulo de proteínas mal dobradas e, por sua vez, é induzida para garantir o dobramento adequado das proteínas atenuando o estresse no RE. Nos mamíferos, a via UPR muito bem caracterizada é regulada pelo chaperone molecular, BiP, e ativada por três receptores: PERK, IRE1 e ATF6. A caracterização da via UPR em Arabidopsis foi baseada em mamífero e é ativada por duas classes de receptores transmembranas do RE: bZIP28 e bZIP17 (homólogos de ATF6) e IRE homólogos, IRE1a e IRE1b. Apesar da importância do RE como uma organela chave envolvida em respostas adaptativas a estresse, a resposta ao estresse RE não tem sido caracterizada no genoma da soja. Portanto, por análise in silico, em comparação com Arabidopsis, e estudos funcionais foi gerado um painel com um completo cenário de resposta ao estresse no RE em soja. No genoma da soja foram também identificados fatores de transcrição induzidos por estresse no RE, um associado à membrana, ortólogo de AtNAC062 e um fator de transcrição ortólogo de AtNAC103. Além de genes envolvidos na via UPR, foi identificado um fator de transcrição associado à membrana do RE, ortólogo de AtNAC89, que contém um domínio NAC e up-regula vii genes associados a morte celular. Em soja foi demonstrado que o sinal de estresse no RE e estresse osmótico integra com outras repostas adaptativas, como a via de sinalização de morte celular programada mediada por DCD/NPRs, específica de planta e iniciada por GmERD15 que ativa o promotor alvo NRP. A expressão aumentada de NRP leva à indução de GmNAC81 e GmNAC30 que cooperam para ativação da expressão do gene VPE (vacuolar processing enzyme), que, por sua vez, executa o processo de morte celular programada. Ao contrário, por análise in silico mostramos que esta via de morte celular mediada por DCD/NRP também é conservada em Arabidopsis, com exceção para GmERD15, que aparententemente não possui ortólogo em Arabidopsis. Em nossa pesquisa fornecemos evidências que as respostas de estresse no RE funcionam de forma semelhante. Primeiramente uma alta conservação de estruturas primárias de soja com preditos ortólogos de Arabidopsis possuem domínios de localização e funcional comuns que podem ser associados com atividade bioquímica correta e localização subcelular. Em segundo, os dois ramos da UPR em soja foram analisados funcionalmente. Ortólogos bZIP17/28 (GmbZIP37 e GmbZIP38) e ortólogo ZIP60 (GmbZIP68) de soja possuem organização estrutural similar e assim como em Arabidopsis são induzidos por estresse no RE e o putativo substrato de GmIREs, transcrito GmbZIP68, possui sítio canônico para atividade endonuclease de IRE1 e sofre splicing sob condições de estresse no RE. A expressão de bZIP38, bZIP37 e bZIP68 suporta que a via UPR em plantas é funcionalmente conservada em soja. O amplo painel compreensivo de resposta a estresse do RE em soja gerado permite predições funcionais da sinalização de componentes de estresse no RE. Portanto, o vetor VIGS desenvolvido possibilitará um avanço na caracterização funcional dos componentes da via e possibilidade de conecções com respostas a múltiplos estresses em plantas. / The RNA silencing can be induced in plants as a result of virus infection, this process is called virus induced gene silencing – VIGS. VIGS vectors allow a fast and efficient functional analysis of soybean genes by reverse genetics. The construction of a VIGS vector for the soybean genes inactivation was based in the modification of the DNA-A of SoCSV (Soybean chlorotic spot virus) genome aiming to delete the protein gene of the capsid, and to incorporate enzyme sites of cloning keys that allow the insertion of sequences to the silencing of specific target genes. The silencing vector derived from the SoCSV genome can be used to enable a better understanding between the possible cross-communication between the UPR pathway and the pathway of cell death mediated by NRPs (DCD/NRP), since the lack of knowledge about transducers signals of the UPR via has limited its study. The UPR (Unfolded Protein Response) is triggers by the accumulation of unfolded proteins, and it is induced to guarantee the proper protein folding attenuating the stress on ER (endoplasmic reticulum). In mammals, a very well characterized UPR pathway is regulated by the molecular chaperone BiP, and it is activated by three receptors: PERK, IRE1 e ATF6. The UPR pathway characterization in Arabidopsis was based on mammals and it is activated by two classes of transmembrane receptors of ER: bZIP28 e bZIP17 (homologs of ATF6) and IRE homologs, IRE1a and IRE1b. Despite the importance of the RE as a key organelle involved in adaptative responses to stress, the ER stress response has not been characterized in the soybean genome. Therefore, by in silico analysis, in comparison with Arabidopsis and functional studies, a panel was created with a complete scenario of ER stress response in soybean. In the soybean genome were also identified transcription factors induced by stress in the ER, one of them associated to the membrane, orthologs of AtNAC062, and a transcription factor ortholog of AtNAC103. Besides the genes involved on the UPR pathway, a transcription factor associated with the ER membrane, orthologs of AtNAC89, that contains a NAC domain and up regulates genes associated to the cell death was identified. In soybean, it was demonstrated that the ER stress and osmotic ix stress-signal integrates with other adaptive responses, as the plant-specific cell death signaling pathways mediated by DCD/NPRs and initiated by GmERD15, that activates the target promoter NPR. The increased expression of NPR leads to the induction of GmNAC81 and GmNAC30 that cooperate to the activation of the expression of the VPE gene (vacuolar processing enzyme), that executes the process of programmed cell death. In a reverse approach, by in silico analysis we also examined the Arabidopsis genome for components of a previously characterized ER stress-induced cell death signaling response in soybean. With the exception of GmERD15, which apparently does not possess an Arabidopsis ortholog, the Arabidopsis genome harbors conserved GmNRP, GmNAC81, GmNAC30 and GmVPE sequences that share significant structural and sequence similarities with their soybean counterparts. In our research we showed evidences that the stress response in the ER operates in a similar fashion in both soybean and Arabidopsis. Firstly, a high conservation of primary structures of soybean with predicted Arabidopsis orthologs have functional common domains that can be associated to the biochemistral activity and subcellular localization. Secondly, both branches of UPR in soybean were analysed functionally. The bZIP17/bZI28 orthologs (GmbZIP37 and GmbZIP38) and ZIP60 ortholog (GmbZIP68) from soybean have a similar structural organization and as in Arabidopsis they are induced by stress in ER and the putative substrate of GmIREs, transcript GmbZIP68, have canonical site to endonuclease activity of IRE1 and undergoes alternatively spliced under stress conditions in ER. The expression of bZIP38, bZIP37 and bZIP68 supports that the UPR pathway in plants is functionally conserved in soybean. Our in silico analyses, along with functional data, have generated a comprehensive overview of the ER stress response in soybean as a framework for functional prediction of ER stress signaling components. Therefore, the development of VIGS vector enables an advance in the functional characterization of the pathway components and the possible connections with multiple stress responses in plants.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-27Bitstream added on 2014-06-13T19:12:48Z : No. of bitstreams: 1 stafuzza_nb_me_sjrp.pdf: 331396 bytes, checksum: 62bedf496f7c8ad27e32a8ea0d781c57 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Nesse trabalho apresentamos o primeiro mapa comparativo do cromossomo 6 do búfalo de rio (BBU6), desenvolvido a partir da utilização de um painel de células somáticas híbridas irradiadas búfalo-roedor com fragmentação de 5000 rads. O mapa preliminar construído é composto por 33 marcadores, os quais estão ordenados em dois grupos de ligação compostos por 12 microssatélites, 19 genes codificantes e duas ESTs. A freqüência de retenção observada entre os marcadores variou de 14.4% a 40%. A ordem dos marcadores dentro dos grupos de ligação do BBU6, em sua maioria, é consistente com o mapa RH bovino. Esse mapa preliminar do BBU6 é um ponto de partida para comparar a ordem dos genes entre as espécies, fornecendo uma oportunidade para estudar micro-arranjos nesse cromossomo, além de possibilitar a clonagem posicional em búfalo de rio. / We present the first radiation hybrid map of BBU6 developed from a recently constructed river buffalo whole-genome radiation hybrid panel (BBURH5000). The preliminary map contains 33 cattle-derived markers, including 12 microsatellites, 19 coding genes and two ESTs, distributed in two linkage groups. The retention frequency of individual markers ranged from 14.4% to 40.0%. Most of the marker order within the linkage groups is consistent with the cattle RH maps. This preliminary BBU6 RH map is the starting point for comparing gene order between both species, presenting opportunity for examination of micro-rearrangements of these chromosomes and, thereby enhancing the possibility of positional candidate cloning in river buffalo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseASCF.pdf: 1203685 bytes, checksum: 09eb7536fd867598d8ede5a251ba023e (MD5) Previous issue date: 2004-11-26 / Universidade Federal de Minas Gerais / Plants seem to have developed, over a long period of time, defence mechanisms against fungi and insects. One of them is the use of protease inhibitor proteins. Cystatins are proteins that inhibit specifically cysteine proteases. They occur naturally in several vegetable species and it is believed that they work in the defence mechanism from plants against some pathogens. The Canecystatin gene which codifies a protein containing 106 amino acids residues, was identified in sugarcane and bears significant similarity with oryzacystatin, a cystatin from rice. The recombinant protein was expressed in E.coli in the soluble form, which promoted its direct purification by affinity chromatography in nickel column. The purified protein was analysed by Circular Dichroism (CD) and displayed estimated secundary structure similar to oryzacystatin I. Besides that, the protein was submitted to crystallization assay, and it was possible to form protein crystal, which will enable future studies by X-Ray Crystallography. Canecystatin, was used successfully in growth inhibition tests against the filamentous fungus Trichoderma reesei. The protein minimum inhibitory dose were about 50 µg/ml. The recombinant canecystatin was also able to inhibit plant pathogenic fungi including Colletotrichum sp P25, Colletotrichum sp P28, Colletotrichum sp P10, Fusarium moniliforme and Aspergillus niger. The most efficient inhibition was obtained against Colletotrichum sp P10 (32.25µg/ml). In order to obtain cystatin with improved activity direct evolution tests were carried out. A shuffling library was constructed using two diferent cystatins, i.e Canecystatin and Oryzacystatin I. One clone formed by this proteins was selected. This clone was expressed, purified and subjected to activity tests, and the results shown that the activity of mutant protein increased, in particular regarding its inhibit activity of Cathepsin B. Our findings open perspectives of using this protein as a natural fungicide and of developing more resistant varieties of sugarcane . / As plantas parecem ter desenvolvido ao longo da evolução mecanismos naturais de defesa contra fungos e insetos. Entre eles está o uso de inibidores de protease. Cistatinas são proteínas que inibem especificamente cisteíno proteases. Elas ocorrem naturalmente em várias espécies de vegetais e acredita-se que elas estejam envolvidas com mecanismos de defesa da planta contra o ataque de patógenos. O gene da Canacistatina que codifica uma proteína contendo106 resíduos de aminoácidos, foi identificado em cana-de-açúcar e possui significante similaridade de sequência com a Orizacistatina I, uma cistatina de arroz. A proteína recombinante foi expressa em E.coli na forma solúvel, o que possibilitou sua purificação direta por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. A proteína purificada foi analisada por Dicroísmo Circular que apresentou uma estrutura secundária estimada similar a proteína Orizacistatina I. Além disso, a proteína foi submetida a ensaios de cristalização e foi possível a formação de cristais protéicos, os quais serão utilizados para futuros estudos de cristalografia de Raio-X. A canacistatina foi utilizada com sucesso em testes de inibição de crescimento do fungo Trichoderma reesei. A dose mínima inibitória foi em torno de 50 µg/ml. A canacistatina recombinante também foi capaz de inibir o crescimento de fungos patogênicos incluindo Colletotrichum sp P25, Colletotrichum sp P28, Colletotrichum sp P10, Fusarium moniliforme e Aspergillus niger. A inibição mais eficiente foi obtida contra Colletotrichum sp P10 (32.25µg/ml). Para obtenção de uma cistatina com atividade melhorada, ensaios de evolução direta foram realizados. Uma biblioteca de shuffling foi construída utilizando duas cistatinas diferentes, a Canacistatina e a Orizacistatina I. Um clone formado por estas duas proteínas foi selecionado. Este clone foi expresso, purificado e submetido a testes de atividade e os resultados demostraram que a atividade do mutante aumentou e este inibe a atividade da catepsina B. Nossos resultados abrem perspectivas para o uso desta proteína como um fingicida natural e para o desenvolvimento de variedades mais resistentes de cana-de-açúcar.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2863.pdf: 780094 bytes, checksum: c8a008a959e5b4d1e7d94595428c3b47 (MD5) Previous issue date: 2010-02-22 / Universidade Federal de Minas Gerais / To remain competitive in the market of meat production, it is crucial that the Brazilian producer is aware of the criteria used by consumers for local and international markets. One factor that determines the beef quality is genetics, so it is necessary to conduct studies in Brazil to understand the genetic variation of carcass and meat quality traits in order to outline plans to improve such attributes. Backfat thickness (BFT) and ribeye area (RAE) are characteristics of late measurements, so the investigation of molecular markers associated with these characteristics can help in their inclusion in breeding programs. In cattle, some polymorphisms have been related to characteristics of meat production. Thus, this work aimed to assess the presence of polymorphisms in candidate genes PPARGC1A (peroxisome proliferative active recptor gamma coactivator 1A), FABP4 (fatty acid binding protein 4), DDEF1 (development and differentiation enhancing factor 1), Leptin, PSMC1 (proteasome 26S subunit, ATPase, 1) and IGF-1 (insulin-like growth factors) and associate them with production traits in reference families of Nellore breed. We used 280 steers descendants of 20 sires, that were chosen to represent the variability in Nellore. The sires were genotyped for all markers to investigate their allelic distribution within the race. The SNPs of the leptin and PSMC1 genes showed no variability in the bulls, so these were not genotyped in the progeny. The other markers were genotyped for the whole population. The investigation of the effects of markers on the characteristics was performed using a mixed model, including fixed and random effects, using the restricted maximum likelihood method. There was a significant association (P<0,05) between FABP4 and BFT and a suggestive association (P<0,10) between fat gain in the feedlot and these marker. Significant association was found between RAE, weaning weight (WW) and yearling weight (YW) and the DDEF1 gene and a suggestive association between the IGF-1 gene and YW in this sample of Nellore cattle. / Para que a produção de carne se mantenha competitiva no mercado, é fundamental que o produtor brasileiro esteja atento aos critérios requeridos pelos consumidores dos mercados locais e internacionais. Um dos fatores que determina a qualidade da carne bovina é a genética, sendo, portanto necessário conduzir estudos no Brasil relacionados à variação genética de características que influenciam a qualidade da carcaça e da carne bovina para que se possam delinear programas de melhoramento no sentido de aperfeiçoar tais atributos. A espessura de gordura subcutânea (EGS) e a área de olho de lombo (AOL) são características de mensuração tardia, por isso, a investigação de marcadores moleculares associados com essas características pode ajudar na inclusão das mesmas em programas de melhoramento. Em bovinos, alguns polimorfismos já foram relacionados com características de produção de carne. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar a presença de polimorfismos nos genes candidatos PPARGC1A (peroxisome proliferative active recptor gamma coactivator 1A), FABP4 (fatty acid binding protein 4), DDEF1 (development and differentiation enhancing factor 1 ), Leptina, PSMC1 (proteasome 26S subunit, ATPase, 1) e IGF-1 (insulin-like growth factor) e associálos com características de produção de carne em famílias de referência da raça Nelore. Foram utilizados 270 novilhos machos, descendentes de 20 touros, escolhidos para representar a variabilidade dentro da raça Nelore. Os touros foram genotipados para todos marcadores para investigar a distribuição alélica dentro da raça. Os SNPs dos genes Leptina e PSMC1 apresentaram-se fixados na amostra, sendo assim, estes não foram genotipados na progênie, enquanto os demais marcadores foram genotipados para toda população. A investigação dos efeitos dos marcadores sobre as características foi realizada através de um modelo misto, incluindo efeitos fixos e aleatórios, utilizando o método de máxima verossimilhança restrita. Foi encontrada uma associação significativa (P<0,05) entre o marcador FABP4 e EGS e associação sugestiva (P<0,10) entre ganho de gordura no confinamento e este marcador. Foi encontrada associação significativa entre o polimorfismo no gene DDEF1 e AOL, peso à desmama (PD) e peso ao sobreano (PS) e associação sugestiva entre o polimorfismo do gene IGF-1 e PS em bovinos da raça Nelore.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLFR.pdf: 1075822 bytes, checksum: f9dc443682a3269a2f32e2a5579089a0 (MD5) Previous issue date: 2005-06-10 / Financiadora de Estudos e Projetos / The ubiquitin system represents a selective mechanism for intracellular proteolysis in eukaryotic cells that involves the sequential activity of three enzymes, E1 (Ubiquitin activating enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-protein ligase). The identification of these proteins and their targets as well as structural data is essential to understand their function in the eukaryotic cell. In the present study the open reading frame of human Ubiquitin- conjugating enzyme UBE2G2 was isolated from a human brain cDNA panel, cloned into pET28 vector and expressed in Escherichia coli. His-tagged protein was then purified by nickel-affinity chromatography and subjected to structural and functional studies using circular dichroism (CD) and an in vitro ubiquitin-binding assay, respectively. The affinity chromatography assay rendered approximately the 27 mg of the soluble recombinant HisUBE2G2 after expressed in bacteria at low amounts of IPTG (0,1mM) in 3 hours of induction. The CD spectra of recombinant pure protein showed a secondary structure content according with the expected for a member of the E2 family (Ubiquitin-conjugating enzyme), with 35 % of &#945;-Helix, 21 % of &#946; sheets and 23 % of turns. Moreover, purified protein was able to bind ubiquitin molecules when mixed with a HeLa cell extract during the pull-down assay. Taken together the results presented in this work allow inferring that HisUBE2G2 was expressed in their active form. / O Sistema de Ubiquitinação representa o mecanismo de degradação protéica intracelular mais importantes em todos nas células eucarióticas e envolve a atividade seqüencial de três enzimas conhecidas como E1, enzima ativadora de ubiquitina, a E2 enzima conjugante de ubiquitina e a E3 enzima ligante de ubiquitina. A identificação destas proteínas e seus alvos protéicos, assim como as obtenções de dados estruturais são essenciais para entender a função deste sistema dentro da célula eucariótica. No presente trabalho, a fase de leitura aberta (ORF) do gene humano ube2g2 foi isolado de um painel de cDNA de cérebro humano, foi clonado no vetor pET28a e expressado em bactérias Escherichia coli. A proteína de 18,5 kDa em fusão com uma cauda de histidinas foi posteriormente purificada por cromatografia de afinidade e submetido a ensaios estruturais e funcionais a traves do medição do CD e a traves do ensaio de pull-down, respectivamente. A cromatografia de afinidade rendeu 27 mg de proteína solúvel, logo após de tê-la expressado heterologamente a baixas concentrações de indutor IPTG 0,1 mM em três horas de indução. O espectro de CD da proteína purificada mostrou o conteúdo de estrutura secundaria de acordo ao esperado para um membro típico da família de enzimas E2, apresentando um 35 % de hélices &#945;, 21 % de folhas &#946; e 23 % de giros. Alem do mais, a proteína purificada foi capaz de ligar molécula de ubiquitina quando misturada com um extrato de células HeLa, durante o ensaio de pull-down. Desta maneira e com esses resultados apresentados aqui pode se inferir que a proteína humana UBE2G2 foi expressa na sua forma ativa.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-28Bitstream added on 2015-04-09T12:47:33Z : No. of bitstreams: 1 000811540.pdf: 772912 bytes, checksum: 9fe40489ccb3153a59c8440d6126a541 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A anemia falciforme (AF) é uma anemia hemolítica hereditária que acarreta ao portador manifestações clínicas complexas e diversificadas. Na AF o estresse oxidativo é um dos fatores que interferem no fenótipo do portador, uma vez que influencia nos processos de vaso-oclusão aumentando as propriedades adesivas dos eritrócitos, leucócitos e plaquetas ao endotélio. Durante a transformação do eritrócito discóide com hemoglobina (Hb) S em eritrócito afoiçado, dentre os eventos bioquímicos e polimerizantes da célula, ocorre a degradação oxidativa dessa Hb, com a liberação agentes pró-oxidantes. Estes promovem a oxidação de lipídeos e também de proteínas e DNA, modificando mecanismos celulares que levam a célula a apoptose e, consequentemente, causam danos aos tecidos. Neste contexto, os principais meios de defesa no organismo são divididos em dois grupos, enzimáticos e não enzimáticos. Entre as enzimas detoxificantes de fase II mais estudadas estão as GSTs, que pertencem a uma família multifuncional de enzimas que catalisam a conjugação da molécula de GSH e possuem papel fundamental em mecanismos de defesa contra compostos endo e xenobióticos. Considerando a grande incidência da AF em nosso país e as manifestações clínicas diferenciadas nos portadores, o presente trabalho pretendeu investigar os polimorfismos das GSTs (GSTM1, GSTT1 e GSTP1) e verificar sua influência sob parâmetros oxidativos – peroxidação lipídica por TBARS, e lesão de DNA pela avaliação de Corpos de Howell-Jolly e Ensaio Cometa em portadores da AF. Foram avaliadas amostras de 91 indivíduos com AF com e sem o uso de HU e 99 amostas de um grupo controle. Para o desenvolvimento do trabalho, as amostras foram separadas em três grupos: indivíduos portadores de anemia falciforme em uso de hidroxiureia (AF + HU: 46 indivíduos), indivíduos portadores de anemia falciforme sem uso de hidroxiureia (AF – HU: 45 indivíduos) e o grupo ... / Sickle cell anemia (SCA) is an inherited hemolytic disease that leads complex and diverse clinical manifestations. In SCA, oxidative stress is one of the factors that affect the phenotype of the carrier, in response of its influences on vaso-occlusion processes that increases the adhesive properties of erythrocytes, leukocytes and platelets to the endothelium. During the transformation of discoid erythrocytes with hemoglobin (Hb) S into sickle cells, among the biochemical and polymerizing events, the oxidative degradation of this Hb occurs, releasing pro-oxidants agents. They promote oxidation of lipids and proteins and modify cellular mechanisms that lead to cell apoptosis and cause tissue damage. In this context, the main means of body defense are divided in two groups: enzymatic and non-enzymatic. Among the phase II detoxifying enzymes, the most studied are Glutathione S-transferases (GSTs), which belong to a family of multifunctional enzymes that catalyze the combination of the glutathione (GSH) molecule and have a central role in mechanisms of defense against xenobiotic compounds. Considering the high incidence of SCA in our country and the different clinical manifestations in patients, this study aimed to investigate polymorphisms of GSTs (GSTM1 , GSTT1 and GSTP1 ) and determine its influence on oxidative parameters - lipid peroxidation by TBARS and DNA damage by evaluation of Howell -Jolly bodies (HJB) and comet assay in patients with SCA. Samples of 91 patients with SCA with and without hydroxyurea (HU) use and 99 samples of a control group were evaluated. For the work development, the samples were separated into three groups: individuals with sickle cell anemia using hydroxyurea (SCA + HU: 46 individuals), individuals with sickle cell disease without use of hydroxyurea (SCA - HU: 45 individuals) and control group (CG: 99 individuals) to verify the influence of medication on the evaluated parameters. Only the genotypic profile ...

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-24Bitstream added on 2014-12-02T11:21:27Z : No. of bitstreams: 1 000799353_20160224.pdf: 289799 bytes, checksum: 0b2547aa37c5af1df5323abf3c3ac04e (MD5) Bitstreams deleted on 2016-02-24T11:27:50Z: 000799353_20160224.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-24T11:28:33Z : No. of bitstreams: 1 000799353.pdf: 4598958 bytes, checksum: c90c43cb77dd0d3eaea210da3979de05 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A doença falciforme (DF) é caracterizada por heterogeneidade clínica variando de pessoas com relativamente poucas complicações clínicas e expectativa de vida normal, até aqueles com complicações graves, como hipertensão pulmonar, priapismo, acidente vascular cerebral (AVC), úlceras de perna, episódios de dor, síndrome torácica aguda (STA) e osteonecrose. O tratamento com a hidroxiureia (HU) tem conquistado espaço na terapia adotada pelos clínicos e sua experiência na DF vem sendo acumulada ao longo dos últimos 25 anos. Porém, muitos estudos têm sido elaborados para investigar as variações genéticas que possam explicar o porquê de alguns pacientes tolerarem e respondem ao uso de HU, enquanto, outros ainda precisam ser tratados por terapias alternativas. Diante disso, nosso objetivo foi avaliar a resposta ao tratamento com a HU considerando a influência dos polimorfismos genéticos envolvidos na fisiopatologia da DF. Para isso, usamos a calculadora de gravidade da DF (CGDF); rastreamos os polimorfismos -509C/T (TGFB1), -308G/A (TNFA), 313 A/G (GSTP1), -786T/C (NOS3), nulos (GSTM1 e GSTT1); e avaliamos os marcadores de estresse oxidativo (catalase, glutationa peroxidase-GPx, glutationa S-transferase-GST, glutationa redutase-GR e as espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico-TBARS). O estudo envolveu 520 pacientes, acima de cinco anos de idade, provenientes do Instituto de Hematologia do Rio de Janeiro/RJ-HEMORIO. A CGDF foi validada para os pacientes brasileiros e os escores de gravidade foram relacionados com os marcadores de estresse oxidativo. Em relação aos polimorfismos, a presença do alelo nulo do gene GSTM1 aumentou a chance de ocorrência de priapismo em pacientes com a DF. A mutação do gene TGFB1 mostrou efeito protetor na ocorrência de STA e úlceras de perna, e à presença do alelo mutante para o gene NOS3 diminuiu a chance de ocorrência de retinopatia e priapismo. Para os marcadores bioquímicos, ... / Sickle cell disease (SCD) is characterized by a very heterogeneous clinical ranging from patients who have normal life expectancy with relatively few complications; others can have severe complications such as pulmonary hypertension, priapism, stroke, leg ulceration, recurrent painful episodes, acute chest syndrome (ACS) and avascular necrosis of bone (AVN). Treatment with hydroxyurea (HU) has become more adopted by medical and HU experience in DF has been accumulated over the last 25 years. However, many studies have been designed to investigate the genetic variations that may explain why some patients tolerate and respond to the use of HU, while others still need to be treated with alternative therapies. In view of this, we aimed to evaluate the response to HU treatment considering the genetic polymorphisms influence involved in the pathophysiology of SCD. For this, we used the calculator severity of DF (CGDF); detected the polymorphisms -509C/T (TGFB1), -308G/A (TNFA), 313 A/G (GSTP1), -786T/C (NOS3), null (GSTM1 and GSTT1), we assessed markers of oxidative stress (catalase, glutathione peroxidase-GPx, glutathione S-transferase-GST, glutathione reductase-GR and the thiobarbituric acid reactive species-TBARS). The study involved 520 patients older than 5 years, from the Instituto de Hematologia do Rio de Janeiro/RJ-HEMORIO. The CGDF was validated for Brazilian patients and severity scores were related to oxidative stress markers. The presence of the GSTM1 null allele increased the occurrence chance of priapism in SCD patients. TGFB1 gene mutation had a protective effect on the occurrence of STA and leg ulcers, and the presence of the mutant allele for the NOS3 gene decreased the occurrence chance of retinopathy and priapism. For biochemical markers, we found that the decreased of enzymes activity (catalase, Gpx and GR), and the increased in GST activity were associated with greater SCD severity. In addition, lipid peroxidation levels ...