Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-05T19:38:44Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 733129 bytes, checksum: 8bbca758a91929a69cd59c9b99926b7f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T19:38:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 733129 bytes, checksum: 8bbca758a91929a69cd59c9b99926b7f (MD5) Previous issue date: 2005-12-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cromossomos B são cromossomos extras ao complemento normal, que seguem suas próprias vias evolutivas, ou seja, têm um padrão de herança distinto do usual (mendeliano) entre os indivíduos que os carreiam. Na espécie Partamona helleri (Hymenoptera, Apidae) foram encontrados até quatro desses cromossomos. Esse trabalho apresentou como objetivos gerais investigar a origem molecular e os efeitos no "fitness" dos cromossomos B de P. helleri. Para facilitar a obtenção dos objetivos gerais, um marcador RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA) associado a cromossomos B em P. helleri foi satisfatoriamente convertido em um marcador SCAR (Sequence Characterized Amplified Region), que se mostrou também associado a tais cromossomos. As análises evidenciaram que os cromossomos B de P. helleri se originaram de uma forma independente em relação aos cromossomos do complemento normal A da espécie. O processo de origem deve ter ocorrido no contexto evolutivo do gênero Partamona, em especial, no contexto evolutivo de um clado monofilético no qual se encontram, além de P. helleri, as espécies P. criptica, P. Cupira, P. rustica e P. mulata. A origem independente dos cromossomos B em relação ao complemento cromossômico normal A deve ter ocorrido por hibridização interespecífica, mas não fica descartada a possibilidade de elementos transponíveis participarem desse processo. Por fim, o trabalho não apontou efeito dos cromossomos B na assimetria dos indivíduos de P. helleri, permitindo concluir que indivíduos que apresentam cromossomos B não são mais assimétricos do que os indivíduos que não possuem tais cromossomos em P. helleri considerando o caráter asa anterior. Apesar de sugerirem uma origem interespecífica para os cromossomos B de P. helleri, os resultados apontam a necessidade de um maior número de estudos de citogenética e genética molecular das espécies do gênero Partamona para se ter maior clareza sobre a origem desses cromossomos. Apontam também, a necessidade de análises de outros caracteres morfológicos externos de P. helleri; bem como caracteres fenotípicos internos (fisiológicos) para se obter conclusões sobre os efeitos dos cromossomos B no "fitness" dos indivíduos e populações dessa espécie. / B chromosomes are additional chromosomes in relation to normal complement (A chromosomes) that presents your own evolutionary pathways and do not obey Mendelian laws of inheritance among individuals present them. In species Partamona helleri (Hymenoptera, Apidae) had been found until four B chromosomes. This work presents like general objectives obtain a better comprehension of molecular origin and fitness effects of P. helleri B chromosomes. In order to make easier general objectives an RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA) marker associated with P. helleri B chromosomes was successful transformed in SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) marker, which also showed association with P. helleri B chromosomes. Analyses showed that P. helleri B chromosomes arise independently from A normal chromosomes. Origin process should be happen on Partamona genus evolutionary context, in special, on evolutionary context of an monophyletic clade where besides P. helleri, were found the species P. criptica, P. Cupira, P. rustica and P. mulata. B chromosomes independently origin in relation to normal xiiA chromosomes could be happen because interspecific hybridization, but there are possibility of transposable elements integrate the process. At last, this work did not point B chromosomes effects on asymmetry of P. helleri individuals; so it is possible conclude that individuals with B chromosomes are not more asymmetric than individuals without B chromosomes considering the character anterior wing. Despite results showed an interspecific origin to P. helleri B chromosomes, it pointed the necessity to do more citogenetics and molecular studies of Partamona species in order to clarify B chromosomes origin in evolutionary context of Partamona genus. The results pointed too the necessity of analyze others morphological and physiological characters of P. helleri in order to obtain conclusions about B chromosomes fitness effects in individuals and populations of this species.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-06T14:03:32Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1133771 bytes, checksum: 640defa7d0749c719bdf5d760421654a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-06T14:03:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1133771 bytes, checksum: 640defa7d0749c719bdf5d760421654a (MD5) Previous issue date: 2007-07-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Para isso foram usadas três estrategias. Inicialmente, palavras-chave correspondentes a termos relacionados aos mecanismos de resistência de plantas a patógenos foram identificadas na literatura e utilizadas como “iscas” para a mineração dos dados. Com o auxílio de ferramentas disponíveis na plataforma de bioinformática do PBGC, foram identificadas ESTs (Expressed Sequence Tags) relacionadas a cada uma destas palavras. Outra estrategia utilizada foi a busca por similaridades entre algumas sequências públicas envolvidas com a resistência do cafeeiro a doenças com as sequências do PBGC, por meio do programa BLAST. Utilizou-se, também, o Electronic Northern, uma ferramenta desenvolvida pelo Laboratório de Genômica e Expressão (LGE). A mineração, usando as três estrategias, identificou 14.060 sequências do PBGC. Essas sequências apresentaram similaridade com proteínas conhecidamente relacionadas com o processo de defesa da planta contra doenças como, por exemplo, quitinase, proteína quinase, citocromo P450, proteína de resistência a doenças, proteína relacionada com patogênese, proteínas com domínio LRR e NBS, proteínas induzidas por hipersensibilidade, entre outras. Os processos biológicos com os quais essas sequências estão envolvidas incluíram metabolismo, transporte, regulação da transcrição, enovelamento de proteínas, biossíntese entre outros. A análise global baseada em ontologia de função molecular das sequências obtidas mostrou que os genes estão envolvidos com metabolismo, resposta a estímulos externos, diferenciação celular, ligação a ácidos nucleicos, ligação a nucleotídeos, resposta de defesa, apoptose entre outras. Visando verificar o envolvimento destas sequências com a resistência do cafeeiro a ferrugem foram desenhados 40 primers para amplificar algumas das sequências mineradas. Os primers foram desenhados com o programa computacional Primer3 e a estabilidade desses foi verificada por meio do programa PrimerSe/ect. Diferentes concentrações dos componentes da reação de PCR foram analisadas. Utilizando as condições de reação e amplificação otimizadas, os 40 primers foram testados em 12 genótipos resistentes e 12 susceptíveis a Hemi/eia vastatrix, fungo causador da ferrugem. Vinte e nove destes 40 primers resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo um polimórfico. Este trabalho permitiu obter, até o momento, um marcador molecular polimórfico entre os indivíduos resistentes e susceptíveis. Esse marcador, denominado CARF 005, amplifica uma região do DNA que corresponde a uma ORF parcial de Coffea arabica que codifica uma proteína de resistência a doenças. / For that, three strategies were used. Initially, keywords related to the plants resistance mechanism to pathogens were searched in scientific literature and used as drivers for data mining. Using the available tools at the PBGC bioinformatics platform, ESTs (Expressed Sequence Tags) related to each one of these words were identified. The search for similarities between some published sequences and sequences from the PBGC, by using the BLAST program was another strategy. The Electronic Northern, a tool developed by the Laboratório de Genômica e Expressão (LGE), was also used. Those strategies allowed the identification of 14,060 sequences of the PBGC. These sequences were similar to proteins known to be related to de plant disease defense process, for instance chitinase, kinase protein, cytochrome P450, disease resistance protein, pathogenesis related protein, LRR and NBS proteins, hypersensibility induced protein among others. The biological processes with witch these sequences are involved included metabolism, transport, transcription regulation, protein folding, biosynthesis and others. The ontology-based global analysis for molecular function showed that the genes are involved with metabolism, external stimulus response, cellular differentiation, nucleic acid binding, nucleotide binding, defense response, apoptosis and others. Aiming to verify the involvement of these sequences with the coffee tree resistance to leaf rust, 40 primers were designed to amplify the mined sequences. The primers were synthesized using the computational program Primer3 and their stability was tested by the program PrimerSelect. Different PCR conditions were tested. Using optimized reaction and amplification conditions, those 40 primers were tested in 12 resistant and 12 susceptible genotypes to Hemileia vastatrix, fungus that causes coffee leaf rust. Twenty nine of those resulted in unique and sharp bands, and only one of these was polymorphic. The 40 primers permitted to find one molecular marker polymorphic between the resistant and susceptible genotypes. This marker amplifies a region of the DNA which corresponds to a Coffea Arabica ORF for disease resistance protein.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-09-01T10:47:58Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2024328 bytes, checksum: 08c459cde47f95de6b200e6cfd84a5e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T10:47:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2024328 bytes, checksum: 08c459cde47f95de6b200e6cfd84a5e0 (MD5) Previous issue date: 2017-03-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A soja (Glycine max (L.) Merrill) é um dos mais importantes produtos do agronegócio brasileiro, apresentando como principais atrativos seus altos teores de óleo e proteína no grão. A proteína de soja apresenta grande importância histórica na pecuária brasileira, sendo ingrediente básico da maioria das rações de suínos, aves e peixes. Atualmente, a soja também é importante fonte de proteína na alimentação humana, sendo consumida na forma de diferentes produtos, alguns dos quais têm na sacarose um importante componente. O óleo de soja, por sua vez, apresenta grande importância tanto na indústria alimentícia quanto na produção de biodiesel, uma forma de combustível biodegradável cuja utilização vem aumentando consideravelmente no país devido a leis de incentivo do Governo Federal. O Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja (PMQS/BIOAGRO/UFV) tem como objetivo o desenvolvimento de cultivares de soja especiais, visando melhor atender ao mercado de soja para alimentação humana e para produção de óleo de qualidade. O presente trabalho insere-se dentro deste contexto e foi dividido em dois capítulos. No Capítulo I foi caracterizada uma nova mutação no gene GmFAD3A da variedade CS303TNKCA, desenvolvida pelo PMQS e que apresenta baixo teor de ácido linolênico. Esta mutação (delA) foi avaliada em uma população F 2 segregante para teor de ácido linolênico contendo 187 plantas, e em populações F 2:3 e F 2:4 , em diferentes ambientes, por meio de um marcador molecular baseado em High Resolution Melt (HRM). DelA explicou entre 48,81-65,97% da variação da característica, reduzindo os teores de ácido linolênico para 3,4-4,4%, se mostrando uma boa fonte de variabilidade genética para o desenvolvimento de cultivares de soja com óleo de maior qualidade. No Capítulo II, foi avaliado o efeito de uma mutação anteriormente caracterizada por outros pesquisadores no gene rafinose sintase 2 (GmRS2) da linhagem PI200508 sobre características de qualidade do grão de soja, pela da avaliação de uma população F 2 contendo 168 indivíduos. A mutação explicou 69,61%, 51,81% e 31,96% dos teores de estaquiose, rafinose e sacarose, respectivamente, e foi capaz de produzir soja com 0,18% de estaquiose no grão, em média. Os baixos valores de coeficiente de determinação encontrados para teor de proteína e óleo indicam que a mutação pode ser utilizada para aumentar o teor de sacarose e reduzir os teores de rafinose e estaquiose sem mudanças significativas nos teores de óleo e proteína. / Soybean (Glycine max (L.) Merrill) is one of the most important products in Brazilian agribusiness, presenting high oil and protein contents as major attractives. Soy protein has a historical importance in Brazilian livestock, as the basic ingredient in pig, poultry and fish feed. Currently, soy is also an important source of protein for human consumption, in the form of different products, some of which depend on the amount of sucrose in the grain. Soybean oil, in turn, has great importance both in food industry and in the biodiesel production, a form of biodegradable fuel whose use has been increasing considerably in the country due to Federal Government's incentive laws. The purpose of the Soybean Quality Improvement Program (PMQS / BIOAGRO / UFV) is to develop special soybean cultivars, for better attend the soybean market for human consumption and for the production of high quality oil. The present work falls within this context and was divided into two chapters. In Chapter I, a new mutation in GmFAD3A gene of CS303TNKCA variety was characterized. This variety was developed by the PMQS and shows low linolenic acid content. This mutation (delA) was evaluated in a F 2 population containing 187 plants segregating for linolenic acid content, and in F 2:3 and F 2:4 populations, in different environments, using a molecular marker based on High Resolution Melt (HRM). DelA explained between 48.81-65.97% of the phenotype variation, reducing the linolenic acid levels to 3.4-4.4%, and was considered a good source of genetic variability for the development of soybean cultivars with a better quality soybean oil. In Chapter II, the effect of a previously characterized mutation in the raffinose synthase 2 gene (GmRS2), from lineage PI200508, on soybean quality characteristics was evaluated by an F 2 population containing 168 individuals. The mutation explained 69.61%, 51.81% and 31.96% of the stachyose, raffinose and sucrose contents, respectively, and we were able to produce soybean with 0.18% of stachyose in the grain, on average. The low coefficient of determination value found for protein and oil content indicates that the mutation can be used to increase sucrose and reduce raffinose and stachyose contents without significant changes in oil and protein.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-09-01T11:36:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 9707476 bytes, checksum: a565c0a06a8c635b67e72e452cff1bff (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T11:36:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 9707476 bytes, checksum: a565c0a06a8c635b67e72e452cff1bff (MD5) Previous issue date: 2017-02-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Cowpea mild mottle virus (CPMMV, família Betaflexiviridade e gênero Carlavirus) é um vírus emergente no Brasil. O vírus é transmitido pela mosca-branca Bemisia tabaci e infecta hospedeiros preferencialmente da família Fabaceae, sendo encontrado em diferentes culturas em quase todos os continentes do mundo. Nesse trabalho, vários aspectos da biologia e genética do CPMMV foram discutidos e a relação CPMMV- hospedeiro foi explorada. O CPMMV causa sintomas muito variados em plantas campo e em casa de vegetação. A natureza dessa variação de sintomas foi determinada nesse trabalho utilizando-se inoculações sucessivas de um isolado de CPMMV brasileiro causador de necrose na cultivar de soja CD206. As inoculações sucessivas levaram o isolado que antes causava necrose a induzir sintomas brandos (mosaicos e clareamento de nervuras). Isso foi verificado após seis inoculações sucessivas de uma amostra vegetal de soja proveniente do campo e também a partir do isolado viral oriundo de uma lesão local, e submetido, portanto a um gargalo genético, em folhas de Nicotiana benthamiana. A alteração do padrão de sintomas aumentou adaptabilidade do vírus e vetor, sugerindo que a indução de diferentes sintomas pelos variantes virais é uma vantagem adaptativa. A região viral envolvida na indução de sintomas pelo CPMMV foi a replicase viral (codificada pela ORF1) e diferentes sítios distribuídos ao longo de blocos recombinantes da ORF1 foram associados às alterações do fenótipo. Nesse trabalho, também se buscou compreender um aspectos da replicação do CPMMV em soja, identificando-se fatores necessários à replicação. Até o momento tudo que se sabia sobre a replicação dos betaflexivírus é que ela ocorria no citoplasma. Nenhum fator do hospedeiro era conhecido. Aqui foram identificadas duas proteínas do hospedeiro capazes de interagir com o domínio RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) a partir de uma biblioteca de cDNA de soja construída em vetor de duplo-híbrido de leveduras. Para a construção da biblioteca foram utilizadas plantas de soja cv. CD206 com infecção pelo CPMMV após 0, 3, 7 e 14 dias de inoculação. As proteínas identificadas foram: a ERD4 tipo CSC1 (GmERD4) e uma inositol metiltransferase (GmIMT). A interação foi confirmada por ensaios de duplo-híbrido de leveduras e por ensaios de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC). A predição e a localização subcelular de ambas as proteínas e do domínio RdRp também foram realizados. GmERD4 localizou-se no retículo endoplasmático (RE) e GmIMT apresentou localização citoplasmática, enquanto o domínio RdRp induziu estruturas pontuais na membrana plasmática e sobre a rede do RE. A análise da expressão de ambos os genes em plantas de soja infectadas com o CPMMV, demonstrou que eles foram induzidos após 3 e 7 dias da inoculação. A superexpressão de GmERD4 e GmIMT foi realizada em protoplastos de soja infectados com o CPMMV e foi verificado que a superexpressão de GmERD4 aumentou o acúmulo viral após 7 dias de infecção. A replicase viral está envolvida em diferentes processos da infecção viral, atuando não apenas na replicação dos genomas, mas também na indução de sintomas. Isso reforça a natureza multifuncional das proteínas virais. / Cowpea mild mottle virus (CPMMV, family Betaflexiviridae and genus Carlavirus) is an emerging virus in Brazil. The virus is transmitted by the whitefly Bemisia tabaci and it infects hosts preferentially of Fabaceae family, being found in different crops in almost all the continents in the world. In this work, several aspects about biology and genetics of CPMMV were dicussed and the CPMMV-host relationship was explored. CPMMV causes varied symptoms in plants in the fields and in greenhouse. The nature of this symptoms variation was determinate in this work using successive inoculations of a CPMMV Brazilian isolate causing necrosis in the CD206 soybean cultivar. Successive inoculations led to the isolate, which previously had caused necrosis to induce mild symptoms (mosaic and vein clearing). This was verified after six successive inoculations of a soybean sample from the field and also from a local lesion of a viral isolate, and thus submitted to a genetic bottleneck, in Nicotiana benthamiana leaves. We have shown that altering of symptoms pattern increased the fitness of the virus and vector, suggesting that the induction of different symptoms by viral variants is an adaptive advantage. The viral region involved in the induction of CPMMV symptoms was viral replicase (encoded by ORF1), different sites distributed throughout the recombinant blocks of ORF1 were associated with phenotype changes. In this work, also shought to the understanding about the replication of CPMMV in soybean identifying factors necessary for replication. To date, all that has been known about betaflexiviruses’s replication is that it occurs in the cytoplasm. None host factor was known. Here, two host proteins able to interact with the RNA-dependent RNA polymerase domain (RdRp) from a yeast two-hybrid vector-constructed soybean cDNA library were indentifyed. For the library construction, soybean plants cv. CD206 with CPMMV infection after 0, 3, 7 and 14 days of inoculation were used. The proteins identified were: the CSC1 type ERD4 (GmERD4) and an inositol methyltransferase (GmIMT). The interaction was confirmed by yeast two-hybrid assays and by Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) assays. Prediction and subcellular localization of both proteins and the RdRp domain were also performed. GmERD4 was located in the endoplasmic reticulum (ER), GmIMT presented cytoplasmic location while the RdRp domain induced punctual structures in the plasma membrane and on the ER network. Analysis of the expression of both genes in soybean plants infected with CPMMV demonstrated that the they were induced after 3 and 7 days of inoculation. Overexpression of GmERD4 and GmIMT was performed on soybean protoplasts infected with CPMMV and it was found that overexpression of GmERD4 increased viral accumulation after 7 days of infection. Viral replicase is involved in different viral infection processes, acting not only on genome replication, but also on the induction of symptoms. This reinforces the multifunctional nature of viral proteins.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-12-17T14:22:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 774323 bytes, checksum: b6cf6fb63a7b4fe8f1931ff6b345b7f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-17T14:22:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 774323 bytes, checksum: b6cf6fb63a7b4fe8f1931ff6b345b7f3 (MD5) Previous issue date: 2009-02-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Desde o contato inicial até o estabelecimento dos sintomas da doença, C. lindemuthianum regula a expressão diferencial de genes essenciais para a patogenicidade que vão possibilitar a colonização do tecido hospedeiro e a finalização do seu ciclo de infecção. Nesse trabalho, o gene pacCl, que codifica o regulador transcricional de resposta ao pH ambiental, foi isolado e caracterizado estrutural e funcionalmente. Uma sequência de 2.546 pb foi isolada do banco genômico de C. lindemuthianum, correspondente ao gene pacCl. Esta sequência apresenta uma ORF de 1.746 pb, codificando, portanto, uma proteína de 581 resíduos de aminoácidos. Foram identificados na sequência, três íntrons putativos, contendo 60, 58 e 74 pb, cada um deles. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida da proteína, com as sequências disponíveis nos bancos de dados, demonstrou elevado grau de identidade e similaridade da proteína identificada com o regulador transcricional PacC/Him101 de fungos filamentosos e leveduras, respectivamente. Além disso, a proteína PacCl se mostrou eficiente como marcador filogenético em fungos, pois agrupou de forma coerente os organismos taxonomicamente relacionados. A hibridização de DNA usando o gene pacCl como sonda, mostrou que o gene encontra- se em uma única cópia no genoma de C. lindemuthianum. Do mesmo modo, a análise do mutante Mutpac2 por hibridização de DNA, confirmou que o gene pacCl havia sido inativado por um evento de recombinação homóloga do tipo troca gênica. Por fim, a técnica de PCR quantitativo em tempo real mostrou que o gene pacCl é expresso em todas as fases do ciclo de infecção, porém, os maiores níveis foram encontrados no final da fase necrotrófica. Pode-se sugerir que um dos fatores responsáveis por esse aumento, seja a alcalinização do tecido vegetal, decorrente do envelhecimento do tecido, e/ou até mesmo da própria atividade do fungo, que em muitos casos secreta substâncias alcalinizantes, como por exemplo, amônia. / From the initial contact to the establishment of the symptoms of the disease, C. lindemuthianum regulates the differential expression of the genes that are essential to the pathogenicity and will make possible the colonization of the host tissue and the conclusion of its infection cycle. In this study, the pacCl gene codifying the transcriptional regulator of the response to the environmental pH was isolated and structurally and functionally characterized. A 2.546 pb sequence was isolated from the genomic bank of C. lindemuthianum, corresponding to the gene pacCl. This sequence shows an ORF with 1.746 pb, therefore codifying a protein containing 581 residues of amino acids. In the sequence, three putative introns containing 60, 58 and 74 pb each one were identified. The multiple alignment of the protein-deduced sequence with the sequences available in the data file showed both high identity level and similarity of the protein identified with the PacC/Him101 transcriptional regulator of filamentous fungus and yeasts, respectively. In addition, the PacCl protein was shown to be efficient as a phylogenetic marker in fungus, since it coherently grouped those taxonomically related organisms. The DNA hybridization by using the pacCl gene as probe showed the gene is found in one single copy in the genome of C. lindemuthianum. In the same way, the mutant Mutpac2 analysis by hybridization of DNA corroborated the gene pacCl was inactivated by an event of the genic exchange-type homologous recombination. Finally, the quantitative PCR technique in real time showed the pacCl gene to be expressed in all phases of the infection cycle, but the highest levels were found at the end of the necrotrophic phase. It can be suggested that one of the factors responsible for this increase to be the alkalization of the vegetal tissue due to the aging of the tissue and/or even from the activity of the fungus, since in many cases it secretes some alkalinizing substances such as the ammonia.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-20T12:28:38Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 650594 bytes, checksum: 9a12741fabc5f870b036b29e8f9a440a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-20T12:28:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 650594 bytes, checksum: 9a12741fabc5f870b036b29e8f9a440a (MD5) Previous issue date: 2016-02-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A ferrugem do cafeeiro é causada pelo fungo Hemileia vastatrix. Trata-se de um parasita biotrófico que infecta apenas o cafeeiro sendo responsável por grandes perdas na produção. Apesar da eficiência dos fungicidas, o emprego de cultivares resistentes é o melhor método de controle, sendo econômico, eficiente, além de não causar impactos ambientais. O grande desafio para os melhoristas é o surgimento de novas raças do patógeno capazes de suplantar a resistência das cultivares resistentes desenvolvidas. A raça XXXIII de H. vastatrix foi recentemente identificada no Brasil, infectando algumas cultivares resistentes à ferrugem do cafeeiro. Durante a interação com a planta hospedeira, os fungos causadores de ferrugem secretam um arsenal de proteínas efetoras que modificam a estrutura e a função da célula hospedeira, permitindo o estabelecimento (ou não) da colonização do parasita. Dessa forma, objetivou-se com esse trabalho, caracterizar genes que codificam proteínas secretadas pelo fungo, por meio de análises de bioinformática e de expressão temporal de genes, que podem funcionar como proteínas efetoras de H. vastatrix (raça XXXIII), a fim de auxiliar a compreensão do processo infeccioso do patógeno. Dentre os 615 genes candidatos a efetores, obtidos a partir de um genoma de referência do fungo, a grande maioria, 376 e 88, apresentaram similaridade com as proteínas de Puccinia sp e Melampsora larici-populina, respectivamente. Utilizando o software BLAST2GO, foi realizada a categorização funcional desses genes. A partir dos resultados do BLASTp, foram extraídos 310 termos GO, distribuídos em três categorias. A categoria mais representada foi “Função Molecular” com 137 termos, seguida por “Processos Biológicos”, 126 termos, e “Componente Celular”, 47 termos. De acordo com a anotação de Enzyme Codes (EC) obtida, as classes enzimáticas mais representadas foram as hidrolases, transferases e as oxidurredutases. Foram selecionados 13 genes para a análise de expressão temporal. A analise foi efetuada pela técnica de PCR em tempo real (RT-PCR), nos tempos 12, 24, 48 e 72 horas após a inoculação (hai) de urediniósporos frescos em plantas de cafeeiro resistente (CIFC 832-1) e suscetível (Caturra) à ferrugem. Foi possível obter quatro padrões diferentes de expressão. Tais padrões sugerem que os genes analisados possam estar envolvidos na tentativa de sobrevivência do fungo em resposta a resistência da planta, na fase biotrófica da infecção, além de genes relacionados com a supressão da resposta de defesa da planta durante a penetração, no reconhecimento do hospedeiro e/ou na fase inicial da colonização. Os resultados indicaram que pode ocorrer comunicação entre o fungo e o hospedeiro, logo no início da infecção, ainda na fase de germinação dos esporos. Estudos biológicos funcionais deverão ser realizados para determinar a verdadeira função desses efetores durante a interação de H. vastatrix com o cafeeiro. Essas informações são úteis para os estudos que visam o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na suplantação da resistência por novas raças do fungo, fornecendo subsídios para o desenvolvimento de cultivares com resistência durável. / Coffee rust is caused by the fungus Hemileia vastatrix. It is a biotrophic parasite that infects coffee only, being responsible for major losses in production. Despite fungicides efficiency, the use of resistant cultivars is the best method of control, being economical, efficient, and does not cause adverse environmental impacts. The challenge for breeders is the emergence of new races of the pathogen able to overcome the resistance of developed resistant cultivars. The race XXXIII of H. vastatrix was recently identified in Brazil infecting some cultivars resistant to coffee rust. During the interaction with the host plant, coffee rust fungi secrete an arsenal of effector proteins which modify the structure and function of the host cell, allowing the establishment (or not) of parasite colonization. Therefore, this study aimed to characterize genes that encode proteins secreted by the fungus, by bioinformatics tools and temporal expression analysis of genes, which may function as an effector protein of H. vastatrix (race XXXIII), in order to understand the infection process of the pathogen. Amongst the 615 candidate effector genes, obtained from a fungal genome reference, the majority (376 and 88) has shown similarity to proteins of Puccinia sp and Melampsora larici- populina, respectively. Functional categorization of those genes was done using BLAST2GO software. Based on the results from BLASTp, 310 GO terms were found, distributed into 3 categories. The most representative category was “Molecular Function” with 137 terms, followed by “Biological Process”, 126 terms, and “Cellular Component”, 47 terms. According to the Enzyme Code (EC) annotation obtained, the most represented enzyme classes were hydrolases, transferases and oxidoreductases. 13 genes were selected for temporal gene expression analysis. The analysis was performed by Real-Time PCR technique, at 12, 24, 48 and 72 hours after inoculation (hai) of fresh urediniospores into resistant (CIFC 832-1) and susceptible (Caturra) coffee plants to rust. Four different expression patterns were found. Those patterns suggest that the genes analyzed may be involved in survival attempts ofthe fungus in response to the resistance of the plant, on biotrophic stage of infection, in addition to genes related to suppression of defense response of the plant during penetration, the host recognition and/or the early stages of colonization. The results indicate that communication may occur between the fungus and the host plant in early stage of infection, during the spore germination stage. Functional biological studies should be performed to determine the real function of these effectors during interaction between H. vastatrix and coffee plants. These information are useful for studies that aim at the understanding of molecular mechanisms involved in supplanting resistance by new races of the fungus, providing subsidies for the development of cultivars with durable resistance.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-17T15:58:03Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 919530 bytes, checksum: 79e4c5e2a21091121057607849cdca46 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-17T15:58:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 919530 bytes, checksum: 79e4c5e2a21091121057607849cdca46 (MD5) Previous issue date: 2005-02-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As cianobactérias e algas são organismos encontrados, abundantemente, em ambientes aquáticos, onde atuam como produtores primários transferindo energia para os diferentes níveis tróficos. A ocorrência de substâncias tóxicas ou xenobióticas tem sido uma ameça constante nos ecossistemas aquáticos. Tais substâncias podem causar efeitos tóxicos sobre diferentes grupos de cianobactérias e algas afetando em nível celular, de população e comunidade, causando prejuízos a cadeia trófica, nestes ambientes. O arsênio (As) é um elemento tóxico freqüentemente associado com depósitos de ouro. Através da mineração, o As é trazido à superfície pelo processo de drenagem ácida sendo, posteriormente, lixiviado e contaminando os corpos d água. Estudos evidenciam que cianobactérias e algas podem acumular As intracelularmente, sendo capazes de biotransformar as formas tóxicas em formas não tóxicas. A utilização destes processos permite a utilização destes organismos como biorremediadores na descontaminação de ambientes aquáticos contaminados pelo As. Com o objetivo de caracterizar os gêneros Geitlerinema UFV-E01 e Stigeoclonium UFV- E02, cultivados na presença de As, foram conduzidos, em laboratório, estudos sobre o crescimento, a absorção e a toxicidade do As. Para a caracterização foram utilizados como parâmetros à alteração morfológica, a produção de biomassa, para ambos os gêneros. A detecção do gene smtA que codifica a proteína metalotioneína (técnica de PCR), foi feita apenas em Geitlerinema UFV-E01. Os resultados mostraram que a absorção de As, em Geitlerinema UFV-E01, foi maior em células cultivadas em meio BG-11 B, com baixa concentração de fosfato (6,5 μmol.mL -1 ). A absorção de As foi proporcional às concentrações crescentes do elemento no meio de cultivo, atingindo o pico máximo de absorção em 24 horas de exposição (665,25 μg As.g -1 ms para células cultivadas em meio BG-11 A e 1.290,32 μg de As.g -1 ms, para células cultivadas em meio BG-11 B), sendo observado uma queda em 48 horas de exposição (500,00 μg As.g -1 ms para células cultivadas em meio BG-11 A, com 17,5 μmol.mL -1 de fosfato, e 810,00 μg de As.g -1 ms para células cultivadas em meio BG-11 B). As células de Geitlerinema UFV-E01 não apresentaram alterações morfológicas e não houve redução na produção de biomassa. Entretanto, foi observada a presença de grânulos densos no citoplasma das células. Os resultados obtidos, por meio da técnica de PCR, mostraram que Geitlerinema UFV-E01 não possui o gene smtA que codifica a proteína metalotioneína, sugerindo que a cianobactéria não utiliza esta estratégia nos processos de detoxificação celular. A absorção de As pelas células de Stigeoclonium UFV-E02, não foram influenciadas pelas concentrações de fosfato no meio BG-11 líquido. A absorção máxima de As ocorreu em 24 horas de exposição (1.300 μg As.g - ms) e foi mantida constante em 48 horas de exposição. Entretanto, em Stigeoclonium UFV- E02, houve redução na produção de biomassa e, também, alterações morfológicas nos filamentos caracterizados pelo aparecimento de células estreitas e longas, com cloroplastos deformados e de tamanho reduzido quando comparado com células sadias (controle). / Cianobacteria and algae are important primary producers in aquatic ecosystems and their energy is transferred throughout the different levels of the environmental trophic chain. The presence of xenobiotic or toxic elements has been a constant threat to aquatic ecosystems. These elements can cause considerable negative effects on microorganisms, since it can affect their different organization levels and consequently impairing the whole trophic chain. The arsenic (As) is a potential toxic element frequently associated with gold deposits. It can be brought to the surface by the gold mining activity, alongside the acid drainage and latter lixiviated, causing water bodies contamination. Previous study has shown that cianobacteria and algae can accumulated toxic As within the cells and sometimes transforming it into a non toxic form. Such trait can be useful for bioremediation purpose, by using these organisms on As decontamination of aquatic environments. In order to assess the bioremediator potential of Geitlerinema UFV-E01 (Cyanobacteria) and Stigeoclonium UFV-02 genera, absorption and toxicity tests were carried out on selected lineages, cultivated in presence of As, under laboratory conditions. The morphological alterations and biomass production were used as evaluation parameters to portray the two genera in relation to As presence. The identification of the smtA gene, which codifies the metallotioneina, was performed on the Geitlerinema UFV-E01 genus by PCR technique. The results indicated that the As absorption by Geitlerinema UFV-E01 cells was greater when they were cultivated in low phosphorus content (6,5 μmomL -1 ) BG-11 medium. The As absorption was proportional to the increase on the element content in culture medium, reaching the maximum after 24 hours of exposure either in the BG-11A medium (665,25 μg As.g -1 ms in BG-11 A and 1.290,32 μg As.g -1 ms in medium BG-11 B). After 48 hours of exposure to As, it was observed a decrease in the amount of element in the cells on both mediums tested, (500,00 μg As.g -1 ms in medium BG- 11 A with 17,5 μmol.mL -1 of fosfato, and 810,00 μg de As.g -1 ms in medium BG-11 B).The G. cells did not shown any signs of morphological alteration or biomass production decay in any of the culture medium tested. Nevertheless, dense corpuscles were observed in the cytoplasm of the cells cultivated. The PCR results revealed that the Geitlerinema UFV-E01 genus does not have the SmtA gene, suggesting that this cianobacteria can be using other mechanism for As detoxification. As detoxification by S. cells was not influenced by the phosphate concentration in the BG-11 medium. The maximum As absorption took place after 24 hours of exposure (1,300μg As.g -1 ms) and stayed constant for 48 hours. It was observed that Stigeoclonium UFV-02 genus had a decrease in the production of biomass and morphological alterations. The filaments shown longer and striated cells, containing smaller and deformed chloroplasts when compared to the control material. / Dissertação importada do Alexandria

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-18Bitstream added on 2014-06-13T20:54:03Z : No. of bitstreams: 1 jardim_bv_me_sjrp.pdf: 1652944 bytes, checksum: df568b54d39070e3bb500cafc6151368 (MD5) / O estudo de marcadores prognósticos e preditivos no câncer tem se mostrado efetivo na pesquisa e rotina diagnóstica. A glutationa (GSH) e as enzimas glutationa peroxidase (GPX) e glutationa S transferase pi (GSTpi) exercem papel fundamental na defesa antioxidante das células e na detoxificação de quimioterápicos. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão das proteínas GSH, GPX e GSTpi em pacientes com câncer de mama, além de avaliar a expressão gênica dessas proteínas em amostras tumorais in vitro após o tratamento com quimioterápico. As proteínas foram detectadas no tecido tumoral de 63 pacientes por imuno-histoquímica e quantificadas pela técnica de densitometria óptica. A expressão dos genes que sintetizam GSH, glutamato cisteina ligase (GCLC) e glutationa sintetase (GSS) e dos genes codificadores da GPX e GSTpi foi analisada por PCR em tempo real em células cultivadas provenientes de 12 amostras tumorais de mama. As células foram submetidas in vitro ao quimioterápico doxorrubicina, e a expressão gênica foi analisada antes e após o tratamento. A expressão da GSH relacionou-se com tumor receptor de estrógeno (RE) negativo (p<0,05). A expressão da GPX foi maior em tumor receptor de progesterona (RP) negativo e em pacientes que vieram a óbito (p<0,05). Alta expressão da GSTpi relacionou-se com características tumorais de prognóstico desfavorável como positividade para p53, grau histológico III, maior tamanho tumoral e óbito (p<0,05). Além disso, as pacientes foram divididas em subgrupos de acordo com o tratamento recebido. Assim, a alta expressão da GSH relacionou-se com a ocorrência de metástase no grupo de pacientes tratadas apenas com quimioterapia adjuvante (p<0,05). Nas pacientes que receberam quimioterapia e radioterapia adjuvantes, a alta expressão da GPX foi relacionada com óbito e a alta expressão da GSTpi... / The study of prognostic and predictive markers in cancer has been proven effective in research and diagnostic routine. Glutathione (GSH) and glutathione peroxidase (GPX) and glutathione S transferase pi (GSTpi) play a crucial role in antioxidant defense of cells and detoxification of chemotherapeutic agents. In this context, the objective of this study was to evaluate the protein expression of GSH, GPX and GSTpi in patients with invasive ductal carcinoma, and to evaluate the expression of genes encoding these proteins in tumor samples in vitro before and after treatment with chemotherapy. The proteins were detected in tumor tissue of 63 patients by immunohistochemistry and quantified by optical densitometry technique. The expression of genes that synthesize GSH, glutamate cysteine ligase (GCLC) and glutathione synthetase (GSS) and the genes encoding GPX and GSTpi were analyzed by real time PCR in cultured cells from 12 tumor samples from patients with breast cancer. The cells were treated in vitro to doxorubicin chemotherapy, and gene expression was analyzed before and after treatment. The expression of GSH was related to tumor estrogen receptor (ER) negative (p <0.05). The expression of GPX was higher in tumor progesterone receptor (PR) negative and patients who died (p <0.05). High expression of GSTpi was related to tumor characteristics of poor prognosis such as p53 positivity, histologic grade III, larger tumor size and death (p <0.05). In addition, patients were divided into subgroups according to treatment received. Thus, high expression of GSH was related to the occurrence of metastasis in patients treated only with adjuvant chemotherapy (p <0.05). In patients who received adjuvant chemotherapy and radiotherapy, high expression of GPX was associated with death and high expression of GSTpi was correlated to local tumor recurrence, metastasis and death (p <0.05)... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-28Bitstream added on 2014-06-13T20:03:28Z : No. of bitstreams: 1 babeto_e_dr_sjrp.pdf: 649918 bytes, checksum: 812ddac8aa99c1d4ba6dfcdc980015a8 (MD5) / O tumor ósseo de células gigantes (TCG) é um tumor benigno, que causa destruição osteolítica, com comportamento biológico incerto e com características particulares como um elevado número de células gigantes multinucleadas e comportamento agressivo. A recorrência local do TCG é freqüentemente observada em 20 a 50% dos casos. Mais agravante que a recorrência, é o fato de que após a recidiva, o paciente muitas vezes também apresenta metástases em outros órgãos, principalmente no pulmão. Dessa forma, o objetivo do trabalho foi á investigação da expressão gênica para identificar genes diferencialmente expressos no TCG, que podem estar envolvidos na biologia molecular e desenvolvimento da doença. A hibridização subtrativa rápida (RaSH) foi utilizada para identificar novos genes diferencialmente expressos, como KTN1, NEB, ROCK1 e ZAK, que foram validados por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) e a imuno-histoquímica em amostras de TCG comparadas ao tecido ósseo normal. A anotação funcional indica que estes genes estão envolvidos em processos celulares relacionadas ao fenótipo tumoral. A expressão dos genes KTN1 e ROCK1 encontra-se aumentada e o gene ZAK tive sua expressão reduzida nas amostras de TCG analisadas. Pela presença de ilhas CpG na região promotora e baixa expressão no tecido tumoral, o padrão de metilação do gene ZAK foi analisado por MSP-PCR. Os genes identificados KTN1, ROCK1 e ZAK pode ser responsável pelas perda de homeostase celular no TCG uma vez que são responsáveis pela várias funções relacionadas com a tumorigênese, como a migração celular, organização do citoesqueleto, apoptose, controle do ciclo celular e, portanto esses resultados poderão contribuir para a compreensão das bases moleculares do TCG, assim ajudando a melhorar o diagnóstico, prognóstico e tratamento dos pacientes / Giant cells tumors of bone (GCTB) are benign in nature but cause osteolytic destruction, with a number of particular characteristics. These tumors can have uncertain biological behavior, often contain a significant proportion of highly multinucleated cells, and may show aggressive behavior. We have studied differential gene expression in GCTB that may give a better understanding of their physiopathology, and might be helpful in prognosis and treatment. Subtractive hybridization (RaSH) was used to identify and measure novel genes that appear to be differentially expressed, including KTN1, NEB, ROCK1 and ZAK, using qRT-PCR and immunohistochemical in the samples of GCTBs compared to normal bone tissue. Normal bone was used in the methodology RaSH for comparison with the GCTB in identification of differentially expressed genes. Functional annotation indicated that these genes are involved in cellular processes related to their tumor phenotype. The differential expression of KTN1, ROCK1 and ZAK was independently confirmed by qRT-PCR and immunohistochemical. The expression of the KTN1 and ROCK1 genes were increased in samples by qRT-PCR and immunohistochemical and ZAK had reduced expression. Since ZAK have CpG islands in their promoter region and low expression in tumor tissue, their methylation pattern was analyzed by MSP-PCR. The genes identified, KTN1, ROCK1 and ZAK may be responsible for loss of cellular homeostasis in GCTB since they are responsible for various functions related to tumorigenesis such as cell migration, cytoskeletal organization, apoptosis, cell cycle control and thus may contribute at some stage in the process of formation and development of GCTB

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1677.pdf: 3237644 bytes, checksum: 05775a00384d5ed86dce49771ff93425 (MD5) Previous issue date: 2008-02-29 / Universidade Federal de Minas Gerais / ABSTRACT Tumor metastasis is usually a major cause of death among cancer patients. Degradation and invasion of the extracellular matrix and basement membrane, key steps in the metastatic process, rely on the activity of proteolytic enzymes. The levels and activities of cathepsins B and L are considerably increased in cancer cells, and have been related to the invasive potential of these cells. Moreover, the levels of their endogenous inhibitors, the cystatins, are decreased, which results in an imbalance that contributes to the development of the metastatic phenotype. Thus, the potential use of cystatins as therapeutic agents in novel anti cancer strategies has been suggested. The sugarcane genome project (SUCEST FAPESP) allowed the identification of about 20 putative cystatins in this plant. In the present study, we describe the heterologous expression, purification and characterization of three cystatins from sugarcane, dubbed as CaneCPI-2, CaneCPI-3 and CaneCPI-4, which showed different inhibitory activities against human cathepsins B and L. While the three recombinant cystatins inhibited cathepsin L activity with Ki values of 0.17, 0.6 and 0.021 nM, respectively, only CaneCPI-4 was capable of efficiently inhibiting cathepsin B activity (Ki = 0.83 nM). Considering the involvement of these cathepsins in tumor cell invasion, the effect of the cystatins on the invasive ability of human breast cancer MDA-MB-231 cells was assessed after the addition of the recombinant cystatins to the cells, and in cell clones expressing the sugarcane cystatins. Overall, the Ki values correlated with the ability of the cystatins to inhibiting the cysteine cathepsin activity of the tumor cells as well as the cell invasion through a Matrigel&#63720; matrix. A slight reduction in the invasive ability was observed in the MDA-MB-231 cells expressing CaneCPI-4. In addition, a substantial reduction of ~ 60% in the cell invasion was obtained in the presence of 2 µM recombinant CaneCPI-2 or CaneCPI- 3, or 0.2 µM of CaneCPI-4. Finally, the cystatins showed negligible effects on the adhesion and proliferation of the cells. Our results open the possibility of considering these as well as other phytocystatins as therapeutics agents in anti-cancer strategies. / A principal causa de mortalidade em pacientes com câncer está associada ao estabelecimento de metástases pelo organismo. A degradação e invasão da matriz extracelular e lâmina basal, etapas chave no processo da metástase, envolvem a ação de enzimas proteolíticas. Em linhagens de células cancerosas as quantidades e a atividade das catepsinas B e L estão consideravelmente aumentadas, e têm sido correlacionadas ao potencial invasivo destas células. Ao mesmo tempo, as quantidades de seus inibidores endógenos, as cistatinas, estão consideravelmente diminuídas, gerando um desequilíbrio que contribui para o desenvolvimento do fenótipo metastático. Assim, no sentido de restabelecer o equilíbrio existente na célula normal, o uso das cistatinas como possíveis agentes terapêuticos em novas estratégias anti-câncer tem sido sugerido. O projeto genoma da cana-de-açúcar (SUCEST FAPESP) possibilitou a identificação de cerca de 20 possíveis cistatinas nesta planta. No presente trabalho, descreve-se a expressão heteróloga, purificação e caracterização de três cistatinas da cana-de-açúcar, denominadas CaneCPI-2, CaneCPI-3 e CaneCPI-4, as quais apresentaram diferenças na ação inibitória contra as catepsinas B e L humanas. Enquanto as três cistatinas inibiram a catepsina L com valores de Ki de 0,17, 0,6 e 0,021 nM, respectivamente, somente a CaneCPI-4 foi capaz de inibir eficientemente a catepsina B (Ki = 0,83 nM). Considerando o envolvimento das catepsinas B e L na invasão das células tumorais, o efeito das cistatinas da cana-de-açúcar sobre a habilidade invasiva da linhagem celular de câncer mamário humano MDA-MB-231 foi avaliado por meio da adição das cistatinas recombinantes às células, e também utilizando células transfectadas com os genes das cistatinas. De modo geral, os valores de Ki correlacionaram-se com a capacidade das cistatinas de inibir a atividade de cisteíno catepsinas das células tumorais, assim como, a invasão celular através de uma matriz de Matrigel. As células que expressavam a cistatina CaneCPI-4 apresentaram uma pequena redução na habilidade invasiva. Por outro lado, uma redução de ~ 60% na invasão celular foi obtida com 2 µM das cistatinas recombinantes CaneCPI-2 ou CaneCPI-3, ou 0,2 µM de CaneCPI-4. Entretanto, as cistatinas não apresentaram nenhum efeito sobre a adesão e a proliferação destas células. Nossos resultados abrem a possibilidade de considerar estas, assim como outras fitocistatinas, como possíveis agentes terapêuticos em estratégias anti-câncer.