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Las distrofias musculares de cinturas (LGMD) son un grupo heterogéneo de enfermedades neuromusculares hereditarias, definidas por una debilidad muscular progresiva y atrofia. Se caracterizan por un patrón distrófico que afecta a la musculatura de las cinturas. Las mutaciones en el gen DYSF son las responsables de un amplio espectro de fenotipos caracterizados todos ellos por ausencia de disferlina en el músculo esquelético y un modo de herencia autosómico recesivo. Los tres fenotipos principales por su frecuencia de aparición son: Miopatía de Miyoshi (MM), Distrofia muscular de cinturas de tipo 2B (LGMD2B) y distrofia muscular tibial anterior (DMAT). Los objetivos planteados fueron: • Estudiar el gen DYSF en pacientes de población española, ya que este gen no se había estudiado nunca antes en esta población. • Diseñar una estrategia técnica rápida y eficaz para el estudio de DYSF o Optimizar el proceso diagnóstico mediante el estudio de RNA vs DNA o Analizar grandes reordenamientos del gen (duplicaciones o deleciones). • Caracterizar el espectro mutacional de DYSF en población española • Establecer una relación genotipo-fenotipo • Analizar posibles genes modificadores Los resultados derivados de este trabajo han sido publicados en las siguientes revistas científicas: -Abnormal expresión of dysferlin in skeletal muscle and monocytes supports primary dysferlinopathy in patients with one mutated allele. M.Meznaric, L. González-Quereda, E. Gallardo, N. de Luna, P. Gallano, M. Fanin, C. Angelini, B. Peterlin and J. Zidar. European Journal of Neurology 2010. Article first published online: 18 OCT 2010 DOI: 10.1111/j.1468-1331.2010.03240.x -A new phenotype of dysferlinopathy with congenital onset. Paradas C, González-Quereda L, de Luna N, Gallardo E, García-Consuegra I, Gómez H, Cabello A, Illa I, Gallano P. *Authors Paradas C and González-Quereda L contributed equally to this work. Neuromuscul Disord. 2009 Jan;19(1):21-5. Epub 2008 Dec 11. doi:10.1016/j.nmd.2008.09.015 Las conclusiones del trabajo son: • Es posible realizar el estudio mutacional en el RNA total extraído de monocitos circulantes en sangre periférica, evitándose por consiguiente el método invasivo de biopsia muscular • Existe una gran heterogeneidad mutacional en el gen DYSF en pacientes de población española con distrofia muscular de cinturas tipo 2B y miopatía distal tipo Miyoshi. • No es posible establecer una relación genotipo-fenotipo en pacientes con disferlinopatía. • La mutación DYSF c.3191_3196dup es la más prevalente en nuestra población. • La heterogeneidad mutacional en los pacientes de nuestra población, en lo referente a la localización dentro del gen, es elevada y no se han identificado “hotspots” del mismo modo que en otras poblaciones caucásicas. • El estudio de DYSF en mRNA vs DNA genómico permite: o Establecer un diagnóstico molecular de forma más rápida y eficaz. o Detectar un mayor número de mutaciones. o Detectar todas las mutaciones que alteran el proceso de splicing. • No se han identificado mutaciones en el gen MG53, que codifica para mitsugumina-53, en nuestra serie de pacientes con disferlinopatía por lo que hasta la actualidad no puede ser considerado como gen modificador. • Se describe un nuevo fenotipo de disferlinopatía con inicio congénito, ampliándose de este modo el espectro clínico de las disferlinopatías y, añadiendo nuevos datos a la historia natural de la enfermedad. / Limb Girdle Muscular Dystrophies (LGMD) are a heterogeneous group of inherited neuromuscular diseases, defined by progressive muscle weakness and atrophy. They are characterized by a progressive dystrophic pattern involving limb-girdle muscles. Mutations in DYSF gene are responsible for a wide range of phenotypes characterized by the absence of dysferlin in skeletal muscle and an autosomal recessive mode of inheritance. So far, three main phenotypes have been reported: Miyoshi Myopathy (MM), Limb Girdle Muscular Dystrophy type 2B (LGMD 2B), and Distal Myopathy with Anterior Tibial onset (DMAT). The objectives of this work were: • To study the DYSF gene in patients from Spanish population, not previously analysed in this population. o To design a technical strategy to analyse the DYSF gene o To optimize the diagnostic process using RNA vs DNA • To analyse gene rearrangements (deletions or duplications). • To characterize the mutational spectrum in our population • To establish a genotype-phenotype relationship • To analyse possible modifiers genes Results from this work had been published: -Abnormal expresión of dysferlin in skeletal muscle and monocytes supports primary dysferlinopathy in patients with one mutated allele. M.Meznaric, L. González-Quereda, E. Gallardo, N. de Luna, P. Gallano, M. Fanin, C. Angelini, B. Peterlin and J. Zidar. European Journal of Neurology 2010. Article first published online: 18 OCT 2010 DOI: 10.1111/j.1468-1331.2010.03240.x -A new phenotype of dysferlinopathy with congenital onset. Paradas C, González-Quereda L, de Luna N, Gallardo E, García-Consuegra I, Gómez H, Cabello A, Illa I, Gallano P. *Authors Paradas C and González-Quereda L contributed equally to this work. Neuromuscul Disord. 2009 Jan;19(1):21-5. Epub 2008 Dec 11. doi:10.1016/j.nmd.2008.09.015 This thesis drew the conclusions: • It is possible to perform the mutational analysis in RNA isolated from total peripheral blood monocytes, avoiding the invasive method of muscle biopsy. • DYSF gene shows high mutational heterogeneity in patients from Spanish population suffering from Limb Girdle Muscular Dystrophy type 2B and Miyoshi Myopathy. • It is not possible to establish a genotype-phenotype correlation in dysferlinopathy patients. • DYSF c.3191_3196dup is the most prevalent mutation in Spanish population. • Patients from our population show high mutational heterogeneity and it is not possible to identify hotspots as mutations are expanded over the whole sequence of the gene. • The DYSF gene study in mRNA vs genomic DNA allows: o To establish a molecular diagnostic in a quick and efficient way. o To detect a high number of mutations o To detect all mutations changing the splicing process. • Mutations in MG53 have not been identified in our serie of patients, so that, MG53 can not be considered as a modifier gene to date. • It has been described a new phenotype of dysferlinopathy with congenital onset. This new phenotype widens the clinical spectrum of dysferlinopathies and add new data to the natural story of the disease.

El empleo de marcadores moleculares como los microsatélites del DNA humano son de mucha importancia en los estudios de filiación e identificación en la práctica forense, estos estudios se basan en las frecuencias alélicas de los microsatélites o marcadores genéticos del DNA, que para el caso del Perú están supeditados a las frecuencias alélicas reportadas para la población hispanoamericana. Este trabajo tiene como objetivo determinar si existe diferencia significativa entre las frecuencias alélicas del microsatélite D16S539 de la muestra poblacional de ascendencia ancashina y la hispanoamericana. Los estudios genéticos, como la identificación de los genotipos de los individuos y la determinación del equilibrio genético de la población fueron realizados en una muestra de 33 individuos no emparentados usando la técnica de PCR seguida por electroforesis en geles de poliacrilamida al 8% 7M urea y tinción con nitrato de plata, encontrándose 5 alelos de 9 reportados para el D16S539 (Steven y col., 1998), siendo la frecuencia del alelo 9 igual a 0.242, 10 igual a 0.258, 11 igual a 0.288, 12 igual a 0.106 y 13 igual a 0.106. La población estudiada se encontró en equilibrio de Hardy-Weinberg con respecto a este marcador y además no existía diferencia significativa entre las frecuencias alélicas del D16S539 de la muestra poblacional de ascendencia andina ancashina y la hispanoamericana. / The use of microsatellites, as molecular markers of human DNA, are important in the studies of affiliation and identification in forensic practices. These studies are based on allelic frequencies in certain populations. For example, in Peru the frequencies reported are often for Hispano-Americans. This research attempts to determine if significant differences among allelic frequencies of the microsatellite D16S539 exist between two populations: a Peruvian Ancash sample and a general sample of Hispano-Americans. Genetic populations studies were carried out in a sample of 33 norelated individuals using PCR followed by 8% polyacrilamide gel electrophoresis and silver staining. The population presented 5 alleles of the 9 found for the D16S539 microsatellite, with the respective frequencies: 9 (0.242), 10 (0.258), 11 (0.288), 12 (0.106) and 13 (0.106). The population in study was found to be in Hardy-Weinberg equilibrium with regard to this marker and there were no significant differences between the allelic frequencies of the population of Ancash origin, and general sample of Hispano-Americans.

Las Repeticiones Cortas en Tandem (STR) son marcadores genéticos distribuidos en todo el genoma, se han venido utilizando en estudios de ligamiento genético de enfermedades, identificación humana y genética de poblaciones debido a su alto grado de polimorfismo. En este trabajo se presentan los resultados obtenidos en una muestra de 35 individuos no emparentados de la población de Yungay (Ancash-Perú), mediante la determinación de los alelos de los STRs: HumTH01 (Tirosina hidroxilasa) y HumTPOX (Tiroidea peroxidasa) con la técnica de la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), electroforesis en geles de poliacrilamida al 6% 7M urea y visualizados con la tinción con nitrato de plata. En la población de Yungay se detectaron los alelos 6, 7 y 9.3 para el marcador HumTH01 con un valor de heterocigosidad de 0.5429 y de homocigosidad de 0.4571. Mientras para el marcador TPOX se detectaron los alelos 8, 9, 11 y 12 con un valor de heterocigosidad de 0.3429 y de homocigosidad de 0.6571. La distribución de frecuencias para el marcador HumTH01 para el alelo 6 igual a 0.3286, alelo 7 igual a 0.5143 y alelo 9.3 igual a 0.1571; y para el marcador TPOX para el alelo 8 igual a 0.7571, alelo 9 igual a 0.0143, alelo 11 igual a 0.2143 y alelo 12 igual a 0.0143. La población se encontró en equilibrio de Hardy-Weinberg para ambos marcadores y, además, no existe diferencia significativa entre las frecuencias alélicas de ambos marcadores de la población de Yungay y la hispanoamericana reportadas por Steven et al. (1998). / Short tandem repeats (STRs) are genetic markers distributed throught the whole genome. Over the last years, they have been used to study the genetic linkage of diseases, human identification and populations genetic due to its high degree of polymorphism. In this work, the results presented were obtained in the allele determination with the STRs: HumTH01(Human tyrosine hydroxylase gene) and HumTPOX (Human thyrid peroxidase gene) in the population sample constituted by 35 non-related individuals from Yungay (Ancash-Peru). The technique used were PCR, 7M urea 6% poliacrylamide gel electroforesis and visualized with silver nitrate staining. In Yungay's population, we found 3 alleles 6, 7 and 9.3 for HumTH01 with a value of heterozigocity of 0.5429 and homocigocity of 0.4571, and for marker HumTPOX 4 alleles 8, 9, 11 and 12with a value of heterozigocity of 0.3429 and homocigocity of 0.6571. The frequency distribution for marker HumTH01 for allele 6 equal to 0.3286, allele 7 equal to 0.5143 and allele 9.3 equal to 0.1571; and for marker TPOX for allele 8 equal to 0.7571, allele 9 equal to 0.0143, allele 11 equal to 0.2143 and allele 12 equal to 0.0143. The population is found in Hardy-Weinberg equilibrium, and there are no significant differences between the allelic frequencies of both markers between Yungay's population and the Hispano-American reported by Steven et al. (1998)

La investigación tuvo como objetivo incorporar una metodología de identificación rápida conocida como ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) para identificar especies del género Vibrio. Se estandarizó la técnica con cepas referenciales. Luego, se aislaron cepas bacterianas asociadas con el cultivo de Litopenaeus vannamei. Posteriormente, se realizaron pruebas bioquímicas para encontrar cepas candidatas de pertenecer al género Vibrio. Al finalizar esta primera etapa, la técnica ARDRA estandarizada, fue aplicada en las cepas candidatas, confirmando de esta manera la factibilidad de la metodología bajo las condiciones estudiadas. En una segunda etapa, se secuenció la región 16S rDNA para confirmar e identificar las cepas candidatas por análisis filogenético. Se reportaron tres especies diferentes con alta similitud pertenecientes al Vibrio core group (Vibrio communis, Vibrio harveyi y Vibrio parahaemolyticus). Con estos resultados, fue posible diseñar una identificación rápida por ARDRA para identificar el Vibrio core group y la especie Vibrio communis. La metodología de diseño del ARDRA fue soportado por una valoración diagnóstica bioinformática, obteniendo de esta evaluación, una sensibilidad y una especificidad de 97,1 y 76,9%, respectivamente para la identificación del Vibrio core group, mientras que para identificar la especie Vibrio communis, se obtuvo una sensibilidad y una especificidad de 100 y 97,4%, respectivamente. Finalmente, se ha demostrado que es posible identificar ciertas especies del genero Vibrio asociados con la acuicultura de Litopenaeus vannamei, por ARDRA y esta metodología de identificación, tiene la ventaja de ser mucho más rápido y económico en comparación con la identificación por análisis filogenético, teniendo a su vez la desventaja de ser dependiente del uso del secuenciamiento en un primer momento para el diseño del ARDRA. Palabras clave: Litopenaeus vannamei, ARDRA, Vibrio communis, Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio core group, evaluación diagnóstica bioinformática. / --- The research aimed to incorporate a quick identification methodology known as ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) to identify Vibrio species. Technique was standardized with reference strains. Then, bacterial strains were isolated associated with the cultivation of Litopenaeus vannamei. Subsequently, biochemical tests were performed to find candidate strains belonging to the genus Vibrio. Upon completion of this first stage, the standard technique (ARDRA) was applied for candidate strains, thus confirming the feasibility of the method under the conditions studied. In a second step, the 16S rDNA region sequenced to confirm and identify candidate strains for phylogenetic analysis. Three different species were reported with high similarity belonging to the Vibrio core group (Vibrio communis, Vibrio harveyi and Vibrio parahaemolyticus). With these results, it was possible to design a quick identification by ARDRA to identify the Vibrio core group and Vibrio communis. The design methodology ARDRA was supported by a bioinformatics diagnostic assessment, obtaining this evaluation, a sensitivity and specificity of 97,1 and 76.9% respectively for the identification of Vibrio core group, while identifying the species Vibrio communis, yielded a sensitivity and specificity of 100 and 97,4%, respectively. Finally, it has proved possible to identify certain Vibrio species associated with aquaculture Litopenaeus vannamei, by ARDRA identification and this methodology has the advantage of being much faster and cheaper compared with the identification by phylogenetic analysis, having in turn, the disadvantage of being dependent on the use of the sequencing at first for ARDRA design. Keywords: Litopenaeus vannamei, ARDRA, Vibrio communis, Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio core group, bioinformatic diagnostic evaluation.

O adenocarcinoma de pâncreas continua sendo uma doença com alta mortalidade apesar dos avanços na ciência e na tecnologia. O diagnóstico é tardio, na maior parte dos casos, impossibilitando uma abordagem com fins curativos. Os estudos em busca de um método para o diagnóstico precoce ou mesmo um tratamento eficaz, até o momento, não revelaram mudanças significativas. Atualmente, pesquisas em biologia molecular apontando alterações em determinados genes nos tumores de pâncreas parecem ser promissoras. Neste sentido, porém seguindo uma outra linha de pesquisa, o estudo atual que objetiva a determinação das características nucleares das células neoplásicas através da cariometria por análise digital, constitui um passo inicial para futuras especulações. Recentemente, estudos em outros tecidos como o prostático, o mamário e o endométrio vêm demonstrando existir eficácia na diferenciação entre seus tecidos normais e neoplásicos e também uma forte relação entre as alterações encontradas na cromatina de seus núcleos celulares e a agressividade de seus respectivos tumores. Utilizando-se tecido pancreático estocado em parafina por até onze anos no laboratório de Patologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), foram determinadas as características nucleares em mil e trezentos núcleos de células ductais de adenocarcinoma de pâncreas e de tecido pancreático normal. Noventa e três características da cromatina foram estudadas por análise digital. Onze características apresentaram valores diferentes entre os dois grupos e estas diferenças foram estatisticamente significativas. A média para o valor da ÁREA nuclear nos tumores foi de 977.78 e de 336.60, no tecido normal; a da RLM278 foi de 353.23 e 97.07; a da RLM266 de 99.32 e 28.06; a do PERIM de 125.58 e 65.05; a do ROUND de 1.37 e 1.04; a da IOD de 123.49 e 107.97; a da FRACDIM de 1.22 e 1.05; a da DENSMIN de 0.01 e 0.14; a da DENSMAX de 0.53 e 0.62; a da DENSSD 0.25 e 0.10 e a da DENS20P de 0.49 e 0.33, respectivamente para os núcleos dos tumores e para os do tecido normal. Sete destas características serviram como marcadores ideais de neoplasia. Estes achados permitiram a criação de uma assinatura digital específica para cada um dos dois tipos de tecido estudado. / Pancreatic adenocarcinoma still results in high mortality rates despite recent advances in science and technology. The diagnosis is late in most cases, hindering the possibilities of cure. So far, studies searching for early diagnostic methods or effective treatment of pancreatic cancer have not resulted in significant changes. Molecular biology has recently expanded our knowledge about the association between gene abnormalities and pancreatic cancer. Following a different research line, this study aims to determine nuclear features of neoplastic cells through digital karyometry assessment, proposing a first step for future speculations. Studies of other tissues like prostate, breast, and endometrium have recently shown efficacy in differentiating between their normal and neoplastic tissues and also a strong relation between changes found in chromatin of cell nuclei and tumor aggressiveness. In the present study, nuclear features were determined in one thousand and three hundred cells removed from cancerous and normal pancreatic tissue stored at the HCPA Pathology Unit through an eleven year period. Ninety-three chromatin features were studied by digital karyometry. Eleven features showed significantly different values between both groups. The average values for nuclear AREA in cancerous and normal tissue was, respectively, 977.78 and 336.60; for RLM278 was 353.23 and 97.07; for RLM266 99.32 and 28.06; PERIMETER of 125.58 and 65.05; ROUNDNESS of 1.37 and 1.04; IOD of 123.49 and 107.97; FRACDIM of 1.22 and 1.05; DENSMIN of 0.01 and 0.14; DENSMAX of 0.53 and 0.62; DENSSD of 0.25 and 0.10; and DENS20P of 0.49 and 0.33, for cancerous nuclei and normal nuclei, respectively. Seven of those features served as ideal neoplasm markers. Such findings yielded the creation of a specific digital signature for each of the two types of studied tissues.

Bacilos são bactérias aeróbias ou anaeróbias facultativas, Gram positivas ou Gram variáveis, produtoras de endósporos, que lhes conferem resistência ao estresse ambiental. Os gêneros Bacillus e Paenibacillus são os que possuem as espécies reconhecidamente fixadoras de nitrogênio. Outra característica dos bacilos é o grande potencial em produzir substâncias capazes de promover o crescimento vegetal, como hormônios, sideróforos, antibióticos e a capacidade de solubilização de fosfatos. Enquanto múltiplas espécies de bacilos podem ser detectadas nos solos e na rizosfera de várias plantas, muito pouco tem sido feito para estimar a sua diversidade e para indicar quais são as espécies mais comumente isoladas. Dois estudos semelhantes foram conduzidos nesse trabalho, com os seguintes objetivos: i) isolar as espécies de bacilos fixadores de nitrogênio predominantes em diferentes regiões orizícolas e tritícolas do Estado do Rio Grande do Sul, ii) estimar a sua diversidade; e iii) avaliar suas atividades como bactérias promotoras de crescimento de plantas, para utilização como futuros inoculantes. Das espécies que foram identificadas, através do seqüenciamento parcial do gene do RNA ribossomal 16S, as mais comuns foram P. borealis e P. graminis. Para a grande maioria das bactérias isoladas não foi possível a identificação em nível de espécie. Há uma alta probabilidade de que tais bactérias constituam espécies ainda não descritas, mas filogeneticamente muito próximas a P. borealis e P. graminis. Dentre os isolados da rizosfera de arroz e trigo, dois foram descritos como novas espécies neste trabalho: Bacillus oryzae e Paenibacillus riograndensis. Uma característica marcante entre os isolados da rizosfera foi a capacidade destes de produzir grandes quantidades de ácido indol-acético. Poucos isolados, tanto do solo quanto da rizosfera, produziram sideróforos e solubilizaram fosfato. As linhagens selecionadas para experimentos in vivo em casa de vegetação provaram ser muito eficientes na promoção do crescimento de suas plantas hospedeiras. Tais linhagens poderão ser usadas na formulação de novos inoculantes, melhorando o sistema de cultivo em que eles venham a ser aplicados. A identificação e o isolamento de bacilos de solos temperados e subtropicais, que combinem a habilidade de fixar nitrogênio com a produção de substâncias capazes de promover o crescimento vegetal, poderá aumentar significativamente a produtividade das lavouras graníferas no Brasil e no Estado do Rio Grande do Sul, em especial. / Bacilli are aerobic or facultatively anaerobic, Gram positive or variable, endospore-forming bacteria that exhibit resistance to environmental stress. Bacillus and Paenibacillus genera include the best knowing nitrogen-fixing species. Another bacilli characteristic is their great potential in producing substances that promote plant growth by the production of hormones, siderophores and phosphate solubilization. While multiple species of bacilli can be detected in the soils and rhizosphere, scarce research has been carried out to estimate their diversity and indicate the most commonly isolated species. In this work, two similar studies have been conducted with the objectives of: i) isolate the predominant nitrogen-fixing bacilli species from different rice and wheat crops of Rio Grande do Sul State, ii) estimate their diversity, and iii) evaluate their plant growth promoting (PGP) activities in order to use them further as inoculant strains. Among the species that have been identified through partial 16S rRNA gene sequence analysis, P. borealis and P. graminis were the most common species in both locations, soil and rhizosphere. It was not possible to identify the vast majority of isolates at the level of species. There is a high probability that these bacteria constitute species not yet described, but phylogenetically very closely related to P. borealis and P. graminis. Two isolates from rice and wheat rhizospheres were described as new species: Bacillus oryzae and Paenibacillus riograndensis. A remarkable characteristic among isolates of the rhizosphere was their ability to produce high amounts of indole-acetic acid. Few isolates, both from bulk soil and rhizosphere, produced siderophores and/or solubilized phosphates. The strains selected for in vivo experiments in a greenhouse proved to be very effective in promoting the growth of their host plants. Such strains can be used in the formulation of new inoculants, improving the cropping system in which they will be applied. The identification and the isolation of PGP bacilli from temperate and subtropical soils, which combine the ability to fix nitrogen with the production of substances capable of promoting plant growth, could also significantly increase the productivity of grain crops in Brazil and Rio Grande do Sul State in special.

Embora o ferro seja um dos elementos mais abundantes na crosta terrestre, somente uma pequena fração está disponível para ser utilizada pelos organismos vivos. A solubilidade do ferro em solos com pH neutro é muito baixa, aproximadamente 10-18 M. Em condições de baixa disponibilidade de ferro, diversos microrganismos podem produzir e excretar sideróforos, quelantes orgânicos de baixo peso molecular envolvidos na solubilização e seqüestro de Fe3+. A captação de ferro é fator limitante para a fixação biológica do nitrogênio, uma vez que esse elemento está diretamente envolvido em moléculas como a nitrogenase, leg-hemoglobina, ferredoxina e citocromos. Enquanto microrganismos de vida-livre, os rizóbios devem ser capazes de solubilizar ferro e competir por ele no solo. As bactérias pertencentes ao gênero Bradyrhizobium são de grande relevância agronômica devido à capacidade de fixar nitrogênio em simbiose com diversas leguminosas, especialmente a soja [Glycine max (L.) Merrill]. B. japonicum and B. elkanii são duas espécies capazes de nodular soja e quatro estirpes são comumente utilizadas como inoculantes no Brasil: B. elkanii SEMIA 587 e SEMIA 5019 e B. japonicum SEMIA 5079 e SEMIA 5080. Os genes fegA e fhuA, relacionados à síntese de proteínas de membrana transportadoras do complexo Fe3+ - sideróforo já foram identificados em B. japonicum 61A152 e Rhizobium leguminosarum, respectivamente. Ao contrário de B. japonicum, nada se conhece sobre esses genes na espécie B. elkanii. No presente trabalho foram analisadas a habilidade em produzir sideróforos e a presença de genes relacionados à síntese de proteínas receptoras do complexo Fe3+ - sideróforo entre diferentes estirpes de Bradyrhizobium. Uma porção do gene fhuA de B. elkanii foi isolada e apresentou um elevado grau de conservação com outros genes relacionados à captação de sideróforos em diferentes bactérias. Experimentos de Southern-blot demonstraram que existe apenas uma cópia do gene fhuA, e nenhuma do gene fegA, no genoma da estirpe SEMIA 587 de B. elkanii. Através do tradicional método CAS, a capacidade de produzir e captar sideróforos in vitro foi confirmada entre as estirpes de B. elkanii utilizadas como inoculantes comerciais no Brasil. As linhagens de B. japonicum, entretanto, mesmo possuindo receptores de membrana específicos para sideróforos, não são capazes de se multiplicar em meio de cultura deficiente em ferro. Tais resultados indicam a possibilidade de diferenças significativas quanto ao sistema de captação de ferro entre tais estirpes. Estudos que confirmem a função do gene fhuA estão sendo conduzidos para verificação da viabilidade fenotípica de B. elkanii mutante para esse gene. / Although iron is one of the most abundant elements in Earth, only one small fraction is available to be used by living organisms. The solubility of iron in soils with neutral pH is very low, approximately 10-18 M. During iron deficiency, many microorganisms can produce and excrete low molecular weight organic chelators termed siderophores involved in the solubilization and sequestration of Fe3+. The iron uptake is a limiting factor for the biological nitrogen fixation as iron is directly involved in many molecules that are essential to this process, like nitrogenase, leg-hemoglobin, ferredoxin and cytochrome. While free-living microorganism, rhizobia should be able to solubilize iron and compete for it in soil. Bacteria belonging to the genus Bradyrhizobium are of enormous agricultural value since they are able to fix atmospheric nitrogen in symbiosis with several leguminous plants, especially soybean [Glycine max (L.) Merrill]. B. japonicum and B. elkanii strains are two species capable of nodulate soybean, in which four strains are commonly used as inoculant in Brazil: B. elkanii SEMIA 587 and SEMIA 5019 and B. japonicum SEMIA 5079 and SEMIA 5080. In B. japonicum 61A152 and Rhizobium leguminosarum fegA and fhuA genes, which are involved in the synthesis of membrane Fe3+-siderophore uptake proteins were already identified, respectively. In the opposite, almost nothing is known about these genes in B. elkanii species. In this work the siderophore production ability and the presence of genes related to the membrane Fe3+- siderophore uptake were analyzed in several Bradyrhizobium strains. A B. elkanii fhuA DNA region was isolated and it presented a high level of homology with others siderophore uptake related genes from different bacterial species. Southern blot experiments shown that there is a single fhuA gene copy in the B. elkanii SEMIA 587 genome, and no fegA gene was identified in this genome. Through the traditional CAS methodology, the siderophore production and uptake in vitro activities were demonstrated in the B. elkanii strains used as inoculant in Brazil. B. japonicum strains, however, although having siderophores specific membrane receptors, were not able to growth in a medium lacking iron. Such results indicated that significant differences concerning iron uptake system might exist between these two bacterial species. Studies to confirm fhuA gene function are under way aiming to verify the phenotypic viability of B. elkanii fhuA mutants.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-02-08T11:42:45Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7141983 bytes, checksum: 6726b1c828edabd75d3397e5e4e2c6d3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T11:42:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7141983 bytes, checksum: 6726b1c828edabd75d3397e5e4e2c6d3 (MD5) Previous issue date: 2016-09-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A floresta Atlântica brasileira, uma das regiões de maior biodiversidade no mundo, está entre as cinco áreas mais importantes, hotspot de biodiversidade, possuindo mais de 8.000 espécies endêmicas. Entretanto, ela é uma das florestas mais ameaçadas do mundo. Estudos vêm sendo conduzidos com o objetivo de tentar entender as razões que levaram a este grande acúmulo de biodiversidade. Nós estudamos o modelo de distribuição de espécies, diversidade genética e filogeografia em populações de Cedrela fissilis da floresta Atlântica, com o intuito de responder se populações estariam em refúgios secos ou em florestas úmidas durante o último máximo glacial (LGM). Nossos resultados mostraram suporte para ambas as hipóteses, sugerindo assim que provavelmente uma combinação de processos atuaram no espaço e no tempo formando a diversidade que existe atualmente. Além disso, Estudos moleculares necessitam de DNA de qualidade e, em plantas, as folhas não estão sempre disponíveis. Dessa forma, nós testamos uma completa metodologia de extração de tecido do câmbio em diferentes espécies (Anadenanthera peregrina var. peregrina, Cedrela fissilis, Ceiba speciosa e Dimorphandra wilsonii) a fim de obter um DNA adequado para amplificação. O protocolo utilizado aqui, desde a coleta até a extração, foi efetivo para a obtenção de produtos de PCR para sequenciamento e genotipagem. / The Brazilian Atlantic forest, one of the most biodiverse regions in the world, is among the five most important areas, biodiversity hotspot, harbouring more than 8,000 endemic species. However, it exhibits the most threatened forests in the world. Studies have been conducted in order to understand the reasons that led to this high accumulation of biodiversity. We evaluated species distribution model, genetic diversity and phylogeography of populations of Cedrela fissilis from Atlantic range, in order to answer whether populations were in dry refugia or in moist forests during the last glacial maximum (LGM). Our results showed support for both hypotheses, suggesting that likely a mixture of processes have acted through space and time. In addition to this study, molecular studies require DNA isolated, and in plants the leaves are not always available. Thus, we also tested a complete methodology of DNA extraction from cambium tissue in different species (Anadenanthera peregrina var. Peregrina, Cedrela fissilis, Ceiba speciosa and Dimorphandra wilsonii) in order to obtain a suitable DNA for amplification. The protocol used here, showed from the collected steps until extraction, was effective for obtaining PCR products for sequencing and genotyping.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-02-13T15:10:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5741738 bytes, checksum: 02add042fb42b01ca9dfe6c88e77ace8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-13T15:10:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5741738 bytes, checksum: 02add042fb42b01ca9dfe6c88e77ace8 (MD5) Previous issue date: 2016-03-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Begomovírus (gênero Begomovirus, família Geminiviridae) possuem um ou dois componentes genômicos de DNA circular de fita simples, encapsidados em partículas icosaédricas geminadas. A maioria dos begomovírus presentes no Novo Mundo (NM) são bissegmentados, enquanto no Velho Mundo (VM) prevalecem os monossegmentados, frequentemente associados a duas classes de DNAs satélites: alfassatélites e betassatélites. Recentemente, alfassatélites foram relatados em associação com begomovírus bissegmentados no NM. Membros do gênero Begomovirus são responsáveis por doenças em culturas economicamente importantes em todo o mundo. Begomovírus que infectam Ipomoea spp. (família Convolvulaceae), comumente denominados "sweepovírus", possuem organização genômica típica dos vírus monossegmentados do VM, porém são filogeneticamente distintos das demais espécies do gênero. O entendimento da dinâmica e variabilidade genética de populações virais em plantas não-cultivadas é importante para auxiliar na previsão e prevenção de doenças em plantas cultivadas. Este trabalho teve como objetivos: (i) estudar a diversidade de espécies de begomovírus em dois hospedeiros não-cultivados amplamente distribuídos no Brasil, Sida spp. e Leonurus sibiricus; (ii) determinar a estrutura e a variabilidade genética das populações de begomovírus em Sida spp. e L. sibiricus; (iii) determinar a variabilidade genética de deltassatélites associados a sweepovírus infectando Ipomoea indica no sul da Espanha, expandindo a análise para outras regiões geográficas. Para os dois primeiros objetivos, o DNA total foi extraído de plantas de Sida spp. e L. sibiricus coletadas nos estados do Rio Grande do Sul, Paraná e Mato Grosso do Sul de 2009 a 2011, e os genomas virais foram amplificados, clonados e sequenciados. A maioria das amostras de Sida spp. estavam infectadas pelo Sida micrantha mosaic virus (SiMMV). Foram encontradas também três novas espécies. A maioria absoluta das amostras de L. sibiricus estavam infectadas pelo Tomato yellow spot virus (ToYSV). Dois alfassatélites foram encontrados: Euphorbia yellow mosaic alphasatellite em Sida sp. e um novo alfassatélite em L. sibiricus. As populações de SiMMV e ToYSV possuem alta variabilidade genética. Embora um elevado nível de recombinação tenha sido detectado, a dinâmica mutacional é o fator primário de diversificação. Os resultados são inconclusivos em relação a estruturação baseada em localização geográfica. Para o terceiro objetivo, DNA foi extraído de plantas de I. indica coletadas no sul da Espanha em 2015, e amplificação por círculo rolante (RCA), uma técnica que leva a amplificação de moléculas de ssDNA circulares sem o conhecimento prévio da sequência nucleotídica, foi usada para clonar os deltassatélites e seus sweepovírus associados, Sweet potato leaf curl virus (SPLCV) e Sweet potato mosaic virus (SPMV). Deltassatélites apresentaram baixa variabilidade de sequência, ausência de recombinação e de estruturação geográfica. Além disso, uma quimera sweepovírus- satélite com um tamanho similar ao dos deltassatélites foi detectada. / Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) possess one or two genomic components of circular, single-stranded DNA (ssDNA) encapsidated in geminate icosahedral particles. Most begomoviruses in the New World (NW) are bipartite, while the majority in the Old World (OW) are monopartite and frequently associated with two classes of satellite DNAs: alphasatellites and betasatellites. Alphasatellites have been recently reported in association with bipartite begomoviruses in the NW. Members of the genus Begomovirus are responsible for important crop diseases worldwide. Begomoviruses that infect Ipomoea spp. (family Convolvulaceae), commonly known as "sweepoviruses", have the typical genomic organization of OW monopartite viruses but are phylogenetically distinct from all other species in the genus. Understanding the dynamics and genetic variability of viral populations in non-cultivated hosts is important for the prediction and consequent prevention of new virus diseases in cultivated plants. This work aimed to: (i) assess the diversity of begomoviruses in two non-cultivated hosts widely distributed in Brazil, Sida spp. and Leonurus sibiricus; (ii) determine the genetic structure and variability of begomovirus populations infecting Sida spp. and L. sibiricus; (iii) determine the genetic variability of deltasatellites associated with sweepoviruses infecting Ipomoea indica in Spain and expand the analysis to other geographical areas. For the first two objectives, total DNA was extracted from samples of Sida spp. and L. sibiricus collected in the states of Rio Grande do Sul, Paraná and Mato Grosso do Sul from 2009 to 2011 and viral genomes were amplified, cloned and sequenced. In Sida spp. the most prevalent virus was Sida micrantha mosaic virus (SiMMV). In addition, three new species were also detected. The vast majority of L. sibiricus samples were infected by Tomato yellow spot virus (ToYSV). Two alphasatellites were found: Euphorbia yellow mosaic alphasatellite in Sida sp. and a new alphasatellite associated with ToYSV in L. sibiricus. Both the SiMMV and ToYSV populations have a high degree of genetic variability. Although a high level of recombination was detected, mutational dynamics was the primary factor of diversification. The results were inconclusive regarding genetic structuration based on geography. For the third objective, DNA was extracted from I. indica samples collected in southern Spain in 2015 and rolling circle amplification (RCA), a technique that allows amplification of circular ssDNA molecules without previous knowledge of nucleotide sequence, was used to clone deltasatellites and two associated sweepoviruses, Sweet potato leaf curl virus (SPLCV) and Sweet potato mosaic virus (SPMV). Deltasatellites showed low sequence variability, no evidence of recombination, and no obvious geographical structuration. Also, a sweepovirus- deltasatellite chimera with a size similar to deltasatellites was detected.